本發(fā)明涉及基因工程動(dòng)物領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，涉及通過(guò)crispr/cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建的ldl受體基因敲除的倉(cāng)鼠。
背景技術(shù)：
：：高膽固醇血癥(hypercholesterolemia)是動(dòng)脈粥樣硬化和心血管疾病最重要的獨(dú)立危險(xiǎn)因子之一，并與諸多遺傳和環(huán)境因素有相互作用。家族型高膽固醇血癥(familialhypercholesterolemia)是原發(fā)性高膽固醇血癥之一，其發(fā)病機(jī)理主要是低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein，ldl)受體的基因突變功能下降或喪失，血漿ldl清除減慢，膽固醇水平升高，導(dǎo)致早發(fā)性心腦血管疾病并常伴有皮膚和肌腱黃色瘤(1,2)。選擇恰當(dāng)?shù)募膊?dòng)物模型是研究人類疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸，藥物篩選及藥理學(xué)研究的必然手段。小鼠因其體積小、繁殖快、費(fèi)用低，更因?yàn)橛卸喾N基因工程模型，因此廣泛用于各種疾病的實(shí)驗(yàn)研究。小鼠對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化不易感，以往基本不用于動(dòng)脈粥樣硬化的研究；直至載脂蛋白e(apolipoproteine，apoe)(3)和低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor,ldl-r)基因敲除小鼠(4)的問(wèn)世，小鼠迅速變成了代謝性心血管病研究領(lǐng)域中最常用的模式動(dòng)物。apoe和ldl-r純合子ko小鼠可以自發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化病變(5)，高脂飼料可加速這種病變的發(fā)生。然而由于小鼠脂代謝與人類差異較大，對(duì)藥物的敏感性不同，一些基于小鼠取得的研究結(jié)果在臨床應(yīng)用上存在一定爭(zhēng)議(6)。此外，小鼠動(dòng)脈粥樣病變多發(fā)于主動(dòng)脈和流出道，極少累及冠脈和腦動(dòng)脈。因此，基于apoeko和ldl-rko小鼠高膽固醇血癥的心腦血管并發(fā)癥的研究，缺乏冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)病因和病生理基礎(chǔ)，不能模擬人類冠心病和中風(fēng)的自然發(fā)病過(guò)程，有明顯局限性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明一方面提供了一種基因工程倉(cāng)鼠，其中該倉(cāng)鼠體內(nèi)的ldl受體基因被敲除。在一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除純合子。在另一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除雜合子。在一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠的血脂水平顯著升高。本發(fā)明另一方面提供了一種制備基因工程倉(cāng)鼠的方法，包括：將該倉(cāng)鼠體內(nèi)的ldl受體基因敲除。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述ldl受體基因通過(guò)crispr/cas9基因編輯技術(shù)被敲除。在一些具體實(shí)施方案中，其中所采用的sgrna序列為倉(cāng)鼠ldl受體基因的互補(bǔ)序列，其靶向ldl受體基因?yàn)榈诙怙@子。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，所采用的crispr-forward和sgrna-reverse序列分別如seqidno:2和3所示。在一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除純合子。在另一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除雜合子。本發(fā)明另一方面提供了一種篩選用于治療人類心血管疾病的藥物的方法，包括以下步驟：a)將候選藥物給予ldl受體基因被敲除的基因工程倉(cāng)鼠，b)測(cè)定給藥之前和給藥之后所述基因工程倉(cāng)鼠體內(nèi)的血脂水平，以及c)如果所述基因工程倉(cāng)鼠體內(nèi)的血脂水平在給藥之后顯著降低，則所述候選藥物被評(píng)定為有效。在一些實(shí)施方案中，所述心血管疾病可以選自由高脂血癥、高膽固醇血癥和動(dòng)脈硬化癥構(gòu)成的組。在一些實(shí)施方案中，所述血脂水平可以為血液膽固醇水平和/或甘油三酯水平。在一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除純合子。在另一些實(shí)施方案中，該倉(cāng)鼠為ldl受體基因敲除雜合子。本發(fā)明另一方面提供了所述基因工程倉(cāng)鼠在篩選藥物中的應(yīng)用，其中所述藥物用于治療人類心血管疾病。在一些實(shí)施方案中，所述心血管疾病選自由高脂血癥、高膽固醇血癥和動(dòng)脈硬化癥構(gòu)成的組。附圖說(shuō)明圖1顯示了ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠的構(gòu)建。(a)引導(dǎo)rna在ldl-r基因第二外顯子上識(shí)別位點(diǎn)示意圖，其中藍(lán)色字體為識(shí)別序列，紅色字體為pam序列。(b)兩只構(gòu)建成功乳鼠的ldl-r基因序列片段，其中藍(lán)色字體為識(shí)別序列，紅色字體為pam序列，綠色字體為點(diǎn)突變序列，虛線部分為缺失序列，突變類型標(biāo)注于每行末端。(c)ldl-r缺失δ194bp倉(cāng)鼠組織經(jīng)pcr擴(kuò)增后的dna凝膠電泳圖，缺失片段dna長(zhǎng)度為394bp。圖2顯示了f1代ldl-r雜合子倉(cāng)鼠血脂明顯升高，血漿中l(wèi)dl膽固醇比例增高。(a)ldl-r基因缺失堿基δ10bp、δ12bp、δ14bp、δ194bp的f1代雜合子及野生型對(duì)照倉(cāng)鼠在普通飲食(before)和高脂飲食(2weeks)喂飼兩周后的血漿總膽固醇(左圖)及甘油三酯(右圖)濃度。(b)缺失δ194雜合子及野生型對(duì)照倉(cāng)鼠在普通飲食(cd)及高脂飲食(hfd)喂飼兩周后的血漿脂蛋白膽固醇分布。以上各組n＝5，與野生型對(duì)照組相比，有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(*為p0.05，**為p<0.01，***為p<0.001)。圖3顯示了ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠血脂與人、小鼠的比較。(a)正常人、ldl-r雜合缺陷及純合缺陷病人，與野生型、ldl-r雜合子及純合子的小鼠、倉(cāng)鼠的血漿膽固醇(左圖)及甘油三酯(右圖)濃度。(b)正常人、ldl-r雜合缺陷及純合缺陷病人，與野生型、ldl-r雜合子及純合子的小鼠、倉(cāng)鼠的血漿脂蛋白膽固醇分布。以上各組中，人類血漿樣品n＝1，小鼠及倉(cāng)鼠血漿樣品n≥5。圖4顯示了依折麥布顯著逆轉(zhuǎn)ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠的高脂血癥。(a)ldl-r基因缺陷δ194bp雜合子倉(cāng)鼠及野生型對(duì)照倉(cāng)鼠，在高脂飲食喂飼同時(shí)給予每日2mg/kg依折麥布或蒸餾水灌胃的0周、1周及2周后血漿膽固醇(左圖)及甘油三酯(右圖)濃度。(b)各組倉(cāng)鼠在兩周內(nèi)的體重變化曲線，紅色箭頭指出禁食12小時(shí)取血的時(shí)間點(diǎn)。ldl-r基因缺陷δ194bp雜合子倉(cāng)鼠及野生型對(duì)照倉(cāng)鼠在高脂飲食喂飼同時(shí)給予每日2mg/kg依折麥布或蒸餾水灌胃兩周后的血漿脂蛋白膽固醇分布。以上各組n＝5，與野生型倉(cāng)鼠蒸餾水灌胃組相比，*為p<0.05，**為p<0.01，***為p<0.001；與ldl-r基因缺陷δ194bp雜合子倉(cāng)鼠蒸餾水灌胃組相比，#為p<0.05，##為p<0.01，###為p<0.001。具體實(shí)施方式本文所用的術(shù)語(yǔ)“倉(cāng)鼠”是指敘利亞金黃地鼠(goldensyrianhamster)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“l(fā)dl”是指低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“l(fā)dl-r”是指低密度脂蛋白受體(lowdensitylipoproteinreceptor)。在本文中，術(shù)語(yǔ)“l(fā)dl-r”、“l(fā)dl受體”和“低密度脂蛋白受體”可以互換使用。本文所用的術(shù)語(yǔ)“ko”是指基因敲除(knock-out)。例如“l(fā)dl-rko”是指低密度脂蛋白受體基因被敲除。本文所用的術(shù)語(yǔ)“sgrna”是指與靶基因序列互補(bǔ)的、引導(dǎo)cas9對(duì)靶基因進(jìn)行切割的rna(singleguiderna)。本文所用的術(shù)語(yǔ)“心血管疾病”泛指由于高脂血癥、血液黏稠、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等所導(dǎo)致的心臟、大腦及全身組織發(fā)生的缺血性或出血性疾病，包括但不限于高脂血癥、高膽固醇血癥和動(dòng)脈硬化癥等。crispr/cas9基因編輯技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。crispr(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)，被稱為規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)，實(shí)際上就是一種基因編輯器，是細(xì)菌用以保護(hù)自身對(duì)抗病毒的一個(gè)系統(tǒng)，也是對(duì)付攻擊者的基因武器。后來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)，它似乎是一種精確的萬(wàn)能基因武器，可以用來(lái)刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標(biāo)基因，是一種可以廣泛使用的生物技術(shù)。crispr簇是一個(gè)廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊dna重復(fù)序列家族，其序列由一個(gè)前導(dǎo)區(qū)(leader)、多個(gè)短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(repeat)和多個(gè)間隔區(qū)(spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于crispr簇上游，是富含at長(zhǎng)度為300～500bp的區(qū)域，被認(rèn)為可能是crispr簇的啟動(dòng)子序列。重復(fù)序列區(qū)長(zhǎng)度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長(zhǎng)度為26～72bp的間隔區(qū)隔開(kāi)。spacer區(qū)域由俘獲的外源dna組成，類似免疫記憶，當(dāng)含有同樣序列的外源dna入侵時(shí)，可被細(xì)菌機(jī)體識(shí)別，并進(jìn)行剪切使之表達(dá)沉默，達(dá)到保護(hù)自身安全的目的。通過(guò)對(duì)crispr簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個(gè)多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與crispr區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為crispr關(guān)聯(lián)基因(crisprassociated)，縮寫(xiě)為cas。目前發(fā)現(xiàn)的cas包括cas1～cas10等多種類型。cas基因與crispr共同進(jìn)化，共同構(gòu)成一個(gè)高度保守的系統(tǒng)。當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源dna入侵時(shí)，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，crispr被轉(zhuǎn)錄為長(zhǎng)的rna前體(prerisprrna，pre-crrna)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crrna，最終識(shí)別并結(jié)合到與其互補(bǔ)的外源dna序列上發(fā)揮剪切作用。目前發(fā)現(xiàn)的crispr/cas系統(tǒng)有三種不同類型即i型、ii型和iii型，它們存在于大約40％已測(cè)序的真細(xì)菌和90％已測(cè)序的古細(xì)菌中。其中ii型的組成較為簡(jiǎn)單，以cas9蛋白以及向?qū)na(grna)為核心組成，也是目前研究中最深入的類型。在ii型系統(tǒng)中pre-crrna的加工由cas家族中的cas9單獨(dú)參與。cas9含有在氨基末端的ruvc和蛋白質(zhì)中部的hnh2個(gè)獨(dú)特的活性位點(diǎn)，在crrna成熟和雙鏈dna剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crrna轉(zhuǎn)錄的同時(shí)，與其重復(fù)序列互補(bǔ)的反式激活crrna(trans-activatingcrrna，tracrrna)也轉(zhuǎn)錄出來(lái)，并且激發(fā)cas9和雙鏈rna特異性rnaseiii核酸酶對(duì)pre-crrna進(jìn)行加工。加工成熟后，crrna、tracrrna和cas9組成復(fù)合體，識(shí)別并結(jié)合于crrna互補(bǔ)的序列，然后解開(kāi)dna雙鏈，形成r-loop，使crrna與互補(bǔ)鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由cas9中的hnh活性位點(diǎn)剪切crrna的互補(bǔ)dna鏈，ruvc活性位點(diǎn)剪切非互補(bǔ)鏈，最終引入dna雙鏈斷裂(dsb)。crispr/cas9的剪切位點(diǎn)位于crrna互補(bǔ)序列下游鄰近的pam區(qū)(protospaceradjacentmotif)的5'-gg-n18-ngg-3'特征區(qū)域中的ngg位點(diǎn)，而這種特征的序列在每128bp的隨機(jī)dna序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。研究結(jié)果表明，cas9還可以剪切線性和超螺旋的質(zhì)粒，其剪切效率堪比限制性內(nèi)切酶。研究概述高膽固醇血癥為心腦血管疾病的重要危險(xiǎn)因素，并與諸多其它遺傳和環(huán)境因素有相互作用。在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究中，用于研究高膽固醇血癥疾病的動(dòng)物模型，主要以低密度脂蛋白受體基因敲除(ldl-rko)、載脂蛋白e基因敲除(apoeko)小鼠為主。但小鼠血脂代謝特點(diǎn)，心腦血管等并發(fā)癥形成的機(jī)制，以及對(duì)藥物的反應(yīng)等方面與人類相差較大，其研究結(jié)果在臨床應(yīng)用方面有眾多爭(zhēng)議。而倉(cāng)鼠(goldensyrianhamster)在糖脂代謝方面，和大鼠與小鼠相比則更接近人類。在前期工作中，我們首創(chuàng)了基因工程倉(cāng)鼠制備方法。在本研究中，我們應(yīng)用crispr/cas9系統(tǒng)結(jié)合獨(dú)創(chuàng)的倉(cāng)鼠基因工程專利技術(shù)，敲除了倉(cāng)鼠ldl-r基因。通過(guò)檢測(cè)ldl-r雜合子和純合子倉(cāng)鼠血脂水平，并與人類ldl-r雜合及純合突變的患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)ldlr缺陷的倉(cāng)鼠模型與人類家族性高膽固醇血癥高度相似，具有明顯的顯性遺傳特征。ldl-r雜合子倉(cāng)鼠膽固醇水平較野生型明顯為高，而在喂飼高脂飼料(0.5％膽固醇，10％脂肪)兩周時(shí)，膽固醇水平便達(dá)到2231mg/dl，是野生型倉(cāng)鼠的5.5倍；給予臨床上常用的降膽固醇藥物依折麥布(2mg/kg)后，血漿膽固醇可降低到喂飼正常飼料的野生型倉(cāng)鼠水平，脂蛋白改變以vldl-c和ldl-c降低為主，hdl-c無(wú)明顯變化。因此，與ldlr和apoe基因敲除的小鼠不同，ldl-r敲除的雜合子倉(cāng)鼠就可以直接用于高脂血癥和動(dòng)脈硬化研究，是和人類ldl受體雜合子基因突變顯性遺傳的家族性高膽固醇血癥高度相似的一個(gè)不可多得的小動(dòng)物模型。實(shí)施例1倉(cāng)鼠(敘利亞金黃地鼠，goldensyrianhamster)是一種小型嚙齒類動(dòng)物，廣泛用于各個(gè)研究領(lǐng)域，包括腫瘤、病毒學(xué)、糖尿病及心血管疾病等(7-10)。在糖脂代謝方面，倉(cāng)鼠具有小鼠大鼠所不具備的、但與人類相似的特征：膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(cholesterylestertransferprotein，cetp)高表達(dá)(11)，只有小腸才有載脂蛋白b的編輯酶活性以及高脂飼料誘發(fā)的復(fù)合型高脂血脂(12,13)。因此，倉(cāng)鼠很有可能成為最理想的高脂血癥小動(dòng)物模型，用于高脂血癥及其并發(fā)癥發(fā)病機(jī)制和藥物療效研究。我們近期在倉(cāng)鼠胚胎操作的技術(shù)上有了重大的突破，成功制備了國(guó)際上第一例基因工程倉(cāng)鼠(14)。在此基礎(chǔ)上，本研究利用crispr/cas9基因編輯技術(shù)(15,16)，構(gòu)建了ldl-r基因敲除的倉(cāng)鼠，并對(duì)其表型與ldl-r基因突變的家族型高膽固醇血癥患者以及l(fā)dl-rko小鼠進(jìn)行了比較分析。實(shí)驗(yàn)方法和材料1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種類及飼養(yǎng)本項(xiàng)目使用的野生型倉(cāng)鼠來(lái)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)公司，按清潔級(jí)標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)。保持溫度24℃，濕度50-60％，光照周期為6：00-20：00光照、20：00-6：00黑暗?；蚯贸齻}(cāng)鼠模型的所有實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程均通過(guò)北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查。2.crispr/cas9系統(tǒng)構(gòu)建2.1倉(cāng)鼠ldl受體基因特異性打靶序列的設(shè)計(jì)倉(cāng)鼠ldl受體基因特異性打靶dna序列的識(shí)別是根據(jù)crispre-cas9打靶的原則，在敘利亞金黃地鼠ldl受體基因的外顯子中，選擇gg(n)18ngg的序列，應(yīng)用用blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)方法，在敘利亞金黃地鼠的全基因組序列中，進(jìn)行特異性驗(yàn)證。若發(fā)現(xiàn)其它基因組序列與該gg(n)18ngg序列的最后12位堿基以及pam序列完全匹配，則認(rèn)為該序列有潛在的脫靶效應(yīng)，即舍棄該打靶序列，重新進(jìn)行設(shè)計(jì)。根據(jù)上述原則，我們采用倉(cāng)鼠ldlr基因中的打靶序列為gaaatgcatcgccagcaag(seqidno:1)。2.2cas9mrna的制備本項(xiàng)目采用的cas9dna模板是含有人源化cas9cdna的pxt7質(zhì)粒(17)。pxt7-cas9具有氨芐青霉素抗性，可用于質(zhì)粒擴(kuò)增；xbai酶切位點(diǎn)，可用于質(zhì)粒線性化。轉(zhuǎn)錄前，pxt7-cas9在xbai的作用下充分線性化。反應(yīng)終止后，蛋白酶k處理0.5小時(shí)，盡可能除去樣品中的rna酶。進(jìn)一步酚-氯仿抽提，乙醇沉淀，得到可用于轉(zhuǎn)錄的dna模板。體外轉(zhuǎn)錄試劑盒為mmessagemmachinet7kit(ambion)。轉(zhuǎn)錄體系于37℃充分反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)所得cas9mrna用酚-氯仿抽提的方法進(jìn)行純化。異丙醇沉淀后，用無(wú)rna酶水溶解，使其濃度為500ng/μl。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得mrna的大小，評(píng)估其降解情況。分裝后，儲(chǔ)存于-80℃，用于注射。2.3sgrna(single-guiderna)的制備sgrna模板通過(guò)下述兩條合成的有互補(bǔ)序列的引物通過(guò)互為模板pcr方式擴(kuò)增得到(18)。分別合成的兩條序列：1)特定的寡核苷酸序列crisprf，該序列包含t7啟動(dòng)子，sgrna序列和部分sgrna骨架部分；2)共同的序列sgrna，即骨架部分。crispr-forward＝gaaattaatacgactcactataggaaatgcatcgccagcaaggttttagagctagaaatagc(seqidno:2)sgrna-reverse＝aaaagcaccgactcggtgccactttttcaagttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagctctaaaac(seqidno:3)pcr于50μl體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為(98℃30s,35cyclesof[98℃10s,60℃30s,72℃15s],72℃10min,4℃∞)。pcr產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，用膠回收試劑盒(takara)回收120bp的dna條帶，即sgrna的模板dna。蛋白酶k處理0.5小時(shí)，盡可能除去樣品中的rna酶。進(jìn)一步，酚仿抽提，乙醇沉淀，得到可用于轉(zhuǎn)錄的dna模板。體外轉(zhuǎn)錄試劑盒為megascriptt7kit(ambion)，轉(zhuǎn)錄體系于37℃充分反應(yīng)4小時(shí)。反應(yīng)所得sgrnamrna用megaclearkit(ambion)進(jìn)行純化。無(wú)rnase水溶解使其濃度為200ng/μl。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所得mrna的大小，評(píng)估其降解情況。分裝后，儲(chǔ)存于-80℃，用于注射。3.基因敲除倉(cāng)鼠構(gòu)建3.1倉(cāng)鼠受精卵的收集和培養(yǎng)選取8-12周齡雌鼠誘導(dǎo)其超數(shù)排卵。倉(cāng)鼠動(dòng)情周期為四天，在周期第二天11:00，即發(fā)情癥狀消失后，腹腔注射20iu孕馬血清促性腺激素(pmsg)。82小時(shí)后，即下一周期的發(fā)情期，與雄鼠合籠進(jìn)行交配。pmsg注射98小時(shí)后，雌鼠腹腔注射過(guò)量的戊巴比妥鈉處死。將其輸卵管剪下，置于37℃預(yù)熱的m2培養(yǎng)基中(sigma-aldrich，st.louis,mo,usa)。在解剖顯微鏡下，將輸卵管膨大的壺腹部撕破，含有受精卵的堆積物流出，收集受精卵。倉(cāng)鼠受精卵的體外培養(yǎng)基是hecm-10(nacl113.8mm,kcl3mm,nahco325mm,sodiumlactate4.5mm,cacl21mm,mgcl22mm,glutamate0.01mm,glutamine0.2mm,glycine0.01mm,histidine0.01mm,lysine0.01mm,proline0.01mm,serine0.01mm,asparagine0.01mm,aspartate0.01mm,cysteine0.01mm,taurine0.5mm,pantothenate0.003mm,pva0.1mg/ml,sigma-aldrich)(19)。用石蠟油將hecm-10培養(yǎng)液滴覆蓋。受精卵培養(yǎng)溫度為37.5℃，co2濃度為10％(14)。3.2顯微注射制備注射液滴，注射皿中，加入一滴100μlm2培養(yǎng)基，礦物油液封。所有的受精卵離開(kāi)孵箱時(shí)間少于15分鐘(20)。sgrna和cas9mrna共同注射至細(xì)胞質(zhì)中，其注射濃度分別為20ng/μl和50ng/μl。注射后受精卵在孵箱中培養(yǎng)0.5小時(shí)后，用于回輸代孕母鼠體內(nèi)。3.3受精卵植入挑選與供卵倉(cāng)鼠年齡相同、動(dòng)情周期一致的雌鼠作為代孕倉(cāng)鼠。代孕鼠、供卵鼠同步，與雄鼠交配。次日，將注射過(guò)的受精卵從輸卵管傘口植入代孕鼠體內(nèi)。每側(cè)輸卵管植入15個(gè)受精卵。3.4基因型分析出生倉(cāng)鼠一周齡后，取其腳趾組織進(jìn)行dna提取鑒定。將突變位點(diǎn)進(jìn)行pcr擴(kuò)增(ldlr-f＝cggcccagatgtcaatat(seqidno:4)，ldlr-r＝gtgaaaccctccaaaccc(seqidno:5))，所得產(chǎn)物測(cè)序鑒定。發(fā)生突變的倉(cāng)鼠，進(jìn)一步序列驗(yàn)證：將其pcr產(chǎn)物連接至peasy-t1載體中(transgenbiotech)，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)后，挑取部分單克隆進(jìn)行測(cè)序。4.高脂飼料喂飼及依折麥布實(shí)驗(yàn)性治療本研究采用的高脂飼料為含0.5％膽固醇，10％豬油的普通嚙齒類飼料。依折麥布的給藥劑量為2mg/kg體重，灌胃給予，對(duì)照組給予三蒸水。分別于高脂前、高脂后兩周，給藥前、給藥后兩周采集血漿。倉(cāng)鼠經(jīng)過(guò)夜禁食12小時(shí)，由腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，經(jīng)眼眶后靜脈采血約1ml，肝素抗凝。5.血漿脂質(zhì)檢測(cè)血漿甘油三酯測(cè)定試劑盒、總膽固醇測(cè)定試劑盒(中生北控生物科技有限公司)用于檢測(cè)血漿甘油三酯、總膽固醇水平。高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)采用聚乙二醇沉淀法去除含apob的脂蛋白后，檢測(cè)其膽固醇水平。血漿脂蛋白中脂質(zhì)組分檢測(cè)，采用美國(guó)amershambiocsciences公司的快速蛋白液相色譜(fastproteinliquidchromatography,fplc)儀，superose6hr10/30色譜柱首先分離血漿脂蛋白組分。血漿200μl通過(guò)0.22μm針筒式過(guò)濾器后上樣，以每分鐘0.5ml的速度自動(dòng)收集分離組分，每個(gè)組分500μl，共35個(gè)組分。對(duì)各個(gè)組分應(yīng)用上述膽固醇檢測(cè)試劑盒檢測(cè)膽固醇含量，做出血漿脂蛋白譜。結(jié)果ldl-r基因突變倉(cāng)鼠的構(gòu)建。我們以ldl-r基因第二外顯子為靶點(diǎn)(圖1a)，設(shè)計(jì)特異性識(shí)別ldl-r基因的引導(dǎo)rna。120個(gè)受精卵經(jīng)細(xì)胞質(zhì)注射后，回輸至代孕4只母鼠體內(nèi)。共出生16只幼崽，經(jīng)pcr后測(cè)序鑒定，其中兩只為ldl-r缺陷倉(cāng)鼠。cas9內(nèi)切酶在特異性位點(diǎn)酶切后，受損dna由末端直接連接或同源重組進(jìn)行修復(fù)，因此產(chǎn)生體內(nèi)有多種不同基因型的ldl-r基因突變嵌合體倉(cāng)鼠(founders，圖1b)。其中，founder1、fouder2分別是含有四種不同基因型、194bp大片段缺失和點(diǎn)突變的嵌合體。圖1c顯示了founder2的f2代基因型鑒定的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。由此建立的ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠均可生育。ldl-r基因缺失導(dǎo)致不同程度的血脂升高。我們對(duì)不同ldl-r基因缺失的founders以及f1代雜合子和f2代純合子倉(cāng)鼠的表型進(jìn)行了分析。本課題所構(gòu)建的founder1、fouder2分別是含有四種不同基因型、194bp大片段缺失和點(diǎn)突變的嵌合體。12周時(shí)，血漿膽固醇水平分別為578mg/dl，429mg/dl，同窩野生型對(duì)照為189mg/dl和161mg/dl。甘油三酯水平達(dá)到422mg/dl和215mg/dl，顯著高于其同窩wt的甘油三酯水平99mg/dl和137mg/dl(圖2a)。founders與wt倉(cāng)鼠交配，產(chǎn)生6種基因型的雜合子ldl-r基因突變倉(cāng)鼠。在普通飼料喂飼下，ldl-r雜合型(+/-)δ194bp(194個(gè)堿基對(duì)缺失)、δ10bp(10個(gè)堿基對(duì)缺失)、δ14bp(14個(gè)堿基對(duì)缺失)平顯著高于野生型(wildtype，wt)。在高脂飼料喂飼兩周后，ldl-r+/-δ194bp和δ10bp膽固醇水平最高達(dá)到2231mg/dl，與高脂前相比升高了7.6倍，是高脂wt的5.5倍。ldl-r+/-δ12bp、和δ14bp膽固醇水平分別達(dá)到881mg/dl、645mg/dl，分別是wt的2.2和1.6倍(圖2b)。不同的ldl-r+/-基因型之間膽固醇水平存在一定差異。圖2b顯示普通飼料時(shí)各個(gè)基因型ldl-r+/-的甘油三酯水平為190mg/dl，與wt沒(méi)有顯著差異。高脂兩周后，ldl-r+/-δ194bp、δ10bp甘油三酯水平最高達(dá)到1040mg/dl，與高脂前相比升高了4.4倍，是高脂wt的4.1倍。與膽固醇變化趨勢(shì)類似，ldl-r+/-δ12bp、和δ14bp高脂飼料后甘油三酯水平分別達(dá)到570mg/dl、310mg/dl，分別是wt的2.28和1.24倍。以下研究主要以基因型為ldl-r+/-δ194bp和δ10bp的倉(cāng)鼠為主進(jìn)行分析。血漿脂蛋白fplc分析的結(jié)果顯示(圖2c)，在普通飼料喂飼下，ldl-r+/-δ194bp倉(cāng)鼠與wt比較，ldl含量顯著增高，而hdl水平?jīng)]有改變。提示倉(cāng)鼠在ldl-r基因缺失一半的情況下就有l(wèi)dl-c升高的表型，這與臨床家族性高膽固醇血癥的顯性遺傳特征類似，即雜合子便有明顯的高膽固醇血癥表型。高脂飼料喂飼兩周后，wt血漿脂質(zhì)中vldl和ldl均有顯著升高，ldl-r+/-血漿脂質(zhì)以vldl、ldl升高為主，hdl水平?jīng)]有明顯變化。ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠血脂與人、小鼠的比較。為了進(jìn)一步確定ldl受體功能缺失，我們對(duì)f2代倉(cāng)鼠野生型、雜合子、純合子血脂情況進(jìn)行檢測(cè)。ldl-r敲除純合子(ldl-r-/-)血漿總膽固醇水平達(dá)到833mg/dl，是其同窩對(duì)照野生型的6.4倍。ldl-r基因敲除雜合子(ldl-r+/-)血漿膽固醇水平達(dá)到237.8mg/dl，約為野生型1.8倍(圖3a)。為了與ldl-r-/-倉(cāng)鼠作比較，我們分別收集了一例家族型高膽固醇血癥雜合子(26歲，男)和純合子患者(8歲，男，服用10mg他汀)血漿。與小鼠ldl-r基因缺陷相比，ldl-r-/-倉(cāng)鼠具有更接近家族性高膽固醇血癥患者的膽固醇水平。與小鼠和人ldl-r缺陷不同，ldl-r-/-倉(cāng)鼠甘油三酯水平達(dá)到350mg/dl，是同窩野生型對(duì)照倉(cāng)鼠的1.7倍(圖3b)。fplc的結(jié)果顯示，與人類不同，小鼠血漿膽固醇主要載體為hdl，有少量的ldl，幾乎沒(méi)有vldl。ldl-r+/-中，脂質(zhì)組分仍以hdl為主，ldl幾乎沒(méi)有改變(21)。僅在純合子ldl-r基因敲除小鼠，ldl水平才有所升高。而野生型倉(cāng)鼠血漿中就有一定含量的ldl，而在ldl-r+/-倉(cāng)鼠中，血漿ldl明顯升高，vldl和hdl沒(méi)有改變。而純合子ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠的vldl與ldl均顯著升高。依折麥布顯著逆轉(zhuǎn)ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠的高脂血癥。和小鼠相比，倉(cāng)鼠在血漿脂質(zhì)和脂蛋白組成與人類更加接近。為了驗(yàn)證臨床上常用的降脂藥物是否對(duì)倉(cāng)鼠同樣具有治療作用，我們檢測(cè)了ldl-r+/-倉(cāng)鼠給予高脂飼料后再給予依折麥布，觀察血漿脂質(zhì)和脂蛋白的改變。圖4a顯示，高脂飼料同時(shí)給予依折麥布2mg/kg灌胃治療兩周后，單純高脂wt和ldl-r+/-倉(cāng)鼠的血漿膽固醇水平為513mg/dl、1864mg/dl，給藥后分別降至111mg/dl和157mg/dl，接近普通飼料的水平。甘油三酯水平也分別由413mg/dl、658mg/dl降至157mg/dl和225mg/dl。依折麥布給藥組的體重與高脂組沒(méi)有顯著差異。在高脂給藥7天和14天時(shí)，由于禁食取血，各個(gè)組的體重有明顯下降，并在第二天恢復(fù)(圖4b)。fplc結(jié)果顯示，依折麥布主要降低血漿中的vldl和ldl，對(duì)hdl的影響不大。討論本研究利用近年來(lái)最新建立基因編輯方法crispr/cas9系統(tǒng)，成功構(gòu)建了ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠。在傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)中，采用同源重組的策略，然而這種方法效率較低，只能在胚胎干細(xì)胞上進(jìn)行操作，限制了其在小鼠之外其他物種上的應(yīng)用。隨著crispr/cas9、talens等高效基因編輯方法的建立完善，基因打靶技術(shù)產(chǎn)生重大變革，其效率大大提高，在受精卵的水平進(jìn)行操作便可高效得到基因修飾的品系，大大擴(kuò)展了基因修飾的物種(22)。與小鼠大鼠相比，倉(cāng)鼠胚胎對(duì)體外操作極為敏感。在前期工作中，我們?cè)趥}(cāng)鼠胚胎操作技術(shù)上有了重大的突破，在國(guó)際上首先報(bào)道了基因工程倉(cāng)鼠的成功制備(14)。倉(cāng)鼠在血漿脂蛋白代謝及免疫反應(yīng)方面具有其他嚙齒類動(dòng)物不具備的特征，而與人類更接近。因此，基因工程倉(cāng)鼠的誕生為人類疾病研究提供了更為理想的動(dòng)物模型。在ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠的構(gòu)建中，由于cas9內(nèi)切酶在識(shí)別特異性位點(diǎn)酶切后，受損dna隨機(jī)由末端直接連接或同源重組進(jìn)行修復(fù)，因此產(chǎn)生ldl-r基因不同程度突變倉(cāng)鼠。我們不僅得到了194bp大片段缺失的ldl-r基因敲除倉(cāng)鼠，而且得到點(diǎn)突變和4氨基酸缺失的ldl-r基因缺陷的動(dòng)物模型。在初步的血脂分析中，不同類型的ldl-r+/-倉(cāng)鼠與野生型相比，膽固醇水平均有不同程度的升高。這與高膽固醇血癥患者ldl-r基因多態(tài)性相似，可以用于不同程度ldl-r基因缺陷病人發(fā)病機(jī)制的研究，并提供不同的臨床治療策略?，F(xiàn)已知的ldl-r基因突變，發(fā)生在渡邊家兔，獼猴，ldl-r敲除小鼠以及人類中的家族型高膽固醇血癥患者中(23,24)。在ldl-r敲除小鼠誕生之前，主要用于高脂血癥和動(dòng)脈粥樣硬化研究的模型為渡邊家兔。與目前最常用的ldl-r敲除小鼠相比，倉(cāng)鼠和家兔具有類人的脂代謝特征：cetp高表達(dá)，對(duì)飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征敏感，只有小腸才有載脂蛋白b的編輯酶活性(25)。與高膽固醇血癥患者相似，渡邊家兔在12月齡時(shí)，血漿膽固醇升至700–1200mg/dl的極高水平，而ldl-r敲除小鼠僅在高脂飲食誘導(dǎo)下，才會(huì)引起血漿膽固醇極度升高。本研究構(gòu)建的ldl-r敲除倉(cāng)鼠純合子在6周時(shí)血漿膽固醇可達(dá)到833mg/dl。與人類高膽固醇血癥患者相似，ldl-r基因突變倉(cāng)鼠亦為顯性遺傳，即ldl-r+/-倉(cāng)鼠具有高脂血癥的表型。這些是ldl-r和apoe基因敲除小鼠所不具備的特征。這意味著，ldl-r敲除雜合子倉(cāng)鼠可以直接用于研究，且代表了臨床上數(shù)量龐大的雜合子家族性高膽固醇血癥的患者(以1/200計(jì)，中國(guó)存在6-7百萬(wàn)患者，全世界則可能有3千多萬(wàn))。由于ldl-r基因突變?yōu)轱@性遺傳，因此ldl-r+/-倉(cāng)鼠在具有高脂血癥表型的同時(shí)，仍有一半的ldl-r的發(fā)揮作用，可以應(yīng)用于新型藥物，如前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶kexin-9型(pcsk9)抑制劑等影響ldl-r功能實(shí)驗(yàn)性研究。此外，通過(guò)選育后，部分嚴(yán)重高膽固醇血癥渡邊家兔可發(fā)生嚴(yán)重的冠脈病變和心肌梗死。但家兔的缺陷在于其致病脂蛋白為β-vldl，不經(jīng)氧化修飾就可被巨噬細(xì)胞大量吞噬；缺乏肝脂酶、apoe和apoaii；而且作為草食動(dòng)物對(duì)膽固醇毒性作用敏感，所以動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制不同于人類。更由于渡邊家兔繁育困難，數(shù)量有限，因此在幾十年中，并沒(méi)有得到在高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化研究領(lǐng)域中的廣泛應(yīng)用。而小鼠動(dòng)脈粥樣病變多發(fā)于主動(dòng)脈、流出道，極少累及冠脈和腦動(dòng)脈?；谛∈蟾吣懝檀佳Y的心腦血管并發(fā)癥的研究，缺乏冠狀動(dòng)脈和腦動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)病因和病生理基礎(chǔ)，不能模擬人類冠心病和中風(fēng)的自然發(fā)病過(guò)程，有明顯局限性。有文獻(xiàn)報(bào)道(26,27)，倉(cāng)鼠在高膽固醇飲食10個(gè)月時(shí)，出現(xiàn)冠脈動(dòng)脈粥樣硬化病變。這提示，倉(cāng)鼠是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化易感的物種。在ldl-r基因敲除的倉(cāng)鼠中，很有可能加速病程的進(jìn)展，加重疾病的發(fā)生，從而導(dǎo)致類似人類冠心病自然發(fā)病過(guò)程。因此，倉(cāng)鼠不僅是很好的高膽固醇血癥小動(dòng)物模型，而且有可能是一個(gè)與人類疾病發(fā)病機(jī)制更為接近的動(dòng)脈粥樣硬化以及冠心病和中風(fēng)的模式動(dòng)物。參考文獻(xiàn)1.hobbshh,brownms,goldsteinjl.moleculargeneticsoftheldlreceptorgeneinfamilialhypercholesterolemia.hummutat.wileysubscriptionservices,inc.,awileycompany；1992；1(6):445–66.2.deferrantisd.familialhypercholesterolemiainchildrenandadolescents:aclinicalperspective.jclinlipidol.2015sep；9(5suppl):s11–9.3.vanreejh,vandenbroekwj,dahlmansve,grootph,vidgeon-hartm,frantsrr,etal.diet-inducedhypercholesterolemiaandatherosclerosisinheterozygousapolipoproteine-deficientmice.atherosclerosis.1994nov；111(1):25–37.4.yokodem,hammerre,ishibashis,brownms,goldsteinjl.diet-inducedhypercholesterolemiainmice:preventionbyoverexpressionofldlreceptors.science.1990nov30；250(4985):1273–5.5.ishibashis,goldsteinjl,brownms,herzj,burnsdk.massivexanthomatosisandatherosclerosisincholesterol-fedlowdensitylipoproteinreceptor-negativemice.jclininvest.1994may；93(5):1885–93.6.spadydk,woollettla,dietschyjm.regulationofplasmaldl-cholesterollevelsbydietarycholesterolandfattyacids.annurevnutr.annualreviews4139elcaminoway,p.o.box10139,paloalto,ca94303-0139,usa；1993；13(1):355–81.7.ebiharah,zivcecm,gardnerd,falzaranod,lacasser,rosenker,etal.asyriangoldenhamstermodelrecapitulatingebolahemorrhagicfever.jinfectdis.2013jan15；207(2):306–18.8.guillaumev,wongkt,looiry,georges-courbotm-c,barrotl,bucklandr,etal.acutehendravirusinfection:analysisofthepathogenesisandpassiveantibodyprotectioninthehamstermodel.virology.2009may10；387(2):459–65.9.vairaktarise,spyridonidous,papakostav,vylliotisa,lazarisa,perread,etal.thehamstermodelofsequentialoraloncogenesis.oraloncol.2008apr；44(4):315–24.10.takahashim,horim,mutohm,wakabayashik,nakagamah.experimentalanimalmodelsofpancreaticcarcinogenesisforpreventionstudiesandtheirrelevancetohumandisease.cancers(basel).2011；3(1):582–602.11.agellonlb,walsha,hayekt,moulinp,jiangxc,shelanskisa,etal.reducedhighdensitylipoproteincholesterolinhumancholesterylestertransferproteintransgenicmice.jbiolchem.1991jun15；266(17):10796–801.12.nakamutam,taniguchis,ishidaby,kobayashik,chanl.phenotypeinteractionofapobec-1andcetp,ldlr,andapoegeneexpressioninmice:roleofapobmrnaeditinginlipoproteinphenotypeexpression.arteriosclerosis,thrombosis,andvascularbiology.1998may；18(5):747–55.13.hiranok,minj,funahashit,davidsonno.cloningandcharacterizationoftheratapobec-1gene:acomparativeanalysisofgenestructureandpromoterusageinratandmouse.jlipidres.1997jun；38(6):1103–19.14.gaom,zhangb,liuj,guox,lih,wangt,etal.generationoftransgenicgoldensyrianhamsters.cellres.2014mar；24(3):380–2.15.congl,ranfa,coxd,lins,barrettor,habibn,etal.multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystems.science.americanassociationfortheadvancementofscience；2013feb15；339(6121):819–23.16.malip,yangl,esveltkm,aachj,guellm,dicarloje,etal.rna-guidedhumangenomeengineeringviacas9.science.americanassociationfortheadvancementofscience；2013feb15；339(6121):823–6.17.changn,sunc,gaol,zhud,xux,zhux,etal.genomeeditingwithrna-guidedcas9nucleaseinzebrafishembryos.cellres.2013apr；23(4):465–72.18.bassettar,tibbitc,pontingcp,liuj-l.highlyefficienttargetedmutagenesisofdrosophilawiththecrispr/cas9system.cellrep.2013jul11；4(1):220–8.19.leest,kimtm,chomy,moonsy,hanjy,limjm.developmentofahamstersuperovulationprogramandadverseeffectsofgonadotropinsonmicrofilamentformationduringoocytedevelopment.fertilsteril.2005apr；83suppl1(4):1264–74.20.fanz,liw,leesr,mengq,shib,bunchtd,etal.efficientgenetargetingingoldensyrianhamstersbythecrispr/cas9system.tangyl,editor.plosone.publiclibraryofscience；2014；9(10):e109755.21.ishibashis,brownms,goldsteinjl,gerardrd,hammerre,herzj.hypercholesterolemiainlowdensitylipoproteinreceptorknockoutmiceanditsreversalbyadenovirus-mediatedgenedelivery.jclininvest.1993aug；92(2):883–93.22.friedlandae,tzu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