本發(fā)明屬于海水動物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種對大菱鲆隨機(jī)群體進(jìn)行個體育種值評估的方法。

背景技術(shù)：
大菱鲆(ScophthalmusmaximusL.)是原產(chǎn)于歐洲的底棲海水魚類，具有生長迅速、耐低溫、風(fēng)味獨特、性格溫順、宜于集約化養(yǎng)殖等優(yōu)點，是歐洲等地的優(yōu)良海水養(yǎng)殖品種之一。自1999年突破生產(chǎn)性育苗技術(shù)以來，大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)在我國得到迅速發(fā)展，已經(jīng)成為我國北方沿海重要的魚類養(yǎng)殖品種。由于我國不是大菱鲆的原產(chǎn)地，養(yǎng)殖生產(chǎn)中長期依賴于歐洲大菱鲆原產(chǎn)國提供、補(bǔ)充種源。同時，由于累代養(yǎng)殖和近親交配比較嚴(yán)重，國內(nèi)大菱鲆產(chǎn)業(yè)普遍出現(xiàn)了種質(zhì)退化現(xiàn)象。主要表現(xiàn)為生長速度降低、白化率增高、出苗率降低等現(xiàn)象。良種選育已經(jīng)成為我國大菱鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要課題之一。基于完整物理系譜記錄的良種選育模式是開展菱鲆良種選育的重要途徑之一。完整、準(zhǔn)確的系譜信息不僅可以有效指導(dǎo)親本選留，避免近交衰退；同時利用系譜信息推算出的個體親緣系數(shù)也是用來進(jìn)行遺傳參數(shù)評估的重要數(shù)據(jù)。但是由于大菱鲆性成熟周期長(2-3年)，目前絕大多數(shù)良種場親魚保有數(shù)量有限，更不用說完整的物理系譜記錄信息；同時，大菱鲆屬于引進(jìn)物種，群體的遺傳背景不清，這也為開展大菱鲆良種選育造成了很大的困難。雖然利用分子標(biāo)記可以實現(xiàn)系譜重建，但是這種重建是很有限的，比如只能重建到父母本一代，只能推算出父母本的基因型組合，而無法推算出具體的父本、母本的基因型。良種選育過程中，最重要的遺傳參數(shù)評估就是個體/家系育種值的評估。因此，目前迫切需要一種無需物理系譜記錄就能夠?qū)蚁颠M(jìn)行育種值評估的技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種對大菱鲆隨機(jī)群體進(jìn)行個體育種值評估的方法，從而在沒有物理系譜的條件下，推算出個體親緣系數(shù)從而進(jìn)行遺傳參數(shù)評估。本發(fā)明的利用隨機(jī)群體進(jìn)行大菱鲆個體育種值評估的方法，包括如下步驟：1)首先利用要檢測的隨機(jī)群體中來構(gòu)建大菱鲆家系；2)個體表型數(shù)據(jù)采集和基因組DNA提?。簩τ谒鶚?gòu)建家系群體，在12月齡時，挑選體重排名靠前的1000個體，測量體長、體重等表型數(shù)據(jù)，同時在不影響個體生長的情況下提取DNA；所述的不影響個體生長的情況下提取DNA，是剪取其鰭條末端組織來提取DNA；3)微衛(wèi)星位點基因分型；利用20個SSR位點進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，20對引物正相序列5′端分別標(biāo)記6-FAM，HEX，TAMRA及ROX熒光標(biāo)記；利用ABI3130型全自動基因分析儀進(jìn)行20個位點的微衛(wèi)星位點基因分型；所述的SSR位點的擴(kuò)增引物信息如下：4)數(shù)據(jù)處理計算將獲得的SSR位點數(shù)據(jù)按照Coancestry軟件的要求輸入到軟件中處理，得到分型個體兩兩之間的分子遺傳相關(guān)度(rXY)；再利用R-project軟件將得到的分子遺傳相關(guān)度(rXY)結(jié)果轉(zhuǎn)化為遺傳相關(guān)矩陣(NumeratorMatrix)的形式；再利用R-project軟件中matrix程序包的nearPD函數(shù)將遺傳相關(guān)矩陣進(jìn)行正定(Bending)，使其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函數(shù)驗證，獲得遺傳相關(guān)矩陣；將正定過的遺傳相關(guān)矩陣轉(zhuǎn)化為ASReml軟件認(rèn)可的三列式“.grm”文件。將“.grm”文件連同表型數(shù)據(jù)文件(記錄個體的編號、表型值、固定效應(yīng)分組)一起輸入到ASReml軟件，使用AI-REML算法，利用動物模型估計育種值；y＝Xb+Zu+e其中y為表型值向量，即研究群體內(nèi)個體的性狀測量值，包括體重、體長等。X和Z分別為b和u的設(shè)計矩陣，b,u和e分別為固定效應(yīng)，隨機(jī)效應(yīng)及殘差的向；按照混合方程組(如下)求解動物模型。其中X’和Z’分別為X和Z矩陣的轉(zhuǎn)置；A-1是A矩陣的逆矩陣，A矩陣為加性遺傳矩陣，即“.grm”文件；和分別是固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)的估計值；本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果如下：第一，無需記錄譜系。傳統(tǒng)選育時，需對選育群體進(jìn)行物理標(biāo)記，記錄譜系以評價個體間的遺傳關(guān)系，這項工作耗費大量人力。本專利所發(fā)明的分子方法可以直接利用分子對個體間遺傳關(guān)系進(jìn)行評價省去系譜記錄環(huán)節(jié)。第二，對個體間的遺傳關(guān)系評價更為準(zhǔn)確。大菱鲆繁殖力較高，子代眾多，管理及其他不可避免的失誤造成的系譜記錄錯誤經(jīng)常發(fā)生。作為引進(jìn)物種，一代親本的遺傳背景往往不明。這些因素導(dǎo)致系譜推斷的遺傳相關(guān)系數(shù)不夠準(zhǔn)確的。而分子方法不涉及它們的親本信息，使結(jié)果更為準(zhǔn)確。第三，更為準(zhǔn)確的個體間親緣關(guān)系使得估計育種值更為準(zhǔn)確，可進(jìn)一步加速選育進(jìn)程。具體實施方式本方法用到的軟件包括Coancestry、R-project和ASReml。Coancestry是一款根據(jù)微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)計算個體間親緣關(guān)系的軟件。R-project是一種用于統(tǒng)計計算的編程語言，由奧克蘭大學(xué)的RossIhaka和RobertGentleman發(fā)明。如今被廣泛地使用于統(tǒng)計分析、數(shù)據(jù)挖掘等方向。ASReml是由VSN公司開發(fā)的擬合線性混合模型的數(shù)據(jù)分析軟件，適合分析大數(shù)據(jù)和復(fù)雜統(tǒng)計模型嗎，被廣泛的應(yīng)用于動植物遺傳育種學(xué)科。下面通過實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的解釋，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不受實施例任何形式上的限制。實施例11)大菱鲆家系構(gòu)建2013年初(1月份)對候選大菱鲆親魚通過控溫控光進(jìn)行生殖調(diào)控。4月末水溫適合時，從候選親魚中挑選性腺發(fā)育成熟，體型完整，體色正常，攝食積極，健康活潑，無傷殘，體重2千克以上的個體進(jìn)行人工受精，構(gòu)建大菱鲆家系。具體為：受精卵放置在80×60×60cm孵化網(wǎng)箱內(nèi)充氣孵化，海水溫度維持在14～15℃，。孵化3天后吸取上浮卵并按照20ml/m2(350粒/ml)的標(biāo)準(zhǔn)，由孵化池移入提前調(diào)好水溫、鹽度、PH及溶解氧的圓形玻璃鋼缸中(0.5m2，容積0.5m3)微充氣，靜水孵化至出苗，各家系均單獨培育；按照大菱鲆家系常規(guī)養(yǎng)殖方法，最后共培育大菱鲆家系78個。2)實驗個體表型數(shù)據(jù)采集：本發(fā)明不需要物理系譜信息，但為了將本發(fā)明所得到的結(jié)果與傳統(tǒng)方法相比較，仍然采用了傳統(tǒng)的分家系培養(yǎng)，記錄了家系信息的方法。待家系個體生長至3月齡時，每個家系挑選挑選體重排名前40的個體作為核心選育群體進(jìn)行標(biāo)記并隨機(jī)分配到三個性狀測試池，繼續(xù)生長到15月齡時對所有個體測量體長、體重數(shù)據(jù)，記錄其所在家系，池號，剪取其鰭條末端組織(類似于取動物的毛發(fā)組織，不會對個體造成任何傷害)備個體基因組DNA提取。-75℃低溫保存。3)基因組DNA提?。夯蚪MDNA提取方法如下：1、取鰭條50mg放入300μl組織裂解液(100mmol/LTris-HClpH8.0，50mmol/LEDTApH8.0，0.5％SDS)中，用剪刀破碎組織；2、加入6μl蛋白酶K(20mg/ml)，56℃水浴至組織溶液澄清透明為止(一般3-4h)，自然冷卻組織消化液至室溫；3、加7M醋酸銨100μl，混勻后放置冰上大約5min4、然后，4℃，12000rmp/min離心約10min；5、吸取上清液，加300μl預(yù)冷異丙醇(-20℃)混勻；6、混合物20℃放置30min，使DNA充分沉淀析出；7、12000rmp/min，4℃離心10min；8、DNA沉淀用70％無水乙醇洗滌2次，自然干燥至產(chǎn)物半透明為止，加適量雙蒸水定濃度至50ng/μl。4)微衛(wèi)星位點基因分型：選用大菱鲆已經(jīng)公布的20個SSR位點進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，位點詳細(xì)信息見表1，20對引物正相序列5’端分別標(biāo)記6-FAM，HEX，TAMRA及ROX熒光標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系包括：總體積25μl，其中基因組DNA2μl(50ng/μl)，TaqDNA聚合酶0.2μl(5U/μl)，10×PCRBuffer2.5μl，Mg2+2μl(2.5mmol/L)，dNTP2μl(2.5mmol/L),引物各0.5μl(10μmol/L)，ddH2O15.3μl。PCR擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5min后進(jìn)入25個PCR循環(huán)：95℃變性40s，退火1min(各引物的退火溫度見表1)，72℃延伸1min，最后于72℃延伸5min，4℃保存。表1微衛(wèi)星引物的基本特征利用ABI3130型全自動基因分析儀進(jìn)行20個位點的微衛(wèi)星分型。在96孔板的每個加樣孔里分別加2μlSSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與8μl內(nèi)標(biāo)體系(去離子甲酰胺：GeneScanTM-500LIZSizeStandard＝7.9:0.1)充分混合后，95℃變性5min，結(jié)束后迅速將96孔板置于冰水混合物中冷卻。將處理好的樣品置于AppliedBiosystems的3130基因分析儀中，進(jìn)行熒光數(shù)據(jù)收集和基因分型。最后利用GeneMapper3.7(AppliedBiosystems)準(zhǔn)確讀取并記錄每一個體的各個等位基因峰值。本實施例個體微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)見表1。表1：微衛(wèi)星個體的分型數(shù)據(jù)4)數(shù)據(jù)處理：1.微衛(wèi)星分型數(shù)據(jù)按照Coancestry軟件的要求的格式輸入到軟件中處理，得到分型個體兩兩之間的分子遺傳相關(guān)度(rXY)。2.利用R-project軟件得到的分子遺傳相關(guān)度構(gòu)建成遺傳相關(guān)矩陣，并利用matrix程序包中nearPD函數(shù)對構(gòu)建矩陣進(jìn)行正定(Bending)即其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函數(shù)驗證。將正定過的遺傳相關(guān)矩陣轉(zhuǎn)化為ASReml軟件認(rèn)可的三列式“.grm”文件；3、將“.grm”文件，連同表型數(shù)據(jù)文件(記錄所有個體的編號、體重、體長、池號)及相應(yīng)的系譜文件一起輸入到ASReml軟件，使用AI-REML算法，利用動物模型(如下)估計育種值。y＝Xb+Zu+e其中y為表型值向量，即表型數(shù)據(jù)文件當(dāng)中所有個體的體重體長性狀測量值。X和Z分別為b和u的設(shè)計矩陣，b,u和e分別為固定效應(yīng)，個體隨機(jī)效應(yīng)及殘差的向量。本實施例中固定效應(yīng)指測試池效應(yīng)，由表行數(shù)據(jù)文件提供。按照Henderson(1959)混合方程組(如下)求解動物模型。其中X’和Z’分別為X和Z矩陣的轉(zhuǎn)置；A-1是A矩陣的逆矩陣，A矩陣由“.grm”文件提供；和分別是固定效應(yīng)和隨機(jī)效應(yīng)的估計值；4.估算的育種值及其標(biāo)準(zhǔn)誤從運算完成后生成的.sln結(jié)果文件中提??；本實施例個體的育種值見表2。表2：個體的體重、體長表型值及其育種值表為了證明本發(fā)明方法的有效性，比較了傳統(tǒng)系譜法和本發(fā)明提供的分子相關(guān)法的育種值準(zhǔn)確度差異。1.系譜法遺傳力和育種值的估計。對于利用傳統(tǒng)系譜法估算育種值的過程，直接將表型數(shù)據(jù)文件及系譜記錄文件導(dǎo)入ASReml軟件利用相同動物模型估算育種值即可。系譜法估算的遺傳力及育種值也可從運算完成后生成的.pvc和.sln結(jié)果文件中提取，系譜法估計得遺傳力為0.33±0.15。2.利用交叉驗證(cross-validation)比較系譜與分子相關(guān)相在育種值準(zhǔn)確度。利用R-project軟件將測得的表型數(shù)據(jù)隨機(jī)分為均等的10份，其中9份作為訓(xùn)練集(trainingset)，剩下一份作為驗證集(validationset)。根據(jù)訓(xùn)練集數(shù)據(jù)，分別利用系譜法和分子相關(guān)法在ASReml中用動物模型來預(yù)測驗證集表型值。根據(jù)如下公式來計算育種值準(zhǔn)確度其中表示育種值準(zhǔn)確度；表示驗證集的預(yù)測值與觀察值之間的皮爾遜相關(guān)度；h2表示根據(jù)系譜相關(guān)度估算的遺傳力。交叉驗證重復(fù)5000次，對育種值準(zhǔn)確度取平均值。結(jié)果顯示，利用本發(fā)明得到的驗證集的預(yù)測值與觀察值之間的平均皮爾遜相關(guān)度為0.63，對育種值的估計準(zhǔn)確度為0.9214，而傳統(tǒng)系譜方法得到的驗證集的預(yù)測值與觀察值之間的平均皮爾遜相關(guān)度為0.58，對育種值的估計準(zhǔn)確度為0.8513。兩者間存在極顯著差異(P<0.01)。說明本專利中的方法在育種值估計準(zhǔn)確度方面優(yōu)于傳統(tǒng)系譜法。