對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉參考本申請(qǐng)要求2014年12月19日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)62/094,281的權(quán)益，將其全文以引用的方式并入本申請(qǐng)中。本申請(qǐng)?zhí)峁┬路f的大環(huán)肽，其抑制pd-1/pd-l1及cd80/pd-l1蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)相互作用且因此可用于改善多種疾病，包括癌癥及感染性疾病。蛋白質(zhì)程序化死亡1(pd-1)為cd28受體家族中的抑制性成員，而cd28受體家族亦包括cd28、ctla-4、icos及btla。pd-1表達(dá)在活化的b細(xì)胞、t細(xì)胞及骨髓細(xì)胞上(agata等人,同上；okazaki等人,curr.opin.immunol.,14:779-782(2002)；bennett等人,j.immunol.,170:711-718(2003))。pd-1蛋白質(zhì)為55kdai型跨膜蛋白，其為ig基因超家族中的部分(agata等人,int.immunol.,8:765-772(1996))。pd-1含有膜近端免疫受體酪氨酸抑制性基序(itim)及膜遠(yuǎn)端基于酪氨酸的轉(zhuǎn)換基序(itsm)(thomas,m.l.,j.exp.med.,181:1953-1956(1995)；vivier,e.等人,immunol.today,18:286-291(1997))。pd-1雖然在結(jié)構(gòu)上類似于ctla-4，但缺少就cd80cd86(b7-2)結(jié)合而言關(guān)鍵的myppy基序。已鑒別出pd-1的兩種配體即pd-l1(b7-h1)及pd-l2(b7-dc)。已證實(shí)表達(dá)pd-1的t細(xì)胞的活化在與表達(dá)pd-l1或pd-l2的細(xì)胞相互作用時(shí)下調(diào)(freeman等人,j.exp.med.,192:1027-1034(2000)；latchman等人,nat.immunol.,2:261-268(2001)；carter等人,eur.j.immunol.,32:634-643(2002))。pd-l1和pd-l2都為結(jié)合至pd-1但不結(jié)合至其它c(diǎn)d28家族成員的b7蛋白質(zhì)家族成員。pd-l1配體在多種人類癌癥中是富含的(dong等人,nat.med.,8:787-789(2002))。pd-1與pd-l1之間的相互作用使腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞、由t細(xì)胞受體介導(dǎo)的增殖及癌細(xì)胞的免疫逃脫得以減少(dong等人,j.mol.med.,81:281-287(2003)；blank等人,cancerimmunol.immunother.,54:307-314(2005)；konishi等人,clin.cancerres.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通過(guò)抑制pd-1與pd-l1的局部相互作用來(lái)逆轉(zhuǎn)且所述作用當(dāng)pd-1與pd-l2的相互作用亦被阻斷時(shí)為相加性的(iwai等人,proc.natl.acad.sci.usa,99:12293-12297(2002)；brown等人,j.immunol.,170:1257-1266(2003))。亦已證實(shí)pd-l1與cd80相互作用(buttemj等人,immunity；27:111-122(2007))。已證實(shí)表達(dá)免疫細(xì)胞上的pd-l1/cd80相互作用為抑制性相互作用。已證實(shí)阻斷此相互作用可消除此抑制性相互作用(patersonam等人,jimmunol.,187:1097-1105(2011)；yangj等人,jimmunol.aug1；187(3):1113-9(2011))。當(dāng)表達(dá)pd-1的t細(xì)胞接觸表達(dá)其配體的細(xì)胞時(shí)，響應(yīng)于抗原性刺激的功能活性(包括增殖、細(xì)胞因子分泌及細(xì)胞毒性)是降低的。pd-1/pd-l1或pd-l2相互作用在感染或腫瘤消退期間或在自身耐受性發(fā)展期間使免疫應(yīng)答下調(diào)(keir,m.e.等人,annu.rev.immunol.,26:epub(2008))。長(zhǎng)期抗原刺激例如在腫瘤疾病或長(zhǎng)期感染期間發(fā)生的長(zhǎng)期抗原刺激使t細(xì)胞表達(dá)提高水平的pd-1且就針對(duì)長(zhǎng)期抗原的活性而言是功能異常的(綜述在kim等人,curr.opin.imm.(2010)中)。此稱為“t細(xì)胞耗竭”。b細(xì)胞亦呈現(xiàn)pd-1/pd配體抑制及“耗竭”。已證實(shí)使用針對(duì)pd-l1的抗體阻斷pd-1/pd-l1連接可修復(fù)及增強(qiáng)多個(gè)系統(tǒng)中的t細(xì)胞活化。晚期癌癥患者受益于用針對(duì)pd-l1的單克隆抗體實(shí)施的療法(brahmer等人,newengl.j.med.(2012))。腫瘤及長(zhǎng)期感染的臨床前動(dòng)物模型已證實(shí)通過(guò)單克隆抗體阻斷pd-1/pd-l1途徑可增強(qiáng)免疫應(yīng)答且使腫瘤得以抗拒或使感染得以控制。利用pd-1/pd-l1阻斷的抗腫瘤免疫療法可增強(qiáng)對(duì)組織學(xué)上不同的多種腫瘤的治療性免疫應(yīng)答(dong,h.等人,“b7-h1pathwayanditsroleintheevasionoftumorimmunity”,j.mol.med.,81(5):281-287(2003)；dong,h.等人,“tumor-associatedb7-h1promotest-cellapoptosis:apotentialmechanismofimmuneevasion”,nat.med.,8(8):793-800(2002))。干擾pd-1/pd-l1相互作用可在具有長(zhǎng)期感染的系統(tǒng)中增強(qiáng)t細(xì)胞活性。阻斷pd-l1可在具有慢性淋巴細(xì)胞性脈絡(luò)叢腦膜炎病毒感染的小鼠中改善病毒清除率及修復(fù)免疫性(barber,d.l.等人,“restoringfunctioninexhaustedcd8tcellsduringchronicviralinfection”,nature,439(7077):682-687(2006))。感染有hiv-1的人源化小鼠顯示出針對(duì)病毒血癥的保護(hù)作用增強(qiáng)及cd4+t細(xì)胞的病毒排除(palmer等人,j.immunol.(2013))。經(jīng)由針對(duì)pd-l1的單克隆抗體阻斷pd-1/pd-l1可修復(fù)針對(duì)來(lái)自以下患者的t細(xì)胞的體外抗原特異性功能：hiv患者(day,nature(2006)；petrovas,j.exp.med.(2006)；trautman,naturemed.(2006)；d’souza,j.immunol.(2007)；zhang,blood(2007)；kaufmann,natureimm.(2007)；kasu,j.immunol.(2010)；porichis,blood(2011))、hcv患者(golden-mason,j.virol.(2007)；jeung,j.leuk.biol.(2007)；urbani,j.hepatol.(2008)；nakamoto,plospath.(2009)；nakamoto,gastroenterology(2008))及hbv患者(boni,j.virol.(2007)；fisicaro,gastro.(2010)；fisicaro等人,gastroenterology(2012)；boni等人,gastro.(2012)；penna等人,j.hep.(2012)；raziorrough,hepatology(2009)；liang,worldj.gastro.(2010)；zhang,gastro.(2008))。亦已證實(shí)阻斷pd-l1/cd80相互作用可刺激免疫性(yangj.等人,jimmunol.aug1；187(3):1113-9(2011))。已證實(shí)由于阻斷pd-l1/cd80相互作用而引起的免疫刺激可經(jīng)由與進(jìn)一步阻斷pd-1/pd-l1或pd-1/pd-l2相互作用組合來(lái)增強(qiáng)。免疫細(xì)胞表型的變化被假設(shè)為敗血癥性休克中的一個(gè)重要因素(hotchkiss等人,nat.rev.immunol.(2013))。這些變化包括pd-1及pd-l1的水平提高(guignant等人,crit.care(2011))。來(lái)自其中pd-1及pd-l1水平提高的敗血癥性休克患者的細(xì)胞展現(xiàn)出t細(xì)胞凋亡的水平提高。針對(duì)pd-l1的抗體可降低免疫細(xì)胞凋亡的水平(zhang等人,crit.care(2011))。另外，缺乏pd-1表達(dá)的小鼠對(duì)敗血癥性休克癥狀的耐受性比野生型小鼠高(yangj.等人,jimmunol.aug1；187(3):1113-9(2011))。研究已證實(shí)使用抗體阻斷pd-l1相互作用可抑制不適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答且改善疾病跡象。除增強(qiáng)對(duì)長(zhǎng)期抗原的免疫應(yīng)答外，亦已證實(shí)阻斷pd-1/pd-l1途徑可增強(qiáng)對(duì)疫苗接種的響應(yīng)，包括長(zhǎng)期感染背景下的治療性疫苗接種(ha,s.j.等人,“enhancingtherapeuticvaccinationbyblockingpd-1-mediatedinhibitorysignalsduringchronicinfection”,j.exp.med.,205(3):543-555(2008)；finnefrock,a.c.等人,“pd-1blockadeinrhesusmacaques:impactonchronicinfectionandprophylacticvaccination”,j.immunol.,182(2):980-987(2009)；song,m.-y.等人,“enhancementofvaccine-inducedprimaryandmemorycd8+t-cellresponsesbysolublepd-1”,j.immunother.,34(3):297-306(2011))。本申請(qǐng)所述分子在生物化學(xué)和基于細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中均顯示出阻斷pd-l1與pd-1相互作用的能力。這些結(jié)果與用于在癌癥或長(zhǎng)期感染中增強(qiáng)免疫性的治療性給藥潛力(包括治療性疫苗)一致。本申請(qǐng)所述大環(huán)肽能夠抑制pd-l1與pd-1及與cd80的相互作用。這些化合物已顯示出高效結(jié)合至pd-l1，阻斷pd-l1與pd-1或cd80的相互作用且能夠促進(jìn)t細(xì)胞功能活性增強(qiáng)，從而使其成為候選物用于胃腸外、經(jīng)口、經(jīng)肺、經(jīng)鼻、口腔及持續(xù)釋放制劑。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┦?i)的化合物或其藥用鹽：其中a選自鍵、其中表示與羰基的連接點(diǎn)及表示與氮原子的連接點(diǎn)；z為0、1或2；w為1或2；n為0或1；m為1或2；m’為0或1；p為0、1或2；rx選自氫、氨基、羥基及甲基；r14及r15獨(dú)立選自氫及甲基；及rz選自氫及-c(o)nhr16；其中r16選自氫、-chr17c(o)nh2、-chr17c(o)nhchr18c(o)nh2及-chr17c(o)nhchr18c(o)nhch2c(o)nh2；其中r17選自氫及-ch2oh及其中r18選自氫及甲基；rv為氫或天然氨基酸側(cè)鏈；rc、rf、rh、ri及rm為氫；rn為氫或甲基或rv與rn形成吡咯烷環(huán)；ra、re、rj及rk各自獨(dú)立選自氫及甲基；各r20獨(dú)立選自氫及c1-c6烷基；各r21獨(dú)立選自氫及c1-c6烷基；r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12及r13獨(dú)立選自天然氨基酸側(cè)鏈及非天然氨基酸側(cè)鏈或可各自獨(dú)立與相應(yīng)偕位r20基團(tuán)形成三員至六員碳環(huán)或含有氧或氮原子的六員環(huán)，其中該環(huán)任選經(jīng)一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)獨(dú)立選自c1-c3烷氧基、c1-c3烷基、c2-c4烯基、鹵素、羥基及氨基的取代基取代且其中五員及六員環(huán)任選與苯基環(huán)稠合；或r1、r2、r3、r4、r5、r6、r7、r8、r9、r10、r11、r12及r13可各自獨(dú)立與如下所述的相應(yīng)鄰位r基團(tuán)形成環(huán)；re及rk可各自與相應(yīng)鄰位r基團(tuán)及和它們連接的原子形成選自氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪及四氫噻唑的環(huán)；其中各環(huán)任選經(jīng)一至四個(gè)獨(dú)立選自氨基、氰基、甲基、鹵素及羥基的基團(tuán)取代；rb為甲基或rb及r2與和它們連接的原子共同形成選自氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪及四氫噻唑的環(huán)；其中各環(huán)任選經(jīng)一至四個(gè)獨(dú)立選自氨基、氰基、甲基、鹵素及羥基的基團(tuán)取代；或當(dāng)r2及偕位r20均不為氫時(shí)，rb為氫；rd為氫或甲基或rd及r4與和它們連接的原子共同可形成選自氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪及四氫噻唑的環(huán)；其中各環(huán)任選經(jīng)一至四個(gè)獨(dú)立選自氨基、氰基、甲基、鹵素、羥基及苯基的基團(tuán)取代；rg為氫或甲基或rg及r7與和它們連接的原子共同可形成選自氮雜環(huán)丁烷、吡咯烷、嗎啉、哌啶、哌嗪及四氫噻唑的環(huán)；其中各環(huán)任選經(jīng)一至四個(gè)獨(dú)立選自氨基、任選經(jīng)鹵素取代的芐基、芐基氧基、氰基、環(huán)己基、甲基、鹵素、羥基、任選經(jīng)甲氧基取代的異喹啉基氧基、任選經(jīng)鹵素取代的喹啉基氧基及四唑基的基團(tuán)取代；且其中該吡咯烷及哌啶環(huán)任選與環(huán)己基、苯基或吲哚基稠合；及rl為甲基或rl及r12與和它們連接的原子共同形成選自氮雜環(huán)丁烷及吡咯烷的環(huán)，其中各環(huán)任選經(jīng)一至四個(gè)獨(dú)立選自氨基、氰基、甲基、鹵素及羥基的基團(tuán)取代；條件為式(i)的化合物在具有四個(gè)不為氫的取代基且不為經(jīng)α-甲基取代的環(huán)的環(huán)的骨架上含有至少一個(gè)碳。本申請(qǐng)第一個(gè)方面的第一個(gè)實(shí)施方案提供權(quán)利要求1的化合物或其藥用鹽，其中a為在第二個(gè)實(shí)施方案中，z及w各自為1；r14及r15為氫；及rz為-c(o)nhr16；其中r16為-chr17c(o)nh2。在第三個(gè)實(shí)施方案中，r1為任選經(jīng)羥基取代的芐基；r2為甲基或與偕位r20共同形成環(huán)丙基環(huán)；r8為-(ch2)吲哚基；r10選自各自任選經(jīng)-ch2co2h取代的-(ch2)吲哚基及-(ch2)苯并噻吩基；r11為丁基；r12為丁基；ra為氫；re為氫；rj為甲基；rk為甲基；及rl為氫。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰谟写诵枰膫€(gè)體中增強(qiáng)、刺激和/或提高免疫應(yīng)答的方法，該方法包括向該個(gè)體給藥治療有效量的式(i)化合物或其治療上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括在給藥式(i)化合物或其治療上可接受的鹽之前、之后或同時(shí)給藥額外的藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該額外的藥劑為抗微生物劑、抗病毒劑、細(xì)胞毒性劑和/或免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該額外的藥劑為hdac抑制劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該額外的藥劑為tlr7和/或tlr8激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰谟写诵枰膫€(gè)體中抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖或轉(zhuǎn)移的方法，該方法包括向該個(gè)體給藥治療有效量的式(i)化合物或其治療上可接受的鹽。應(yīng)理解該抑制可為直接或間接的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該癌癥選自黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、鱗狀非小細(xì)胞肺癌(nsclc)、非鱗狀nsclc、結(jié)腸直腸癌、去勢(shì)抗性前列腺癌、卵巢癌、胃癌、肝細(xì)胞癌、胰腺癌、頭頸鱗狀細(xì)胞癌、食道癌、胃腸道癌及乳腺癌及血液學(xué)惡性疾病。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰谟写诵枰膫€(gè)體中治療感染性疾病的方法，該方法包括向該個(gè)體給藥治療有效量的式(i)化合物或其治療上可接受的鹽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該感染性疾病由病毒引起。在另一個(gè)實(shí)施方案中，該病毒選自hiv、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、皰疹病毒及流感。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰谟写诵枰膫€(gè)體中治療敗血癥性休克的方法，該方法包括向該個(gè)體給藥治療有效量的一或多種本申請(qǐng)所述大環(huán)肽。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰趥€(gè)體中阻斷pd-l1與pd-1和/或cd80的相互作用的方法，該方法包括向該個(gè)體給藥治療有效量的至少一種本申請(qǐng)所述大環(huán)肽。在其中r側(cè)鏈為經(jīng)甲基取代的環(huán)的部分的式(i)化合物中，應(yīng)理解該甲基可在環(huán)的任何可取代的碳原子(包括作為大環(huán)母體結(jié)構(gòu)的部分的碳)上。在本申請(qǐng)化合物中，至少一個(gè)碳存在于具有四個(gè)不為氫的取代基且不為式(ii)的經(jīng)α-甲基取代的環(huán)的環(huán)的骨架上：其中a為在權(quán)利要求書(shū)中描述的環(huán)且其中表示與大環(huán)結(jié)構(gòu)的其余部分的連接點(diǎn)。在式(i)化合物中，r1側(cè)鏈優(yōu)選為苯丙氨酸、酪氨酸、3-噻吩-2-基、4-甲基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、3-甲氧基苯丙氨酸、異色氨酸、3-甲基苯丙氨酸、1-萘基丙氨酸、3,4-二氟苯丙氨酸、4-氟苯丙氨酸、3,4-二甲氧基苯丙氨酸、3,4-二氯苯丙氨酸、4-二氟甲基苯丙氨酸、2-甲基苯丙氨酸、2-萘基丙氨酸、色氨酸、4-吡啶基、4-溴苯丙氨酸、3-吡啶基、4-三氟甲基苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、4-甲氧基苯丙氨酸、聯(lián)苯丙氨酸及3-氯苯丙氨酸及2,4-二氨基丁烷。在其中r2不為環(huán)的部分的式(i)化合物中，r2側(cè)鏈優(yōu)選為丙氨酸、絲氨酸及甘氨酸。在式(i)化合物中，r3側(cè)鏈優(yōu)選為天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、組氨酸、蘇氨酸、亮氨酸、丙氨酸、2,3-二氨基丙烷及2,4-二氨基丁烷。在其中r4不為環(huán)的部分的式(i)化合物中，r4側(cè)鏈優(yōu)選為纈氨酸、丙氨酸、異亮氨酸及甘氨酸。在式(i)化合物中，r5側(cè)鏈優(yōu)選為氨基甲烷、組氨酸、天冬酰胺、2,3-二氨基丙烷、絲氨酸、甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、蘇氨酸、丙氨酸、賴氨酸、天冬氨酸、丙氨酸及3-噻唑基丙氨酸。在式(i)化合物中，r6側(cè)鏈優(yōu)選為亮氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、絲氨酸、賴氨酸、3-環(huán)己烷、蘇氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2,4-二氨基丁烷、丙氨酸、精氨酸及鳥(niǎo)氨酸(coch3)。在其中r7不為環(huán)的部分的式(i)化合物中，r7側(cè)鏈優(yōu)選為甘氨酸、2,4-二氨基丁烷、絲氨酸、賴氨酸、精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、組氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丙氨酸及2,4-二氨基丁烷(c(o)環(huán)丁烷)。在式(i)化合物中，r8側(cè)鏈優(yōu)選為色氨酸及1,2-苯并異噻唑啉基丙氨酸。在式(i)化合物中，r9側(cè)鏈優(yōu)選為絲氨酸、組氨酸、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、2,4-二丁基胺、蘇氨酸、賴氨酸、甘氨酸、谷氨酸、纈氨酸、2,3-二氨基丙烷、精氨酸、天冬氨酸及酪氨酸。在式(i)化合物中，r10側(cè)鏈優(yōu)選為任選經(jīng)取代的色氨酸、苯并異噻唑基丙氨酸、1-萘基丙氨酸及甲硫氨酸。在式(i)化合物中，r11側(cè)鏈優(yōu)選為正亮氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、甲硫氨酸、乙氧基甲烷、丙氨酸、色氨酸、異亮氨酸、苯基丙烷、谷氨酸、己烷及庚烷。在其中r12不為環(huán)的部分的式(i)化合物中，r12側(cè)鏈優(yōu)選為正亮氨酸、丙氨酸、乙氧基甲烷、甲硫氨酸、絲氨酸、苯丙氨酸、甲氧基乙烷、亮氨酸、色氨酸、異亮氨酸、谷氨酸、己烷、庚烷及甘氨酸。在式(i)化合物中，r13側(cè)鏈優(yōu)選為精氨酸、鳥(niǎo)氨酸、丙氨酸、2,4-二氨基丁烷、2,3-二氨基丙烷、亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、賴氨酸、蘇氨酸、環(huán)丙基甲烷、甘氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸及2-氨基丁烷。本申請(qǐng)已發(fā)現(xiàn)特異性結(jié)合至pd-l1且能夠抑制pd-l1與pd-1及cd80相互作用的肽。這些大環(huán)肽展現(xiàn)出體外免疫調(diào)節(jié)功效，從而使其成為用于治療多種疾病(包括癌癥及感染性疾病)的治療性候選物。術(shù)語(yǔ)“特異性結(jié)合”是指蛋白質(zhì)與結(jié)合分子(例如化合物或配體)之間的相互作用。所述相互作用取決于結(jié)合分子所識(shí)別的蛋白質(zhì)的特定結(jié)構(gòu)(即酶結(jié)合位點(diǎn)、抗原決定簇或表位)的存在。例如，若化合物特異性結(jié)合至蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)“a”，則化合物在含有包含結(jié)合位點(diǎn)a的蛋白質(zhì)及特異性結(jié)合至蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)a的標(biāo)記肽的反應(yīng)混合物中的存在將使結(jié)合至蛋白質(zhì)的標(biāo)記肽的量降低。相反地，化合物非特異性結(jié)合至蛋白質(zhì)不會(huì)使標(biāo)記肽發(fā)生濃度依賴性置換而與蛋白質(zhì)分開(kāi)。本申請(qǐng)意欲包括存在于本申請(qǐng)化合物中的原子的所有同位素。同位素包括原子序數(shù)相同但質(zhì)量數(shù)不同的那些原子。例如但不限于此，氫的同位素包括氘及氚。碳的同位素包括13c及14c。本申請(qǐng)經(jīng)同位素標(biāo)記的化合物通?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)或通過(guò)與本申請(qǐng)所述那些方法類似的方法使用經(jīng)同位素標(biāo)記的適當(dāng)試劑代替在其它情況下使用的未經(jīng)標(biāo)記的試劑來(lái)制備。這些化合物可具有多種潛在用途例如在確定生物活性中作為標(biāo)準(zhǔn)品及試劑。在同位素是穩(wěn)定的情況下，這些化合物可具有有利地修改生物學(xué)、藥理學(xué)或藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的潛力。本申請(qǐng)所述主題的另一個(gè)方面為所述肽作為經(jīng)放射性標(biāo)記的配體在開(kāi)發(fā)配體結(jié)合測(cè)定或監(jiān)測(cè)體內(nèi)吸收、代謝、分布、受體結(jié)合或占領(lǐng)或化合物處置中的用途。例如，本申請(qǐng)所述大環(huán)肽可使用放射性同位素125i制備且所得經(jīng)放射性標(biāo)記的肽可用于開(kāi)發(fā)結(jié)合測(cè)定或代謝研究。可選擇地且出于相同目的，本申請(qǐng)所述大環(huán)肽可通過(guò)催化氚化使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而轉(zhuǎn)化為經(jīng)放射性標(biāo)記的形式。本申請(qǐng)大環(huán)肽亦可通過(guò)添加放射性示蹤劑使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而用作pet成像劑。優(yōu)選的肽包括本申請(qǐng)?zhí)峁┑闹辽僖环N大環(huán)肽且這些肽可包含在藥物組合物及組合中。除非在特定情況下另有限制，否則本申請(qǐng)?zhí)峁┑幌抻诖说亩x適用于本說(shuō)明書(shū)通篇使用的術(shù)語(yǔ)。氨基酸及肽化學(xué)領(lǐng)域技術(shù)人員知道氨基酸包括由以下通式結(jié)構(gòu)表示的化合物：其中r及r’如本申請(qǐng)所述。除非另有說(shuō)明，否則本申請(qǐng)單獨(dú)或作為另一個(gè)基團(tuán)的部分使用的術(shù)語(yǔ)“氨基酸”包括但不限于連接至同一個(gè)碳(稱為“α”碳)的氨基及羧基，其中r和/或r’可為天然或非天然側(cè)鏈，包括氫。“α”碳的絕對(duì)“s”構(gòu)型通常稱為“l(fā)”或“天然”構(gòu)型。在r和r’取代基均為氫的情況下，氨基酸為甘氨酸且不具有手性。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“天然的氨基酸側(cè)鏈”及“天然存在的氨基酸側(cè)鏈”是指任何天然存在的通常呈s構(gòu)型的氨基酸(即l-氨基酸)(即丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸及纈氨酸)的側(cè)鏈。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“非天然的氨基酸側(cè)鏈”及“非天然存在的氨基酸側(cè)鏈”是指任何天然存在的通常呈r構(gòu)型的氨基酸(即d-氨基酸)的側(cè)鏈或是指除天然存在的呈r或s構(gòu)型的氨基酸側(cè)鏈(即分別為d-或l-氨基酸)外的基團(tuán)，其選自：c2-c7烯基、c1-c3烷氧基c1-c3烷基、c1-c6烷氧基羰基c1-c3烷基、c1-c7烷基、c1-c3烷基硫基c1-c3烷基、酰氨基c1-c3烷基、氨基c1-c3烷基、氮雜吲哚基c1-c3烷基、苯并噻唑基c1-c3烷基、苯并噻吩基c1-c3烷基、芐基氧基c1-c3烷基、羧基c1-c3烷基、c3-c14環(huán)烷基c1-c3烷基、聯(lián)苯基甲基、呋喃基c1-c3烷基、咪唑基c1-c3烷基、萘基c1-c3烷基、吡啶基c1-c3烷基、噻唑基c1-c3烷基、噻吩基c1-c3烷基；聯(lián)苯基c1-c3烷基，其中所述聯(lián)苯基任選經(jīng)甲基取代；；雜環(huán)基，其任選經(jīng)一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)獨(dú)立選自c1-c4烷氧基、c1-c4烷基、c1-c3烷基磺?；被?、酰氨基、氨基、氨基c1-c3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、鹵素、鹵代c1-c3烷基、羥基、-nc(nh2)2、硝基及-op(o)(oh)2的基團(tuán)取代；吲哚基c1-c3烷基，其中所述吲哚基部分任選經(jīng)一個(gè)選自c1-c3烷基、羧基c1-c3烷基、鹵素、羥基及苯基的基團(tuán)取代，其中所述苯基進(jìn)一步任選經(jīng)一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)獨(dú)立選自c1-c3烷氧基、c1-c3烷基及鹵素的基團(tuán)取代；nryry’(c1-c7烷基)，其中ry及ry’獨(dú)立選自氫、c2-c4烯基氧基羰基、c1-c3烷基、c1-c3烷基羰基、c3-c14環(huán)烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基；當(dāng)烷基連接基含有多于一個(gè)碳時(shí)，另一個(gè)nryry’基團(tuán)可在鏈上；nrqrt羰基c1-c3烷基，其中rq及rt獨(dú)立選自氫、c1-c3烷基及三苯基甲基；苯基，其任選經(jīng)一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)獨(dú)立選自c1-c4烷氧基、c1-c4烷基、c1-c3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基c1-c3烷基、氨基磺酰基、羧基、氰基、鹵素、鹵代c1-c3烷基、羥基、-nc(nh2)2、硝基及-op(o)(oh)2的基團(tuán)取代；nra’rb’(c1-c7烷基)，其中ra’及rb’獨(dú)立選自氫、c2-c4烯基氧基羰基、c1-c3烷基、c1-c3烷基羰基、c3-c6環(huán)烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基；當(dāng)烷基連接基含有多于一個(gè)碳時(shí)，另一個(gè)nra’rb’基團(tuán)可在鏈上；nrc’rd’羰基c1-c3烷基，其中rc’及rd’獨(dú)立選自氫、c1-c3烷基及三苯基甲基；苯基c1-c3烷基，其中所述苯基部分任選經(jīng)一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或五個(gè)獨(dú)立選自c1-c4烷氧基、c1-c4烷基、c1-c3烷基磺酰基氨基、酰氨基、氨基、氨基c1-c3烷基、氨基磺?；?、羧基、氰基、鹵素、鹵代c1-c3烷基、羥基、-nc(nh2)2、硝基及-op(o)(oh)2的基團(tuán)取代；及苯氧基c1-c3烷基，其中所述苯基任選經(jīng)c1-c3烷基取代。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c2-c4烯基”是指含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的具有兩至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c2-c7烯基”是指含有至少一個(gè)碳碳雙鍵的具有兩至七個(gè)碳原子的直鏈或支鏈基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c2-c4烯基氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的c2-c4烯基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的c1-c3烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c4烷氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的c1-c4烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的c1-c6烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷氧基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的c1-c3烷氧基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷氧基羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的c1-c6烷氧基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷氧基羰基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的c1-c6烷氧基羰基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基”是指衍生自含有一至三個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴的基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c4烷基”是指衍生自含有一至四個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴的基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c6烷基”是指衍生自含有一至六個(gè)碳原子的直鏈或支鏈飽和烴的基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的c1-c3烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基硫基”是指經(jīng)由硫原子連接至母體分子部分的c1-c3烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基硫基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的c1-c3烷基硫基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基磺酰基”是指經(jīng)由磺?；B接至母體分子部分的c1-c3烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c1-c3烷基磺?；被笔侵附?jīng)由氨基連接至母體分子部分的c1-c3烷基磺?；?。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“酰氨基”是指-c(o)nh2。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“酰氨基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的酰氨基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“氨基”是指-nh2。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“氨基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的氨基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“氨基磺酰基”是指經(jīng)由磺?；B接至母體分子部分的氨基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“氮雜吲哚基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子的氮雜吲哚基。氮雜吲哚基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯并噻唑基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子的苯并噻唑基。苯并噻唑基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯并噻吩基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子的苯并噻吩基。苯并噻吩基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“芐基氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的芐基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“芐基氧基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的芐基氧基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“聯(lián)苯基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的聯(lián)苯基團(tuán)。聯(lián)苯基團(tuán)可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“羰基”是指-c(o)-。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“羧基”是指-co2h。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“羧基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的羧基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“氰基”是指-cn。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c3-c14環(huán)烷基”是指具有三至十四個(gè)碳原子及零個(gè)雜原子的飽和單環(huán)狀、雙環(huán)狀或三環(huán)狀烴環(huán)體系。雙環(huán)狀及三環(huán)狀環(huán)可為稠合、螺環(huán)或橋聯(lián)的。環(huán)烷基的代表性實(shí)例包括但不限于環(huán)丙基、環(huán)戊基、雙環(huán)[3.1.1]庚基及金剛烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c3-c14環(huán)烷基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的c3-c14環(huán)烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“c3-c14環(huán)烷基羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的c3-c14環(huán)烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“呋喃基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的呋喃基。呋喃基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“呋喃基羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的呋喃基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“鹵代”及“鹵素”是指f、cl、br或i。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“鹵代c1-c3烷基”是指經(jīng)一、兩或三個(gè)鹵素原子取代的c1-c3烷基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“鹵代甲基”是指經(jīng)一、兩或三個(gè)鹵素原子取代的甲基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”是指含有一、兩或三個(gè)獨(dú)立選自氮、氧及硫的雜原子的五、六或七元環(huán)。五元環(huán)具有零至兩個(gè)雙鍵，而六及七元環(huán)具有零至三個(gè)雙鍵。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”亦包括其中雜環(huán)基環(huán)稠合至四至六元芳族或非芳族碳環(huán)狀環(huán)或另一個(gè)單環(huán)狀雜環(huán)基的雙環(huán)狀基團(tuán)。本申請(qǐng)雜環(huán)基經(jīng)該基團(tuán)中的碳原子連接至母體分子部分。雜環(huán)基的實(shí)例包括但不限于苯并噻吩基、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基、噁唑基、哌嗪基、哌啶基、吡唑基、吡啶基、吡咯烷基、吡咯并吡啶基、吡咯基、噻唑基、噻吩基及硫代嗎啉基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“羥基”是指-oh。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“咪唑基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的咪唑基。咪唑基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“吲哚基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的吲哚基。吲哚基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“萘基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的萘基。萘基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“硝基”是指-no2。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“nra’rb’”是指經(jīng)由氮原子連接至母體分子部分的兩個(gè)基團(tuán)即ra’及rb’。ra’及rb’獨(dú)立選自氫、c2-c4烯基氧基羰基、c1-c3烷基羰基、c3-c14環(huán)烷基羰基、呋喃基羰基及苯基羰基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“nra’rb’(c1-c3)烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的nra’rb’基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“nrc’rd’”是指經(jīng)由氮原子連接至母體分子部分的兩個(gè)基團(tuán)即rc’及rd’。rc’及rd’獨(dú)立選自氫、c1-c3烷基及三苯基甲基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“nrc’rd’羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的nrc’rd’基團(tuán)。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“nrc’rd’羰基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的nrc’rd’羰基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯氧基”是指經(jīng)由氧原子連接至母體分子部分的苯基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯氧基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的苯氧基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的苯基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“苯基羰基”是指經(jīng)由羰基連接至母體分子部分的苯基。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“吡啶基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的吡啶基。吡啶基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“硫基”是指-s-。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“磺酰基”是指-so2-。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“噻唑基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的噻唑基。噻唑基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“噻吩基c1-c3烷基”是指經(jīng)由c1-c3烷基連接至母體分子部分的噻吩基。噻吩基可經(jīng)由該基團(tuán)中的任何可取代的原子連接至烷基部分。術(shù)語(yǔ)“治療”是指：(i)防止易患疾病、病癥和/或病狀但尚未確診患病的患者發(fā)生疾病、病癥或病狀；(ii)抑制疾病、病癥或病狀，即阻止其發(fā)展；及(iii)緩解疾病、病癥或病狀，即促使疾病、病癥和/或病狀和/或與疾病、病癥和/或病狀相關(guān)的癥狀消退。大環(huán)肽與pd-l1的結(jié)合可例如通過(guò)以下方法測(cè)量，所述方法為例如均相時(shí)間分辨熒光(htrf)、表面等離子共振(spr)、等溫滴定量熱法(itc)、核磁共振譜(nmr)等。另外，大環(huán)肽與在細(xì)胞表面上表達(dá)的pd-l1的結(jié)合可如本申請(qǐng)所述在細(xì)胞結(jié)合測(cè)定中測(cè)量。給藥本申請(qǐng)所述治療劑包括但不限于給藥治療有效量的治療劑。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“治療有效量”是指但不限于治療劑用于對(duì)可通過(guò)給藥本申請(qǐng)所述pd-1/pd-l1結(jié)合抑制劑的組合物來(lái)治療的病狀進(jìn)行治療或預(yù)防的量。該量為足以展現(xiàn)出可檢測(cè)的治療或預(yù)防或改善作用的量。該作用可包括例如但不限于治療或預(yù)防本申請(qǐng)所列病狀。針對(duì)個(gè)體的準(zhǔn)確有效量將取決于個(gè)體的身材及健康狀況、所治療的病狀的性質(zhì)及程度、主治醫(yī)師的建議及所選用于給藥的治療劑或治療劑組合。因此，預(yù)先指定確切有效量不是有用的。在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)涉及使用本申請(qǐng)大環(huán)肽在個(gè)體中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。如本申請(qǐng)所示，本申請(qǐng)大環(huán)肽能夠結(jié)合至pd-l1，斷開(kāi)pd-l1與pd-1之間的相互作用，與已知阻斷與pd-1相互作用的抗pd-1單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合pd-l1，增強(qiáng)cmv特異性t細(xì)胞ifnγ分泌及增強(qiáng)hiv特異性t細(xì)胞ifng分泌。因此，本申請(qǐng)大環(huán)肽可用于調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答、治療疾病例如癌癥或感染性疾病、刺激保護(hù)性自身免疫應(yīng)答或刺激抗原特異性免疫應(yīng)答(例如通過(guò)將pd-l1阻斷肽與所關(guān)注的抗原共同給藥)。為了較容易地理解本申請(qǐng)，首先定義某些術(shù)語(yǔ)。其它定義參見(jiàn)詳細(xì)描述。術(shù)語(yǔ)“程序化死亡配體1”、“程序化細(xì)胞死亡配體1”、“蛋白質(zhì)pd-l1”、“pd-l1”、“pdl1”、“pdcdl1”、“hpd-l1”、“hpd-li”、“cd274”及“b7-h1”可互換使用且包括人pd-l1的變異體、同工型、同源物及與pd-l1具有至少一個(gè)共同表位的類似物。完整的pd-l1序列可參見(jiàn)登記號(hào)np_054862。術(shù)語(yǔ)“程序化死亡1”、“程序化細(xì)胞死亡1”、“蛋白質(zhì)pd-1”、“pd-1”、“pd1”、“pdcd1”、“hpd-1”及“hpd-i”可互換使用且包括人pd-1的變異體、同工型、同源物及與pd-1具有至少一個(gè)共同表位的類似物。完整的pd-1序列可參見(jiàn)登記號(hào)u64863。術(shù)語(yǔ)“細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4”、“ctla-4”、“ctla4”、“ctla-4抗原”及“cd152”(參見(jiàn)例如murata,am.j.pathol.,155:453-460(1999))可互換使用且包括人ctla-4的變異體、同工型、同源物及與ctla-4具有至少一個(gè)共同表位的類似物(參見(jiàn)例如balzano,int.j.cancersuppl.,7:28-32(1992))。完整的ctla-4核酸序列可參見(jiàn)登記號(hào)l15006。術(shù)語(yǔ)“免疫應(yīng)答”是指例如淋巴細(xì)胞、抗原呈遞細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及上述細(xì)胞或肝臟所產(chǎn)生的可溶性大分子(包括大環(huán)肽、細(xì)胞因子及補(bǔ)體)的作用，所述作用對(duì)侵入性病原體、感染有病原體的細(xì)胞或組織、癌細(xì)胞或自身免疫或病理性炎癥情況下的正常人體細(xì)胞或組織產(chǎn)生選擇性損傷、破壞或?qū)⑵鋸娜梭w中清除。本申請(qǐng)使用的“不良事件”(ae)為與使用醫(yī)學(xué)處置相關(guān)的任何不利且通常不預(yù)期甚至不合需要的跡象(包括異常實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn))、癥狀或疾病。例如，不良事件可能與免疫系統(tǒng)應(yīng)答于處置而活化或免疫系統(tǒng)細(xì)胞(例如t細(xì)胞)應(yīng)答于處置而擴(kuò)增相關(guān)。醫(yī)學(xué)處置可具有一或多個(gè)相關(guān)ae且各ae可具有相同或不同的嚴(yán)重程度。提及能夠“改變不良事件”的方法意指處置方案降低與使用不同處置方案相關(guān)的一或多個(gè)ae的發(fā)生率和/或嚴(yán)重程度。本申請(qǐng)使用的“過(guò)度增殖性疾病”是指其中細(xì)胞生長(zhǎng)增強(qiáng)而超過(guò)正常水準(zhǔn)的病狀。例如，過(guò)度增殖性疾病或病癥包括惡性疾病(例如食道癌、結(jié)腸癌、膽管癌)及非惡性疾病(例如動(dòng)脈粥樣硬化、良性增生及良性前列腺肥大)。本申請(qǐng)使用的“約”或“基本上包含”意指如本領(lǐng)域技術(shù)人員所確定，特定值在可接受的誤差范圍內(nèi)，其部分地依賴于該值如何測(cè)量或確定即測(cè)量系統(tǒng)的局限性。例如，“約”或“基本上包含”可意指根據(jù)本領(lǐng)域?qū)嵺`，在一個(gè)或超過(guò)一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差內(nèi)?？蛇x擇地，“約”或“基本上包含”可意指至多20％的范圍。另外，尤其就生物系統(tǒng)或方法而言，所述術(shù)語(yǔ)可意指值的至多一個(gè)數(shù)量級(jí)或至多5倍。當(dāng)本申請(qǐng)及權(quán)利要求書(shū)提供特定值時(shí)，除非另有說(shuō)明，否則“約”或“基本上包含”的含義應(yīng)推定在該特定值的可接受的誤差范圍內(nèi)。除非另有說(shuō)明，否則如本申請(qǐng)所述，任何濃度范圍、百分比范圍、比率范圍或整數(shù)范圍應(yīng)理解為包括所述范圍內(nèi)的任何整數(shù)值及(適當(dāng)時(shí))其分?jǐn)?shù)(例如整數(shù)的十分之一及百分之一)。競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定本申請(qǐng)亦涉及能夠以至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％、至少約90％及至少約100％與參考抗pd-l1抗體(mdx-1105)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的大環(huán)肽。這些大環(huán)肽可與本申請(qǐng)所述一或多種大環(huán)肽共有結(jié)構(gòu)同源性(包括突變體、保守性取代、功能性取代及缺失形式，條件為其特異性結(jié)合至pd-l1)。例如，若大環(huán)肽實(shí)質(zhì)上結(jié)合至pd-l1的與參考抗pd-l1抗體相同的區(qū)域，則大環(huán)肽所結(jié)合的pd-l1表位應(yīng)至少與抗pd-l1單克隆抗體所結(jié)合的pd-l1表位重疊。重疊區(qū)范圍可為一個(gè)氨基酸殘基至幾百個(gè)氨基酸殘基。大環(huán)肽然后應(yīng)與抗pd-l1單克隆抗體競(jìng)爭(zhēng)和/或阻斷抗pd-l1單克隆抗體結(jié)合至pd-l1且由此減少抗pd-l1單克隆抗體結(jié)合至pd-l1，在競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定中優(yōu)選使結(jié)合減少至少約50％?？勺鳛閰⒖伎贵w用于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定目的的抗pd-l1抗體在本領(lǐng)域中已知。例如，可使用以下代表性抗pd-l1抗體：mdx-1105(bms)；l01x-c(serono)、l1x3(serono)、msb-0010718c(serono)及pd-l1前驅(qū)抗體(cytomx)及在共同擁有的wo2007/005874中揭示的pd-l1抗體?？勺鳛閰⒖伎贵w用于競(jìng)爭(zhēng)測(cè)定目的的抗pd-1抗體在本領(lǐng)域中已知。例如，可使用以下代表性抗pd-1抗體：尼沃單抗(bms)；17d8、2d3、4h1、4a11、7d3及5f4，其各自揭示于共同擁有的美國(guó)專利8,008,449(bms)中；mk-3475(merck)(其揭示于美國(guó)專利8,168,757中)；及在美國(guó)專利7,488,802中揭示的抗體。藥物組合物在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┙M合物例如藥物組合物，其含有與藥用載體配制在一起的本申請(qǐng)大環(huán)肽之一或其組合。這些組合物可包含本申請(qǐng)大環(huán)肽之一或其組合(例如兩種或更多種不同的本申請(qǐng)大環(huán)肽)或免疫綴合物或雙特異性分子。例如，本申請(qǐng)藥物組合物可包含結(jié)合至目標(biāo)抗原上的不同表位或具有互補(bǔ)活性的大環(huán)肽(或免疫綴合物或雙特異性分子)的組合。本申請(qǐng)藥物組合物亦可按組合療法(即與其它藥劑組合)給藥。例如，組合療法可包括大環(huán)肽與至少一種其它抗炎或免疫抑制劑的組合?？砂唇M合療法使用的治療劑的實(shí)例更詳細(xì)地描述在本申請(qǐng)大環(huán)肽的用途章節(jié)中。本申請(qǐng)使用的“藥用載體”包括生理學(xué)上相容的任何及所有溶劑、分散介質(zhì)、包衣劑、抗細(xì)菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑等。優(yōu)選地，載體適于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、胃腸外、脊髓或表皮給藥(例如通過(guò)注射或輸注)。視給藥途徑而定，活性化合物(即大環(huán)肽、免疫綴合物或雙特異性分子)可用保護(hù)化合物免受酸及可使化合物失活的其它自然條件的作用的材料包衣。本申請(qǐng)藥物化合物可包括一或多種藥用鹽?！八幱名}”或“治療上可接受的鹽”是指保留母體化合物的所需生物活性且不產(chǎn)生任何非所需毒理學(xué)效應(yīng)的鹽(參見(jiàn)例如berge,s.m.等人,j.pharm.sci.,66:1-19(1977))。這些鹽的實(shí)例包括酸加成鹽及堿加成鹽。酸加成鹽包括衍生自以下的那些酸加成鹽：非毒性無(wú)機(jī)酸，例如鹽酸、硝酸、磷酸、硫酸、氫溴酸、氫碘酸、亞磷酸等；及非毒性有機(jī)酸，例如脂族單及二羧酸、經(jīng)苯基取代的烷酸、羥基烷酸、芳族酸、脂族及芳族磺酸等。堿加成鹽包括衍生自以下的那些堿加成鹽：堿土金屬，例如鈉、鉀、鎂、鈣等；及非毒性有機(jī)胺，例如n,n’-二芐基乙二胺、n-甲基萄糖胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、普魯卡因等。本申請(qǐng)藥物組合物亦可包含藥用抗氧化劑。藥用抗氧化劑的實(shí)例包括：(1)水溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸、半胱氨酸鹽酸鹽、硫酸氫鈉、偏亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉等；(2)油溶性抗氧化劑，例如抗壞血酸棕櫚酸酯、丁基化羥基苯甲醚(bha)、丁基化羥基甲苯(bht)、卵磷脂、沒(méi)食子酸丙酯、α-生育酚等；及(3)金屬螯合劑，例如檸檬酸、乙二胺四乙酸(edta)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等?？捎糜诒旧暾?qǐng)藥物組合物的適宜水性及非水性載體的實(shí)例包括水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇、聚乙二醇等)及其適宜混合物；植物油，例如橄欖油；及可注射有機(jī)酯，例如油酸乙酯。適當(dāng)流動(dòng)性可例如通過(guò)使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散液的情況下通過(guò)維持所需粒度及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。這些組合物亦可含有輔料例如防腐劑、濕潤(rùn)劑、乳化劑及分散劑。防止微生物存在可通過(guò)上述滅菌程序及通過(guò)包含各種抗細(xì)菌劑及抗真菌劑(例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等)來(lái)確保。組合物亦可需要包含等張劑例如糖、氯化鈉等。另外，可注射藥物形式可通過(guò)包含延遲吸收劑(例如單硬脂酸鋁及明膠)來(lái)達(dá)成延長(zhǎng)吸收。藥用載體包括無(wú)菌水溶液或分散液及可供臨時(shí)制備無(wú)菌可注射溶液或分散液的無(wú)菌粉末。這些介質(zhì)及試劑用于藥物活性物質(zhì)的用途在本領(lǐng)域中已知。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與活性化合物不相容，否則涵蓋其用于本申請(qǐng)藥物組合物的用途。補(bǔ)充性活性化合物亦可并入組合物中。治療性組合物典型地必須無(wú)菌且在制造及儲(chǔ)存條件下穩(wěn)定。組合物可配制成溶液、微乳液、脂質(zhì)體或適于高藥物濃度的其它有序結(jié)構(gòu)。載體可為溶劑或分散介質(zhì)，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如丙三醇、丙二醇及液體聚乙二醇等)及其適宜混合物。適當(dāng)流動(dòng)性可例如通過(guò)使用包衣材料(例如卵磷脂)、在分散液的情況下通過(guò)維持所需粒度及通過(guò)使用表面活性劑來(lái)維持。在很多情況下，組合物將優(yōu)選包含等張劑例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉?？勺⑸浣M合物可通過(guò)將延遲吸收劑(例如單硬脂酸鹽及明膠)包含于組合物中來(lái)達(dá)成延長(zhǎng)吸收。無(wú)菌可注射溶液可如下制備：根據(jù)需要將所需量的活性化合物并入具有上述成分之一或其組合的適當(dāng)溶劑中，然后進(jìn)行無(wú)菌微過(guò)濾。通常，分散液如下制備：將活性化合物并入含有堿性分散介質(zhì)及選自上述成分的其它所需成分的無(wú)菌媒劑中。就用于制備無(wú)菌可注射溶液的無(wú)菌粉末而言，優(yōu)選的制備方法為真空干燥及冷凍干燥(凍干)，其自活性成分及任何其它所需成分的先前無(wú)菌過(guò)濾溶液產(chǎn)生其粉末?？膳c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量將根據(jù)所治療的個(gè)體及特定給藥模式而變化?？膳c載體物質(zhì)組合以產(chǎn)生單一劑型的活性成分的量通常將為產(chǎn)生療效的組合物的量。通常，以百分之一百計(jì)，此量的范圍將為約0.01％至約99％活性成分，優(yōu)選約0.1％至約70％，最優(yōu)選約1％至約30％活性成分，其與藥用載體組合。調(diào)整給藥方案以提供最佳的所需反應(yīng)(例如治療性反應(yīng))。例如，可給藥單次推注，可隨時(shí)間給藥若干分次劑量或可根據(jù)治療情形的急迫性指示按比例降低或提高劑量。將胃腸外組合物配制成易于給藥及給藥一致性的單位劑型為特別有利的。本申請(qǐng)使用的單位劑型是指適于所治療的個(gè)體的呈單一劑型的物理上離散的單元；每個(gè)單元含有經(jīng)計(jì)算可產(chǎn)生所需療效的預(yù)定量的活性化合物及所需藥物載體。本申請(qǐng)單位劑型的規(guī)模決定且直接依賴于(a)活性化合物的獨(dú)特特性及欲達(dá)成的特定療效及(b)混配此種活性化合物的技術(shù)中對(duì)個(gè)體治療敏感性的固有限制。對(duì)于給藥大環(huán)肽，劑量范圍為每公斤宿主體重約0.0001mg至100mg且更通常為每公斤宿主體重0.01mg至5mg。例如，劑量可為每公斤體重0.3mg、每公斤體重1mg、每公斤體重3mg、每公斤體重5mg或每公斤體重10mg或在每公斤體重1mg至10mg范圍內(nèi)。示例性治療方案需要每日一次、每日兩次、每周二次、每周三次、每周一次，每?jī)芍芤淮巍⒚咳芤淮?、每四周一次、每月一次、?個(gè)月一次或每3個(gè)月至6個(gè)月一次給藥。本申請(qǐng)大環(huán)肽的優(yōu)選給藥方案包括經(jīng)由靜脈內(nèi)給藥每公斤體重1mg或每公斤體重3mg，其中大環(huán)使用以下給藥時(shí)程之一給予：(i)每四周給藥六次，然后每三個(gè)月；(ii)每三周；(iii)每公斤體重3mg一次，然后每三周每公斤體重1mg。在一些方法中，具有不同結(jié)合特異性的兩種或更多種大環(huán)肽同時(shí)給藥，在此情況下各化合物的給藥劑量在指定范圍內(nèi)?；衔锿ǔＴ诙喾N場(chǎng)合下給藥。單次給藥之間的間隔時(shí)間可為例如每周、每月、每三個(gè)月或每年。根據(jù)測(cè)量患者中針對(duì)靶抗原的大環(huán)肽的血液水平所指示，間隔時(shí)間亦可為不規(guī)則的。在一些方法中，調(diào)整劑量以達(dá)成約1-1000μg/ml及在一些方法中約25-300μg/ml的血漿濃度?？蛇x擇地，大環(huán)肽可按持續(xù)釋放型制劑形式給藥，在此情況下需要較小的給藥頻率。給藥劑量及頻率可視治療是預(yù)防性還是治療性而變化。在預(yù)防性應(yīng)用中，相對(duì)較低的劑量在較長(zhǎng)的時(shí)期內(nèi)以相對(duì)不頻繁的間隔時(shí)間給藥。一些患者在其余生持續(xù)接受治療。在治療性應(yīng)用中，有時(shí)需要以相對(duì)較短的間隔時(shí)間給藥相對(duì)較高的劑量直至疾病進(jìn)展降低或終止且優(yōu)選直至患者顯示出疾病癥狀的部分或完全改善。然后可將預(yù)防性方案給予患者。本申請(qǐng)藥物組合物中活性成分的實(shí)際劑量水平可變化以得到針對(duì)特定患者、組合物及給藥模式可有效達(dá)成所需治療反應(yīng)而不會(huì)使患者中毒的活性成分的量。所選劑量水平將視多種藥物動(dòng)力學(xué)因素而定，包括所用本申請(qǐng)?zhí)囟ńM合物或其酯、鹽或酰胺的活性；給藥途徑；給藥時(shí)間；所用特定化合物的排泄速率；治療持續(xù)時(shí)間；與所用特定組合物聯(lián)用的其它藥物、化合物和/或物質(zhì)；所治療的患者的年齡、性別、體重、病狀、一般健康狀況及先前醫(yī)藥史；及醫(yī)藥領(lǐng)域中熟知的類似因素。本申請(qǐng)大環(huán)肽的“治療有效劑量”優(yōu)選使疾病癥狀的嚴(yán)重程度降低，使無(wú)疾病癥狀的時(shí)段的頻率及持續(xù)時(shí)間增加或預(yù)防因罹患疾病所致的損害或失能。例如，對(duì)于治療腫瘤，相對(duì)于未經(jīng)治療的個(gè)體，“治療有效劑量”優(yōu)選使細(xì)胞生長(zhǎng)或腫瘤生長(zhǎng)抑制至少約20％，更優(yōu)選抑制至少約40％，甚至更優(yōu)選抑制至少約60％且仍更優(yōu)選抑制至少約80％?；衔镆种颇[瘤生長(zhǎng)和/或hiv的能力可用預(yù)測(cè)人類腫瘤功效或病毒功效的動(dòng)物模型系統(tǒng)評(píng)估?？蛇x擇地，組合物的此特性可通過(guò)檢查化合物抑制能力例如體外抑制通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的測(cè)定來(lái)評(píng)估。治療有效量的治療性化合物可減小腫瘤尺寸，降低病毒負(fù)荷或以其它方式改善個(gè)體的癥狀。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)例如以下因素來(lái)確定這些量：個(gè)體身材、個(gè)體癥狀的嚴(yán)重程度及所選的特定組合物或給藥途徑。在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┓盅b部分的藥物試劑盒，其包含本申請(qǐng)所述大環(huán)肽及其它免疫調(diào)節(jié)劑。試劑盒亦可進(jìn)一步包含用于治療過(guò)度增殖性疾病(例如本申請(qǐng)所述癌癥)和/或抗病毒疾病的說(shuō)明書(shū)。本申請(qǐng)組合物可經(jīng)由一或多種給藥途徑使用本領(lǐng)域已知的多種方法中的一或多種給藥。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到的那樣，給藥途徑和/或模式將視所需結(jié)果而變化。用于本申請(qǐng)大環(huán)肽的優(yōu)選給藥途徑包括靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、脊髓或其它胃腸外給藥途徑例如注射或輸注。本申請(qǐng)使用的短語(yǔ)“胃腸外給藥”意指除經(jīng)腸及局部給藥外的一般通過(guò)注射的給藥模式且包括但不限于靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、鞘內(nèi)、囊內(nèi)、眶內(nèi)、心內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)氣管、皮下、表皮下、關(guān)節(jié)內(nèi)、囊下、蛛網(wǎng)膜下、脊髓內(nèi)、硬膜外及胸骨內(nèi)注射及輸注?？蛇x擇地，本申請(qǐng)大環(huán)肽可經(jīng)由非胃腸外途徑給藥，例如局部、表皮或粘膜給藥途徑，例如鼻內(nèi)、經(jīng)口、陰道、直腸、舌下或局部?；钚曰衔锟捎檬够衔锊粫?huì)快速釋放的載體制備，例如控制釋放型制劑，包括植入物、經(jīng)皮貼片及微囊化遞送系統(tǒng)?？墒褂蒙锟山到獾纳锵嗳莸木酆衔锢缫蚁?乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原蛋白、聚原酸酯及聚乳酸。用于制備這些制劑的許多方法已獲專利或?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知。參見(jiàn)例如robinson,j.r.編輯,sustainedandcontrolledreleasedrugdeliverysystems,marceldekker,inc.,newyork(1978)。治療性組合物可用本領(lǐng)域已知的醫(yī)藥裝置給藥。例如，在優(yōu)選實(shí)施方案中，本申請(qǐng)治療性組合物可用無(wú)針皮下注射裝置給藥，例如美國(guó)專利5,399,163、5,383,851、5,312,335、5,064,413、4,941,880、4,790,824或4,596,556所揭示的裝置。適用于本申請(qǐng)的已知植入物及模塊的實(shí)例包括：美國(guó)專利4,487,603，其揭示以受控速率分配藥物的可植入微輸注泵；美國(guó)專利4,486,194，其揭示經(jīng)由皮膚給藥藥物的治療裝置；美國(guó)專利4,447,233，其揭示以準(zhǔn)確輸注速率遞送藥物的藥物輸注泵；美國(guó)專利4,447,224，其揭示用于連續(xù)遞送藥物的變流可植入輸注裝置；美國(guó)專利4,439,196，其揭示具有多個(gè)腔室的滲透性藥物遞送系統(tǒng)；及美國(guó)專利4,475,196，其揭示滲透性藥物遞送系統(tǒng)。這些專利以引用的方式并入本申請(qǐng)中。許多其它此類植入物、遞送系統(tǒng)及模塊已為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)大環(huán)肽可經(jīng)配制以確保適當(dāng)?shù)捏w內(nèi)分布。例如，血腦屏障(bbb)排斥許多高度親水性化合物。為了確保本申請(qǐng)治療性化合物通過(guò)bbb(需要時(shí))，其可配制成例如脂質(zhì)體。制備脂質(zhì)體的方法參見(jiàn)例如美國(guó)專利4,522,811、5,374,548及5,399,331。脂質(zhì)體可包含選擇性輸送至特定細(xì)胞或器官內(nèi)從而增強(qiáng)靶向藥物遞送的一或多種部分(參見(jiàn)例如ranade,v.v.,j.clin.pharmacol.,29:685(1989))。示例性靶向部分包括葉酸或生物素(參見(jiàn)例如頒予low等人的美國(guó)專利5,416,016)；甘露糖苷(umezawa等人,biochem.biophys.res.commun.,153:1038(1988))；大環(huán)肽(bloeman,p.g.等人,febslett.,357:140(1995)；owais,m.等人,antimicrob.agentschemother.,39:180(1995))；表面活性劑蛋白質(zhì)a受體(briscoe等人,am.j.physiol.,1233:134(1995))；p120(schreier等人,j.biol.chem.,269:9090(1994))；亦參見(jiàn)keinanen,k.等人,febslett.,346:123(1994)；killion,j.j.等人,immunomethods4:273(1994)。本申請(qǐng)用途及方法本申請(qǐng)大環(huán)肽、組合物及方法具有許多體外及體內(nèi)效用，包括例如檢測(cè)pd-l1或通過(guò)阻斷pd-l1來(lái)增強(qiáng)免疫應(yīng)答。例如，這些分子可體外或離體給藥于培養(yǎng)基中的細(xì)胞或例如體內(nèi)給藥于人類個(gè)體以在多種情形下增強(qiáng)免疫性。因此，在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┱{(diào)節(jié)個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包括向該個(gè)體給藥本申請(qǐng)大環(huán)肽以調(diào)節(jié)該個(gè)體中的免疫應(yīng)答。優(yōu)選增強(qiáng)、刺激或上調(diào)應(yīng)答。在其它方面，所述大環(huán)肽可具有抗食蟹猴、抗小鼠和/或抗土撥鼠結(jié)合及治療活性。本申請(qǐng)使用的術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”意欲包括人類及非人類動(dòng)物。非人類動(dòng)物包括所有脊椎動(dòng)物，例如哺乳動(dòng)物及非哺乳動(dòng)物，例如非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、犬、貓、牛、馬、小雞、土撥鼠、兩棲動(dòng)物及爬行動(dòng)物，但哺乳動(dòng)物是優(yōu)選的，例如非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物、綿羊、犬、貓、牛及馬。優(yōu)選個(gè)體包括需要增強(qiáng)免疫應(yīng)答的人類患者。所述方法尤其適于治療患有可通過(guò)增強(qiáng)t細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答來(lái)治療的病癥的人類患者。在特定實(shí)施方案中，所述方法尤其適于體內(nèi)治療癌細(xì)胞。為了達(dá)成免疫性的抗原特異性增強(qiáng)，所述大環(huán)肽可與所關(guān)注的抗原一起給藥。當(dāng)針對(duì)pd-l1的大環(huán)肽與另一種藥劑一起給藥時(shí)，這兩者可依次或同時(shí)給藥。本申請(qǐng)進(jìn)一步提供檢測(cè)樣品中人類、土撥鼠、食蟹猴和/或小鼠pd-l1抗原的存在或測(cè)量人類、土撥鼠、食蟹猴和/或小鼠pd-l1抗原的量的方法，其包括使樣品及對(duì)照樣品與特異性結(jié)合至人類、土撥鼠、食蟹猴和/或小鼠pd-l1的參考大環(huán)肽在允許所述大環(huán)肽與人類、土撥鼠、食蟹猴和/或小鼠pd-l1形成復(fù)合物的條件下接觸。然后檢測(cè)復(fù)合物的形成，其中與對(duì)照樣品相比，在樣品之間形成復(fù)合物的差異表明在樣品中存在人類、土撥鼠、食蟹猴和/或小鼠pd-l1抗原。若與cd28、icos及ctla-4相比，本申請(qǐng)大環(huán)肽特異性結(jié)合pd-l1，則本申請(qǐng)大環(huán)肽可用于特異性檢測(cè)細(xì)胞表面上的pd-l1表達(dá)且還可經(jīng)由免疫親和性純化用于純化pd-l1。癌癥通過(guò)大環(huán)肽阻斷pd-1可增強(qiáng)患者中針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。pd-1的配體即pd-l1不表達(dá)于正常人類細(xì)胞中，但在多種人類癌癥中為富含的(dong等人,nat.med.,8:787-789(2002))。pd-1與pd-l1之間的相互作用減少了腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞，減少了由t細(xì)胞受體介導(dǎo)的增殖及癌細(xì)胞的免疫逃避(dong等人,j.mol.med.,81:281-287(2003)；blank等人,cancerimmunol.immunother.,54:307-314(2005)；konishi等人,clin.cancerres.,10:5094-5100(2004))。免疫抑制可通過(guò)抑制pd-1與pd-l1的局部相互作用來(lái)逆轉(zhuǎn)且所述作用當(dāng)pd-1與pd-l2的相互作用亦被阻斷時(shí)為相加性的(iwai等人,proc.natl.acad.sci.,99:12293-12297(2002)；brown等人,j.immunol.,170:1257-1266(2003))。雖然先前研究已證實(shí)通過(guò)抑制pd-1與pd-l1的相互作用可修復(fù)t細(xì)胞增殖，但阻斷pd-1/pd-l1相互作用對(duì)癌癥腫瘤生長(zhǎng)的體內(nèi)直接作用尚無(wú)報(bào)道。在一個(gè)方面，本申請(qǐng)涉及使用大環(huán)肽體內(nèi)治療個(gè)體從而抑制癌癥腫瘤生長(zhǎng)。大環(huán)肽可單獨(dú)使用以抑制癌癥腫瘤生長(zhǎng)?？蛇x擇地，大環(huán)肽可如下所述與其它免疫原性藥劑、標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法或其它大環(huán)肽聯(lián)用。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┰趥€(gè)體中抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，其包括向所述個(gè)體給藥治療有效量的大環(huán)肽。可使用本申請(qǐng)大環(huán)肽抑制生長(zhǎng)的優(yōu)選癌癥包括對(duì)免疫療法典型地有應(yīng)答的癌癥。所治療的優(yōu)選癌癥的非限制性實(shí)例包括黑色素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤)、腎細(xì)胞癌(例如透明細(xì)胞癌)、前列腺癌(例如激素難治性前列腺癌及去勢(shì)抗性前列腺癌)、乳腺癌、結(jié)腸直腸癌及肺癌(例如鱗狀及非鱗狀非小細(xì)胞肺癌)。另外，本申請(qǐng)包括可使用本申請(qǐng)大環(huán)肽抑制生長(zhǎng)的難治性或復(fù)發(fā)性惡性疾病。可使用本申請(qǐng)方法治療的其它癌癥的實(shí)例包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、直腸癌、肛區(qū)癌癥、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、兒童期實(shí)體腫瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)贅生物、原發(fā)性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌癥、鱗狀細(xì)胞癌、t細(xì)胞淋巴瘤、由環(huán)境誘發(fā)的癌癥(包括由石棉誘發(fā)的那些癌癥)及所述癌癥的組合。本申請(qǐng)亦適用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥尤其是表達(dá)pd-l1的轉(zhuǎn)移性癌癥(iwai等人,int.immunol.,17:133-144(2005))。針對(duì)pd-l1的大環(huán)肽可任選與免疫原性藥劑組合，例如癌細(xì)胞、經(jīng)純化的腫瘤抗原(包括重組蛋白質(zhì)、肽及碳水化合物分子)、細(xì)胞及經(jīng)編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(he等人,j.immunol.,173:4919-4928(2004))?？墒褂玫哪[瘤疫苗的非限制性實(shí)例包括黑色素瘤抗原的肽例如gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶的肽或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達(dá)細(xì)胞因子gm-csf的腫瘤細(xì)胞(下文進(jìn)一步論述)。在人類中已證實(shí)一些腫瘤例如黑色素瘤具有免疫原性?？深A(yù)見(jiàn)的是，通過(guò)pd-l1阻斷而提高t細(xì)胞活化的閾值，由此預(yù)期活化宿主中的腫瘤應(yīng)答。pd-l1阻斷當(dāng)與疫苗接種方案組合時(shí)可能最有效。已設(shè)計(jì)出許多針對(duì)腫瘤的實(shí)驗(yàn)性疫苗接種策略(參見(jiàn)rosenberg,s.,developmentofcancervaccines,ascoeducationalbookspring:60-62(2000)；logothetis,c.,ascoeducationalbookspring:300-302(2000)；khayat,d.,ascoeducationalbookspring:414-428(2000)；foon,k.,ascoeducationalbookspring:730-738(2000)；亦參見(jiàn)restifo,n.等人,cancervaccines,第61章,第3023-3043頁(yè),devita,v.等人編輯,cancer:principlesandpracticeofoncology,第5版(1997))。在這些策略之一中，使用自體或同種異體腫瘤細(xì)胞制備疫苗。已證實(shí)當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)gm-csf時(shí)，這些細(xì)胞疫苗最有效。對(duì)于腫瘤疫苗接種，已證實(shí)gm-csf為抗原呈遞的強(qiáng)活化劑(dranoff等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:3539-3543(1993))。對(duì)各種腫瘤中的基因表達(dá)及大規(guī)?；虮磉_(dá)模式的研究已產(chǎn)生關(guān)于所謂的腫瘤特異性抗原的定義(rosenberg,s.a.,immunity,10:281-287(1999))。在很多情況下，這些腫瘤特異性抗原為表達(dá)于腫瘤及腫瘤所來(lái)源的細(xì)胞中的分化抗原，例如黑色素細(xì)胞抗原gp100、mage抗原及trp-2。更重要的是，可證實(shí)許多這些抗原為發(fā)現(xiàn)于宿主中的腫瘤特異性t細(xì)胞的靶標(biāo)。pd-l1阻斷可與腫瘤中所表達(dá)的許多重組蛋白質(zhì)和/或肽聯(lián)用以產(chǎn)生針對(duì)這些蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。這些蛋白質(zhì)通常被免疫系統(tǒng)識(shí)別為自身抗原且因此對(duì)其具有耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質(zhì)端粒酶，其為合成染色體端粒所必需的且表達(dá)于超過(guò)85％的人類癌癥及僅有限的體細(xì)胞組織中(kim,n.等人,science,266:2011-2013(1994))。(這些體細(xì)胞組織可通過(guò)各種方式加以保護(hù)以防免疫攻擊)。由于改變蛋白質(zhì)序列或在兩個(gè)無(wú)關(guān)序列之間產(chǎn)生融合蛋白(即費(fèi)城染色體中的bcr-abl)的體細(xì)胞突變或來(lái)自b細(xì)胞腫瘤的個(gè)體基因型，腫瘤抗原亦可為表達(dá)于癌細(xì)胞中的“新抗原”。其它腫瘤疫苗可包括來(lái)自牽涉人類癌癥的病毒的蛋白質(zhì)，例如人類乳頭狀瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv及hcv)及卡波西氏皰疹肉瘤病毒(khsv)?？膳cpd-l1阻斷聯(lián)用的另一種形式的腫瘤特異性抗原為自腫瘤組織自身分離的純化熱休克蛋白(hsp)。這些熱休克蛋白含有來(lái)自腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的片段且這些hsp高效遞送至抗原呈遞細(xì)胞以引發(fā)腫瘤免疫(suot,r.等人,science,269:1585-1588(1995)；tamura,y.等人,science,278:117-120(1997))。樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)為可用于致敏抗原特異性應(yīng)答的強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞。dc可離體產(chǎn)生且裝載各種蛋白質(zhì)及肽抗原及腫瘤細(xì)胞提取物(nestle,f.等人,nat.med.,4:328-332(1998))。dc亦可通過(guò)遺傳方式轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而亦表達(dá)這些腫瘤抗原。dc亦已直接融合至腫瘤細(xì)胞用于免疫目的(kugler,a.等人,nat.med.,6:332-336(2000))。dc免疫作為疫苗接種方法可有效地與pd-l1阻斷組合以活化更強(qiáng)的抗腫瘤應(yīng)答。pd-l1阻斷亦可與標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法組合。pd-l1阻斷可有效地與化學(xué)治療方案組合。在這些情況下，可降低化學(xué)治療劑的給藥劑量(mokyr,m.等人,cancerres.,58:5301-5304(1998))。此組合的一個(gè)實(shí)例為大環(huán)肽與達(dá)卡巴嗪組合用于治療黑色素瘤。此組合的另一個(gè)實(shí)例為大環(huán)肽與白介素-2(il-2)組合用于治療黑色素瘤。pd-l1阻斷與化學(xué)療法聯(lián)用的科學(xué)原理為作為大部分化學(xué)治療性化合物的細(xì)胞毒性作用后果的細(xì)胞死亡應(yīng)使腫瘤抗原在抗原呈遞途徑中的水平提高。可與pd-l1阻斷經(jīng)由細(xì)胞死亡產(chǎn)生協(xié)同作用的其它組合療法為放射、手術(shù)及激素去除。這些方案各自在宿主中產(chǎn)生腫瘤抗原來(lái)源。血管生成抑制劑亦可與pd-l1阻斷組合。血管生成抑制引起腫瘤細(xì)胞死亡，從而可將腫瘤抗原饋入宿主抗原呈遞途徑中。pd-l1阻斷性大環(huán)肽亦可與使表達(dá)fcα或fcγ受體的效應(yīng)細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的雙特異性大環(huán)肽聯(lián)用(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,922,845及5,837,243)。雙特異性大環(huán)肽可用于靶向兩種不同的抗原。例如，抗fc受體/抗腫瘤抗原(例如her-2/neu)雙特異性大環(huán)肽已用于使巨噬細(xì)胞靶向腫瘤部位。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性應(yīng)答。使用pd-l1阻斷可增強(qiáng)這些應(yīng)答的t細(xì)胞臂。可選擇地，可通過(guò)使用結(jié)合至腫瘤抗原及樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物的雙特異性大環(huán)肽將抗原直接遞送至dc。腫瘤通過(guò)很多種機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)視。使腫瘤所表達(dá)且具有免疫抑制性的蛋白質(zhì)不活化可戰(zhàn)勝許多這些機(jī)制。這些尤其包括tgf-β(kehrl,j.等人,j.exp.med.,163:1037-1050(1986))、il-10(howard,m.等人,immunologytoday,13:198-200(1992))及fas配體(hahne,m.等人,science,274:1363-1365(1996))。針對(duì)這些實(shí)體中的每種的大環(huán)肽可與抗pd-l1聯(lián)用以抵消免疫抑制劑的作用且促成宿主的腫瘤免疫應(yīng)答?？捎糜诨罨拗髅庖邞?yīng)答性的其它大環(huán)肽可與抗pd-l1聯(lián)用。這些包括樹(shù)突狀細(xì)胞表面上的活化dc功能及抗原呈遞的分子?？筩d40大環(huán)肽能夠有效地代替t細(xì)胞輔助活性(ridge,j.等人,nature,393:474-478(1998))且可與pd-1抗體聯(lián)用(ito,n.等人,immunobiology,201(5):527-540(2000))?；罨槍?duì)例如以下的t細(xì)胞共刺激分子的大環(huán)肽亦可使t細(xì)胞活化水平提高：ctla-4(例如美國(guó)專利5,811,097)、ox-40(weinberg,a.等人,immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1bb(melero,i.等人,nat.med.,3:682-685(1997)及icos(hutloff,a.等人,nature,397:262-266(1999))。骨髓移植當(dāng)前用于治療多種造血源性腫瘤。雖然移植物抗宿主疾病為此治療的后果，但可自移植物抗腫瘤應(yīng)答得到治療益處。pd-l1阻斷可用于提高供者所植入的腫瘤特異性t細(xì)胞的有效性。亦存在若干種實(shí)驗(yàn)性治療方案，包括離體活化及擴(kuò)增抗原特異性t細(xì)胞且將這些細(xì)胞繼承性轉(zhuǎn)移至受者中以使抗原特異性t細(xì)胞針對(duì)腫瘤(greenberg,r.等人,science,285:546-551(1999))。這些方法亦可用于活化針對(duì)感染劑(例如cmv)的t細(xì)胞應(yīng)答。在大環(huán)肽存在下的離體活化作用預(yù)期可提高繼承性轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞的頻率及活性。感染性疾病本申請(qǐng)其它方法用于治療已暴露于特定毒素或病原體的患者。因此，本申請(qǐng)另一個(gè)方面提供在個(gè)體中治療感染性疾病的方法，其包括向該個(gè)體給藥本申請(qǐng)大環(huán)肽以在該個(gè)體中治療感染性疾病。類似于上述對(duì)腫瘤的應(yīng)用，pd-l1阻斷可單獨(dú)使用或作為輔助與疫苗聯(lián)用以刺激針對(duì)病原體、毒素及自身抗原的免疫應(yīng)答。此治療方法尤其可適用的病原體的實(shí)例包括當(dāng)前無(wú)有效疫苗的病原體或常規(guī)疫苗不完全有效的病原體。這些包括但不限于hiv、肝炎(甲型、乙型及丙型)、流感、皰疹、賈第蟲(chóng)屬、瘧疾(butler,n.s.等人,natureimmunology,13:188-195(2012)；hafalla,j.c.r.等人,plospathogens,2012年2月2日))、利什曼蟲(chóng)屬、金黃色葡萄球菌、綠膿假單胞菌。pd-l1阻斷對(duì)于hiv等在感染過(guò)程中呈遞改變的抗原的病原體所建立的感染特別有用。這些新穎表位在抗人pd-l1給藥時(shí)被識(shí)別為外來(lái)的，從而激發(fā)不會(huì)因pd-l1的負(fù)信號(hào)而衰減的強(qiáng)t細(xì)胞應(yīng)答?？捎杀旧暾?qǐng)方法治療的致感染性病原性病毒的一些實(shí)例包括hiv、肝炎(甲型、乙型及丙型)、皰疹病毒(例如vzv、hsv-1、hav-6、hsv-ii及cmv、埃-巴二氏病毒)、腺病毒、流感病毒、黃病毒、?？刹《尽⒈遣《?、柯薩奇病毒、冠狀病毒、呼吸道合胞體病毒、腮腺炎病毒、輪狀病毒、麻疹病毒、風(fēng)疹病毒、細(xì)小病毒、痘苗病毒、htlv病毒、登革熱病毒、乳頭瘤病毒、軟疣病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、狂犬病病毒、jc病毒及蟲(chóng)媒病毒性腦炎病毒?？捎杀旧暾?qǐng)方法治療的致感染性病原性細(xì)菌的一些實(shí)例包括衣原體、立克次體細(xì)菌、分枝桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、腦膜炎雙球菌及淋球菌、克雷伯氏菌、變形桿菌、沙雷氏菌、假單胞菌、軍團(tuán)菌、白喉、沙門氏菌、桿菌、霍亂、破傷風(fēng)、肉毒中毒、炭疽、鼠疫、鉤端螺旋體病及萊姆病細(xì)菌?？捎杀旧暾?qǐng)方法治療的致感染性病原性真菌的一些實(shí)例包括念珠菌屬(白色念珠菌、克魯斯氏念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌等)、新型隱球菌、曲霉屬(煙曲霉、黑曲霉等)、毛霉菌屬(白霉屬、犁頭霉屬、根霉屬)、申克氏孢子絲菌、皮炎芽生菌、巴西副球孢子菌、粗球孢子菌及莢膜組織孢漿菌?？捎杀旧暾?qǐng)方法治療的致感染性病原性寄生蟲(chóng)的一些實(shí)例包括痢疾內(nèi)變形蟲(chóng)、結(jié)腸小袋纖毛蟲(chóng)、福氏耐格里變形蟲(chóng)、棘阿米巴屬種、藍(lán)氏梨形鞭毛蟲(chóng)、隱孢子蟲(chóng)屬種、卡氏肺囊蟲(chóng)、間日瘧原蟲(chóng)、微小巴貝蟲(chóng)、布魯氏錐蟲(chóng)、克氏錐蟲(chóng)、杜氏利什曼蟲(chóng)、岡氏弓形蟲(chóng)及巴西日?qǐng)A線蟲(chóng)。在所有上述方法中，pd-l1阻斷可與其它形式的免疫療法組合，例如細(xì)胞因子療法(例如干擾素、靶向vegf活性或vegf受體gm-csf、g-csf、il-2的藥劑)或使腫瘤抗原呈遞增強(qiáng)的雙特異性抗體療法(參見(jiàn)例如holliger,proc.natl.acad.sci.usa,90:6444-6448(1993)；poljak,structure,2:1121-1123(1994))。自身免疫應(yīng)答大環(huán)肽可激發(fā)且擴(kuò)增自身免疫應(yīng)答。實(shí)際上，使用腫瘤細(xì)胞及肽疫苗誘導(dǎo)抗腫瘤應(yīng)答揭示許多抗腫瘤應(yīng)答涉及抗自身反應(yīng)性(在抗ctla-4+gm-csf改造的b16黑色素瘤中觀測(cè)到脫色素(vanelsas等人,同上)；在接種trp-2的小鼠中觀測(cè)到脫色素(overwijk,w.等人,proc.natl.acad.sci.usa,96:2982-2987(1999))；tramp腫瘤細(xì)胞疫苗引起自身免疫前列腺炎(hurwitz,a.,同上(2000))；黑色素瘤肽抗原疫苗接種及在人類臨床試驗(yàn)中觀測(cè)到白斑病(rosenberg,s.a.等人,j.immunother.emphasistumorimmunol.,19(1):81-84(1996))。因此，可考慮將抗pd-l1阻斷與各種自身蛋白質(zhì)聯(lián)用以設(shè)計(jì)出有效產(chǎn)生針對(duì)這些自身蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答以治療疾病的疫苗接種方案。例如，阿茲海默氏病牽涉淀粉樣蛋白沉積物中的aβ肽于腦中的不當(dāng)積聚；針對(duì)淀粉樣蛋白的抗體應(yīng)答能夠清除這些淀粉樣蛋白沉積物(schenk等人,nature,400:173-177(1999))。其它自身蛋白質(zhì)亦可用作治療過(guò)敏癥及哮喘的靶標(biāo)例如ige及治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的靶標(biāo)例如tnfα。最后可使用本申請(qǐng)所述大環(huán)誘導(dǎo)針對(duì)各種激素的抗體應(yīng)答。中和針對(duì)生殖性激素的抗體應(yīng)答可用于避孕。中和針對(duì)特定腫瘤生長(zhǎng)所必需的激素及其它可溶性因子的抗體應(yīng)答亦可視為可能的疫苗接種靶標(biāo)。如上所述使用抗pd-l1大環(huán)的類似方法可用于誘導(dǎo)治療性自身免疫應(yīng)答以治療具有其它自身抗原例如包括阿茲海默氏病中的aβ在內(nèi)的淀粉樣蛋白沉積物、細(xì)胞因子例如tnfα及ige不當(dāng)積聚的患者。疫苗大環(huán)肽可通過(guò)將抗pd-1大環(huán)與所關(guān)注的抗原(例如疫苗)共同給藥而用于刺激抗原特異性免疫應(yīng)答。因此，在另一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┰鰪?qiáng)個(gè)體中針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答的方法，其包括向該個(gè)體給藥：(i)抗原；及(ii)抗pd-1大環(huán)，從而增強(qiáng)該個(gè)體中針對(duì)抗原的免疫應(yīng)答?？乖蔀槔缒[瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原或病原體抗原。這些抗原的非限制性實(shí)例包括上述那些，例如上述腫瘤抗原(或腫瘤疫苗)或來(lái)自上述病毒、細(xì)菌或其它病原體的抗原。體內(nèi)及體外給藥本申請(qǐng)組合物(例如大環(huán)肽、多特異性及雙特異性分子及免疫綴合物)的適合途徑在本領(lǐng)域中熟知且可由本領(lǐng)域技術(shù)人員選擇。例如，組合物可通過(guò)注射給藥(例如靜脈內(nèi)或皮下)。所用分子的適合劑量將視個(gè)體的年齡及體重及組合物的濃度和/或配方而定。如上所述，本申請(qǐng)大環(huán)肽可與一或多種其它治療劑(例如細(xì)胞毒性劑、放射毒性劑或免疫抑制劑)共同給藥。肽可連接至藥劑(呈免疫復(fù)合物形式)或可與藥劑分開(kāi)給藥。在后者情況下(分開(kāi)給藥)，肽可在藥劑之前、之后或并行給藥或可與其它已知療法(例如抗癌療法例如放射)共同給藥。這些治療劑尤其包括抗贅生性藥劑例如多柔比星(阿霉素)、順鉑、硫酸博萊霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、達(dá)卡巴嗪及環(huán)磷酰胺/羥脲，其自身僅在對(duì)患者有毒性或亞毒性的水平有效。順鉑每四周一次靜脈內(nèi)給藥100mg/劑量，而阿霉素每21天一次靜脈內(nèi)給藥60-75mg/ml劑量。本申請(qǐng)大環(huán)肽與化學(xué)治療劑的共同給藥提供了經(jīng)由對(duì)人類腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用的不同機(jī)制發(fā)揮作用的兩種抗癌劑。此共同給藥可解決由于抗藥性的發(fā)展或腫瘤細(xì)胞抗原性的變化使其對(duì)肽無(wú)反應(yīng)而引起的問(wèn)題。包含本申請(qǐng)組合物(例如大環(huán)肽、雙特異性或多特異性分子或免疫綴合物)及使用說(shuō)明書(shū)的試劑盒亦屬于本申請(qǐng)范疇內(nèi)。試劑盒可進(jìn)一步含有至少一種其它試劑或本申請(qǐng)一或多種其它大環(huán)肽(例如具有互補(bǔ)活性的結(jié)合至pd-l1抗原中與大環(huán)不同的表位的人類抗體)。試劑盒典型地包括指明試劑盒的內(nèi)含物的指定用途的標(biāo)簽。術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽”包括任何書(shū)面或記錄材料，其提供于試劑盒上或與試劑盒一起提供或以其它方式附于試劑盒。組合療法本申請(qǐng)大環(huán)肽與另一種pd-l1拮抗劑和/或其它免疫調(diào)節(jié)劑的組合適用于增強(qiáng)針對(duì)過(guò)度增殖性疾病的免疫應(yīng)答。例如，這些分子可體外或離體給藥于所培養(yǎng)的細(xì)胞或例如體內(nèi)給藥于人類個(gè)體以在多種情形下增強(qiáng)免疫性。因此，在一個(gè)方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┱{(diào)節(jié)個(gè)體中的免疫應(yīng)答的方法，其包括向該個(gè)體給藥本申請(qǐng)大環(huán)肽以調(diào)節(jié)該個(gè)體中的免疫應(yīng)答。優(yōu)選增強(qiáng)、刺激或上調(diào)應(yīng)答。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┦褂妹庖叽碳ば灾委焺└淖兣c治療過(guò)度增殖性疾病相關(guān)的不良事件的方法，其包括向個(gè)體給藥本申請(qǐng)大環(huán)肽及亞治療劑量的其它免疫調(diào)節(jié)劑。大環(huán)肽阻斷pd-l1可增強(qiáng)患者中針對(duì)癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答?？墒褂帽旧暾?qǐng)大環(huán)肽抑制生長(zhǎng)的癌癥包括對(duì)免疫療法典型地有應(yīng)答的癌癥?？捎帽旧暾?qǐng)組合療法治療的癌癥的代表性實(shí)例包括黑色素瘤(例如轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤)、腎癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌?？墒褂帽旧暾?qǐng)方法治療的其它癌癥的實(shí)例包括骨癌、胰腺癌、皮膚癌、頭頸癌、皮膚或眼內(nèi)惡性黑色素瘤、子宮癌、卵巢癌、直腸癌、肛區(qū)癌癥、胃癌、睪丸癌、子宮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌、陰道癌、外陰癌、霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤、食道癌、小腸癌、內(nèi)分泌系統(tǒng)癌癥、甲狀腺癌、甲狀旁腺癌、腎上腺癌、軟組織肉瘤、尿道癌、陰莖癌、慢性或急性白血病(包括急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性淋巴母細(xì)胞性白血病、慢性淋巴細(xì)胞性白血病)、兒童期實(shí)體腫瘤、淋巴細(xì)胞性淋巴瘤、膀胱癌、腎癌或輸尿管癌、腎盂癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)(cns)贅生物、原發(fā)性cns淋巴瘤、腫瘤血管生成、脊柱軸腫瘤、腦干神經(jīng)膠質(zhì)瘤、垂體腺瘤、卡波西氏肉瘤、表皮樣癌癥、鱗狀細(xì)胞癌、t細(xì)胞淋巴瘤、由環(huán)境誘發(fā)的癌癥(包括由石棉誘發(fā)的那些癌癥)及所述癌癥的組合。本申請(qǐng)亦適用于治療轉(zhuǎn)移性癌癥。在某些實(shí)施方案中，含有至少一種本申請(qǐng)所述大環(huán)肽的治療劑組合可按于藥用載體中的單一組合物形式并行給藥或按其中各藥劑可依序給藥的不同組合物形式并行給藥。例如，第二免疫調(diào)節(jié)劑及本申請(qǐng)大環(huán)肽可依序給藥，例如首先給藥第二免疫調(diào)節(jié)劑且其次給藥大環(huán)肽或首先給藥大環(huán)肽且其次給藥第二免疫調(diào)節(jié)劑。另外，若超過(guò)一個(gè)劑量的組合療法依序給藥，則依序給藥的次序可顛倒或在每個(gè)給藥時(shí)間點(diǎn)保持相同次序，依序給藥可與并行給藥組合或其任何組合。例如，第二免疫調(diào)節(jié)劑和大環(huán)肽的首次給藥可為并行的，第二次給藥可為依序的，其中首先給藥第二免疫調(diào)節(jié)劑且其次給藥大環(huán)肽且第三次給藥可為依序的，其中首先給藥大環(huán)肽且其次給藥第二免疫調(diào)節(jié)劑等。另一種代表性給藥方案可包括首先給藥大環(huán)肽且其次給藥第二免疫調(diào)節(jié)劑的首次依序給藥且然后給藥可為并行的。大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合可任選進(jìn)一步與免疫原性藥劑組合，例如癌細(xì)胞、純化腫瘤抗原(包括重組蛋白質(zhì)、肽及碳水化合物分子)、細(xì)胞及經(jīng)編碼免疫刺激性細(xì)胞因子的基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(he等人,j.immunol.,173:4919-4928(2004))。可使用的腫瘤疫苗的非限制性實(shí)例包括黑色素瘤抗原的肽例如gp100、mage抗原、trp-2、mart1和/或酪氨酸酶的肽或經(jīng)轉(zhuǎn)染以表達(dá)細(xì)胞因子gm-csf的腫瘤細(xì)胞(下文進(jìn)一步論述)。所組合的pd-l1大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑可進(jìn)一步與疫苗接種方案組合。已設(shè)計(jì)出許多針對(duì)腫瘤的實(shí)驗(yàn)性疫苗接種策略(參見(jiàn)rosenberg,s.,developmentofcancervaccines,ascoeducationalbookspring:60-62(2000)；logothetis,c.,ascoeducationalbookspring:300-302(2000)；khayat,d.,ascoeducationalbookspring:414-428(2000)；foon,k.,ascoeducationalbookspring:730-738(2000)；亦參見(jiàn)restifo等人,cancervaccines,第61章,第3023-3043頁(yè),devita等人編輯,cancer:principlesandpracticeofoncology,第5版(1997))。在這些策略之一中，使用自體或同種異體腫瘤細(xì)胞制備疫苗。已證實(shí)當(dāng)腫瘤細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)gm-csf時(shí)，這些細(xì)胞疫苗最有效。對(duì)于腫瘤疫苗接種，已證實(shí)gm-csf為抗原呈遞的強(qiáng)活化劑(dranoff等人,proc.natl.acad.sci.usa,90:3539-3543(1993))。對(duì)各種腫瘤中的基因表達(dá)及大規(guī)?；虮磉_(dá)模式的研究已產(chǎn)生關(guān)于所謂的腫瘤特異性抗原的定義(rosenberg,s.a.,immunity,10:281-287(1999))。在很多情況下，這些腫瘤特異性抗原為表達(dá)于腫瘤及腫瘤所來(lái)源的細(xì)胞中的分化抗原，例如黑色素細(xì)胞抗原gp100、mage抗原及trp-2。更重要的是，可證實(shí)許多這些抗原為發(fā)現(xiàn)于宿主中的腫瘤特異性t細(xì)胞的靶標(biāo)。在某些實(shí)施方案中，所組合的pd-l1大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑可與腫瘤中所表達(dá)的許多重組蛋白質(zhì)和/或肽聯(lián)用以產(chǎn)生針對(duì)這些蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答。這些蛋白質(zhì)通常被免疫系統(tǒng)識(shí)別為自身抗原且因此對(duì)其具耐受性。腫瘤抗原亦可包括蛋白質(zhì)端粒酶，其為合成染色體端粒所必需的且表達(dá)于超過(guò)85％的人類癌癥及僅有限的體細(xì)胞組織中(kim等人,science,266:2011-2013(1994))。(這些體細(xì)胞組織可通過(guò)各種方式加以保護(hù)以防免疫攻擊)。由于改變蛋白質(zhì)序列或在兩個(gè)無(wú)關(guān)序列之間產(chǎn)生融合蛋白(即費(fèi)城染色體中的bcr-abl)的體細(xì)胞突變或來(lái)自b細(xì)胞腫瘤的個(gè)體基因型，腫瘤抗原亦可為表達(dá)于癌細(xì)胞中的“新抗原”。其它腫瘤疫苗可包括牽涉人類癌癥的病毒的蛋白質(zhì)，例如人類乳頭狀瘤病毒(hpv)、肝炎病毒(hbv及hcv)及卡波西氏皰疹肉瘤病毒(khsv)?？膳cpd-l1大環(huán)肽阻斷聯(lián)用的另一種形式的腫瘤特異性抗原為自腫瘤組織自身分離的純化熱休克蛋白(hsp)。這些熱休克蛋白含有來(lái)自腫瘤細(xì)胞的蛋白質(zhì)的片段且這些hsp高效遞送至抗原呈遞細(xì)胞以引發(fā)腫瘤免疫(suot等人，science,269:1585-1588(1995)；tamura等人，science,278:117-120(1997))。樹(shù)突狀細(xì)胞(dc)為可用于致敏抗原特異性應(yīng)答的強(qiáng)抗原呈遞細(xì)胞。dc可離體產(chǎn)生且裝載各種蛋白質(zhì)及肽抗原及腫瘤細(xì)胞提取物(nestle等人,nat.med.,4:328-332(1998))。dc亦可通過(guò)遺傳方式轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而亦表達(dá)這些腫瘤抗原。dc亦已直接融合至腫瘤細(xì)胞用于免疫目的(kugler等人,nat.med.,6:332-336(2000))。dc免疫作為疫苗接種方法可有效地進(jìn)一步與所組合的抗pd-l1大環(huán)肽及第二免疫調(diào)節(jié)劑組合以活化更強(qiáng)的抗腫瘤應(yīng)答。所組合的抗pd-l1大環(huán)肽與其它免疫調(diào)節(jié)劑亦可進(jìn)一步與標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法組合。例如，大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合可有效地與化學(xué)治療方案組合。在這些情形下，如就大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合所觀測(cè)到的那樣，可降低與本申請(qǐng)組合一起給藥的其它化學(xué)治療劑的劑量(mokyr等人,cancerres.,58:5301-5304(1998))。此組合的一個(gè)實(shí)例為大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合進(jìn)一步與達(dá)卡巴嗪的組合用于治療黑色素瘤。另一個(gè)實(shí)例為大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合進(jìn)一步與白介素-2(il-2)的組合用于治療黑色素瘤。pd-l1大環(huán)肽及其它免疫調(diào)節(jié)劑與化學(xué)療法聯(lián)用的科學(xué)原理為作為大部分化學(xué)治療性化合物的細(xì)胞毒性作用后果的細(xì)胞死亡應(yīng)使腫瘤抗原在抗原呈遞途徑中的水平提高?？膳c所組合的抗pd-l1大環(huán)肽及其它免疫調(diào)節(jié)劑經(jīng)由細(xì)胞死亡產(chǎn)生協(xié)同作用的其它組合療法包括放射、手術(shù)及激素去除。這些方案各自在宿主中產(chǎn)生腫瘤抗原來(lái)源。血管生成抑制劑亦可與所組合的pd-l1及第二免疫調(diào)節(jié)劑組合。血管生成抑制引起腫瘤細(xì)胞死亡，從而可將腫瘤抗原來(lái)源饋入宿主抗原呈遞途徑中。pd-l1與其它免疫調(diào)節(jié)劑的組合亦可與使表達(dá)fcα或fcγ受體的效應(yīng)細(xì)胞靶向腫瘤細(xì)胞的雙特異性大環(huán)肽聯(lián)用(參見(jiàn)例如美國(guó)專利5,922,845及5,837,243)。雙特異性大環(huán)肽可用于靶向兩種不同的抗原。例如，抗fc受體/抗腫瘤抗原(例如her-2/neu)雙特異性大環(huán)肽已用于使巨噬細(xì)胞靶向腫瘤部位。此靶向可更有效地活化腫瘤特異性應(yīng)答。使用所組合的pd-l1與第二免疫調(diào)節(jié)劑可增強(qiáng)這些應(yīng)答的t細(xì)胞臂?？蛇x擇地，可通過(guò)使用結(jié)合至腫瘤抗原及樹(shù)突狀細(xì)胞特異性細(xì)胞表面標(biāo)志物的雙特異性大環(huán)肽將抗原直接遞送至dc。在另一個(gè)實(shí)施方案中，大環(huán)肽與第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合可與抗贅生性大環(huán)藥劑聯(lián)用，例如(利妥昔單抗)、(曲妥珠單抗)、(托西莫單抗)、(替伊莫單抗)、(阿來(lái)組單抗)、lymphocide(依帕珠單抗)、(貝伐株單抗)及(埃羅替尼)等。例如且不希望受理論束縛，用抗癌抗體或與毒素綴合的抗癌抗體進(jìn)行的治療可引起癌細(xì)胞(例如腫瘤細(xì)胞)死亡，其可強(qiáng)化第二免疫調(diào)節(jié)劑靶標(biāo)或pd-l1所介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，對(duì)過(guò)度增殖性疾病(例如癌癥腫瘤)的治療可包括抗癌抗體與大環(huán)肽及第二免疫調(diào)節(jié)劑的組合(并行或依序或其任何組合)，其可強(qiáng)化宿主的抗腫瘤免疫應(yīng)答。腫瘤通過(guò)很多種機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)視。使腫瘤所表達(dá)且具有免疫抑制性的蛋白質(zhì)不活化可戰(zhàn)勝許多這些機(jī)制。這些尤其包括tgf-β(kehrl,j.等人,j.exp.med.,163:1037-1050(1986))、il-10(howard,m.等人,immunologytoday,13:198-200(1992))及fas配體(hahne,m.等人,science,274:1363-1365(1996))。在另一個(gè)實(shí)施方案中，針對(duì)這些實(shí)體中的每種的抗體可進(jìn)一步與大環(huán)肽及其它免疫調(diào)節(jié)劑組合以抵消免疫抑制劑的作用且促成宿主的腫瘤免疫應(yīng)答?？捎糜诨罨拗髅庖邞?yīng)答性的其它藥劑可進(jìn)一步與本申請(qǐng)大環(huán)肽聯(lián)用。這些包括樹(shù)突狀細(xì)胞表面上的活化dc功能及抗原呈遞的分子?？筩d40大環(huán)肽能夠有效地代替t細(xì)胞輔助活性(ridge,j.等人,nature,393:474-478(1998))且可與單獨(dú)或與抗ctla-4組合的本申請(qǐng)大環(huán)肽聯(lián)用(ito,n.等人,immunobiology,201(5):527-540(2000))。活化針對(duì)例如以下的t細(xì)胞共刺激分子的大環(huán)肽亦可使t細(xì)胞活化水平提高：ox-40(weinberg,a.等人,immunol.,164:2160-2169(2000))、4-1bb(melero,i.等人,nat.med.,3:682-685(1997)及icos(hutloff,a.等人,nature,397:262-266(1999))。骨髓移植當(dāng)前用于治療多種造血源性腫瘤。雖然移植物抗宿主疾病為此治療的后果，但可自移植物抗腫瘤應(yīng)答得到治療益處。單獨(dú)或與其它免疫調(diào)節(jié)劑組合的本申請(qǐng)大環(huán)肽可用于提高供者所植入的腫瘤特異性t細(xì)胞的有效性。亦存在若干種實(shí)驗(yàn)性治療方案，包括離體活化及擴(kuò)增抗原特異性t細(xì)胞且將這些細(xì)胞繼承性轉(zhuǎn)移至受者中以使抗原特異性t細(xì)胞針對(duì)腫瘤(greenberg,r.等人,science,285:546-551(1999))。這些方法亦可用于活化針對(duì)感染劑(例如cmv)的t細(xì)胞應(yīng)答。在單獨(dú)或與其它免疫調(diào)節(jié)劑組合的本申請(qǐng)大環(huán)肽存在下的離體活化作用預(yù)期可提高繼承性轉(zhuǎn)移的t細(xì)胞的頻率及活性。在某些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┦褂妹庖叽碳└淖兣c治療過(guò)度增殖性疾病相關(guān)的不良事件的方法，其包括向個(gè)體給藥本申請(qǐng)大環(huán)肽與亞治療劑量的其它免疫調(diào)節(jié)劑的組合。例如，本申請(qǐng)方法提供通過(guò)給藥非吸收性類固醇至患者來(lái)降低免疫刺激性治療抗體所誘發(fā)的結(jié)腸炎或腹瀉的方法。因?yàn)閷⒔邮苊庖叽碳ば灾委熆贵w的任何患者處于發(fā)生此治療所誘發(fā)的結(jié)腸炎或腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)中，所以此整個(gè)患者群體適于根據(jù)本申請(qǐng)方法的療法。雖然已給藥類固醇以治療炎性腸病(ibd)及預(yù)防ibd惡化，但其尚未用于在尚未診斷有ibd的患者中預(yù)防(降低發(fā)病率)ibd。與類固醇甚至是非吸收性類固醇相關(guān)的顯著副作用已妨礙預(yù)防性用途。在其它實(shí)施方案中，單獨(dú)或與其它免疫調(diào)節(jié)劑組合的本申請(qǐng)大環(huán)肽可進(jìn)一步與任何非吸收性類固醇聯(lián)用。本申請(qǐng)使用的“非吸收性類固醇”為展現(xiàn)出明顯首過(guò)代謝的糖皮質(zhì)激素，其在肝臟代謝后的生物利用度較低即小于約20％。在本申請(qǐng)一個(gè)實(shí)施方案中，非吸收性類固醇為布地奈德。布地奈德為局部發(fā)揮作用的糖皮質(zhì)類固醇，其在經(jīng)口給藥后發(fā)生明顯代謝，主要由肝臟進(jìn)行。ec(astra-zeneca)為ph及時(shí)間依賴性口服布地奈德制劑，其經(jīng)開(kāi)發(fā)可最佳化藥物遞送至回腸及整個(gè)結(jié)腸。ec在美國(guó)已獲準(zhǔn)用于治療牽涉回腸和/或升結(jié)腸的輕度至中度克羅恩氏病。ec用于治療克羅恩氏病的一般口服劑量為每日6mg至9mg。ec在吸收前釋放于腸中且保留于腸粘膜中。ec一旦通過(guò)腸粘膜靶標(biāo)組織，則通過(guò)肝臟中的細(xì)胞色素p450系統(tǒng)發(fā)生明顯代謝而產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素活性可忽略的代謝物。因此，生物利用度較低(約10％)。與首過(guò)代謝較不明顯的其它糖皮質(zhì)激素相比，布地奈德的較低生物利用度使治療比提高。與全身性發(fā)揮作用的皮質(zhì)類固醇相比，布地奈德產(chǎn)生的不良作用較少，包括較小的下丘腦-垂體抑制。然而，長(zhǎng)期給藥ec可產(chǎn)生全身性糖皮質(zhì)激素作用例如腎上腺皮質(zhì)高能癥及腎上腺抑制。參見(jiàn)physicians’deskreferencesupplement,第58版,608-610(2004)。在其它實(shí)施方案中，pd-l1與其它免疫調(diào)節(jié)劑及非吸收性類固醇的組合可進(jìn)一步與水楊酸組合。水楊酸包括5-asa藥劑例如：柳氮磺胺吡啶(pharmacia&upjohn)；奧色拉秦(pharmacia&upjohn)；巴柳氮(salixpharmaceuticals,inc.)；及美沙拉嗪(procter&gamblepharmaceuticals；shireus；axcanscandipharm,inc.；solvay)。劑量及制劑適合的式i肽或更具體為本申請(qǐng)所述大環(huán)肽可按單獨(dú)化合物和/或與可接受的載體混合的藥物制劑形式給藥于患者以治療糖尿病及其它相關(guān)疾病。糖尿病治療領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地確定化合物向需要此治療的哺乳動(dòng)物(包括人類)給藥的劑量及途徑。給藥途徑可包括但不限于經(jīng)口、口內(nèi)、直腸、經(jīng)皮、頰內(nèi)、鼻內(nèi)、經(jīng)肺、皮下、肌內(nèi)、皮內(nèi)、舌下、結(jié)腸內(nèi)、眼內(nèi)、靜脈內(nèi)或經(jīng)腸給藥?；衔锔鶕?jù)給藥途徑基于可接受的藥學(xué)實(shí)踐來(lái)配制(fingl等人,thepharmacologicalbasisoftherapeutics,第1章,第1頁(yè)(1975)；remington’spharmaceuticalsciences,第18版,mackpublishingco.,easton,pa(1990))。本申請(qǐng)所述藥用肽組分可按多種劑型給藥，例如片劑、膠囊(其各自包括持續(xù)釋放型或定時(shí)釋放型制劑)、丸劑、散劑、顆粒劑、酏劑、原位凝膠劑、微球劑、結(jié)晶復(fù)合物、脂質(zhì)體、微乳劑、酊劑、混懸劑、糖漿劑、氣溶膠噴霧劑及乳液。本申請(qǐng)所述組合物亦可按經(jīng)口、靜脈內(nèi)(推注或輸注)、腹膜內(nèi)、皮下、經(jīng)皮或肌內(nèi)形式給藥，其均使用藥物領(lǐng)域技術(shù)人員已知的那些劑型。組合物可單獨(dú)給藥，但通常將與藥物載體一起給藥，所述藥物載體根據(jù)所選給藥途徑及標(biāo)準(zhǔn)藥物實(shí)踐來(lái)選擇。本申請(qǐng)所述組合物的給藥方案當(dāng)然將視已知因素而變化，例如特定藥劑的藥效學(xué)特征及其給藥模式及途徑；接受者的物種、年齡、性別、健康、醫(yī)學(xué)狀況及體重；癥狀的性質(zhì)及程度；并行療法的種類；治療頻率；給藥途徑；患者的腎臟及肝臟功能；及所需的作用。醫(yī)師或獸醫(yī)可確定及開(kāi)具預(yù)防、對(duì)抗或阻止病癥進(jìn)展所必需的藥物有效量。根據(jù)一般指導(dǎo)，活性成分當(dāng)用于指定作用時(shí)的每日口服劑量將為每公斤體重約0.001mg至1000mg，優(yōu)選每日每公斤體重約0.01mg至100mg且最優(yōu)選每日約0.6至20mg/kg?；钚猿煞之?dāng)用于指定作用時(shí)的靜脈內(nèi)每日劑量在恒速輸注期間將為每公斤體重0.001ng/min至100.0ng/min。此恒速靜脈內(nèi)輸注優(yōu)選可按每公斤體重0.01ng/min至50ng/min的速率且最優(yōu)選按每公斤體重0.01ng/min至10.0mg/min的速率給藥。本申請(qǐng)所述組合物可按單一每日劑量給藥或每日總劑量可按每日兩、三或四次的分次劑量給藥。本申請(qǐng)所述組合物亦可通過(guò)儲(chǔ)庫(kù)式制劑給藥，所述儲(chǔ)庫(kù)式制劑允許藥物按需在數(shù)日/數(shù)周/數(shù)月時(shí)段內(nèi)持續(xù)釋放。本申請(qǐng)所述組合物可按鼻內(nèi)形式經(jīng)由局部使用適合的鼻內(nèi)媒劑來(lái)給藥或經(jīng)由透皮途徑使用透皮貼劑來(lái)給藥。當(dāng)以透皮遞送系統(tǒng)形式給藥時(shí)，給藥在整個(gè)給藥方案中當(dāng)然將為連續(xù)而非間歇的。組合物典型地以與適合的藥物稀釋劑、賦形劑或載體(本申請(qǐng)統(tǒng)稱為藥物載體)的混合物形式給藥，其根據(jù)指定給藥形式即口服片劑、膠囊、酏劑、用或不用推進(jìn)劑產(chǎn)生的氣溶膠噴霧劑及糖漿劑適當(dāng)選擇且符合常規(guī)藥物實(shí)踐。例如，就以片劑或膠囊形式經(jīng)口給藥而言，活性藥物組分可與口服無(wú)毒藥用惰性載體組合，例如但不限于乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露糖醇及山梨糖醇；就以液體形式經(jīng)口給藥而言，口服藥物組分可與任何口服無(wú)毒藥用惰性載體組合，例如但不限于乙醇、丙三醇及水。另外，當(dāng)需要或必需時(shí)，亦可將適合的粘合劑、滑潤(rùn)劑、崩解劑及著色劑并入混合物中。適合的粘合劑包括但不限于淀粉、明膠、天然糖(例如但不限于葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑)、天然及合成膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠或海藻酸鈉)、羧甲基纖維素、聚乙二醇及蠟。在這些劑型中使用的滑潤(rùn)劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉及氯化鈉。崩解劑包括但不限于淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤(rùn)土及黃胞膠。本申請(qǐng)所述組合物亦可按混合膠束或脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)形式給藥，例如單層小囊泡、單層大囊泡及多層囊泡。脂質(zhì)體可由多種磷脂例如膽固醇、十八烷基胺或磷脂酰膽堿形成?？商砑訚B透增強(qiáng)劑以增強(qiáng)藥物吸收。由于已知前藥可增強(qiáng)藥物的多種所需品質(zhì)(即溶解性、生物利用度、制造性等)，因此本申請(qǐng)所述化合物可按前藥形式遞送。因此，本申請(qǐng)所述主題意欲涵蓋本申請(qǐng)所要求保護(hù)的化合物的前藥、遞送其的方法及含有其的組合物。本申請(qǐng)所述組合物亦可與作為靶向性藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這些聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基-甲基丙烯酰胺-苯酚、聚羥基乙基天冬酰胺苯酚或經(jīng)棕櫚?；〈木垩趸蚁?聚賴氨酸。另外，本申請(qǐng)所述組合物可與適用于達(dá)成藥物控制釋放的一類生物降解性聚合物組合，例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯及水凝膠的交聯(lián)或兩性嵌段共聚物。適于給藥的劑型(藥物組合物)在每個(gè)劑量單位中可含有約0.01毫克至約500毫克活性成分。在這些藥物組合物中，活性成分按組合物的總重量計(jì)通常將以約0.5-95重量％的量存在。明膠膠囊可含有活性成分及粉末狀載體例如乳糖、淀粉、纖維素衍生物、硬脂酸鎂及硬脂酸。類似的稀釋劑可用于制備壓制片劑。片劑與膠囊均可制備為持續(xù)釋放型產(chǎn)品以使藥物在數(shù)小時(shí)內(nèi)連續(xù)釋放。壓制片劑可包有糖衣或包有薄膜衣以遮蔽任何不愉快的味道且保護(hù)片劑以免接觸空氣或包有腸溶衣以在胃腸道中選擇性崩解?？诜后w劑型可含有著色劑及矯味劑以增加患者接受性。通常，水、適合的油、鹽水、右旋糖(葡萄糖)水溶液及相關(guān)糖溶液及二醇例如丙二醇或聚乙二醇為適用于胃腸外溶液的載體。用于胃腸外給藥的溶液優(yōu)選含有活性成分的水溶性鹽、適合的穩(wěn)定劑及必要時(shí)的緩沖物質(zhì)。單獨(dú)或組合的抗氧化劑例如亞硫酸氫鈉、亞硫酸鈉或抗壞血酸為適合的穩(wěn)定劑。亦使用檸檬酸及其鹽及edta鈉。另外，胃腸外溶液可含有防腐劑例如苯扎氯銨、對(duì)羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯及氯丁醇。適合的藥物載體參見(jiàn)remington:thescienceandpracticeofpharmacy,第19版,mackpublishingcompany(1995)(本領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)參考教科書(shū))。適用于給藥本申請(qǐng)所述化合物的代表性藥物劑型可說(shuō)明如下：膠囊大量單位膠囊可如下制備：向標(biāo)準(zhǔn)兩段式硬明膠膠囊中填充100毫克粉末狀活性成分、150毫克乳糖、50毫克纖維素及6毫克硬脂酸鎂。軟明膠膠囊可制備活性成分于可消化的油例如大豆油、棉籽油或橄欖油中的混合物且借助正排量泵注入到明膠中以形成含有100毫克活性成分的軟明膠膠囊。膠囊應(yīng)洗滌且干燥。片劑片劑可通過(guò)常規(guī)程序制備，從而使單位劑量為例如100毫克活性成分、0.2毫克膠體二氧化硅、5毫克硬脂酸鎂、275毫克微晶纖維素、11毫克淀粉及98.8毫克乳糖?？赏扛策m當(dāng)?shù)陌乱栽鰪?qiáng)適口性或延遲吸收。注射劑本申請(qǐng)所述肽組分的注射劑可或可不需要使用賦形劑例如已由監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的那些。這些賦形劑包括但不限于溶劑及共溶劑、增溶劑、乳化劑或增稠劑、螯合劑、抗氧化劑及還原劑、抗微生物防腐劑、緩沖劑及ph調(diào)節(jié)劑、增容劑、保護(hù)劑及張力調(diào)節(jié)劑及特殊添加劑。注射劑必須無(wú)菌無(wú)熱原且在溶液的情況下不含顆粒物質(zhì)。適于注射給藥的胃腸外組合物可如下制備：將例如1.5重量％活性成分在可或可不含有共溶劑或其它賦形劑的藥用緩沖液中攪拌。溶液應(yīng)使用氯化鈉產(chǎn)生等張性且滅菌。混懸液水性混懸液可根據(jù)口服和/或胃腸外給藥來(lái)制備，從而使例如每5ml含有100mg細(xì)粉狀活性成分、20mg羧甲基纖維素鈉、5mg苯甲酸鈉、1.0g山梨糖醇溶液(u.s.p.)及0.025ml香草精或其它適口矯味劑。生物降解性微粒適于注射給藥的持續(xù)釋放型胃腸外組合物可例如如下制備：將適合的生物降解性聚合物溶解于溶劑中，將欲并入的活性劑添加至聚合物溶液中且自基質(zhì)中除去溶劑，從而形成活性劑遍布在基質(zhì)中的聚合物基質(zhì)。肽合成本申請(qǐng)應(yīng)根據(jù)化學(xué)鍵合定律及原理來(lái)理解。應(yīng)理解本申請(qǐng)涵蓋的化合物為適當(dāng)?shù)胤€(wěn)定以用作藥劑的那些化合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員基于化學(xué)鍵合及穩(wěn)定性的一般原理將知曉哪些化合物可為穩(wěn)定的及可不為穩(wěn)定的。可采用多種本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行本申請(qǐng)大環(huán)肽的化學(xué)合成，包括經(jīng)由肽片段的構(gòu)形輔助再連接、克隆或合成肽片段的酶連接及化學(xué)連接的逐步固相合成、半合成。合成本申請(qǐng)所述大環(huán)肽及其類似物的優(yōu)選方法為使用各種固相技術(shù)的化學(xué)合成，例如參見(jiàn)chan,w.c.等人編輯,fmocsolidphasesynthesis,oxforduniversitypress,oxford(2000)；barany,g.等人,thepeptides:analysis,synthesis,biology,第2卷:“specialmethodsinpeptidesynthesis,parta”,第3-284頁(yè),gross,e.等人編輯,academicpress,newyork(1980)；及stewart,j.m.等人，solid-phasepeptidesynthesis,第2版,piercechemicalco.,rockford,il(1984)。優(yōu)選的策略基于fmoc基團(tuán)(9-芴基甲基氧基羰基)暫時(shí)保護(hù)α-氨基與叔丁基暫時(shí)保護(hù)氨基酸側(cè)鏈的組合(參見(jiàn)例如atherton,e.等人,“thefluorenylmethoxycarbonylaminoprotectinggroup”,thepeptides:analysis,synthesis,biology,第9卷:“specialmethodsinpeptidesynthesis,partc”,第1-38頁(yè),undenfriend,s.等人編輯,academicpress,sandiego(1987)?？勺噪牡腸末端開(kāi)始以逐步方式在不溶性聚合物載體(亦稱為“樹(shù)脂”)上合成肽。合成開(kāi)始于肽的c末端氨基酸經(jīng)由形成酰胺鍵或酯鍵而附接至樹(shù)脂。這使所得肽最終分別以c末端酰胺或羧酸形式釋放。合成使用的c末端氨基酸及所有其它氨基酸的α-氨基及側(cè)鏈官能團(tuán)(若存在)必需得到有差別的保護(hù)，從而在合成期間可選擇性地除去α-氨基保護(hù)基。氨基酸的偶聯(lián)如下進(jìn)行：將其羧基活化成活性酯且使其與附接至樹(shù)脂的n末端氨基酸的未阻斷的α-氨基反應(yīng)。依序重復(fù)進(jìn)行α-氨基脫保護(hù)及偶聯(lián)直至組裝成整個(gè)肽序列。然后在側(cè)鏈官能團(tuán)脫保護(hù)的伴隨下，通常在限制副反應(yīng)的適當(dāng)清除劑存在下，使肽自樹(shù)脂釋放。所得肽最后通過(guò)反相hplc純化。作為最終肽所需的前體的肽基樹(shù)脂的合成使用商購(gòu)的交聯(lián)聚苯乙烯聚合物樹(shù)脂(novabiochem,sandiego,ca；appliedbiosystems,fostercity,ca)。對(duì)于c末端羧酰胺，優(yōu)選的固體載體為：4-(2’,4’-二甲氧基苯基-fmoc-氨基甲基)-苯氧基乙?；?對(duì)甲基二苯甲胺樹(shù)脂(rink酰胺mbha樹(shù)脂)；9-fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基-merrifield樹(shù)脂(sieber酰胺樹(shù)脂)；4-(9-fmoc)氨基甲基-3,5-二甲氧基苯氧基)戊?；?氨基甲基-merrifield樹(shù)脂(pal樹(shù)脂)。第一個(gè)及后續(xù)氨基酸的偶聯(lián)可分別使用由dic/hobt、hbtu/hobt、bop、pybop產(chǎn)生或由dic/6-cl-hobt、hctu、dic/hoat或hatu產(chǎn)生的hobt、6-cl-hobt或hoat活性酯來(lái)完成。對(duì)于經(jīng)保護(hù)的肽片段，優(yōu)選的固體載體為：2-氯三苯甲基氯化物樹(shù)脂及9-fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基-merrifield樹(shù)脂(sieber酰胺樹(shù)脂)。將第一個(gè)氨基酸裝載至2-氯三苯甲基氯化物樹(shù)脂上通過(guò)使經(jīng)fmoc保護(hù)的氨基酸與樹(shù)脂在二氯甲烷及diea中反應(yīng)而最佳達(dá)成。必要時(shí)，可添加少量dmf以促進(jìn)氨基酸溶解。合成本申請(qǐng)所述肽類似物可使用單通道或多通道肽合成儀進(jìn)行，例如cemliberty微波合成儀或proteintechnologies,inc.prelude(6通道)或symphony(12通道)合成儀。用于各個(gè)肽的肽基樹(shù)脂前體可使用任何標(biāo)準(zhǔn)程序來(lái)裂解及脫保護(hù)(參見(jiàn)例如king,d.s.等人,int.j.peptideproteinres.,36:255-266(1990))。所需方法為在水及tis存在下使用tfa作為清除劑。典型地，將肽基樹(shù)脂在tfa/水/tis(94:3:3,v:v:v；1ml/100mg肽基樹(shù)脂)中在室溫?cái)嚢?至6小時(shí)。然后濾去廢樹(shù)脂且將tfa溶液減壓濃縮或干燥。所得粗肽析出且用et2o洗滌或直接重新溶解于dmso或50％乙酸水溶液中以通過(guò)制備型hplc純化。具有所需純度的肽可通過(guò)使用制備型hplc進(jìn)行純化(例如在waters4000型或shimadzulc-8a型液相色譜儀上)來(lái)得到。將粗肽的溶液注入ymcs5ods(20×100mm)柱中且用mecn/水(均經(jīng)0.1％tfa緩沖)的線性梯度以14至20ml/min的流速洗脫，其中洗脫液根據(jù)220nm的uv吸收度監(jiān)測(cè)。純化的肽的結(jié)構(gòu)可通過(guò)電噴霧ms分析來(lái)確認(rèn)。實(shí)施例本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉在本申請(qǐng)中尤其在以下說(shuō)明性方案及實(shí)施例中所使用的縮寫(xiě)。所使用的一些縮寫(xiě)如下：hobt為1-羥基苯并三唑；hbtu為六氟磷酸o-(苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；bop為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基-三(二甲基氨基)鏻；pybop為六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷子基鏻；hctu為六氟磷酸o-(6-氯-1h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；tfa為三氟乙酸；tis為三異丙基硅烷；dmso為二甲基亞砜；mecn或acn為乙腈；dcm為1,1-二氯甲烷；diea或dipea為二異丙基乙基胺；fmoc為9-芴基甲基氧基羰基；nmm為n-甲基嗎啉；nmp為n-甲基吡咯烷酮；ac為乙?；?；及et為乙基。分析數(shù)據(jù)：質(zhì)譜：“esi-ms(+)”表示以正離子模式進(jìn)行的電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-ms(-)”表示以負(fù)離子模式進(jìn)行的電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-hrms(+)”表示以正離子模式進(jìn)行的高分辨率電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-hrms(-)”表示以負(fù)離子模式進(jìn)行的高分辨率電噴霧離子化質(zhì)譜。所檢測(cè)到的質(zhì)量報(bào)道在“m/z”單位名稱后。準(zhǔn)確質(zhì)量大于1000的化合物常常以雙電荷或三電荷離子形式檢測(cè)到。分析型lcms條件a：柱：behc18，2.1×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：具有0.05％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.05％tfa的乙腈；溫度：50℃；梯度：在2分鐘內(nèi)從2％b變?yōu)?8％b，接著0.5分鐘維持在98％b；流速：0.8ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件b：柱：behc18，2.1×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.05％tfa)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.05％tfa)；溫度：50℃；梯度：在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.75分鐘維持在100％b；流速：1.11ml/min。分析型lcms條件c：柱：behc18，2.1×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：具有0.2％甲酸及0.01％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.2％甲酸及0.01％tfa的乙腈；溫度：50℃；梯度：在2分鐘內(nèi)從2％b變?yōu)?0％b，在0.1分鐘內(nèi)從80％b變?yōu)?8％b，接著0.5分鐘維持在98％b；流速：0.8ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件d：柱：watersacquityuplcbehc18，2.1×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：50℃；梯度：在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.75分鐘維持在100％b；流速：1.11ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件e：柱：watersacquityuplcbehc18，2.1×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；溫度：50℃；梯度：在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.75分鐘維持在100％b；流速：1.11ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件f：柱：watersxbridgec18，2.1×50mm；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：35℃；梯度：在4分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著1分鐘維持在100％b；流速：4ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件g：finniganltq質(zhì)譜儀；柱：phenomenexjupiterc4，1×50mm；流動(dòng)相a：1％甲酸含于水中；流動(dòng)相b：0.1％甲酸含于乙腈中；溫度：30℃；梯度：1min維持在1％b；在3min內(nèi)從1％b變?yōu)?5％b，接著3min維持在95％b；流速：0.15ml/min。分析型lcms條件h：柱：watersbehc18，2.0×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：50℃；梯度：在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.5分鐘維持在100％b；流速：1.0ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型lcms條件i：柱：watersbehc18，2.0×50mm，1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：50℃；梯度：在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.5分鐘維持在100％b；流速：0.5ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型hplc條件a：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在25min內(nèi)從35％b變?yōu)?0％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件b：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在25min內(nèi)從25％b變?yōu)?5％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件c：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在25min內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件d：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在25min內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件e：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在20min內(nèi)從25％b變?yōu)?0％b；流速：1.25ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件f：柱：ymcpackods-aq3μm150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％tfa的水；流動(dòng)相b：具有0.1％tfa的乙腈；溫度：60℃；梯度：在20min內(nèi)從25％b變?yōu)?5％b；流速：1.25ml/min；檢測(cè)：217nmuv。分析型hplc條件g：柱：sunfirec183.5μm，3.0×150mm；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.05％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.05％三氟乙酸)；溫度：50℃；梯度：在12分鐘內(nèi)從10％b變?yōu)?00％b，接著3分鐘維持在100％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型hplc條件h：柱：xbridgephenyl3.5×150μm，流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.05％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.05％三氟乙酸)；溫度：50℃；梯度：在12分鐘內(nèi)從10％b變?yōu)?00％b，接著3分鐘維持在100％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型hplc條件i：柱：phenomenexluna5μc18(2)150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％三氟乙酸的水；流動(dòng)相b：具有0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度：在20min內(nèi)從5％b變?yōu)?00％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：220nmuv。分析型hplc條件j：柱：phenomenexluna5μc18(2)150×4.6mm；流動(dòng)相a：具有0.1％三氟乙酸的水；流動(dòng)相b：具有0.1％三氟乙酸的乙腈；梯度：在20min內(nèi)從10％b變?yōu)?00％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：220nmuv。通用程序：prelude方法a：自動(dòng)化在prelude肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的10或45ml聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至prelude肽合成儀?？赏ㄟ^(guò)管的頂部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。通過(guò)管的底部添加其余試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液。“周期性攪動(dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每30秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。dmf＝二甲基甲酰胺；dic＝n,n’-二異丙基碳二亞胺；hoat＝1-羥基-7-氮雜苯并三唑；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh。“prelude方法a”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約140mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。fmoc-n-甲基氨基酸的偶聯(lián)及與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“仲胺偶聯(lián)程序”。氯乙酰基與肽的n末端的偶聯(lián)參見(jiàn)以下詳述的“氯乙酰氯偶聯(lián)程序”或“氯乙酸偶聯(lián)程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(140mg，0.100mmol)添加至40ml聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(5.0ml)及dcm(5.0ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后排出溶劑。單一偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸的溶液及hoat(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加dic(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)60min，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸的溶液及hoat(0.2m于dmf中，5.0ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加dic(0.2m于dmf中，5.0ml，5eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300min，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。氯乙酰氯偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dipea(4.0mmol，0.699ml，40eq)及氯乙酰氯(2.0mmol，0.160ml，20eq)在dmf中的3.0ml溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)12至18小時(shí)，接著排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加dcm(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后排出溶液。prelude方法b：自動(dòng)化在prelude肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。在裝有底部玻璃濾片的10或45ml聚丙烯中進(jìn)行所有程序。可通過(guò)管的頂部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。通過(guò)管的底部添加其余試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液。“周期性攪動(dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每30秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh?！皃relude方法b”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約140mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“仲胺偶聯(lián)程序”。氯乙?；c肽的n末端的偶聯(lián)參見(jiàn)以下詳述的“氯乙酰氯偶聯(lián)程序”或“氯乙酸偶聯(lián)程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(140mg，0.100mmol)添加至40ml聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(5.0ml)及dcm(5.0ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。單一偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hctu(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，2.5ml，20eq)。將混合物周期性攪動(dòng)30分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。雙重偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hctu(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，2.5ml，20eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。通過(guò)容器頂部用dmf(4.0ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液，如此連續(xù)進(jìn)行3次。將氨基酸(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hctu(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，2.5ml，20eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hctu(0.2m于dmf中，2.5ml，10eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.5ml，12eq)。將混合物周期性攪動(dòng)12h，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。氯乙酰氯偶聯(lián)程序a：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dipea(4.0mmol，0.699ml，40eq)及氯乙酰氯(2.0mmol，0.160ml，20eq)在dmf中的3.0ml溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)12至18小時(shí)，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加ch2cl2(2.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。氯乙酸偶聯(lián)程序b：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dmf(2.0ml)、氯乙酸(1.2mmol，113mg，12eq)及n,n’-二異丙基碳二亞胺(1.2mmol，0.187ml，12eq)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)12至18小時(shí)，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加ch2cl2(2.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液prelude方法c：自動(dòng)化在prelude肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的10或45ml聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至prelude肽合成儀?？赏ㄟ^(guò)管的頂部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。通過(guò)管的底部添加其余試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液?！爸芷谛詳噭?dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每30秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh?！皃relude方法c”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約140mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“仲胺偶聯(lián)程序”。對(duì)樹(shù)脂的最后洗滌使用下述“最終洗滌程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(140mg，0.100mmol)添加至40ml聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(5.0ml)及dcm(5.0ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。單一偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，5.0ml，10eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，2.5ml，20eq)。將混合物周期性攪動(dòng)60分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，1.5ml，12eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，1.5ml，12eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。定制氨基酸偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，0.5至2.5ml，1至5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，0.5至2.5ml，1至5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.5至1.5ml，4至12eq)。將混合物周期性攪動(dòng)60分鐘至600分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。最終洗滌程序：如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dcm(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。氯乙酸偶聯(lián)程序：注意手動(dòng)步驟。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。在室溫振蕩該混合物5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且攪拌所得混合物，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dmf(2.0ml)、氯乙酸(1.2mmol，113mg，12eq)及n,n’-二異丙基碳二亞胺(1.2mmol，0.187ml，12eq)添加至反應(yīng)容器。在室溫振蕩該混合物12至18小時(shí)，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(4.0ml)于容器頂部且攪拌所得混合物90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加ch2cl2(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。prelude方法d：自動(dòng)化在prelude肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的10或45ml聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至prelude肽合成儀?？赏ㄟ^(guò)管的頂部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。通過(guò)管的底部添加其余試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液?！爸芷谛詳噭?dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每30秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh。“prelude方法d”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約140mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“仲胺偶聯(lián)程序”。對(duì)樹(shù)脂的最后洗滌使用下述“最終洗滌程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(140mg，0.100mmol)添加至40ml聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(5.0ml)及dcm(5.0ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。單一偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.75ml，5eq)。將混合物周期性攪動(dòng)30分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.75ml，5eq)。將混合物周期性攪動(dòng)30分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，2.5eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.75ml，5eq)。將混合物周期性攪動(dòng)30分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。最終洗滌程序：如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dcm(4.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。氯乙酸偶聯(lián)程序：注意手動(dòng)步驟。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。在室溫振蕩該混合物5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且攪拌所得混合物，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dmf(2.0ml)、氯乙酸(1.2mmol，113mg，12eq)及n,n’-二異丙基碳二亞胺(1.2mmol，0.187ml，12eq)添加至反應(yīng)容器。在室溫振蕩該混合物12至18小時(shí)，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(4.0ml)于容器頂部且攪拌所得混合物90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加ch2cl2(4.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。cem方法a：自動(dòng)化在cemliberty微波肽合成儀(cemcorporation)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在與cemdiscovery微波單元連接的裝有底部玻璃濾片的30或125ml聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至cemliberty合成儀?？赏ㄟ^(guò)管的頂部及底部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。除從頂部轉(zhuǎn)移樹(shù)脂外，通過(guò)管的底部除去所有溶液。“周期性鼓泡”描述的是，n2氣體短暫鼓泡通過(guò)底部玻璃濾片。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。可在合成中使用其它常見(jiàn)樹(shù)脂例如rink、氯三苯甲基或其它酸敏感性連接基，除非在具體實(shí)施例中另有注明，否則使用seiber酰胺樹(shù)脂。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-orn(boc)-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh。“cem方法a”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約140mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“仲胺偶聯(lián)程序”。氯乙?；c肽的n末端的偶聯(lián)參見(jiàn)以上詳述的“氯乙酰氯偶聯(lián)程序”或“氯乙酸偶聯(lián)程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(140mg，0.100mmol)添加至50ml聚丙烯圓錐管。然后，將dmf(7ml)添加至管，接著添加dcm(7ml)。接著將樹(shù)脂從容器頂部轉(zhuǎn)移至反應(yīng)容器。再重復(fù)該程序兩次。添加dmf(7ml)，接著添加dcm(7ml)。通過(guò)從反應(yīng)容器底部將n2鼓泡15分鐘使樹(shù)脂溶脹，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)、hatu(0.5m于dmf中，1.0ml，5eq)及dipea(2m于nmp中，0.5ml，10eq)添加至反應(yīng)容器。除在50℃偶聯(lián)的fmoc-cys(trt)-oh及fmoc-his(trt)-oh外，針對(duì)所有氨基酸通過(guò)在75℃將n2鼓泡5分鐘使混合物得以混合，通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物在65℃周期性鼓泡2分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。雙重偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)、hatu(0.5m于dmf中，1.0ml，5eq)及dipea(2m于nmp中，0.5ml，10eq)添加至反應(yīng)容器。除在50℃偶聯(lián)的fmoc-cys(trt)-oh及fmoc-his(trt)-oh外，針對(duì)所有氨基酸通過(guò)在75℃將n2鼓泡5分鐘使混合物得以混合，通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)、hatu(0.5m于dmf中，1.0ml，5eq)及dipea(2m于nmp中，0.5ml，10eq)添加至反應(yīng)容器。除在50℃偶聯(lián)的fmoc-cys(trt)-oh及fmoc-his(trt)-oh外，針對(duì)所有氨基酸通過(guò)在75℃將n2鼓泡5分鐘使混合物得以混合，通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物在65℃周期性鼓泡2分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：將5％哌嗪及0.1mhobt在dmf(7ml)中的溶液添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物在75℃周期性振蕩3分鐘且接著排出溶液。再次重復(fù)此程序。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將氨基酸(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq)、hctu(0.5m于dmf中，1.0ml，5eq)及dipea(2m于nmp中，0.5ml，10eq)添加至反應(yīng)容器。針對(duì)所有氨基酸通過(guò)在75℃(就fmoc-cys(trt)-oh及fmoc-his(trt)-oh而言在50℃)將n2鼓泡5分鐘使混合物得以混合，接著在不加熱的情況下保持6h。排出后，如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物在65℃周期性鼓泡2分鐘，接著排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。定制氨基酸偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將含有hatu(2.5eq至10eq)的氨基酸溶液(1.25ml至5ml，2.5eq至10eq)添加至反應(yīng)容器及最后添加dipea(2m于nmp中，0.5ml至1ml，20eq)。通過(guò)在25℃至75℃將n2鼓泡5分鐘至2小時(shí)使混合物得以混合，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將乙酸酐:diea:dmf(10:1:89v/v/v，5.0ml)的溶液添加至反應(yīng)容器。將混合物在65℃周期性鼓泡2分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：用dmf(7ml)從頂部洗滌，接著用dmf(7ml)從底部洗滌及最后用dmf(7ml)從頂部洗滌。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。symphony方法a：自動(dòng)化在symphony肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的symphony聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至symphony肽合成儀。通過(guò)管的底部添加所有溶劑、dmf、dcm、氨基酸及試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液?！爸芷谛詳噭?dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每15秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；nmm＝n-甲基嗎啉；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。亦可在合成中使用其它常見(jiàn)酸敏感性樹(shù)脂例如rink或官能化氯三苯甲基樹(shù)脂。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh?！皊ymphony方法a”的程序描述了以0.050mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約70mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.050mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用“雙重偶聯(lián)”，定制氨基酸通過(guò)手動(dòng)blank添加即下述氨基酸“blank偶聯(lián)”來(lái)偶聯(lián)。溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(70mg，0.050mmol)添加至symphony聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。定制氨基酸偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。通過(guò)symphony軟件暫停合成以將定制氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)手動(dòng)添加至反應(yīng)容器，接著重新啟動(dòng)自動(dòng)化以添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)300分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(2.5ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液，如此進(jìn)行六次。將ac2o/dipea/dmf(v/v/v1:1:3，2.5ml)添加至反應(yīng)容器，將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。symphony方法b：自動(dòng)化在symphony肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的symphony聚丙烯管中進(jìn)行所有程序。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至symphony肽合成儀。通過(guò)管的底部添加所有溶劑、dmf、dcm、氨基酸及試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液?！爸芷谛詳噭?dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每15秒進(jìn)行一次。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hctu＝2-(6-氯-1-h-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鎓；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；nmm＝n-甲基嗎啉；dipea＝二異丙基乙基胺；sieber＝fmoc-氨基-夾氧雜蒽-3-基氧基，其中“3-基氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有sieber連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.71mmol/g負(fù)載。亦可在合成中使用其它常見(jiàn)酸敏感性樹(shù)脂例如rink或官能化氯三苯甲基樹(shù)脂。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh。“symphony方法b”的程序描述了以0.050mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約70mg上述sieber-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.050mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用“仲胺偶聯(lián)程序b”，定制氨基酸通過(guò)手動(dòng)blank添加即下述氨基酸“定制氨基酸偶聯(lián)程序”來(lái)偶聯(lián)及使用下述“最終封端程序”添加氯乙酸酐至序列的最后位置。溶脹程序：將merrifield:sieber樹(shù)脂(70mg，0.050mmol)添加至symphony聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后經(jīng)由使n2自反應(yīng)容器底部鼓泡將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將ac2o/dipea/dmf(v/v/v1:1:3，2.5ml)添加至反應(yīng)容器，將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。仲胺偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)且最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將ac2o/dipea/dmf(v/v/v1:1:3，2.5ml)添加至反應(yīng)容器，將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。定制氨基酸偶聯(lián)程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將系統(tǒng)暫停以手動(dòng)添加定制氨基酸(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)至反應(yīng)容器，接著重新啟動(dòng)自動(dòng)化以向反應(yīng)容器中添加hatu(0.2m于dmf中，1.25ml，5eq)及最后添加nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將ac2o/dipea/dmf(v/v/v1:1:3，2.5ml)添加至反應(yīng)容器，將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。最終封端程序：如下洗滌樹(shù)脂三次：將dmf(2.5ml)添加至反應(yīng)容器，然后通過(guò)從反應(yīng)容器底部鼓泡n2將混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.5ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)2.5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加氯乙酸酐(0.4m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。用通過(guò)容器底部添加的dmf(6.25ml)洗滌樹(shù)脂且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將nmm(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加氯乙酸酐(0.4m于dmf中，1.25ml，10eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂6次：通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將ac2o/dipea/dmf(v/v/v1:1:3，2.5ml)添加至反應(yīng)容器，將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dmf(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒。然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器底部添加dcm(2.5ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。接著用氮?dú)鈿饬鲗⑺脴?shù)脂干燥10min。整體脫保護(hù)方法a：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！罢w脫保護(hù)方法a”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:水:三異丙基硅烷:二硫蘇糖醇(92.5:2.5:2.5:2.5v:v:v:w)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至25ml配備有玻璃濾片的針筒。將“脫保護(hù)溶液”(5.0ml)添加至針筒。在振蕩器中將混合物混合85min。過(guò)濾溶液，濃縮且在乙醚(30ml)中稀釋。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。整體脫保護(hù)方法b：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“整體脫保護(hù)方法b”的程序?yàn)橐?.04mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.04mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:三異丙基硅烷(96:4；v:v)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至10ml配備有玻璃濾片的針筒。將“脫保護(hù)溶液”(2.0至3.0ml)添加至針筒。在振蕩器中將混合物混合1h或1.5h。過(guò)濾溶液，用脫保護(hù)溶液(0.5ml)洗滌，濃縮，然后在乙醚(30ml)中稀釋。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。整體脫保護(hù)方法c：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“整體脫保護(hù)方法c”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:三異丙基硅烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至bio-rad管。將“脫保護(hù)溶液”(4.0ml)添加至bio-rad管。在振蕩器中將混合物混合60分鐘。過(guò)濾溶液且在乙醚(30ml)中稀釋。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。整體脫保護(hù)方法d：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！罢w脫保護(hù)方法d”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:三異丙基硅烷:二硫蘇糖醇(94:3:3v:v:w)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至25ml配備有玻璃濾片的針筒。將“脫保護(hù)溶液”(5.0ml)添加至針筒。在振蕩器中將混合物混合5分鐘。過(guò)濾溶液且在乙醚(30ml)中稀釋。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。整體脫保護(hù)方法e：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！罢w脫保護(hù)方法e”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的fmocgly-cltrt連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:三異丙基硅烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至bio-rad管。將“脫保護(hù)溶液”(2.0ml)添加至bio-rad管。在振蕩器中將混合物混合3分鐘。過(guò)濾溶液且收集于離心管中。將“脫保護(hù)溶液”(2.0ml)添加至bio-rad管。在振蕩器中將混合物混合3分鐘。過(guò)濾溶液且收集于離心管中。將“脫保護(hù)溶液”(2.0ml)添加至bio-rad管。在振蕩器中將混合物混合3分鐘。過(guò)濾溶液且收集于離心管中。將離心管中的溶液靜置60分鐘。接著用乙醚(30ml)稀釋所收集的溶液及形成析出物。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。整體脫保護(hù)方法f：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！罢w脫保護(hù)方法f”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的rink連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。使用三氟乙酸:三異丙基硅烷:二硫蘇糖醇(95:2.5:2.5v:v:w)制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至6mlbio-rad管。將“脫保護(hù)溶液”(4.0ml)添加至bio-rad。在振蕩器中將混合物混合90分鐘。過(guò)濾溶液且在乙醚(30ml)中稀釋。離心所析出的固體3分鐘。傾出上清液且將固體再次懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且將殘余固體懸浮于乙醚(25ml)中。離心懸浮液3分鐘。傾出上清液且在高真空下干燥殘余固體。獲得呈灰白色固體的粗肽。環(huán)化方法a除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“環(huán)化方法a”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于乙腈:8m胍水溶液/50mmtris(1:3)(ph8.6)(7ml:18ml或類似比例)的溶液中且接著按需使用naoh水溶液(1.0m)將溶液調(diào)節(jié)至ph＝8.5至9.0。接著使用振蕩器將溶液混合12至18小時(shí)。濃縮反應(yīng)溶液且接著將殘余物溶解于乙腈:水中。對(duì)該溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。環(huán)化方法c：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“環(huán)化方法c”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于乙腈:0.1m碳酸氫銨緩沖水溶液(11ml:24ml或類似比例)的溶液中且接著使用naoh水溶液(1.0m)小心地將溶液調(diào)節(jié)至ph＝8.5至9.0。接著使用振蕩器將溶液混合12至18小時(shí)。濃縮反應(yīng)溶液且接著將殘余物溶解于乙腈:水中。對(duì)該溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。環(huán)化方法d：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“環(huán)化方法d”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于乙腈:0.1m碳酸氫銨緩沖水溶液(11ml:24ml)的溶液中且接著使用naoh水溶液(1.0m)小心地將溶液調(diào)節(jié)至ph＝8.5至9.0。接著通過(guò)攪拌將溶液混合12至18小時(shí)。濃縮反應(yīng)溶液且接著將殘余物溶解于乙腈:水中。對(duì)該溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。環(huán)化方法e：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！碍h(huán)化方法e”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于6m鹽酸胍緩沖水溶液(15ml)中，接著通過(guò)攪拌將溶液混合12至18小時(shí)。濃縮反應(yīng)溶液且將15mldmso添加至殘余物，得到漿液，將其過(guò)濾。對(duì)所過(guò)濾的該溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。手動(dòng)偶聯(lián)程序a：將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的bio-rad反應(yīng)容器。將混合物周期性振蕩5分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂五次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物振蕩60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(1.2至10當(dāng)量)(典型為(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq))添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(1.210當(dāng)量)(典型為(0.2m于dmf中，2.5ml，5eq))且最后添加dipea(2.4至20當(dāng)量)(典型為(0.8m于dmf中，1.25ml，10eq))。將混合物振蕩60分鐘至18小時(shí)，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(4.0ml)且將所得混合物振蕩60秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。樹(shù)脂上n-甲基化方法a(turner,r.a.；hauksson,n.e.；gipe,j.h.；lokey,r.s.org.lett.2013,15(19),5012-5015)：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！皹?shù)脂上n-甲基化方法a”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的sieber連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將樹(shù)脂轉(zhuǎn)移至25ml燒結(jié)針筒。將哌啶:dmf(20:80v/v，5.0ml)添加至樹(shù)脂。將混合物振蕩3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。用dmf(4.0ml)洗滌樹(shù)脂3次。將哌啶:dmf(20:80v/v，4.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物振蕩3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。用dmf(4.0ml)連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次，然后用dcm(4.0ml)洗滌三次。將樹(shù)脂懸浮于dmf(2.0ml)及三氟乙酸乙酯(0.119ml，1.00mmol)、1,8-二氮雜雙環(huán)[5.4.0]十一碳-7-烯(0.181ml，1.20mmol)中。將混合物置于振蕩器上60min。通過(guò)玻璃濾片排出溶液。用dmf(4.0ml)連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次，然后用dcm(4.0ml)洗滌三次。用無(wú)水thf(2.0ml)洗滌樹(shù)脂三次以除去任何殘留水。在經(jīng)烘箱干燥的4.0ml小瓶中，將thf(1.0ml)及三苯基膦(131mg，0.500mmol)加到干燥分子篩(20mg)上。將溶液轉(zhuǎn)移至樹(shù)脂且慢慢地添加偶氮二羧酸二異丙酯(0.097ml，0.5mmol)。攪拌樹(shù)脂15min。通過(guò)玻璃濾片排出溶液且用無(wú)水thf(2.0ml)洗滌樹(shù)脂三次以除去任何殘留水。在經(jīng)烘箱干燥的4.0ml小瓶中，將thf(1.0ml)、三苯基膦(131mg，0.500mmol)加到干燥分子篩(20mg)上。將溶液轉(zhuǎn)移至樹(shù)脂且慢慢地添加偶氮二羧酸二異丙酯(0.097ml，0.5mmol)。攪拌樹(shù)脂15min。通過(guò)玻璃濾片排出溶液。用dmf(4.0ml)連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次，然后用dcm(4.0ml)洗滌三次。將樹(shù)脂懸浮于乙醇(1.0ml)及thf(1.0ml)中且添加硼氫化鈉(37.8mg，1.000mmol)。將混合物攪拌30min并排出。用dmf(4.0ml)連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次，然后用dcm(4.0ml)洗滌三次。微裂解a：將2滴tis及1ml三氟乙酸添加至<10mg的小份樹(shù)脂樣品，在室溫振蕩。1h后，取出小份等分試樣并用0.5ml乙腈稀釋，過(guò)濾及通過(guò)lc-ms分析。制備實(shí)施例1001在rink樹(shù)脂上遵循通用合成程序制備實(shí)施例1001：遵循fmoc-gly-oh“symphony方法b：樹(shù)脂溶脹程序”遵循fmoc-cys(trt)-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-arg(pbf)-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-n-甲基-nle-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-n-甲基-nle-oh“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”遵循fmoc-trp(boc)-oh“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”遵循fmoc-ser(tbu)-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-trp(boc)-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-環(huán)戊基-gly-oh“手動(dòng)偶聯(lián)程序a”遵循fmoc-leu-oh“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”遵循fmoc-his(trt)-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-pro-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-asn(trt)-oh“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”遵循fmoc-n-甲基-ala-oh“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”遵循fmoc-phe-oh“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”遵循“symphony方法b：最終封端程序”遵循“整體脫保護(hù)方法f”遵循“環(huán)化方法d”通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：watersxbridgec18,19×250mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；梯度：在25分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為6.4mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析型lcms條件d：保留時(shí)間＝1.67min；esi-ms(+)m/z947.2(m+2h)。分析型lcms條件e：保留時(shí)間＝1.57min；esi-ms(+)m/z946.7(m+2h)。制備實(shí)施例1002在rink樹(shù)脂上遵循針對(duì)制備實(shí)施例1001所述的通用合成順序制備實(shí)施例1002，其由以下通用程序構(gòu)成：“symphony方法b：樹(shù)脂溶脹程序”、“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”、“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”、“手動(dòng)偶聯(lián)程序a”、“symphony方法b：最終封端程序”、“整體脫保護(hù)方法f”及“環(huán)化方法d”。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：watersxbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在25分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為6.0mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析型lcms條件d：保留時(shí)間＝1.60min；esi-ms(+)m/z934.0(m+2h)。分析型lcms條件e：保留時(shí)間＝1.52min；esi-ms(+)m/z933.9(m+2h)。制備實(shí)施例1003在rink樹(shù)脂上遵循針對(duì)制備實(shí)施例1001所述的通用合成順序制備實(shí)施例1003，其由以下通用程序構(gòu)成：“symphony方法b：樹(shù)脂溶脹程序”、“symphony方法b：標(biāo)準(zhǔn)偶聯(lián)程序”、“symphony方法b：仲胺偶聯(lián)程序”、“手動(dòng)偶聯(lián)程序a”、“symphony方法b：最終封端程序”、“整體脫保護(hù)方法f”及“環(huán)化方法d”。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：watersxbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在25分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為2.2mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析型lcms條件d：保留時(shí)間＝1.58min；esi-ms(+)m/z926.7(m+2h)。分析型lcms條件e：保留時(shí)間＝1.51min；esi-ms(+)m/z926.2(m+2h)。化合物5001分析數(shù)據(jù)：質(zhì)譜：“esi-ms(+)”表示以正離子模式進(jìn)行的電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-ms(-)”表示以負(fù)離子模式進(jìn)行的電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-hrms(+)”表示以正離子模式進(jìn)行的高分辨率電噴霧離子化質(zhì)譜；“esi-hrms(-)”表示以負(fù)離子模式進(jìn)行的高分辨率電噴霧離子化質(zhì)譜。所檢測(cè)到的質(zhì)量報(bào)道在“m/z”單位名稱后。準(zhǔn)確質(zhì)量大于1000的化合物常常以雙電荷或三電荷離子形式檢測(cè)到?；衔?001分析條件a：柱：watersbehc18,2.0×50mm,1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：50℃；梯度：0％b，在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.5分鐘維持在100％b；流速：1ml/min；檢測(cè)：220nmuv?；衔?001分析條件b：柱：watersbehc18,2.0×50mm,1.7μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；溫度：50℃；梯度：0％b，在3分鐘內(nèi)從0％b變?yōu)?00％b，接著0.5分鐘維持在100％b；流速：0.5ml/min；檢測(cè)：220nmuv。制備實(shí)施例5001如下制備實(shí)施例5001。將rink-merrifield樹(shù)脂(178mg，0.100mmol)添加至10ml聚丙烯固相反應(yīng)容器且將反應(yīng)容器置于prelude肽合成儀上。遵循“prelude方法a：樹(shù)脂溶脹程序”。接著在prelude上若與樹(shù)脂結(jié)合的肽的n末端為伯胺則遵循“prelude方法a：?jiǎn)我慌悸?lián)程序”或若與樹(shù)脂結(jié)合的肽的n末端為仲胺則遵循“prelude方法a：雙重偶聯(lián)程序”連續(xù)進(jìn)行一系列氨基酸偶聯(lián)。遵循“prelude方法a：氯乙酰氯偶聯(lián)程序”；接著遵循“整體脫保護(hù)方法a”；然后，遵循“環(huán)化方法a”。如所示那樣在合成中使用1-((((9h-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)環(huán)丙烷羧酸(fmoc-acpc-oh)。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從10％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為14.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為95％。分析條件a：保留時(shí)間＝2.10min；esi-ms(+)m/z888.3(m-2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.85min；esi-ms(+)m/z890.5(m+2h)。以下示例的所有實(shí)施例遵循“通用合成順序a”進(jìn)行制備通用合成順序a：“通用合成順序a”描述了用于得到本申請(qǐng)所述環(huán)肽的程序的通用順序。出于此通用程序的目的，“symphony方法a”的程序可與“prelude方法a”的程序互換。向10ml聚丙烯固相反應(yīng)容器中添加rink-merrifield樹(shù)脂(178mg，0.100mmol)且將反應(yīng)容器放置在prelude肽合成儀上。進(jìn)行“prelude方法a：樹(shù)脂溶脹程序”。然后在prelude上遵循“prelude方法a：?jiǎn)我慌悸?lián)程序”(若與樹(shù)脂結(jié)合的肽的n末端為伯胺)或“prelude方法a：雙重偶聯(lián)程序”(若與樹(shù)脂結(jié)合的肽的n末端為仲胺)依次進(jìn)行一系列氨基酸偶聯(lián)。進(jìn)行“prelude方法a：氯乙酰氯偶聯(lián)程序”；然后進(jìn)行“整體脫保護(hù)方法a”；然后進(jìn)行“環(huán)化方法a”。通用程序：prelude方法a：自動(dòng)化在prelude肽合成儀(proteintechnologies)上進(jìn)行所有操作。除非注明，否則在裝有底部玻璃濾片的10ml聚丙烯管中進(jìn)行所有程序；當(dāng)反應(yīng)規(guī)模超過(guò)0.100mmol時(shí)，使用裝有底部玻璃濾片的40ml聚丙烯管。管經(jīng)由管的底部和頂部連接至prelude肽合成儀。可通過(guò)管的頂部添加dmf及dcm，其均等地沿著管的側(cè)壁沖下。通過(guò)管的底部添加其余試劑且向上通過(guò)玻璃濾片而與樹(shù)脂接觸。通過(guò)管的底部除去所有溶液?！爸芷谛詳噭?dòng)”描述的是，n2氣體短暫脈沖通過(guò)底部玻璃濾片；脈沖持續(xù)約5秒且每30秒進(jìn)行一次。氯乙酰氯在dmf中的溶液在制備后24h內(nèi)使用。氨基酸溶液由制備到使用通常不超過(guò)三周。hatu溶液在制備后5天內(nèi)使用。dmf＝二甲基甲酰胺；hatu＝六氟磷酸1-[二(二甲基氨基)亞甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡錠3-氧化物；dipea＝二異丙基乙基胺；rink＝(2,4-二甲氧基苯基)(4-烷氧基苯基)甲胺，其中“4-烷氧基”描述了與聚苯乙烯樹(shù)脂連接的位置及類型。所使用的樹(shù)脂為具有rink連接基(在氮處經(jīng)fmoc保護(hù))的merrifield聚合物(聚苯乙烯)；100至200目，1％dvb，0.56mmol/g負(fù)載。所用常見(jiàn)氨基酸如下所列，其中側(cè)鏈保護(hù)基示于括號(hào)內(nèi)。fmoc-ala-oh；fmoc-arg(pbf)-oh；fmoc-asn(trt)-oh；fmoc-asp(otbu)-oh；fmoc-bzt-oh；fmoc-cys(trt)-oh；fmoc-dab(boc)-oh；fmoc-dap(boc)-oh；fmoc-gln(trt)-oh；fmoc-gly-oh；fmoc-his(trt)-oh；fmoc-hyp(tbu)-oh；fmoc-ile-oh；fmoc-leu-oh；fmoc-lys(boc)-oh；fmoc-nle-oh；fmoc-met-oh；fmoc-[n-me]ala-oh；fmoc-[n-me]nle-oh；fmoc-phe-oh；fmoc-pro-oh；fmoc-sar-oh；fmoc-ser(tbu)-oh；fmoc-thr(tbu)-oh；fmoc-trp(boc)-oh；fmoc-tyr(tbu)-oh；fmoc-val-oh?！皃relude方法a”的程序描述了以0.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的rink連接基的量確定。此規(guī)模相當(dāng)于約178mg上述rink-merrifield樹(shù)脂。所有程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。氨基酸偶聯(lián)前，以樹(shù)脂溶脹程序(以下稱為“樹(shù)脂溶脹程序”)開(kāi)始所有肽合成順序。氨基酸與伯胺n末端的偶聯(lián)使用下述“單一偶聯(lián)程序”。氨基酸與仲胺n末端的偶聯(lián)使用下述“雙重偶聯(lián)程序”。氯乙酰氯與肽的n末端的偶聯(lián)參見(jiàn)以下詳述的“氯乙酰氯偶聯(lián)程序”。樹(shù)脂溶脹程序：將merrifield:rink樹(shù)脂(178mg，0.100mmol)添加至10ml聚丙烯固相反應(yīng)容器。如下洗滌(溶脹)樹(shù)脂三次：將dmf(2.0ml)添加至反應(yīng)容器，然后將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶劑。單一偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.5ml，4eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐(2.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。雙重偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.5ml，4eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將氨基酸(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加hatu(0.2m于dmf中，1.0ml，2eq)且最后添加dipea(0.8m于dmf中，0.5ml，4eq)。將混合物周期性攪動(dòng)15分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出反應(yīng)溶液。如下洗滌樹(shù)脂兩次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將乙酸酐(2.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)10分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂直接用于下一步。氯乙酰氯偶聯(lián)程序：將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至含有來(lái)自先前步驟的樹(shù)脂的反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將哌啶:dmf(20:80v/v，2.0ml)添加至反應(yīng)容器。將混合物周期性攪動(dòng)3分鐘且接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂六次：對(duì)于每次洗滌，通過(guò)容器頂部添加dmf(2.0ml)且將所得混合物周期性攪動(dòng)30秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將dipea(0.8m于dmf中，3.0ml，24eq)添加至反應(yīng)容器，接著添加氯乙酰氯(0.8m于dmf中，1.65ml，13.2eq)。將混合物周期性攪動(dòng)30分鐘，接著通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂三次：對(duì)于每次洗滌，添加dmf(2.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。如下連續(xù)洗滌樹(shù)脂四次：對(duì)于每次洗滌，添加ch2cl2(2.0ml)于容器頂部且將所得混合物周期性攪動(dòng)90秒，然后通過(guò)玻璃濾片排出溶液。將所得樹(shù)脂置于n2氣流下15分鐘。symphony方法a：除注明外，該程序集與“prelude方法a”的程序集相同。對(duì)于所有程序，使用symphonyx肽合成儀(proteintechnologies)替代prelude肽合成儀及通過(guò)反應(yīng)容器頂部添加所有試劑。樹(shù)脂溶脹程序：該程序與“prelude方法a：樹(shù)脂溶脹程序”相同。單一偶聯(lián)程序：該程序與“prelude方法a：?jiǎn)我慌悸?lián)程序”相同，但dipea溶液的濃度為0.4m且將1.0ml該溶液遞送至反應(yīng)。雙重偶聯(lián)程序：該程序與“prelude方法a：雙重偶聯(lián)程序”相同，但dipea溶液的濃度為0.4m且將1.0ml該溶液遞送至反應(yīng)。氯乙酰氯偶聯(lián)程序：該程序與“prelude方法a：氯乙酰氯偶聯(lián)程序”相同。整體脫保護(hù)方法a：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作。“整體脫保護(hù)方法a”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至樹(shù)脂的rink連接基的量確定。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。通過(guò)在40ml玻璃小瓶中將三氟乙酸(22ml)、苯酚(1.325g)、水(1.25ml)及三異丙基硅烷(0.5ml)組合制備“脫保護(hù)溶液”。自反應(yīng)容器取出樹(shù)脂且轉(zhuǎn)移至4ml玻璃小瓶。將“脫保護(hù)溶液”(2.0ml)添加至小瓶。將混合物在振蕩器中劇烈混合(以1000rpm混合1分鐘，接著以500rpm混合1至2h)。通過(guò)0.2微米針筒過(guò)濾器過(guò)濾混合物及用“脫保護(hù)溶液”(1.0ml)或tfa(1.0ml)萃取固體。將et2o(15ml)添加至裝有所合并的濾液的24ml試管。將混合物劇烈混合，然后析出大量白色固體。將混合物離心5分鐘，接著自固體傾出溶液并棄去。將固體懸浮于et2o(20ml)中；接著將混合物離心5分鐘；及自固體傾出溶液并棄去。對(duì)于最后一次，將固體懸浮于et2o(20ml)中；將混合物離心5分鐘；及自固體傾出溶液并棄去，得到呈灰白色固體的粗肽。環(huán)化方法a：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！碍h(huán)化方法a”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的rink連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于mecn:0.1mnh4oac水溶液(30ml:30ml)中且接著使用naoh水溶液(1.0m)小心地將溶液調(diào)節(jié)至ph＝8.5至9.0。接著將溶液在無(wú)攪拌下靜置12至18h。濃縮反應(yīng)溶液且接著將殘余物溶解于dmso:meoh中。對(duì)溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。環(huán)化方法b：除非另外注明，否則手動(dòng)進(jìn)行所有操作?！碍h(huán)化方法b”的程序?yàn)橐?.100mmol規(guī)模進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，其中所述規(guī)模由結(jié)合至用于產(chǎn)生肽的樹(shù)脂的rink連接基的量確定。此規(guī)模不是基于直接確定程序所使用的肽的量。程序可通過(guò)以所述規(guī)模的倍數(shù)調(diào)整所述體積而放大超過(guò)0.100mmol規(guī)模。將粗肽固體溶解于mecn:0.1mnh4oac水溶液(1:1)中至18至22ml的總體積且接著使用naoh水溶液(1.0m)小心地將溶液調(diào)節(jié)至ph＝8.5至9.0。接著將溶液在無(wú)攪拌下靜置12至18h。濃縮反應(yīng)溶液且接著將殘余物溶解于dmso:meoh中。對(duì)溶液進(jìn)行反相hplc純化，得到所需環(huán)狀肽。制備實(shí)施例9001實(shí)施例9001通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為19.4mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.62min；esi-ms(+)m/z963.4(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.84min；esi-ms(+)m/z963.8(m+2h)。制備實(shí)施例9002實(shí)施例9002通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從40％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為24.0mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.63min；esi-ms(+)m/z954.75(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝3.11min；esi-ms(+)m/z954.25(m+2h)。制備實(shí)施例9003實(shí)施例9003通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為35.5mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.61min；esi-ms(+)m/z964.3(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.84min；esi-ms(+)m/z964.1(m+2h)。制備實(shí)施例9004實(shí)施例9004通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從45％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為23.9mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為99％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.48min；esi-ms(+)m/z956.0(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.67min；esi-ms(+)m/z955.7(m+2h)。制備實(shí)施例9005實(shí)施例9005通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從40％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為18.8mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為99％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.64min；esi-ms(+)m/z901.6(m+2h)。制備實(shí)施例9006實(shí)施例9006通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從50％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為40.5mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.59min；esi-ms(+)m/z900.3(m+2h)。制備實(shí)施例9007實(shí)施例9007通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從45％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件進(jìn)一步純化物質(zhì)：柱：waterscshc18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從5％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為19.3mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.95min；esi-ms(+)m/z907.8(m+2h)。制備實(shí)施例9008實(shí)施例9008通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從45％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為14.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為98％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.90min；esi-ms(+)m/z906.6(m+2h)。制備實(shí)施例9009實(shí)施例9009通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從40％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件進(jìn)一步純化物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從5％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為2.2mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為91％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.73min；esi-ms(+)m/z901.4(m+2h)。制備實(shí)施例9011實(shí)施例9011通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從40％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為29.2mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為98％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.81min；esi-ms(+)m/z914.8(m+2h)。制備實(shí)施例9012實(shí)施例9012通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從40％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件進(jìn)一步純化物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為16.4mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為96％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.97min；esi-ms(+)m/z914.3(m+2h)。制備實(shí)施例9013實(shí)施例9013通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從45％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為21.9mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.78min；esi-ms(+)m/z901.4(m+2h)。制備實(shí)施例9014實(shí)施例9014通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5甲醇:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從50％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為35.3mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.76min；esi-ms(+)m/z900.2(m+2h)。制備實(shí)施例9015實(shí)施例9015通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為15.8mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為99％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.56min；esi-ms(+)m/z914.3(m+2h)。制備實(shí)施例9016實(shí)施例9016通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：waterscshc-18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；梯度：在30分鐘內(nèi)從15％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為17.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為94％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.65min；esi-ms(+)m/z938.1(m+2h)。制備實(shí)施例9017實(shí)施例9017通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在30分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件進(jìn)一步純化物質(zhì)：柱：waterscshc18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從25％b變?yōu)?5％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為20.3mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.76min；esi-ms(+)m/z927.9(m+2h)。制備實(shí)施例9018實(shí)施例9018通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化粗物質(zhì)：柱：waterscshc-18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有0.1％三氟乙酸)；梯度：在30分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為4.8mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為96％。分析條件a：保留時(shí)間＝184min；esi-ms(+)m/z951.9(m+2h)。制備實(shí)施例10001實(shí)施例10001通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10001的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為16.5mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為95％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.82min；esi-ms(+)m/z962.8(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.98min；esi-ms(+)m/z962.8(m+2h)。制備實(shí)施例10002實(shí)施例10002通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10002的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為3.9mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.81min；esi-ms(+)m/z970.9(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.98min；esi-ms(+)m/z970.8(m+2h)。制備實(shí)施例10003實(shí)施例10003通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10003的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為33.4mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.76min；esi-ms(+)m/z957.0(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.97min；esi-ms(+)m/z956.8(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：955.9633(m+2h)；實(shí)測(cè)值：955.9610(m+2h)。制備實(shí)施例10004實(shí)施例10004通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10004的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為17.2mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.72min；esi-ms(+)m/z964.8(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.97min；esi-ms(+)m/z964.7(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：963.9607(m+2h)；實(shí)測(cè)值：963.9581(m+2h)。制備實(shí)施例10005實(shí)施例10005通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10005的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為10.0mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.65min；esi-ms(+)m/z956.6(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.87min；esi-ms(+)m/z956.7(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：955.9633(m+2h)；實(shí)測(cè)值：955.9601(m+2h)。制備實(shí)施例10006實(shí)施例10006通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10006的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為12.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.61min；esi-ms(+)m/z965.1(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.85min；esi-ms(+)m/z965.0(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：963.9580(m+2h)；實(shí)測(cè)值：963.9607(m+2h)。制備實(shí)施例10007實(shí)施例10007通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10007的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為13.3mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.51min；esi-ms(+)m/z956.7(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.66min；esi-ms(+)m/z956.3(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：955.4801(m+2h)；實(shí)測(cè)值：955.4766(m+2h)。制備實(shí)施例10008實(shí)施例10008通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10008的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為16.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為100％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.73min；esi-ms(+)m/z971.8(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.96min；esi-ms(+)m/z971.7(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：970.9686(m+2h)；實(shí)測(cè)值：970.9667(m+2h)。制備實(shí)施例10009實(shí)施例10009通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10009的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為44.3mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為97％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.67min；esi-ms(+)m/z963.2(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.86min；esi-ms(+)m/z963.3(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：962.4880(m+2h)；實(shí)測(cè)值：962.4857(m+2h)。制備實(shí)施例10010實(shí)施例10010通過(guò)制備型lc/ms利用以下條件純化實(shí)施例10010的粗物質(zhì)：柱：xbridgec18,19×200mm,5μm顆粒；流動(dòng)相a：5:95乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；流動(dòng)相b：95:5乙腈:水(具有10mm乙酸銨)；梯度：在15分鐘內(nèi)從20％b變?yōu)?0％b，接著5分鐘維持在100％b；流速：20ml/min。合并含有所需產(chǎn)物的級(jí)份并通過(guò)離心蒸發(fā)干燥。產(chǎn)物的產(chǎn)量為31.1mg及其通過(guò)lcms分析估算的純度為99％。分析條件a：保留時(shí)間＝1.71min；esi-ms(+)m/z955.2(m+2h)。分析條件b：保留時(shí)間＝2.89min；esi-ms(+)m/z955.4(m+2h)。esi-hrms(+)m/z：計(jì)算值：954.4905(m+2h)；實(shí)測(cè)值：954.4881(m+2h)。使用均質(zhì)時(shí)間分辨熒光(htrf)結(jié)合測(cè)定對(duì)大環(huán)肽與pd-1競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合至pd-l1的能力進(jìn)行測(cè)試的方法使用pd-1/pd-l1均質(zhì)時(shí)間分辨熒光(htrf)結(jié)合測(cè)定研究本申請(qǐng)大環(huán)肽結(jié)合至pd-l1的能力。方法可溶性pd-1結(jié)合至可溶性pd-l1的均質(zhì)時(shí)間分辨熒光(htrf)測(cè)定?？扇苄詐d-1及可溶性pd-l1是指具有羧基端截短的蛋白質(zhì)，所述羧基端截短移除跨膜區(qū)且融合至異源序列且具體地融合至人免疫球蛋白g序列(ig)的fc部分或六聚組氨酸表位標(biāo)簽(his)。所有結(jié)合研究均用htrf測(cè)定緩沖液進(jìn)行，其由補(bǔ)充有0.1％(w/v)牛血清白蛋白及0.05％(v/v)tween-20的dpbs構(gòu)成。對(duì)于pd-1-ig/pd-l1-his結(jié)合測(cè)定，抑制劑與pd-l1-his(10nm最終濃度)在4μl測(cè)定緩沖液中預(yù)培養(yǎng)15分鐘，然后添加含有pd-1-ig(20nm最終濃度)的1μl測(cè)定緩沖液且再培養(yǎng)15分鐘。使用來(lái)自人類、食蟹猴、小鼠或其它物種的pd-l1融合蛋白。使用經(jīng)銪穴狀化合物標(biāo)記的抗ig單克隆抗體(1nm最終濃度)及經(jīng)別藻藍(lán)蛋白(apc)標(biāo)記的抗his單克隆抗體(20nm最終濃度)進(jìn)行htrf檢測(cè)?？贵w在htrf檢測(cè)緩沖液中稀釋且分配5μl至結(jié)合反應(yīng)混合物上。允許反應(yīng)混合物平衡30分鐘且使用envision熒光計(jì)得到信號(hào)(665nm/620nm比率)。在pd-1-ig/pd-l2-his(分別為20nm及5nm)、cd80-his/pd-l1-ig(分別為100nm及10nm)及cd80-his/ctla4-ig(分別為10nm及5nm)之間進(jìn)行額外的結(jié)合測(cè)定。如下進(jìn)行在生物素化化合物71與人pd-l1-his之間的結(jié)合/競(jìng)爭(zhēng)研究。大環(huán)肽抑制劑與pd-l1-his(10nm最終濃度)一起在4μl測(cè)定緩沖液中預(yù)培養(yǎng)60分鐘，然后添加含有生物素化化合物71(0.5nm最終濃度)的1μl測(cè)定緩沖液。允許結(jié)合平衡30分鐘，然后添加含有經(jīng)銪穴狀化合物標(biāo)記的鏈霉親和素(2.5pm最終濃度)及經(jīng)apc標(biāo)記的抗his(20nm最終濃度)的5μlhtrf緩沖液。允許反應(yīng)混合物平衡30分鐘且使用envision熒光計(jì)得到信號(hào)(665nm/620nm比率)。重組蛋白。使具有c末端人ig表位標(biāo)簽的經(jīng)羧基截短的人pd-1(氨基酸25-167)[hpd-1(25-167)-3s-ig]及具有c末端his表位標(biāo)簽的人pd-l1(氨基酸18-239)[hpd-l1(19-239)-煙草葉脈斑紋病毒蛋白酶裂解位點(diǎn)(tvmv)-his]表達(dá)在hek293t細(xì)胞中且依次通過(guò)重組蛋白a親和性色譜及尺寸排阻色譜純化。人pd-l2-his(sinobiologicals)、cd80-his(sinobiologicals)、ctla4-ig(rndsystems)均經(jīng)由商業(yè)來(lái)源得到。重組人pd-1-ig的序列重組人pd-l1-tvmv-his(pd-l1-his)的序列結(jié)果顯示在表1中。如所示那樣，本申請(qǐng)大環(huán)肽對(duì)pd-1-ig結(jié)合至pd-l1-tvmv-his(pd-l1-his)的活性顯示出強(qiáng)抑制作用。范圍如下：a＝0.10至10μm；b＝0.01至0.099μm；c＝0.004至0.0099μm。表1實(shí)施例編號(hào)htrfic50(μm)實(shí)施例9001c實(shí)施例90024.13e-03實(shí)施例9003b實(shí)施例9004b實(shí)施例9013a實(shí)施例9014a實(shí)施例10001a實(shí)施例100020.20實(shí)施例10003a實(shí)施例10004b實(shí)施例10008b實(shí)施例10009a實(shí)施例10010a實(shí)施例90110.02實(shí)施例9012b實(shí)施例9017b實(shí)施例9018b實(shí)施例9009a實(shí)施例1001a實(shí)施例1002a實(shí)施例100051.00實(shí)施例10006a實(shí)施例10007a實(shí)施例1003a實(shí)施例9007a實(shí)施例90083.62實(shí)施例5001a實(shí)施例9005a實(shí)施例90060.04實(shí)施例9015b實(shí)施例9016b本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白本申請(qǐng)不限于前述說(shuō)明性實(shí)施例且其可在不脫離本申請(qǐng)本質(zhì)屬性的情況下以其它特定形式體現(xiàn)。因此，實(shí)施例的所有方面應(yīng)視為說(shuō)明性而非限制性，參考隨附權(quán)利要求書(shū)而非前述實(shí)施例且因此本申請(qǐng)意欲涵蓋屬于權(quán)利要求書(shū)的等效形式的含義及范圍內(nèi)的所有改變。序列表<110>百時(shí)美施貴寶公司<120>免疫調(diào)節(jié)劑<130>12408-wo-pct<150>us62/094,281<151>2014-12-19<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>384<212>prt<213>homosapiens<400>1leuaspserproaspargprotrpasnproprothrpheserproala151015leuleuvalvalthrgluglyaspasnalathrphethrcysserphe202530serasnthrsergluserphevalleuasntrptyrargmetserpro354045serasnglnthrasplysleualaalapheprogluaspargsergln505560proglyglnaspcysargpheargvalthrglnleuproasnglyarg65707580aspphehismetservalvalargalaargargasnaspserglythr859095tyrleucysglyalaileserleualaprolysalaglnilelysglu100105110serleuargalagluleuargvalthrgluargargalagluvalpro115120125thralahisproserproserproargproalaglyglnpheglngly130135140serproglyglyglyglyglyarggluprolysserserasplysthr145150155160histhrserproproserproalaprogluleuleuglyglyserser165170175valpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserarg180185190thrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluasppro195200205gluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnala210215220lysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalval225230235240servalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasnglylysglutyr245250255lyscyslysvalserasnlysalaleuproalaproileglulysthr260265270ileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleu275280285proproserargaspgluleuthrlysasnglnvalserleuthrcys290295300leuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluser305310315320asnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrproprovalleuasp325330335seraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysser340345350argtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisgluala355360365leuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys370375380<210>2<211>237<212>prt<213>homosapiens<400>2phethrvalthrvalprolysaspleutyrvalvalglutyrglyser151015asnmetthrileglucyslyspheprovalglulysglnleuaspleu202530alaalaleuilevaltyrtrpglumetgluasplysasnileilegln354045phevalhisglyglugluaspleulysvalglnhissersertyrarg505560glnargalaargleuleulysaspglnleuserleuglyasnalaala65707580leuglnilethraspvallysleuglnaspalaglyvaltyrargcys859095metilesertyrglyglyalaasptyrlysargilethrvallysval100105110asnalaprotyrasnlysileasnglnargileleuvalvalasppro115120125valthrsergluhisgluleuthrcysglnalagluglytyrprolys130135140alagluvaliletrpthrserserasphisglnvalleuserglylys145150155160thrthrthrthrasnserlysarggluglulysleupheasnvalthr165170175serthrleuargileasnthrthrthrasngluilephetyrcysthr180185190pheargargleuaspproglugluasnhisthralagluleuvalile195200205progluleuproleualahisproproasngluargthrglyserser210215220gluthrvalargpheglnglyhishishishishishis225230235當(dāng)前第1頁(yè)12