本發(fā)明涉及一種檢測試劑盒，具體地說是一種丙型肝炎檢測試劑盒和其專用HCV NS3單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株HCV4及HCV5和由該細(xì)胞株分泌的單克隆抗體。

背景技術(shù)：

丙型肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一種嚴(yán)重威脅人們身體健康傳染病。超過50％的HCV患者將發(fā)展成為慢性肝炎，10～20％的HCV患者最終發(fā)展成為肝硬化，同時(shí)肝細(xì)胞癌變的風(fēng)險(xiǎn)也大大增加。HCV的檢測對丙型肝炎病毒感染的早期診斷和指導(dǎo)臨床治療有重大的意義。目前丙型肝炎的檢測主要是丙肝抗體和丙肝RNA兩項(xiàng)檢測指標(biāo)，HCV感染后一般到丙肝抗體的檢出平均有70天的“窗口期”，因此存在一定的漏檢率，HCV RNA檢測具有早期、敏感和特異等特點(diǎn)，但該方法在技術(shù)和設(shè)備上要求較高，且費(fèi)時(shí)，檢出率較低。類似于HIV病毒的抗體檢測試劑，盡管目前應(yīng)用最為廣泛，但對于感染“窗口期”的檢測則靈敏性欠佳。而病毒核酸的檢測往往采用RT-PCR擴(kuò)增的方法，因此具有易污染，且需要基因擴(kuò)增儀等缺點(diǎn)，難于在基層單位開展。血中病毒抗原的出現(xiàn)早于抗體的出現(xiàn)，亦是一種直接的病原檢測手段，將作為HCV診斷方法的有力補(bǔ)充。HCV感染者血清中HCVNS3抗原(HCAg NS3)是HCV復(fù)制的一個(gè)直接標(biāo)志物，在感染一周左右即可出現(xiàn)，而且還有利于HCV感染患者的早期發(fā)現(xiàn)，特別是某些免疫功能紊亂、免疫功能低下的患者和某些不產(chǎn)生抗體的攜帶者。因此，檢測感染者血中NS3抗原是最理想的HCV感染檢測靶目標(biāo)，然而，HCAg NS3在血清中的濃度(10²～10³CID/ml)常常低于目前國內(nèi)外使用最為普遍的酶聯(lián)免疫吸附分析法(ELISA)的檢測限(0.1ng/ml～1μg/ml)，使HCAg NS3檢出率受到很大限制，成為HCV抗原檢測試劑開發(fā)的瓶頸。因此，迫切需要一種高靈敏度、高特異性的丙型肝炎抗原定性和定量檢測試劑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于解決上述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，提出一種高靈敏性、高特異性的檢測HVC NS3的單克隆抗體HCV4。

本發(fā)明的第二目的在于提出一種檢測抗體，即HCV NS3單克隆抗體HCV5。

本發(fā)明的第三目的在于提出一種由上述單克隆抗體制備得到的免疫磁珠。

本發(fā)明的第四目的在于提出一種高靈敏性和高特異性檢測丙型肝炎的檢測試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

雜交瘤細(xì)胞株HCV4，建議的分類命名：骨髓瘤雜交細(xì)胞。所述細(xì)胞株的保藏編號(hào)為：CGMCC No.10120。

HCV NS3單克隆抗體HCV4，由保藏編號(hào)為CGMCC No.10120的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。該細(xì)胞株于2014年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。電話：010-64807355。

雜交瘤細(xì)胞株HCV5，建議的分類命名：骨髓瘤雜交細(xì)胞。所述細(xì)胞株的保藏編號(hào)為：CGMCC No.12282。

HCV NS3單克隆抗體HCV5，上述HCV NS3單克隆抗體HCV5由保藏編號(hào)為CGMCC No.12282的雜交瘤細(xì)胞株分泌得到。該細(xì)胞株于2016年4月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編：100101。電話：010-64807355。

上述單克隆抗體HCV4和/或單克隆抗體HCV5在制備檢測丙型肝炎試劑盒中的應(yīng)用。

一種檢測丙型肝炎的試劑盒，其中，所述試劑盒包括捕獲抗體和檢測抗體，所述捕獲抗體為上述HCV NS3單克隆抗體HCV4；所述檢測抗體為上述HCV NS3單克隆抗體HCV5。

一種生物素標(biāo)記的上述單克隆抗體HCV4與鏈霉親和素修飾的納米磁珠偶聯(lián)得到的免疫磁珠。

上述磁珠直徑為10～12nm，其表面覆蓋無機(jī)小分子單層為二氧化硅SiO₂。

上述免疫磁珠在制備檢測丙型肝炎試劑盒中的應(yīng)用。

一種檢測丙型肝炎的試劑盒，其中，所述試劑盒含有上述的免疫磁珠及上述的HCV NS3單克隆抗體HCV5。

所述試劑盒由下述試劑組成：鏈霉親和素修飾的抗HCV4單克隆抗體偶聯(lián)免疫磁珠板96人份×1塊、HCV-NS3陽性對照1ml×1瓶、HCV-NS3陰性對照1ml×1瓶、樣品稀釋液12ml×1瓶、HRP標(biāo)記的抗HCV5單克隆抗體0.3ml×1瓶、濃縮的抗體酶結(jié)合物稀釋液24ml×1瓶、濃縮洗滌液(20×)50ml×1瓶、顯色劑A液7ml×1瓶、顯色劑B液7ml×1瓶、終止液7ml×1瓶、封板膜3張、說明書1份。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果是：

(1)本發(fā)明制備得到的針對HCV NS3N末端表位“MWTVYHGAG”和表位“TRKGSSGGP”兩株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株HCV4和HCV5，兩單克隆抗體配對檢測HCV NS3抗原具有很高的靈敏性和特異性。具有早期檢測優(yōu)勢，即患者感染一周左右即可檢測到。高靈敏度，平均檢測靈敏度為5.2pg/ml，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于現(xiàn)有技術(shù)中ELISA檢測法的1～2ng/ml。

(2)本發(fā)明采用生物素標(biāo)記單克隆抗體HCV4偶聯(lián)鏈霉親和素修飾的納米磁珠制 備得到免疫磁珠，具有特殊的超順磁性效應(yīng)，在無外加磁場時(shí)無剩磁，可以完全消除磁性團(tuán)聚，均勻分散在溶液中，這就快速、高效地促進(jìn)了抗原、抗體之間的反應(yīng)，抗原、抗體之間的反應(yīng)只需30min即可完成。同時(shí)還具有較高的抗體偶聯(lián)量和很好的穩(wěn)定性。磁珠直徑的選擇是關(guān)鍵，本發(fā)明選擇直徑為10～12nm的磁珠，具有巨大的比表面積，能夠偶聯(lián)更多的抗體，而且使抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)充分暴露，減少位阻效應(yīng)，有效的提高了檢測的靈敏度。由于免疫磁珠在磁場中可控運(yùn)動(dòng)的特點(diǎn)，反應(yīng)后產(chǎn)物很容易磁性分離，使本方法操作簡便快速。

(3)本發(fā)明所提供的納米磁珠丙型肝炎核心抗原診斷方法與HCV RNA檢測方法(本發(fā)明中對照HCV RNA定量檢測由CobasTaqman HCV RNA定量檢測試劑完成)的相關(guān)性良好，陽性符合率為84％。

附圖說明

圖1為免疫磁珠用量的選擇結(jié)果圖；

圖2為免疫磁珠最佳反應(yīng)時(shí)間的選擇結(jié)果圖；

圖3為本發(fā)明檢測試劑盒的穩(wěn)定性結(jié)果示意圖；

圖4為本發(fā)明試劑盒檢測靈敏度標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中使用的方法如無特殊說明均為本領(lǐng)域常規(guī)方法。下述實(shí)施例中使用的材料、試劑等如無特殊說明均可通過市售購買獲得。

實(shí)施例1HCV NS3單克隆抗體的建立

1.抗原制備：

(1)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：以HCV NS3的全長序列為模板，利用下述引物，通過PCR合成基因片段，進(jìn)行PCR產(chǎn)物膠回收純化，常規(guī)方法轉(zhuǎn)化連接入PMD18T(測序載體)，進(jìn)行測序驗(yàn)證。

引物設(shè)計(jì)和克隆：根據(jù)GenBank中人HCV NS3的全長序列(FJ890494.1)設(shè)計(jì)上、下游引物，如SEQ ID No.1及SEQ ID No.2所示：

上游SEQ ID No.1：atgctaggcaccataatcacaa

下游SEQ ID No.2：cactgctttatccacacccgg

PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)為:94℃，4min；94℃，30s；55℃，,30s；72℃，1min，20個(gè)循環(huán)，72℃延伸4min。

(2)目的蛋白表達(dá)與純化：采用含BamHI、EcoRI酶切位點(diǎn)的引物擴(kuò)增HCV NS3基因(465bp)，酶切純化后常規(guī)方法與經(jīng)BamHI、EcoRI酶切后的PGEX-4T-2質(zhì)粒連接， 轉(zhuǎn)化入BL21。選取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，1％NP-40裂解，-80℃反復(fù)凍融3次，采用層析法純化HCV NS3抗原。

(3)根據(jù)HCV NS3N末端蛋白酶區(qū)域，設(shè)計(jì)并合成兩段針對催化中心的H57，S139的多肽，分別序列為N-MWTVYHGAG和N-TRKGSSGGP，BSA偶聯(lián)。

2.動(dòng)物免疫

取HCV重組抗原蛋白500mg/L與完全福氏佐劑等量混合制成乳化劑，共免疫6周齡雌性Balb/c小鼠5只。第1次免疫100μg/只，皮下多點(diǎn)注射，2周后用不完全福氏佐劑乳化抗原，第2次免疫，劑量、途徑與第1次相同，2周后進(jìn)行第三次免疫，劑量、途徑與方法同前。2周后尾靜脈取血測定效價(jià)，抗HCV效價(jià)達(dá)1：1000～1：5000時(shí)供融合用。融合前3天用抗原直接腹腔脾區(qū)加強(qiáng)免疫1次，3天后取小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合。

另，分別將以上兩個(gè)多肽抗原(E814-1-1-1)免疫鼠齡為6周的雌性BALB/c健康小鼠3只。第一次用福氏完全佐劑，每只50ug,腹腔注射，總劑量0.5ml/只，間隔3周第二次起用福氏不完全佐劑，劑量為50ug/0.5ml/只，第三次注射后10天檢測血抗體滴度(ELISA法)，選擇免疫反應(yīng)最好的小鼠脾臟進(jìn)行融合。

3.融合和單抗篩選

免疫反應(yīng)最好的小鼠的脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0)進(jìn)行融合，融合后的細(xì)胞經(jīng)過適當(dāng)稀釋，分置于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，培養(yǎng)10-14天進(jìn)行ELISA檢測，挑選OD值高的孔中的細(xì)胞進(jìn)行有限稀釋法亞克隆。具體方法如下：將有限稀釋的細(xì)胞培養(yǎng)至96孔板中，待克隆生長到全孔的1/6時(shí)，標(biāo)記單克隆及多克隆，對單克隆進(jìn)行ELISA檢測。ELISA檢測后將OD值最高的單克隆再有限稀釋接入96孔板中如上法所述再次亞克隆，此過程重復(fù)數(shù)次，直至陽性孔比率為100％，我們即認(rèn)為此為單克隆。即我們通常認(rèn)為的建株成功的細(xì)胞株。將篩選得到的陽性單克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，細(xì)胞數(shù)按1～2×10⁶/管進(jìn)行凍存。同時(shí)收集細(xì)胞安排腹水制備。

4.腹水制備

細(xì)胞株采用小鼠腹腔接種法制備腹水，10-14天收集腹水，ELISA檢測腹水是否制備成功。純化腹水，純化后抗體進(jìn)行效價(jià)測定，顯示出5株抗體最高效價(jià)為1：2560000(見表1)，其中抗HCV1-3為HCV NS3全長融合蛋白免疫產(chǎn)生，抗HCV4為N-MWTVYHGAG；抗HCV5為N-TRKGSSGGP免疫產(chǎn)生。

表1 5株抗-HCV McAb上清液和腹水的效價(jià)測定

5.抗體鑒定

(1)特異性鑒定

以重組HCV基因工程表達(dá)抗原、大腸桿菌BL－21菌體和HDV重組蛋白分別包被聚苯乙烯板條，置4℃過夜。用2％BSA-PBS封閉后，分別加入不同株細(xì)胞培養(yǎng)上清液，室溫2h后，加入抗IgG-HRP標(biāo)記物，室溫1h，洗滌后顯色，觀察各細(xì)胞株與不同抗原有無交叉反應(yīng)，見表2。

表2 5株抗-HCV McAb與其他抗原蛋白的交叉反應(yīng)OD值

(2)亞類鑒定

用HCAg(2.5mg/L)包被96孔板條,4℃過夜。2％BSA-PBS-Tween20封閉后，加入不同株細(xì)胞培養(yǎng)上清液(0.1ml/孔)，室溫2h，洗滌后加入抗小鼠Ig及其亞類的兔免疫血清，37℃孵育1h，洗滌后加入酶標(biāo)記羊抗兔Ig抗體，37℃1h，洗滌，顯色，判斷結(jié)果，見表3。

表3HCV單克隆抗體亞類鑒定

其中針對N末端抗原表位的抗HCV4(表位MWTVYHGAG)和抗HCV5(表位TRKGSSGGP)效價(jià)顯著高于其他株抗體。

(3)幾株單克隆抗體分別配伍進(jìn)行HCV NS3抗原的檢測，選擇配伍檢測效率最高的用于試劑盒開發(fā)：

選擇抗HCV1，抗HCV4和抗HCV5分別進(jìn)行磁珠標(biāo)記和HRP標(biāo)記(方法見實(shí)施例2)，分別作為捕獲抗體和檢測抗體進(jìn)行配伍檢測HCV NS3重組蛋白和HCV患者血清中HCV NS3抗原水平，其中檢測HCV NS3抗原實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，取均值。結(jié)果見表4，表5，對于HCV NS3重組蛋白的檢測，幾組配伍之間無顯著性差異，但對于HCV患者血清的檢測可以看出，以HCV‐4和HCV‐5兩株抗體配伍的檢測值最高，即檢測效率最高。

表4單克隆抗體配伍檢測HCV NS3重組蛋白OD值

表5單克隆抗體配伍檢測HCV患者血清OD值

實(shí)施例2本發(fā)明納米磁珠丙型肝炎檢測試劑盒的制備

1.免疫磁珠(MIB)的制備

本實(shí)施例使用的微球，可以為專利號(hào)ZL201010168903.2，專利名稱為“一種合成磁性聚合物微球的方法”中所述的微球，或其他市售的超順磁性聚合物微球。

取1mg鏈霉親和素修飾磁微球，用MIB清洗緩沖液洗一次，加入100μl生物素標(biāo)記HCV NS3單克隆抗體HCV4，充分混勻，室溫反應(yīng)30min，磁性分離，吸取上清液，測蛋白濃度，用MIB清洗緩沖液洗三次，加入1ml MIB保存緩沖液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.免疫磁珠表面抗體的偶聯(lián)效率的鑒定

采用紫外可見分光光度計(jì)測定偶聯(lián)前的抗體溶液(pre)、偶聯(lián)后的上清液(post)和偶聯(lián)過程中清洗液(wash)在波長280nm處的OD值，測量結(jié)果分別為：OD pre＝0.325，OD post＝0.040，OD wash＝0.002，按以下公式計(jì)算得到抗體的偶聯(lián)效率為87.1％，該結(jié)果表明生物素標(biāo)記HCV NS3單克隆抗體HCV4高效地與鏈霉親和素修飾磁微球進(jìn)行了偶聯(lián)，形成了MIB。偶聯(lián)效率計(jì)算公式如下：

3.試劑盒中免疫磁珠用量和反應(yīng)時(shí)間的優(yōu)化選擇

以基因工程表達(dá)HCAg NS3為陽性對照，正常人血清為陰性對照。將20μl HCAg NS3，20μlMIB(上述方法制備得到的)，50μl HRP標(biāo)記HCV NS3單克隆抗體HVC5和50μl反應(yīng)緩沖液加入離心管中，充分混勻，37℃反應(yīng)30min，磁性分離后，用0.02mol/L PBST洗三次，加入TMB底物液，37℃反應(yīng)10min，以2mol/L H₂SO₄終止反應(yīng)，磁性分離，在波長450nm處測定上清液的吸光度(OD)值，如圖1所示。分別加入MIB 5，10，20，30，40和50μl后，測定陽性對照和陰性對照的OD值。結(jié)果表明差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不明顯(r＝0.304，p＞0.05)，隨著MIB量的增加，陽性對照OD值增加到一定程度后趨于減少，而陰性對照OD值變化不明顯，MIB最佳用量為20μl。

按上述方法，選擇不同反應(yīng)時(shí)間測定陽性對照和陰性對照的OD值：5，10，15，20，30和40min，如圖2所示。結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r＝0.956，p＜0.01)，隨著反應(yīng)時(shí)間延長，陽性對照OD值增加，在反應(yīng)時(shí)間30min后，陽性對照OD值增加不明顯。陰性對照在所研究的每個(gè)反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)都顯示很低的OD值。最佳反應(yīng)時(shí)間為30min。

4.本發(fā)明檢測試劑盒的穩(wěn)定性試驗(yàn)

將上述方法3中的主要試劑，包括MIB、HRP標(biāo)記物、陽性對照、陰性對照、反應(yīng)緩沖液和底物液于4℃放置，分別在第1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、9個(gè)月和12個(gè)月時(shí)測定陽性對照和陰性對照的OD值，計(jì)算P/N，結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r＝－0.985，p＜0.01)，P/N無明顯下降，在第12個(gè)月時(shí)，P/N仍大于2.1，顯示本檢測試劑盒有很好的穩(wěn)定性。

5.本發(fā)明檢測試劑盒的靈敏度和精密度測定

對零標(biāo)準(zhǔn)濃度進(jìn)行10次平行測定，計(jì)算OD值的平均值及其標(biāo)準(zhǔn)偏差，OD值平均值減去兩倍標(biāo)準(zhǔn)偏差后的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的濃度即為靈敏度。重復(fù)試驗(yàn)三次，得到平均檢測靈敏度為5.2pg/ml。應(yīng)用HCV NS3重組蛋白倍比稀釋后，分別檢測其OD值如表6，圖4所示，以O(shè)D值大于1.0為陽性Cutoff值，最低檢測限為5pg/ml。

表6試劑盒靈敏度檢測

用同批制備的MIB對濃度為100，200和500pg/ml的HCAg NS3溶液進(jìn)行10次批內(nèi)、3次批間重復(fù)試驗(yàn)，結(jié)果見表7，批內(nèi)和批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15％，表明該方法有較好的重復(fù)性。

表7精密度測定結(jié)果

實(shí)施例4本發(fā)明丙型肝炎檢測試劑盒在臨床標(biāo)本檢測方面的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1. 3708例HCV抗體陰性血清標(biāo)本的檢測：

HCV抗體由萬泰丙型肝炎-丙型肝炎病毒(HCV)抗體診斷試劑盒(雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法，國藥準(zhǔn)字S20130002)完成，收集北京佑安醫(yī)院2003年1月至2005年12月留取的血清標(biāo)本(-80℃保存)，其中48例檢測到HCV NS3抗原陽性(1.3％)，抗原陽性患者的檢測OD值見表8為本發(fā)明試劑盒檢測48例HCV抗體陰性、HCV NS3抗原陽性患者OD值(>0.168為陽性)。

表8HCV抗體陰性血清標(biāo)本HCV NS3抗原陽性檢測結(jié)果

2. 173例HCV抗體陽性患者HCV NS3抗原檢測：173HCV抗體陽性樣本中，42例為HCV NS3抗原檢測陽性，其比例約為24.3％。

3.HCV NS3抗原檢測陽性標(biāo)本的確認(rèn)：

(1)15例HCV NS3抗原陽性標(biāo)本中，9例(60％)為HCV RNA陽性；

(2)當(dāng)與HCV抗體陽性血清中和以后，23例HCV NS3抗原陽性血清標(biāo)本的OD值顯著降低，以下降50％為例，其中和比率為87.0％(20/23)。中和反應(yīng)結(jié)果見表9。

表9

(3)將23例HCV NS3抗原陽性的血清標(biāo)本進(jìn)行免疫印跡檢測，16(69.6％)例為免疫印跡檢測陽性。

4. 25例系列血清標(biāo)本的動(dòng)態(tài)HCV NS3抗原檢測：

我們檢測了11例HCV NS3抗原陽性的患者系列動(dòng)態(tài)血清標(biāo)本，其HCV NS3抗原OD值隨著患者感染時(shí)間的延長而降低，HCV NS3抗原檢測OD值與患者感染時(shí)間的關(guān)系見表10。

表10 25例系列血清標(biāo)本的動(dòng)態(tài)HCV NS3抗原檢測

5. 25例HCV患者HCV-RNA、HCV抗體檢測結(jié)果與本發(fā)明HCV NS3抗原檢測結(jié)果的相關(guān)性分析：HCV NS3抗原檢測與HCV-RNA陽性的符合率達(dá)84％，與HCV抗體檢測亦有較好的相關(guān)性，見表11。

表11HCV-RNA、HCV抗體檢測結(jié)果與本發(fā)明HCV NS3抗原檢測結(jié)果的相關(guān)性分析