本發(fā)明涉及甘草酸生物合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶(ugt)基因，并利用體外酶促反應(yīng)的方法對該基因編碼蛋白進行功能活性分析，涉及到甘草酸生物合成途徑中ugt基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

甘草酸是一種來源于甘草屬(glycyrrhiz)植物的三萜皂苷類天然產(chǎn)物，其具有廣泛的生物活性，包括抗炎、抗過敏以及抗病毒等。目前甘草酸已被開發(fā)成注射液在臨床上用于慢性乙肝和急性肝損傷的治療。據(jù)報道，以甘草酸為主要成分制成的天晴甘美注射劑年銷量可達16億人民幣。同時，由于甘草酸的甜度是蔗糖的150倍，它也作為甜味劑遠銷世界各地，其相關(guān)出口產(chǎn)品年銷量可達4千萬美元，市場需求量大。

植物中甘草酸的生物合成需要其生物合成途徑中的相關(guān)酶進行一系列催化反應(yīng)，目前，甘草酸生物合成途徑中的大多數(shù)酶的基因已被成功克隆，并能利用生物技術(shù)的方法人工合成甘草次酸，但是，催化甘草酸合成的最后一步反應(yīng)的ugt基因仍未能被成功克隆。因此，克隆甘草酸ugt基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)和生產(chǎn)甘草酸具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

(1)本發(fā)明要解決的問題

ugt基因是植物中重要的超家族基因，成員眾多，功能多樣，克隆和表征其功能往往十分困難。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中涉及甘草酸ugt核苷酸及其氨基酸序列。本發(fā)明的目的在于提供甘草酸ugt核苷酸及其氨基酸序列。

(2)技術(shù)方案

為獲得甘草酸ugt核苷酸及其氨基酸序列，我們將克隆得到的甘草(glycyrrhizauralensisfisch)中的ugt核苷酸序列連接于表達載體并在宿主細(xì)胞中表達獲得蛋白，再經(jīng)過體外催化實驗表征其功能，最終實現(xiàn)了本發(fā)明。

本發(fā)明具體如下所述。

[1]一種多核苷酸，為以下的(a)、(b)或(c)所示的多核苷酸：

(a)一種核苷酸，其核苷酸序列由seqidno.1所示的第1-1458位核苷酸組成；

(b)一種多核苷酸，其包含與(a)所述核苷酸序列具有40％或更高百分比同一性的核苷酸序列，并且編碼的蛋白質(zhì)具有甘草酸ugt活性；或

(c)一種多核苷酸，其在嚴(yán)格條件下與(a)反向互補的核苷酸雜交，并且編碼的蛋白質(zhì)具有甘草酸ugt活性。

[2]一種蛋白質(zhì)，為以下的(a)、(b)或(c)所示的蛋白質(zhì)：

(a)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列由seqidno.2所示的氨基酸組成；

(b)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含與(a)所述的氨基酸序列具有32％或更高百分比同一性的氨基酸序列，并且具有甘草酸ugt活性；或

(c)一種蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含(a)所述的氨基酸序列中具有一個或幾個氨基酸的缺失、置換、添加或插入的氨基酸序列，并且具有甘草酸ugt活性。

[3]一種重組載體，其由[1]所述的多核苷酸或編碼[2]所述蛋白質(zhì)的多核苷酸與已知載體重組而成。

[4]一種轉(zhuǎn)化體，其通過將根據(jù)[3]所述的重組載體、[1]所述的多核苷酸或編碼[2]中所述蛋白質(zhì)的多核苷酸導(dǎo)入宿主中制備而成。

[5]在[3]所述的已知載體是已知的細(xì)胞系統(tǒng)載體或已知的無細(xì)胞系統(tǒng)載體。

[6]在[4]所述的宿主是屬于棒狀桿菌屬(corynebacterium)、泛菌屬(pantoea)、腸桿菌屬(enterobacter)或酵母菌屬(saccharomyces)已知的微生物。

[7]一種生產(chǎn)甘草酸的方法，所述方法是通過培養(yǎng)[4]和[6]中任一項所述的轉(zhuǎn)化體來直接生產(chǎn)甘草酸。

[8]含有[1]所述的多核苷酸或編碼[2]所述蛋白質(zhì)的多核苷酸在甘草遺傳育種中的應(yīng)用。

(3)有益效果

在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中涉及甘草酸ugt核苷酸及其氨基酸序列，本發(fā)明提供了甘草酸ugt的多核苷酸序列，它們編碼的蛋白具有甘草酸ugt活性，并可用于調(diào)節(jié)和生產(chǎn)甘草酸。

本發(fā)明所述的“甘草酸ugt”指的是具有催化甘草次酸(cas：471-53-4)生成甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)或甘草酸(cas：1405-86-3)，或是催化甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)生成甘草酸(cas：1405-86-3)的ugt。所述的cas指的是物質(zhì)數(shù)字識別號碼(chemicalabstractsservice)，是每一種自然世界中的化學(xué)物質(zhì)的唯一識別碼。

本發(fā)明所述的百分比同一性是指通過blast(basiclocalalignmentsearchtool)算法來確定的核苷酸或蛋白質(zhì)之間的相似性，核苷酸之間的百分比同一性可通過blastn算法計算確定，蛋白質(zhì)之間的百分比同一性可通過blastp算法計算確定，blastp和blastn的程序可參見網(wǎng)站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)。

附圖說明

圖1是甘草酸ugt催化示意圖；

圖2是以甘草次酸為底物時seqidno.1編碼蛋白催化反應(yīng)產(chǎn)物lc-ms色譜圖(圖中保留時間為5.84min的峰是甘草次酸，保留時間為5.18min的峰是甘草次酸單葡萄糖醛酸，保留時間為4.46min的峰是甘草酸)；

圖3是以甘草次酸單葡萄糖醛酸為底物時seqidno.1編碼蛋白催化反應(yīng)產(chǎn)物lc-ms色譜圖(圖中保留時間為5.18min的峰是甘草次酸單葡萄糖醛酸，保留時間為4.46min的峰是甘草酸)。

具體實施方式

本發(fā)明通過克隆得到的編碼甘草酸ugt的多核苷酸并將其連接到表達載體，再將帶有編碼甘草酸ugt的多核苷酸的重組表達載體分別轉(zhuǎn)入宿主中表達。提取得到的純化蛋白加入到含有不同底物的體外酶促反應(yīng)體系中進行反應(yīng)，催化產(chǎn)物用lc-ms分析。lc-ms結(jié)果證明該多核苷酸編碼的蛋白酶具有甘草酸ugt活性。具體內(nèi)容如下所述。

<編碼甘草酸ugt的多核苷酸>

本發(fā)明提供了編碼甘草酸ugt的多核苷酸。

在一個實施方案中，本發(fā)明的核苷酸是由seqidno.1核苷酸序列中的第1-1458位核苷酸組成，其編碼蛋白的氨基酸序列如seqidno.2所示，并且該蛋白質(zhì)具有甘草酸ugt活性。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是包含與seqidno.1的核苷酸序列具有40％或更高百分比同一性的核苷酸序列的多核苷酸，且該多核苷酸能編碼均具有甘草酸ugt活性的蛋白質(zhì)。該百分比同一性可以是40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是在嚴(yán)格條件下能與seqidno.1反向互補核苷酸序列雜交的多核苷酸，且該多核苷酸能編碼均具有甘草酸ugt活性的蛋白質(zhì)。

“嚴(yán)格條件”是指其中形成所謂的特異性雜交而不形成非特異性雜交的條件。這樣的條件是難以清楚定量的。然而，舉例而言，該條件是其中基本上相同的多核苷酸具有高度同一性的條件，例如，以上所描述的具有百分比同一性的多核苷酸相互雜交，而具有較低同一性的多核苷酸相互不雜交。特別地，該條件可包括在約45℃下在6×scc(氯化鈉/檸檬酸鈉)中雜交，然后在50至65℃下在0.2×scc和0.1％sds中洗滌一次或兩次或多次。

本發(fā)明的多核苷酸可以是dna或rna，且優(yōu)選為dna。本發(fā)明的多核苷酸還可以是編碼本發(fā)明下文的蛋白質(zhì)的多核苷酸。

<甘草酸ugt的蛋白>

本發(fā)明還提供了具有甘草酸ugt活性的蛋白質(zhì)。

在一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如seqidno.2所示，其具有甘草酸ugt活性。

在另一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是包含與seqidno.2的氨基酸序列具有32％或更高百分比同一性的蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)均具有甘草酸ugt活性。該百分比同一性可以是32％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高。

在又一個實施方案中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)是包含在seqidno.2的氨基酸序列中具有一個或數(shù)個氨基酸突變的蛋白質(zhì)，且該蛋白質(zhì)均具有甘草酸ugt活性。氨基酸殘基突變的例子可包括一個或數(shù)個氨基酸殘基的缺失、置換、添加和插入。術(shù)語“一個或數(shù)個”是指對蛋白三維結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)的活性未受實質(zhì)性影響的范圍。

在本發(fā)明的蛋白質(zhì)中，可將突變導(dǎo)入到催化結(jié)構(gòu)域中的位點和除催化結(jié)構(gòu)域之外的位點中，且保持原有活性。能夠保持目的活性的待突變的氨基酸殘基的位置是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。特別地，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠識別結(jié)構(gòu)和功能之間的關(guān)聯(lián)，因為本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠：(1)比較具有相同類型的活性的多個蛋白質(zhì)的氨基酸序列(例如，由seqidno.2代表的氨基酸序列與其他甘草酸ugt的氨基酸序列的比較)，(2)明確相對保守的區(qū)域和非相對保守的區(qū)域，(3)從相對保守的區(qū)域和非相對保守的區(qū)域分別地預(yù)測能夠起重要功能作用的區(qū)域和不能起重要作用的區(qū)域。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠獲得甘草酸ugt的氨基酸序列的待突變的氨基酸殘基的位置。

氨基酸殘基的置換可以是保守置換，也可以是不影響蛋白質(zhì)活性的非保守置換。如本文所用的，術(shù)語“保守置換”指利用具有相似的側(cè)鏈的氨基酸殘基置換某些氨基酸殘基。具有相似側(cè)鏈的氨基酸殘基的家族是本領(lǐng)域中已知的。這樣的家族的例子可包括具有堿性側(cè)鏈的氨基酸(例如，賴氨酸、精氨酸、組氨酸)，具有酸性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不帶電荷的極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非極性側(cè)鏈的氨基酸(例如，甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，在具有β位置具有支鏈的氨基酸(例如，蘇氨酸，纈氨酸、異亮氨酸)，具有芳香族側(cè)鏈的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、組氨酸)，具有含羥基(例如，醇式，酚式)側(cè)鏈的氨基酸(例如，絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸)，和具有含硫側(cè)鏈的氨基酸(例如，半胱氨酸、甲硫氨酸)。優(yōu)選地，氨基酸的保守置換可以是天冬氨酸和谷氨酸之間的置換，精氨酸、賴氨酸和組氨酸之間的置換，色氨酸和苯丙氨酸之間的置換，苯丙氨酸和纈氨酸之間的置換，亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸之間的置換，和甘氨酸和丙氨酸之間的置換。

<重組載體>

本發(fā)明提供了重組載體。本發(fā)明的重組載體由本發(fā)明的多核苷酸或編碼本發(fā)明中蛋白質(zhì)的多核苷酸與已知載體重組而成。所述的已知載體可包括細(xì)胞系統(tǒng)載體(其在宿主細(xì)胞中表達蛋白質(zhì))和無細(xì)胞系統(tǒng)載體(其利用蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng))。已知載體還可以是質(zhì)?；蛘陷d體。已知載體還可以是dna載體或rna載體。

細(xì)胞系統(tǒng)載體的例子包括基于cole質(zhì)粒，代表為pbr322衍生物，具有p15a起始點的基于pacyc質(zhì)粒，基于psc的質(zhì)粒和來源于bac的f因子的小型f質(zhì)粒以及大腸桿菌(escherichiacoli)中類似的表達載體。此外，還可包括具有色氨酸啟動子諸如trc和tac的表達載體、lac啟動子、t7啟動子、t5啟動子、t3啟動子、sp6啟動子、阿拉伯糖誘導(dǎo)型啟動子、冷休克啟動子、四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子和類似物。

無細(xì)胞系統(tǒng)載體的例子可包括具有在細(xì)胞系統(tǒng)載體中示例的t7啟動子或t3啟動子的表達載體和用于在小麥無細(xì)胞系統(tǒng)中合成蛋白質(zhì)的載體，比如基于peu的質(zhì)粒，其具有sp6啟動子或t7啟動子。

在利用無細(xì)胞系統(tǒng)載體的蛋白質(zhì)合成中，首先利用轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)將目的蛋白質(zhì)的cdna轉(zhuǎn)錄而合成mrna。所述轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)可包括常規(guī)地和公開地已知的那些轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，其中通過rna聚合酶轉(zhuǎn)錄cdna。rna聚合酶的例子可包括t7rna聚合酶。

因此，利用無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)翻譯mrna以合成蛋白質(zhì)，該系統(tǒng)為翻譯系統(tǒng)。在該系統(tǒng)中，包含翻譯所需的核糖體、翻譯起始因子、翻譯延伸因子、解離因子和氨酰trna合成酶。這樣的蛋白質(zhì)翻譯系統(tǒng)的例子可包括大腸桿菌提取物、兔網(wǎng)織紅細(xì)胞和小麥胚芽提取物。

并且，還可包括重構(gòu)的無細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)，其由以上翻譯所需的因子組成，其獨立地純化。

利用細(xì)胞系統(tǒng)載體進行的蛋白質(zhì)合成將在下文<轉(zhuǎn)化體>中描述。

可純化利用細(xì)胞系統(tǒng)載體或無細(xì)胞系統(tǒng)載體合成的蛋白質(zhì)。純化方法的例子可包括利用鹽析方法和多種層析方法的方法。當(dāng)設(shè)計表達載體以表達標(biāo)簽序列諸如目的蛋白質(zhì)的c末端或n末端的組氨酸標(biāo)簽，可應(yīng)用利用諸如鎳或鈷的對該標(biāo)簽具有親和力的物質(zhì)利用親和層析方法的純化方法。此外，通過適當(dāng)?shù)募兓椒ㄅc離子交換層析、凝膠過濾層析或類似的方法相組合可提高本發(fā)明的蛋白質(zhì)的純度。

<轉(zhuǎn)化體>

本發(fā)明提供了包含本發(fā)明的表達載體的轉(zhuǎn)化體。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化體是通過將本發(fā)明的表達載體導(dǎo)入到宿主中獲得的一種轉(zhuǎn)化體。用于本發(fā)明的宿主優(yōu)選為細(xì)菌或真菌。

細(xì)菌可以是革蘭氏陽性細(xì)菌或革蘭氏陰性細(xì)菌。

革蘭氏陽性菌可包括屬于以下屬的細(xì)菌：桿菌屬(bacillus)、李斯特菌屬(listeria)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、腸球菌屬(enterococcus)、梭菌屬(clostridium)、棒狀桿菌屬(corynebacterium)和鏈球菌屬(streptomyces)。優(yōu)選的是屬于桿菌屬和棒狀桿菌屬的細(xì)菌。

桿菌屬的細(xì)菌可包括枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、炭疽桿菌(bacillusanthracis)和蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)。枯草芽孢桿菌是更優(yōu)選的。

棒狀桿菌的細(xì)菌可包括谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、有效棒狀桿菌(corynebacteriumefficiens)和帚石南棒狀桿菌(corynebacteriumcallunae)。谷氨酸棒狀桿菌是更優(yōu)選的。

革蘭氏陰性細(xì)菌的例子可包括屬于以下屬的細(xì)菌：大腸桿菌屬(escherichia)、泛菌屬(pantoea)、沙門氏菌屬(salmonella)、弧菌屬(vivrio)、沙雷氏菌屬(serratia)和腸桿菌屬(enterobacter)。屬于大腸桿菌屬和腸桿菌屬的細(xì)菌是優(yōu)選的。

作為屬于大腸桿菌屬的大腸桿菌是優(yōu)選的。

屬于泛菌屬的細(xì)菌的例子可包括菠蘿泛菌(pantoeaananatis)、斯氏泛菌(pantoeastewartii)、成團泛菌(pantoeaagglomerans)和檸檬泛菌(pantoeacitrea)。菠蘿泛菌和檸檬泛菌是優(yōu)選的。歐洲專利申請公開0952221中示例的菌株可用作屬于泛菌屬的細(xì)菌。屬于泛菌屬的細(xì)菌的代表性菌株的例子可包括公開于歐洲專利申請公開0952221中的菠蘿泛菌aj13355菌株(fermbp-6614)和菠蘿泛菌aj13356菌株(fermbp-6615)。

屬于腸桿菌屬的細(xì)菌的例子可包括成團腸桿菌(enterobacteragglomerans)和產(chǎn)氣腸桿菌(enterobacteraerogenes)。產(chǎn)氣腸桿菌是優(yōu)選的。歐洲專利申請公開0952221中示例的細(xì)菌菌株可用作屬于腸桿菌屬的細(xì)菌。屬于腸桿菌屬的細(xì)菌的代表性菌株的例子可包括成團腸桿菌atcc12287菌株、產(chǎn)氣腸桿菌tacc13048菌株、產(chǎn)氣腸桿菌nbrc12010菌株(biotechnol.bioeng.，2007，mar.27；98(2)：340-348)和產(chǎn)氣腸桿菌aj110637(fermbp-10955)。

真菌的例子可包括屬于以下屬的微生物：酵母(saccharomyces)、裂殖酵母(schizosaccharomyces)、耶羅威亞酵母(yarrowia)、木霉(trichoderma)、曲霉(aspergillus)、鐮刀霉(fusarium)和毛霉(mucor)。屬于酵母屬、裂殖酵母屬、亞羅酵母屬或木霉屬的微生物是優(yōu)選的。

屬于酵母屬的微生物的例子可包括卡爾斯伯酵母(saccharomycescarlsbergensis)、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)、分散酵母(saccharomycesdiastaticus)、道格拉氏酵母(saccharomycesdouglasii)、克魯弗酵母(saccharomyceskluyveri)、諾地酵母(saccharomycesnorbensis)和卵形酵母(saccharomycesoviformis)。釀酒酵母是優(yōu)選的。

粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)作為屬于裂殖酵母屬的微生物是優(yōu)選的。

解脂耶羅威亞酵母(yarrowialypolytica)作為屬于耶羅威亞酵母屬的微生物是優(yōu)選的。

屬于木霉屬的微生物的例子可包括哈茨木霉(trichodermaharzianum)、康氏木霉(trichodermakoningii)、長枝木霉(trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉(trichodermareesei)和綠色木霉(trichodermaviride)。里氏木霉是優(yōu)選的。

此外，用于本發(fā)明的宿主不受具體局限，宿主也可以是微生物、昆蟲細(xì)胞、動物細(xì)胞、植物細(xì)胞、昆蟲組織、動物組織、植物組織、昆蟲器官、動物器官、植物器官、昆蟲全體、動物全體、植物全體或類似物。

實施例

以下將以核苷酸序列表中的seqidno.1為代表具體描述本發(fā)明，但本發(fā)明不限于以下實施例。

實施例1：烏拉爾甘草中ugt的克隆

我們通過rna提取試劑盒(日本takara公司)提取甘草(glycyrrhizauralensisfisch)根中總rna，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本takara公司)獲得cdna，依據(jù)ugt基因序列的5’端和3’端設(shè)計帶有酶切位點的引物，用高保真的hstaq酶(日本takara公司)進行pcr擴增，pcr產(chǎn)物進行測序和拼接，可獲得本發(fā)明涉及的甘草酸生物合成相關(guān)的ugt基因的全長核苷酸序列，其由seqidno.1所代表，其全長開放讀碼框(orf)的長度為1458bp，編碼485個氨基酸，詳細(xì)氨基酸序列見序列表中的seqidno.2。

實施例2：重組表達載體的構(gòu)建

我們將實施例1中得到的甘草酸ugt的核苷酸片段(seqidno.1)和表達載體pet-32a(+)同時用限制性內(nèi)切酶(日本takara公司)進行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(日本takara公司)的方法進行純化并回收，回收的產(chǎn)物用dna連接酶在16℃的金屬浴中連接過夜，得到重組質(zhì)粒。重組質(zhì)粒再轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞并涂板于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，陽性克隆再次送測序驗證，測序驗證正確的克隆通過質(zhì)粒純化試劑盒(日本takara公司)的方法可回收得到帶有seqidno.1核苷酸序列的重組表達載體。

實施例3：宿主菌的構(gòu)建

我們將實施例2中得到的重組表達載體按照感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化說明書(日本takara公司)的方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)感受態(tài)細(xì)胞并涂板于含有氨芐青霉素的固體培養(yǎng)基中篩選，陽性克隆再次送測序驗證，測序驗證正確的克隆作為宿主菌，其含有帶有seqidno.1核苷酸序列的重組表達載體。

實施例4：誘導(dǎo)表達與蛋白純化

我們將實施例3中得到的宿主菌的菌液2ml分別加入100ml的lb液體培養(yǎng)基中，在37℃條件下震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期，此時od600值約為0.6至1.0。其中以不含有甘草酸ugt的空載體pet-32a(+)轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21(de3)的宿主菌作為陰性對照。上述4個宿主菌分別加入0.4mm異丙基硫代半乳糖苷(iptg)，18℃，誘導(dǎo)12h以上。5000rpm，4℃離心5min收集菌體，用預(yù)冷的蒸餾水洗滌2次，收集菌體。加入2ml蒸餾水重新懸浮菌體，冰浴中超聲破碎細(xì)菌，條件為：超聲10s，間隔10s，共12次。整個操作在冰浴中進行，并不時搖動菌液防止其過熱，每隔3次拿出來冰浴一次。4℃，13000rpm離心2min，收集上清。上清液通過蛋白純化試劑盒(日本takara公司)的方法純化并獲得帶有甘草酸gut的純化蛋白(圖2)和不帶有甘草酸gut的純化蛋白。

實施例5：蛋白的催化分析

我們將實施例4中得到的2種純化蛋白分別加入到以甘草次酸(cas：471-53-4)和甘草次酸單葡糖糖醛酸(cas：34096-83-8)為底物的體外酶促反應(yīng)體系中進行反應(yīng)，催化反應(yīng)緩沖體系包括50mm的tric-hcl(ph8.0)、1mm的尿苷-5-二磷酸葡萄糖醛酸(udp-glca)、1mm的二硫蘇糖醇(dtt)和200μm底物甘草次酸，催化反應(yīng)溫度為30℃，催化時間在30min上，含有帶有甘草酸gut純化蛋白的催化反應(yīng)體系作為催化組，含有不帶有甘草酸gut純化蛋白的催化反應(yīng)體系作為對照組，催化產(chǎn)物用lc-ms分析。lc-ms儀器為accela600pump高效液相色譜-ltq-orbitrapxl質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國thermoscientific公司)，配有電噴霧離子源(esi)。色譜柱為agilentzorbaxsbc18柱(250mm×4.6mm×5μm)。流動相a為0.1％的甲酸水，b為純甲醇。線性梯度洗脫程序為：0～3.5min，79％b；3.5～8.2min，79％～98％b；8.2～11min，98％～79％b；11～20min，79％b。流速1.0ml/min，柱溫25℃，進樣量10μl。質(zhì)譜esi檢測為負(fù)離子檢測，全離子掃描模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，催化組與對照組相比，均生成了新的峰，通過對比標(biāo)準(zhǔn)品與新峰的保留時間、精確分子離子峰與主要裂解方式，確定以甘草次酸(cas：471-53-4)為底物的催化組(圖2)產(chǎn)生了甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)和甘草酸(cas：1405-86-3)；以甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)為底物的催化組(圖3)產(chǎn)生了甘草酸(cas：1405-86-3)。因此，通過實驗證明，核苷酸(序列如seqidno.1所示)編碼的蛋白(序列如seqidno.2)具有催化甘草次酸(cas：471-53-4)生成甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)或甘草酸(cas：1405-86-3)，或是催化甘草次酸單葡萄糖醛酸(cas：34096-83-8)生成甘草酸(cas：1405-86-3)的活性。

實施例6：突變分析

我們通過點突變試劑盒(日本takara公司)的方法將seqidno.2中的部分氨基酸序列進行敲除實驗，敲除位點分別包括：seqidno.2序列4位點的“n”(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為99％，該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為99％)、seqidno.2序列4至6位點的“nsn”(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為99％，該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為99％)。通過實施例2至5的方法進行實驗證明：本實施例中部分氨基酸序列敲除的蛋白仍具有甘草酸ugt活性。

我們也通過點突變試劑盒(日本takara公司)的方法將seqidno.2中的部分氨基酸序列進行置換實驗，置換位點分別包括：seqidno.2序列124位點的“d”置換成“a”(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為99％，該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為99％)、seqidno.2序列9至11位點的“l(fā)hm”置換成“ead”(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為99％，該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為99％)。通過實施例2至5的方法進行實驗證明：本實施例中部分氨基酸序列置換的蛋白仍具有甘草酸ugt活性。

我們還通過基因融合的方法將帶有麥芽糖結(jié)合蛋白mbp標(biāo)簽的核苷酸序列分別添加在seqidno.1核苷酸序列的5’端，獲得新的核苷酸序列，命名為rhgs1(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為74％)。通過實施例2至4的方法將rhgs1與載體pmal-c4x進行連接并表達獲得新的融合蛋白，命名為rhdb1(此時該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為74％)。通過實施例5的方法進行分析表明：本實施例中部分氨基酸序列添加的蛋白rhdb1仍具有甘草酸ugt活性。

我們還通過基因融合的方法將帶有trx·tag標(biāo)簽蛋白的核苷酸序列插入在seqidno.1核苷酸序列的12至13位點之間獲得的新核苷酸序列，命名為rhgs2(此時該突變體核苷酸序列與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為82％)。通過實施例2至4的方法將rhgs2與載體pmal-c4x進行連接并表達獲得新的融合蛋白，命名為rhdb2(此時該突變體蛋白質(zhì)序列與seqidno.2蛋白質(zhì)序列的百分比同一性為82％).通過實施例5的方法進行分析表明：本實施例中部分氨基酸序列插入的蛋白rhi)b2仍具有甘草酸ugt活性。

同時，我們還人工設(shè)計了seqidno.3核苷酸序列，其與seqidno.1核苷酸序列的百分比同一性為40％，seqidno.3編碼蛋白與seqidno.2氨基酸序列的百分比同一性為32％。通過實施例2至5的方法進行實驗證明：本實施例中seqidno.3編碼的蛋白仍具有甘草酸ugt活性。

實施例7：序列雜交分析

我們將seqidno.3與seqidno.1的反向互補核苷酸在約45℃下在6×scc(氯化鈉/檸檬酸鈉)中進行雜交，然后在50至65℃下在0.2×scc和0.1％sds中洗滌一次或兩次或多次。結(jié)果表明：在該條件下，兩核苷酸成功雜交。同時，在實施例6中已證明了seqidno.3編碼的蛋白具有甘草酸ugt的活性，所以，該結(jié)果證明：如果能與seqidno.1反向互補核苷酸序列雜交，且編碼具有甘草酸ugt活性的蛋白質(zhì)的核苷酸分子也在本發(fā)明保護范圍。

實施例8：產(chǎn)甘草酸的酵母工程菌的構(gòu)建

我們通過實施例1的方法克隆已知的bas基因(genbank注冊號為gu072921.1)、cyp72a154基因(genbank注冊號為ab558153.1)、cyp88d6基因(genbank注冊號為ab433179.1)、atcpr1(genbank注冊號為nm_001203894.1)和ugdh基因(genbank注冊號為aj007702.1)，同時我們還克隆了酵母菌中已知的啟動子(ppgk1、ptef1、pfba1、ptdh3)、終止子(tadh1、tcyc1、ttpi1、ttdh2)和thmgm1基因。隨后，通過基因融合的方法，我們獲得了融合片段rh1(ppgk1-thmg1-tadh1)、rh2(ptdh3-seqidno.1-ttpi1-ptef1-ugdh-tcyc1)和rh3(ppgk1-cyp72a154-tadh1-pfba1-cyp88d6-ttdh2-ptdh3-atcpr1-ttp11-ptef1-bas-tcyc1)。接著，我們運用基因同源重組的方法將獲得的三個融合片段分別導(dǎo)入釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)by4742菌株基因組中的δdna位點、rdna位點和his3位點構(gòu)建工程菌。構(gòu)建的工程菌在酵母膏胨葡萄糖(ypd)瓊脂培養(yǎng)基中7天，培養(yǎng)條件為30℃和250rpm。培養(yǎng)得到的產(chǎn)物用實施例5的方法檢測，結(jié)果證明獲得了8.8mg/l的甘草酸。

實施例9：seqidno.1基因在甘草毛狀根遺傳育種中的應(yīng)用

本實施例以甘草毛狀根的遺傳改良為例描述常規(guī)的甘草遺傳改良方式。依據(jù)seqidno.1基因序列的5’端和3’端設(shè)計帶有酶切位點的引物，分別將seqidno.1基因和載體pbi121進行雙酶切并回收產(chǎn)物，用t4dna連接酶在4℃連接過夜，取1μl連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，菌液進行pcr檢驗，將正確的單克隆菌液進行測序。對測序序列進行分析后，提取正確重組的質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌。轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌在yeb固體培養(yǎng)基中篩選并用pcr驗證。pcr檢驗正確的農(nóng)桿菌用于侵染甘草(glycyrrhizauralensisfisch)毛狀根，侵染后的甘草毛狀根放在新的ms培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)，之后轉(zhuǎn)入1/2ms液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，pcr鑒定成功侵染的毛狀根。結(jié)果表明：與對照組相比，成功轉(zhuǎn)入seqidno.1基因過表達的甘草毛狀根中甘草酸的含量提高了1.9倍。