本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及醫(yī)學和生物技術(shù)，具體的是涉及一種pml/rarα融合基因檢測試劑盒和檢測方法。
背景技術(shù)：
：急性早幼粒細胞白血病(acutepromyelocyticleukemia，apl)是急性髓細胞白血病的一種特殊類型，被fab協(xié)作組定為急性髓細胞白血病m3型，其特點是骨髓及其他造血組織中有大量白血病細胞無限制地增生，并進入外周血液，而正常血細胞的制造被明顯抑制，該病居年輕人惡性疾病中的首位，病因至今仍不完全清楚。95％的apl患者具有t(15；17)染色體異常，形成的pml-rarα融合基因是其分子標志。位于15q22的pml基因與位于17q21的rarα基因相互易位，形成pml-rarα融合基因。由于pml基因的斷裂點不同，而rarα斷裂點恒定(2號內(nèi)含子)，導致可以產(chǎn)生相應的3種不同pml-rarα融合基因的異構(gòu)體：位于第6內(nèi)含子的斷裂點，形成長型(l型)融合基因，約占病人的55％；位于第3內(nèi)含子的斷裂點，形成短型(s型)融合基因，約占病人的40％；位于第6外顯子的斷裂點，形成變異型(v型)融合基因，約占病人的5％；其中以長型和短型融合基因為主。pml-rarα融合基因表達的融合蛋白干擾了正常rarα在核內(nèi)的分布和對細胞分化的調(diào)控，使大量細胞阻滯在早幼細胞階段，在apl發(fā)病機制中起重要作用。有研究報道，在復發(fā)前的3～6個月pml/rarα融合基因的轉(zhuǎn)錄信號顯著增強；緩解1年，查pml/rarα融合基因仍可陽性。由此可見，pml/rarα融合基因的預報復發(fā)，即使經(jīng)治者只含少量殘留細胞同樣可檢測到。不同的基因異構(gòu)體分型的預后有明顯不同，s型患者緩解前的死亡率及緩解后的復發(fā)率均高于l型。因此，對pml/rarα融合基因進行檢測和分型，能更好地指導患者分子靶向治療及預后判斷。目前，pml-rarα融合基因的檢測方法主要包括以下3種：細胞遺傳學檢測、基于pcr方法的檢測和fish檢測。細胞遺傳學檢測需培養(yǎng)細胞，耗時較長，只能檢測中期的細胞，且成功率和靈敏度低；基于pcr的檢測如rt-pcr、q-pcr等易污染，假陽性率高，只能檢測已知的斷裂點，對未知或含少量轉(zhuǎn)錄本的pml-rarα融合基因無法檢出。fish檢測對病人外周血或骨髓的pml-rarα融合基因具有極高的靈敏度和檢測隱匿型易位的能力，其假陽性率遠遠低于pcr檢測，能提供相對于核型分析更為可靠的分子遺傳學證據(jù)，可用于預后判斷、用藥療效、微小病灶殘留及移植術(shù)后效果的監(jiān)測。雖然。目前fish檢測方法得到了廣泛的應用和改良，但仍具有以下缺陷：(1)以bac為模板制備的探針中存在較多的重復序列，影響雜交的特異性，同時造成較高的背景熒光；(2)檢測步驟繁雜，探針序列過長，探針與樣本雜交往往需要12-16h才能保證充分雜交，費時費力；(3)一些優(yōu)化的探針序列過短，導致檢測特異性降低且信號微弱難以被檢測；(4)由于斷裂點之間距離較近，現(xiàn)有的fish產(chǎn)品不能對pml-rarα融合基因進行分型。因此，急需一種fish檢測方法，其探針不含重復序列、長度適宜，既能保證雜交反應的特異性和最佳的熒光檢測強度，又能最大限度縮短fish檢測時長，提高檢測特異性和檢測效率，同時可區(qū)分pml-rarα融合基因類型。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種特異性強、靈敏度高和檢測效率高的pml-rarα融合基因檢測試劑盒。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種pml-rarα融合基因檢測試劑盒，包括有針對pml基因l型斷裂熱點上游基因序列的第一組探針和針對rarα全基因序列的第二組探針；兩組探針標記有染料，同一組探針的染料顏色相同，不同組探針的染料顏色不同；所述兩組探針為分別以人基因組dna為模板，通過擴增引物得到的擴增產(chǎn)物；針對所述第一組探針的擴增引物為：選自seqidno.1和seqidno.2、seqidno.3和seqidno.4、seqidno.5和seqidno.6、seqidno.7和seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10、seqidno.11和seqidno.12、seqidno.13和seqidno.14、seqidno.15和seqidno.16、seqidno.17和seqidno.18、seqidno.19和seqidno.20、seqidno.21和seqidno.22、seqidno.23和seqidno.24、seqidno.25和seqidno.26、seqidno.27和seqidno.28、seqidno.29和seqidno.30中的至少一對；針對所述第二組探針的擴增引物為：選自seqidno.31和seqidno.32、seqidno.33和seqidno.34、seqidno.35和seqidno.36、seqidno.37和seqidno.38、seqidno.39和seqidno.40、seqidno.41和seqidno.42、seqidno.43和seqidno.44、seqidno.45和seqidno.46、seqidno.47和seqidno.48、seqidno.49和seqidno.50、seqidno.51和seqidno.52、seqidno.53和seqidno.54、seqidno.55和seqidno.56、seqidno.57和seqidno.58、seqidno.59和seqidno.60中的至少一對。在其中一個實施例中，得到的擴增產(chǎn)物的大小為100-500bp。在其中一個實施例中，針對所述第一組探針的擴增引物選自上述引物對中的至少三對，針對所述第二組探針的擴增引物選自上述引物對中的至少三對。在其中一個實施例中，針對所述第一組探針的擴增引物選自上述引物對中的至少六對，針對所述第二組探針的擴增引物選自上述引物對中的至少六對。在其中一個實施例中，所述熒光染料選自：fam、tet、joe、hex、cy3、tamra、rox、texasred、lcred640、cy5、lcred705、alexafluor488和alexafluor750，且針對不同探針組的熒光染料互不相同。本發(fā)明的另一目的，在于提供一種pml-rarα融合基因檢測方法。實現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下。一種pml-rarα融合基因檢測方法，包括以下步驟：(1)待測樣本預處理和制片；(2)使用上述pml-rarα融合基因檢測試劑盒進行雜交檢測；(3)在熒光顯微鏡下觀察熒光信號，對不同熒光信號進行觀察和計數(shù)。在其中一個實施例中，使用上述pml-rarα融合基因檢測試劑盒進行雜交檢測，包括以下步驟：(2.1)探針平衡至室溫；準備好具有雜交區(qū)域的切片樣本；(2.2)預變性：將切片依次置于70％、85％、100％乙醇中脫水；烘干；(2.3)雜交：在切片樣本的雜交區(qū)域加入探針溶液，進行雜交反應；(2.4)洗滌；(2.5)dapi復染。在其中一個實施例中，步驟(2.3)中雜交反應條件為，42±1℃雜交4±0.5h。本發(fā)明的主要優(yōu)點在于：(1)本發(fā)明fish探針的長度是發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，對實驗結(jié)果進行比對和統(tǒng)計分析后得出的最優(yōu)長度，能達到檢測特異性和雜交時長之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時間，使得檢測能在7-8個小時內(nèi)完成，提高了檢測效率。(2)常規(guī)的fish探針標記方法不能實現(xiàn)熒光信號的放大，因此需要較長的探針才能保證檢測的靈敏度，從而導致雜交時間過長。本發(fā)明采用新的探針標記方法，能將探針上的熒光信號進行放大，大大提高檢測靈敏度。本發(fā)明通過信號放大的探針標記方法與探針長度的優(yōu)化，極大縮短了探針與目的基因充分雜交所需時長，提高了檢測靈敏度和檢測效率。(3)由于pml基因s和l型斷裂點之間距離較近，常規(guī)的fish探針不能有效區(qū)分兩種斷裂類型。本發(fā)明通過fish探針的設(shè)計和新型探針標記方法，具有很強的特異性，背景噪音低，大大提高了fish探針的分辨率，實現(xiàn)了s和l型pml-rarα融合基因的分型檢測。附圖說明圖1是本發(fā)明信號計數(shù)指南-典型陽性細胞信號模式；圖2是本發(fā)明信號計數(shù)指南-典型陰性細胞信號模式。具體實施方式為了便于理解本發(fā)明，下面將對本發(fā)明進行更全面的描述。本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內(nèi)容的理解更加透徹全面。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實施例中所用到的各種常用化學試劑，均為市售產(chǎn)品。除非另有定義，本發(fā)明所使用的所有的技術(shù)和科學術(shù)語與屬于本發(fā)明的
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員通常理解的含義相同。本發(fā)明的說明書中所使用的術(shù)語只是為了描述具體的實施例的目的，不用于限制本發(fā)明。本發(fā)明所使用的術(shù)語“和/或”包括一個或多個相關(guān)的所列項目的任意的和所有的組合。實施例1試劑盒組成本實施例所述的pml-rarα融合基因檢測試劑盒，主要包括有：一、熒光染料標記的探針所述探針包括有針對pml基因l型斷裂熱點上游基因序列的第一組探針和針對rarα全基因序列的第二組探針。所述探針以人外周血細胞dna為模板，利用30對特異性引物對進行pcr擴增反應而得到，其制備方法如下：1、擴增引物的設(shè)計位于15q22的pml基因與位于17q21的rarα基因相互易位，形成pml-rarα融合基因。由于pml基因的斷裂點不同，而rarα斷裂點恒定(2號內(nèi)含子)，導致可以產(chǎn)生不同的pml-rarα融合基因異構(gòu)體l型融合基因、s型融合基因和v型融合基因，其中以l型和s型融合基因為主。為了檢測pml-rarα融合基因，同時區(qū)分兩種主要的融合類型，分別設(shè)計了2組擴增引物：針對pml基因l型斷裂熱點上游基因序列的第一組擴增引物和針對rarα全基因序列的第二組擴增引物。所述擴增引物組的擴增區(qū)域分別為pml和rarα基因目標檢測區(qū)域中非重復且高度保守的片段，片段長度大于1000bp，擴增引物相應的擴增產(chǎn)物長度在100-500bp之間，分別構(gòu)成了第一組和第二組探針庫。擴增引物序列信息及其相應的擴增產(chǎn)物見表1(注：1f/1r為一對引物，分別表示正向引物和反向引物；其他以此類推)。表1擴增引物及擴增產(chǎn)物引物序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，合成后的每條序列分別用10mmol/ltrisbuffer配制成100pmol/ml的貯存液，并做好標記。2、探針庫構(gòu)建利用上述設(shè)計的引物對，以人類基因組dna為模板進行pcr擴增，相應的擴增產(chǎn)物分別構(gòu)成了第一組和第二組探針庫。(1)人基因組dna提?。焊鶕?jù)本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)，可參考《分子克隆實驗指導-第三版》(科學出版社)或按照市售人基因組dna提取試劑盒產(chǎn)品說明書進行操作。(2)配置pcr引物工作液：針對第一組探針庫，將相應的擴增引物(1f/1r-15f/15r)分為3個擴增引物組，對pml基因l型斷裂熱點上游基因的3個非重復且高度保守區(qū)域進展擴增：分別取相應的擴增引物(1f/1r-5f/5r、6f/6r-10f/10r、11f/11r-15f/15r)儲存液50ul置于3支1.5ml離心管中，使用10mmol/ltrisbuffer配制成終濃度各為10pmol/ml的3支擴增引物工作液，相應做好標記；針對第二組探針庫，將相應的擴增引物(16f/16r-30f/30r)分為3個擴增引物組，對rarα全基因的3個非重復且高度保守區(qū)域進行擴增：分別取相應的擴增引物(16f/16r-20f/20r、21f/21r-25f/25r、26f/26r-30f/30r)儲存液50ul置于3支1.5ml離心管中，使用10mmol/ltrisbuffer配制成終濃度各為10pmol/ml的3支擴增引物工作液，相應做好標記。(3)配置pcr擴增體系：分別進行上述6個體系的擴增，擴增體系試劑組成如下：試劑每反應(μl)10×緩沖液(含mg2+)510×dntpmix(含biotin-dutp)5taqdna聚合酶2pcr引物工作液10dna(10ng/μl)1滅菌雙蒸水27總體積50(4)pcr擴增：配置好體系后輕輕混合均勻，瞬時離心5-10s，按如下程序進行擴增：95℃5min，95℃30s，58℃30s，72℃30s，從第二步開始30個循環(huán)，72℃5min，4℃保持。(5)產(chǎn)物鑒定和純化：將針對pml基因l型斷裂熱點上游之間基因的3個非重復且高度保守區(qū)域的擴增產(chǎn)物混合均勻，得到第一組探針庫；將針對rarα全基因3個非重復且高度保守區(qū)域的擴增產(chǎn)物混合均勻，得到第二組探針庫。通過2％瓊脂糖凝膠電泳對兩組探針庫進行鑒定，切割大小在100-500bp之間的產(chǎn)物，并對產(chǎn)物進行回收，即得到第一組和第二組探針庫，相應做好標記。3、染料標記探針本實施例優(yōu)選cy3(紅色熒光)標記第一組探針，優(yōu)選alexafluor488(綠色熒光)標記第二組探針。人工合成cy3標記和alexafluor488標記的polya序列，所述polya序列包含1-30個堿基，優(yōu)選的是包含10-20個堿基，更優(yōu)選的是包含2-8個堿基，polya序列末端修飾有鏈霉親和素。將cy3標記和alexafluor488標記的polya序列分別與修飾有生物素的第一組和第二組探針庫混合(每100ug探針庫加入20ul熒光標記的polya序列)，于37℃緩慢搖動孵育30min，得到相應熒光標記的探針。探針經(jīng)純化和沉淀，溶解在te緩沖液中，即獲得紅色標記的第一組探針和綠色標記的第二組探針，將探針于-20℃避光保存。二、試劑盒其他組分1、ssc緩沖貯存液(20×ssc，ph5.3)：氯化鈉88g、檸檬酸鈉44g、超純水400ml，充分溶解混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至5.3，用超純水將溶液定容至500ml，0.45μm濾器過濾。2、乙醇溶液(70％和85％)：無水乙醇700ml/850ml、超純水300ml/150ml，充分混勻。3、洗滌緩沖液ⅰ：20×ssc(ph5.3)35ml、乙基苯基聚乙二醇(np-40)3ml、超純水912ml，充分混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至7.0，用超純水將溶液定容至1000ml，0.45μm濾器過濾。4、洗滌緩沖液ⅱ：20×ssc(ph5.3)100ml、乙基苯基聚乙二醇(np-40)1ml、超純水849ml，充分混勻，室溫下將溶液ph值調(diào)至7.0，用超純水將溶液定容至1000ml，0.45μm濾器過濾。實施例2利用實施例1試劑盒對臨床樣品進行檢測一、樣本預處理1、用肝素鈉抗凝管采集患者外周血1-1.5ml，2000rpm離心5min；2、棄上清，加入5-10ml0.075m的kcl溶液，吹打均勻，37℃低滲處理30min；3、加入1ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，靜置5min；4、2000rpm離心5min，棄上清；5、加入10ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，靜置10min；6、2000rpm離心5min，棄上清；7、加入10ml新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)，吹打均勻，2000rpm離心5min，棄上清；8、重復步驟7兩次，最后加10ul新鮮固定液(甲醇/冰醋酸3:1)重懸細胞；9、將制備好的細胞懸液滴加到玻片上。二、fish檢測fish檢測主要包括預變性、變性、雜交和復染四個步驟，從雜交開始的操作步驟均需要在避光條件下進行：1、準備工作：探針平衡至室溫，渦旋混勻后置于微量離心機中離心2-3s；開啟并預熱雜交儀，將濕條浸入蒸餾水中備用(至少浸泡2h)，雜交時放入雜交儀；使用玻璃刀在切片反面圈出樣本雜交區(qū)域。2、預變性：將玻片在室溫2×ssc液中浸泡2min，隨后將玻片依次置于70％、85％、100％乙醇中脫水各2min。置于烤片機上2-5min烘干。3、雜交(避光操作)：在玻片樣本雜交區(qū)域加入10ul探針溶液(探針濃度15ng/ul，每一標準人份探針量，對應檢測的樣本面積約為20mm×20mm，樣本區(qū)域較大的樣本可根據(jù)實際情況增加用量)，蓋上蓋玻片，確保蓋玻片下無氣泡、探針均勻分布。使用封片膠覆蓋蓋玻片四周位置，形成閉合的密封圈。將切片放入已安裝好濕條的雜交儀中，設(shè)置雜交反應程序：85℃變性8min，42℃雜交4h。4、雜交后洗滌(避光操作)：開啟水浴鍋(76±1℃)，將洗滌緩沖液ⅱ置于水浴鍋預熱。將雜交后的切片從雜交儀中取出，去除封片膠，置于室溫的洗滌緩沖液ⅰ中5min，洗掉蓋玻片，再置于76±1℃的洗滌緩沖液ⅱ中5min，期間可輕輕晃動切片1-3s；重復上述洗滌步驟1次，最后用洗滌沖液ⅰ再重復洗滌一次，每種洗滌緩沖液重復洗滌時的時間與第一次用該緩沖液洗滌時時間相同。洗滌后將切片直立風干。5、dapi復染(避光操作)：在樣本雜交區(qū)域加入10μl復染液，蓋上蓋玻片，室溫避光5-10min后即可顯微鏡下觀察熒光信號。dapi復染后的切片也可置于-25℃至-18℃避光保存(保存時間不超過72h)，需要檢測時將玻片放至室溫后進行觀察。三、結(jié)果判定標準本發(fā)明試劑盒結(jié)果判定標準如下：1、每例樣本計數(shù)100個細胞，若陽性細胞數(shù)小于3個(3/100或＜3％)，該樣本判定為陰性。2、每例樣本計數(shù)100個細胞，若陽性細胞數(shù)大于5個(5/100或＞5％)，該樣本判定為陽性。3、每例樣本計數(shù)100個細胞，若陽性細胞數(shù)介于3-5個(3-5％)，需另一閱片人另外計數(shù)100個細胞。匯總兩位閱片人計數(shù)細胞數(shù)與陽性細胞數(shù)，即總計200個細胞中，若陽性細胞總數(shù)小于8個(＜4％)，該樣本判定為陰性，若陽性細胞總數(shù)大于等于8個(≥4％)，該樣本判定為陽性。細胞的陽性與陰性判定：上下移動顯微鏡視野，查找所有存在于細胞核內(nèi)的信號。1、以下信號模式可判定為pml-rarα融合基因陽性細胞(詳見圖1)：(1)s型融合細胞：間期核中出現(xiàn)的是1個紅色、1綠色和2個紅綠雜交信號(1r1g2f)；(2)l型融合細胞：間期核中出現(xiàn)的是1個紅色、2個綠色和1個紅綠雜交信號(1r2g1f)。2、以下信號模式可判定為pml-rarα融合基因陰性細胞(詳見圖2)：間期核中出現(xiàn)的是2個紅色和2個綠色隨機分散的4個雜交信號(2r2g)。注：附圖中黑色代表紅色的，白色代表綠色點。四、檢測結(jié)果分析利用實施例1試劑盒對15例急性早幼粒細胞白血病患者外周血樣本(編號1-15)進行檢測，同時選用nb4細胞株作為陽性對照、k562細胞株作為陰性對照，本領(lǐng)域技術(shù)人員只要知道細胞株的名稱即可通過購買得到。分別各取約2000個nb4和k562細胞(通過細胞計數(shù)器確定)，混合均勻后將樣本各均分為5份，編號16-20和21-25。具體檢測結(jié)果如表3：表3樣本檢測結(jié)果由上述檢測結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒對pml-rarα融合基因的檢測具有很好的靈敏度和特異性，能實現(xiàn)急性早幼粒細胞白血病患者外周血樣本的檢測和斷裂位點分型，同時所有的nb4細胞均為pml-rarα融合基因陽性，而所有的k562細胞均為pml-rarα融合基因陰性。說明本試劑盒設(shè)計的探針能特異性地與目標基因序列發(fā)生雜交反應，產(chǎn)生的熒光信號強并且穩(wěn)定，保證了檢測結(jié)果的特異性和準確性。實施例3雜交時長對試劑盒檢測效果的影響一、雜交時長本發(fā)明試劑盒探針長度和染料標記方法的設(shè)計是發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，對實驗結(jié)果進行比對和統(tǒng)計分析后得出的最優(yōu)方案，能達到檢測特異性和雜交時長之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時間，提高檢測效率。為驗證雜交時長對本發(fā)明檢測結(jié)果的影響，本實施例設(shè)置了不同雜交時長的4個實驗組，具體見表4，所用檢測探針和試劑與實施例1試劑盒一致。表4雜交時長分組實驗組1實驗組2實驗組3實驗組4雜交時間2h4h8h16h二、樣本檢測采用上述設(shè)計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對急性早幼粒細胞白血病患者外周血樣本26-40進行檢測，其中各實驗組雜交時間與表4雜交時間一致，具體實驗結(jié)果如下：表5雜交時長對檢測結(jié)果的影響對比4個實驗組的檢測結(jié)果可知，本發(fā)明試劑盒設(shè)計的探針在4h內(nèi)即可與樣本目標基因充分雜交，實現(xiàn)樣本的檢測并保證結(jié)果的特異性和準確性。2h的雜交時長由于探針不能與樣本充分雜交，而導致一些陽性細胞漏檢，造成假陰性結(jié)果，且檢測結(jié)果不穩(wěn)定；而8h和16h的雜交時長檢測結(jié)果與4h完全一致，且熒光信號強度基本一致。說明本發(fā)明探針長度和染料標記方式能顯著減短探針與目標基因的雜交時間，提高檢測效果，同時保證檢測的特異性和準確性。實施例4探針長度對試劑盒檢測效果的影響一、探針長度本發(fā)明試劑盒探針長度和染料標記方法的設(shè)計是發(fā)明人經(jīng)過大量實驗，對實驗結(jié)果進行比對和統(tǒng)計分析后得出的最優(yōu)方案，能達到檢測特異性和雜交時長之間的最優(yōu)平衡，既能保證結(jié)果特異性和靈敏度，又能縮短雜交時間，提高檢測效率。為驗證探針長度對本發(fā)明檢測結(jié)果的影響，本實施例設(shè)置了不同探針長度的4個實驗組，具體見表6，4個實驗組擴增區(qū)域位置相同。所用檢測探針制備方法和試劑與實施例1試劑盒一致。表6探針長度分組實驗組5實驗組6實驗組7實驗組8探針長度20-100bp100-500bp500-1000bp＞1000bp二、樣本檢測采用上述設(shè)計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對急性早幼粒細胞白血病患者外周血樣本41-55進行檢測，具體實驗結(jié)果如下：表7探針長度對檢測結(jié)果的影響對比4個實驗組的檢測結(jié)果可知，實驗組6使用100-500bp的探針，在4h內(nèi)即可與樣本目標基因充分雜交，實現(xiàn)樣本的檢測并保證結(jié)果的特異性和準確性。探針長度過短(實驗組5)，會降低檢測特異性，造成較高的背景噪音，同時產(chǎn)生的熒光信號很弱，造成結(jié)果的誤判；探針長度過長(實驗組7和8)會降低細胞對探針的攝取能力，同時延長雜交所需要的時間，導致在4h探針不能與目標基因充分雜交，影響檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定性。實施例5構(gòu)建探針庫引物對種類和數(shù)量對試劑盒檢測效果的影響一、引物對的選擇本發(fā)明試劑盒針對pml-rarα融合基因的檢測和分型設(shè)計了二組探針庫，每組探針庫分別由15對引物擴增得到，擴增區(qū)域分別為pml和rarα基因目標檢測區(qū)域中非重復且高度保守的片段，本發(fā)明針對pml和rarα基因分別優(yōu)選了基因中非重復且高度保守的3個擴增區(qū)域，針對每個區(qū)域設(shè)計了5對特異性基因。為檢測構(gòu)建探針庫所使用的引物對種類和數(shù)量對本發(fā)明檢測結(jié)果的影響，本實施例以第一組探針的構(gòu)建為例，設(shè)置了3個實驗組，具體見表8，所用檢測探針制備方法和試劑與實施例1試劑盒一致，第二組探針使用全部的擴增引物進行建庫。表8引物對的選擇二、樣本檢測采用上述設(shè)計制備的試劑盒，按實施例2所述檢測過程和方法對急性早幼粒細胞白血病患者外周血樣本56-70進行檢測，具體實驗結(jié)果如下：表9構(gòu)建探針庫引物對種類和數(shù)量對檢測結(jié)果的影響比較上述3個實驗組的檢測結(jié)果可知，當目標基因每個擴增區(qū)域選用1對、2對和5對擴增引物，即第一組探針庫使用3對、6對和15對引物進行探針庫構(gòu)建時，均可完成檢測。當使用6對或以上引物對進行建庫時，其特異性和穩(wěn)定性都很好。其中，當使用全部15條的建庫引物對時，信號更強更穩(wěn)定，檢測效果最佳。其他針對第一組和第二組探針庫建庫引物對種類和數(shù)量的選擇實驗結(jié)果上述一致，具體數(shù)據(jù)省略。以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所附權(quán)利要求為準。當前第1頁12