本公開涉及能夠?qū)κ茉囌叩娜橄俳M織進(jìn)行病理分層或鑒定腫瘤類型的方法。更具體地，本公開的方法通過(guò)根據(jù)與感興趣的突變相關(guān)聯(lián)的預(yù)定測(cè)試模塊檢測(cè)或定位同時(shí)存在于乳腺組織中的突變來(lái)鑒定腫瘤類型、階段或組。本公開還提供了被配置為能實(shí)現(xiàn)本公開的方法的試劑盒。
背景技術(shù)：
：乳腺纖維上皮腫瘤是以上皮和基質(zhì)成分兩相增殖為特征的病種。纖維上皮性乳腺腫瘤包括纖維腺瘤(fas)和葉狀腫瘤(pts)，其后者可以根據(jù)組織學(xué)特征1進(jìn)一步細(xì)分為良性、邊緣性以及惡性等級(jí)。fas每年在世界范圍內(nèi)影響數(shù)百萬(wàn)婦女3，pts發(fā)生的頻率約占乳腺腫瘤的1％或更少，以及高達(dá)7％的亞洲乳腺癌4。與fas相比，pts具有更晚的中位發(fā)病年齡(35歲相對(duì)于43歲)，以及更高的局部復(fù)發(fā)傾向，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也發(fā)生在一些惡性pts中5。以前的研究表明，pts和fas可能高度相關(guān)4。在pts組織病理學(xué)檢查中fa類似區(qū)域并不罕見(jiàn)，一些研究提出了從fa到pt的克隆發(fā)展6-10。在分子水平上，最近在fas和pts中觀察到rna聚合酶ii轉(zhuǎn)錄中介亞基12(med12)外顯子2的頻繁突變2,11-14，而基因表達(dá)和dna甲基化分析已經(jīng)涉及pt發(fā)展中的基因如hoxb13和hmga215-17。更高的拷貝數(shù)變更率(cna)也與更高級(jí)別的pts相關(guān)18,19，最近的一項(xiàng)研究使用靶向癌癥基因組分析了少量pts(n＝15，每等級(jí)5個(gè))，揭示腫瘤蛋白p53(tp53)的復(fù)發(fā)突變和視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(rb1)以及神經(jīng)纖維瘤蛋白1(nf1)中單突變僅存在于高等級(jí)的pts中11。然而，與全面突變圖譜已被廣泛研究的乳腺癌(bcs)不同20-23，對(duì)于連接不同類型的乳腺纖維上皮病變的遺傳和分子關(guān)系，知之甚少。pts的診斷和分型經(jīng)常對(duì)病理學(xué)家是個(gè)挑戰(zhàn)，特別是區(qū)分良性pt與fa。這種分型在為患有fa、pt或bc的患者提供疾病特異性治療方面具有臨床重要性。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本公開旨在提供一種用于對(duì)受試者的乳腺組織相關(guān)腫瘤的分級(jí)、鑒定或分類的方法。通過(guò)正確鑒定腫瘤的類型、階段或組，本公開促進(jìn)針對(duì)受試者的疾病特異性療法。本公開的另一個(gè)目的是使用一種或多種基于核酸的測(cè)定來(lái)輔助與受試者的乳腺組織相關(guān)的腫瘤類型的分級(jí)、鑒定或分類。本公開的方法使用基于核酸的測(cè)定，除了用于腫瘤分級(jí)的樣品的物理檢查之外，還提供可靠的結(jié)果用作支持性診斷工具。特別地，本公開的方法允許病理學(xué)家大體上區(qū)分良性pt與fa。本公開的又一個(gè)目的是提供一種試劑盒，該試劑盒至少部分包含必需試劑，以促進(jìn)上述一種或多種基于核酸的測(cè)定在所需的腫瘤分級(jí)中的表現(xiàn)。本公開的試劑盒可以以各種實(shí)施方案，在基于核酸的測(cè)定的不同平臺(tái)下操作。通過(guò)本公開，前述目的中的至少一個(gè)被全部或部分地滿足，其中，本公開的實(shí)施例之一是用于鑒定受試者乳腺組織中的腫瘤類型的方法，該方法包括執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)基于核酸的測(cè)定的步驟，以通過(guò)第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊鑒定從受試者獲得的乳腺組織中存在的突變，第一和第二測(cè)試模塊均與一個(gè)或多個(gè)基因中的至少一個(gè)預(yù)定突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，并配置為提供與組織中檢測(cè)到至少一個(gè)預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果或與樣品中不存在可檢測(cè)的預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陰性結(jié)果，所述第一測(cè)試模塊與med12基因突變和/或視黃酸受體α(rara)基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，所述第二測(cè)試模塊與細(xì)絲蛋白aα(flna)基因突變，含有2(setd2)基因的set結(jié)構(gòu)域突變和/或混合譜系白血病蛋白2(mll2)基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)；并且基于第一和第二測(cè)試模塊提供的結(jié)果識(shí)別乳腺組織腫瘤的類型。優(yōu)選地，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果分別為陽(yáng)性和陰性時(shí)，腫瘤的類型被認(rèn)為是纖維腺瘤。或者，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，腫瘤的類型被認(rèn)為是葉狀腫瘤。此外，第一測(cè)試模塊可以進(jìn)一步與受試者的端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(tert)基因突變的檢測(cè)有關(guān)。根據(jù)多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，執(zhí)行一種或多種基于核酸的測(cè)定的步驟還包括與檢測(cè)nf1基因突變、rb1基因突變和/或磷脂酰肌醇4,5-二磷酸-3-激酶催化亞基α(pik3ca)基因突變相關(guān)聯(lián)的第三測(cè)試模塊。優(yōu)選地，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊、第二測(cè)試模塊以及第三測(cè)試模塊的結(jié)果都為陽(yáng)性時(shí)，腫瘤的類型被認(rèn)為是惡性葉狀腫瘤。根據(jù)本公開的方法的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，med12基因的突變是位于med12基因的外顯子2的位置-8處的剪切位點(diǎn)突變，位于med12基因cdna的密碼子44處的錯(cuò)義突變或位于med12基因cdna的密碼子36處的錯(cuò)義突變。根據(jù)更優(yōu)選的實(shí)施例，rara基因中的突變對(duì)應(yīng)于或?qū)е聫氖茉囌叩膔ara基因翻譯的中發(fā)現(xiàn)的p.f286del、p.f287l、p.n299h、p.r394q、p.l409del和/或p.g289r。對(duì)于多個(gè)實(shí)施例，flna基因中的突變對(duì)應(yīng)于從受試者的flna基因翻譯的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.a1191t、p.s1199l、p.p1244s、p.1687-1688tv>m和/或p.s1186w。待檢測(cè)的這些突變特別涉及產(chǎn)生的多肽上的錯(cuò)義突變。對(duì)于多個(gè)實(shí)施例，setd2基因中的突變涉及在其可翻譯的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.r1674-1675ea>d、p.k1587fs、p.q1545*、p.y1605fs和/或p.f1651fs。在setd2基因中發(fā)現(xiàn)的突變通常與錯(cuò)義或體細(xì)胞突變有關(guān)。在多個(gè)實(shí)施例中，tert基因中待檢測(cè)的突變優(yōu)選位于啟動(dòng)子區(qū)域。例如，位于tert基因的啟動(dòng)子區(qū)域的-124和/或-146處的突變導(dǎo)致錯(cuò)義突變。本公開的另一方面，提供了一種用于鑒定受試者的乳腺組織中的腫瘤類型的試劑盒。優(yōu)選地，該試劑盒包括至少一個(gè)能夠進(jìn)行一種或多種基于核酸的測(cè)定的平臺(tái)，依據(jù)第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊鑒定從受試者獲得的乳腺組織中存在的突變，各測(cè)試模塊均與一個(gè)或多個(gè)基因中的至少一個(gè)預(yù)定突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，各測(cè)試模塊均配置為提供與組織中檢測(cè)到至少一個(gè)預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果或與樣品中不存在可檢測(cè)的預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陰性結(jié)果，所述第一測(cè)試模塊與med12基因突變、tert和/或rara基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，所述第二測(cè)試模塊與flna基因突變，setd2基因突變和/或mll2基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。優(yōu)選地，所述測(cè)試模塊被配置為對(duì)應(yīng)任何陽(yáng)性結(jié)果發(fā)射可檢測(cè)的或可視的信號(hào)。當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果分別為陽(yáng)性和陰性時(shí)，腫瘤的類型被認(rèn)為是纖維腺瘤。或者，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，腫瘤的類型被認(rèn)為是良性葉狀腫瘤。在本公開的試劑盒的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例中，所述至少一個(gè)平臺(tái)進(jìn)一步包括與檢測(cè)nf1基因突變、rb1基因突變和/或pik3ca基因突變相關(guān)聯(lián)的第三測(cè)試模塊。通過(guò)包含所述第三測(cè)試模塊，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊、第二測(cè)試模塊和第三測(cè)試模塊的結(jié)果全部為陽(yáng)性時(shí)，本公開的試劑盒可以進(jìn)一步考慮、分級(jí)或鑒定腫瘤類型為惡性葉狀腫瘤。在一些實(shí)施方案，所述乳腺組織是與本公開的用于腫瘤分級(jí)或鑒定的試劑盒一起使用的基質(zhì)細(xì)胞。附圖說(shuō)明圖1a為組合圖，顯示了通過(guò)靶向測(cè)序鑒定的100個(gè)纖維上皮腫瘤中頻發(fā)突變基因的分布，包括21個(gè)fas和79個(gè)pts，中心圖表明頻發(fā)突變基因的分組，點(diǎn)表示同一患者中第二突變的發(fā)生，左側(cè)柱狀圖顯示變異次數(shù)及相鄰數(shù)字，以指示組中的變異頻率，右側(cè)欄顯示亞型突變的頻率，而星號(hào)表示樣品未匹配正常；圖1b為簡(jiǎn)單的圖表，用于說(shuō)明基于本公開的發(fā)現(xiàn)，與纖維上皮腫瘤譜的每個(gè)時(shí)期相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵遺傳變異和通路的概述；圖2a為med12中的突變的示意圖，在其從左到右標(biāo)記為med、轉(zhuǎn)錄中介復(fù)合亞基med12、med12-lcewav、真核中介12亞結(jié)構(gòu)域、med12-pql、真核中質(zhì)12鏈蛋白結(jié)合域之后，其每個(gè)變異的頻率表示在括號(hào)中；圖2b為rara突變的示意圖，rara中的結(jié)構(gòu)域：nr_dbd(視黃酸受體的dna結(jié)合結(jié)構(gòu)域)；nr_lbd(視黃酸受體的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)；圖2c為flna突變的示意圖，flna中的結(jié)構(gòu)域：ch(鈣調(diào)節(jié)蛋白同源結(jié)構(gòu)域)和ig_flmn(細(xì)絲蛋白型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)；圖2d為setd2突變的示意圖，setd2中的結(jié)構(gòu)域：aws(與set結(jié)構(gòu)域相關(guān))、set(su(var)3-9、zeste增強(qiáng)子、trithorax)結(jié)構(gòu)域、ww(wwp結(jié)構(gòu)域)以及sri(set2rbp1相互作用域)；圖2e為mll2突變的示意圖，mll2中的結(jié)構(gòu)域：zf-hc(phd樣鋅結(jié)合結(jié)構(gòu)域)、指環(huán)(真正有趣的新基因)結(jié)構(gòu)域、phd(phd鋅指)、hmg(高遷移率組-框結(jié)構(gòu)域)fyrn(富含f/y的n末端)、fyrc(富含fy結(jié)構(gòu)域的c末端區(qū)域)set(su(var)3-9，zeste增強(qiáng)子、trithorax)結(jié)構(gòu)域；圖3歸納了葉狀腫瘤體細(xì)胞突變圖，圖(a)表明fa和pt中的體細(xì)胞突變數(shù)。*p<0.001(b)顯示22個(gè)葉狀腫瘤中每例突變的頻率，表示為覆蓋目標(biāo)序列每兆堿基(mb)的突變數(shù)，(c)22對(duì)pt中的突變特征，以及(d)顯示100個(gè)纖維上皮腫瘤中50個(gè)靶基因的變異拷貝數(shù)，與低級(jí)別腫瘤相比，高級(jí)別腫瘤傾向于具有更多的cna。n.s.，不顯著性*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；圖4a為顯示纖維上皮腫瘤和實(shí)體瘤中具有體細(xì)胞突變的樣品的百分比的圖示，所述樣品來(lái)自tcga樣品，通過(guò)從cbioportal(括號(hào)中的每項(xiàng)研究的樣品數(shù))得到的公開數(shù)據(jù)鑒定，其中acc為腎上腺皮質(zhì)癌，ccrcc為腎透明細(xì)胞癌；圖4b為顯示纖維上皮腫瘤中qpcr檢測(cè)到的rara的表達(dá)水平的圖示，其中含rara野生型(17例)或突變型(13例)；圖4c為表明rara突變體轉(zhuǎn)錄活性低于野生型rara的圖示，其中用rarecignal報(bào)告基因以及分別含有空載體、野生型和突變型rara的cdna的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞，轉(zhuǎn)錄活性在缺失和存在ra刺激下測(cè)量(誤差線＝sd，n＝3)；圖4d為顯示hek293細(xì)胞中進(jìn)行的哺乳動(dòng)物雙雜交測(cè)定的結(jié)果的圖示，以評(píng)估在不存在和存在ra的情況下，野生型或突變型rara與核共抑制子ncor1的相互作用(誤差線＝sd，n＝3)；圖5a顯示乳腺癌中體細(xì)胞flna突變的示意圖譜，使用flna蛋白的結(jié)構(gòu)域的，乳腺癌中的變異根據(jù)cbioportal(tcga)獲得的公開數(shù)據(jù)確定，其中ch為calponin同源性結(jié)構(gòu)域，ig-flmn為細(xì)絲蛋白型免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域；圖5b顯示3個(gè)新鮮冷凍pt中flna變體的cdnasanger測(cè)序結(jié)果；圖6a為揭示邊界(樣品1056)和惡性(樣品1076)pt中egfr擴(kuò)增模式的圖；圖6b為egfr的ihc染色的代表圖，表明邊界pt(樣品1056)中的蛋白質(zhì)水平和egfr位置，圖像顯示egfr蛋白僅位于基質(zhì)細(xì)胞中并不存在于上皮細(xì)胞中；圖7顯示了基于靶向測(cè)序分析的fa、pt和bc中突變譜的比較，以及已知在bcs中顯著突變的代表性基因(tp53、pik3ca、map3k1、gata3和cdh1)；圖8a是樣品1007的蘇木精和曙紅(h&e)染色部分的顯微照片，通過(guò)激光捕獲顯微切割(lcm)獲得，其中s表示基質(zhì)和e表述上皮；圖8b顯示了在圖8a中提供的相同染色樣品的本體組織、上皮以及基質(zhì)區(qū)域中的med12、rara和brca1的sanger測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示突變是基質(zhì)區(qū)獨(dú)有的；圖9(a)是具有寬闊葉狀基質(zhì)葉狀突起到由良性上皮排列的裂縫空間的石蠟化腫瘤部分的低放大倍數(shù)顯微照片，(b)是由良性雙層上皮覆蓋的輕度至中度細(xì)胞基質(zhì)的中等放大倍數(shù)，(c)是顯示滲透到相鄰脂肪中的基質(zhì)細(xì)胞的滲透性邊界的顯微照片，(d)通過(guò)有絲分裂顯示基質(zhì)有絲分裂活性，(e)是樣品004腫瘤和匹配血液的rb1和egfr的sanger測(cè)序；圖10a為顯示fa和pt并發(fā)的h&e染色切片的一個(gè)顯微照片，選擇用于從一個(gè)患者中宏觀解剖，所述突變中癌癥相關(guān)基因的獲得僅定位在pt中，最下面的顯微照片為egfr的ihc染色，pt區(qū)域的蛋白質(zhì)顯著，但不在fa樣區(qū)域；以及圖10b描繪了基于在上圖中報(bào)道的每個(gè)患者的組織學(xué)亞型的并發(fā)和縱向fas/pt的體細(xì)胞突變譜，底部圖是用于指示所鑒定的突變類型的示意圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明可以以其他具體形式實(shí)施，而不脫離其結(jié)構(gòu)、方法或本文中廣泛描述并要求保護(hù)的其它基本特征。所描述的實(shí)施例在所有方面僅被認(rèn)為是說(shuō)明性的，而不是限制性的。因此，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求而不是前面的描述來(lái)表示。在權(quán)利要求的等同的含義和范圍內(nèi)的所有變化將被包括在其范圍內(nèi)。除非另有說(shuō)明，本文所用的術(shù)語(yǔ)“包括”和“包含”及其語(yǔ)法變體旨在表示“開放”或“包含性”的語(yǔ)言，使得它們包括所引用的元素，但也允許包含附加的未引用的元素。如本文所使用的，短語(yǔ)“在實(shí)施例中”是指在一些實(shí)施例中，但不一定在所有實(shí)施例中。如本文所使用的，在組分濃度、條件、其他測(cè)量值等的上下文中，術(shù)語(yǔ)“約”或“大約”是指所述值的+/-5％，或所述值+/-4％，或所述值的+/-3％，或所述值的+/-2％，或所述值的+/-1％，或所述值的+/-0.5％，或所述值的+/-0％。本文所用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”或“核酸”指代mrna、rna、crna、cdna或dna。該術(shù)語(yǔ)通常是指長(zhǎng)度大于30個(gè)核苷酸殘基的寡核苷酸。本說(shuō)明書中使用的術(shù)語(yǔ)“引物”是指當(dāng)與dna鏈配對(duì)時(shí)，能夠在合適的聚合劑存在下引發(fā)引物延伸產(chǎn)物的合成的寡核苷酸。為了擴(kuò)增的最大效率，引物優(yōu)選為單鏈的，但也可以是雙鏈的。引物必須足夠長(zhǎng)，以在聚合劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物可以與其被設(shè)計(jì)去雜交的模板上的序列“實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)”，并且作為合成起始的位點(diǎn)。“實(shí)質(zhì)上互補(bǔ)”是指引物充分互補(bǔ)以與靶多核苷酸雜交。優(yōu)選地，引物不含與其被設(shè)計(jì)與之雜交的模板的錯(cuò)配，但這不是必需的。例如，非互補(bǔ)核苷酸殘基可以連接到引物的5'末端，引物序列的其余部分與模板互補(bǔ)。或者，非互補(bǔ)核苷酸殘基或一段非互補(bǔ)核苷酸殘基可以散布到引物中，只要引物序列與模板序列具有足夠的互補(bǔ)性以與其雜交，從而形成用于合成引物延伸產(chǎn)物的模板。本文所用的術(shù)語(yǔ)“基因”可以指具有功能意義的dna序列。其可以是天然核酸序列，或衍生自天然來(lái)源或合成構(gòu)建體的重組核酸序列。術(shù)語(yǔ)“基因”也可以用于指，例如但不限于，直接或間接地由基因組dna序列編碼或衍生自其的cdna和/或mrna。本公開的一個(gè)主要方面，公開了一種用于鑒定受試者乳腺組織中的腫瘤類型的方法。優(yōu)選地，本公開的方法包括以下步驟：執(zhí)行一種或多種基于核酸的測(cè)定，從而依據(jù)第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊鑒定從受試者獲得的乳腺組織中存在的突變，各測(cè)試模塊均與一個(gè)或多個(gè)基因中的至少一個(gè)預(yù)定突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，各測(cè)試模塊均配置為提供與組織中檢測(cè)到至少一個(gè)預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果或與樣品中不存在可檢測(cè)的預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陰性結(jié)果，所述第一測(cè)試模塊與med12基因突變、tert基于突變和/或rara基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，所述第二測(cè)試模塊與flna基因突變，setd2基因突變和/或mll2基因突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。以及基于第一和第二測(cè)試模塊所提供的結(jié)果，來(lái)確定乳腺組織的腫瘤的類型。一般普通技術(shù)人員應(yīng)理解，本文描述的至少部分基于核酸的測(cè)定法還可以包括至少一些公知的完成測(cè)定的方法或步驟，盡管在本說(shuō)明書中可能未完全詳細(xì)描述。例如，基于核酸的測(cè)定的一部分可以涉及使用任何方法或商業(yè)化試劑盒提取或分離含有關(guān)于受試者或被檢體組織樣品遺傳信息的脫氧核糖核酸(dna)和/或核糖核酸(rna)材料的步驟。如在一些優(yōu)選實(shí)施例中，基于核酸的測(cè)定的一部分還可能涉及針對(duì)分離的dna或rna材料進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，連同預(yù)定的熱循環(huán)和條件，以擴(kuò)增基因或部分基因，在測(cè)試模塊中進(jìn)行分析，以完成病理分級(jí)。這些預(yù)處理或過(guò)程可以構(gòu)成基于核酸的測(cè)定的一部分，最終導(dǎo)致腫瘤分級(jí)和分類所需基因的等位基因、突變和/或基因分型的鑒定。根據(jù)本公開的方法的一些優(yōu)選實(shí)施例，基于核酸的測(cè)定優(yōu)選進(jìn)行鑒定、檢測(cè)和/或基因分型潛在的突變，所述突變存在于引發(fā)腫瘤或癌癥發(fā)展的受試者的一個(gè)或多個(gè)基因中。本公開的基于核酸的測(cè)定包括測(cè)序感興趣的基因。測(cè)序可以在自乳腺組織分離出的dna或rna材料擴(kuò)增和/或復(fù)制的多核苷酸上進(jìn)行。更具體地，本公開中采用的用于實(shí)現(xiàn)突變鑒定或檢測(cè)的測(cè)序方法可以是sanger測(cè)序和/或標(biāo)記擴(kuò)增超深度測(cè)序，其有效并且能夠高度精確和可靠地得出識(shí)別測(cè)試模塊中設(shè)置的感興趣的突變。sanger測(cè)序和/或標(biāo)記擴(kuò)增超深度測(cè)序的細(xì)節(jié)在以下并入的實(shí)施例中進(jìn)一步闡述。對(duì)于其他技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，重要的是意識(shí)到可以使用其他已知的等同的測(cè)序或非等同程序或方法來(lái)檢測(cè)所分析的多核苷酸中感興趣的突變的存在，從而實(shí)現(xiàn)本公開的方法，并且這種修改不應(yīng)偏離本公開的范圍?？捎糜阼b定或輔助鑒定這些突變的其它已知方法可以是但不限于溫度梯度凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、擴(kuò)增受阻突變體系聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(arms-pcr)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(dash)、用于下一代測(cè)序(ngs)的靶捕獲、高密度寡核苷酸snp陣列或限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)。本公開利用來(lái)自測(cè)試模塊的模式、成果或結(jié)果，關(guān)于預(yù)定的與給定模塊相關(guān)的基因，對(duì)組織樣品的腫瘤分期或類型進(jìn)行分級(jí)，而不僅僅是采用特定的引物或單個(gè)平臺(tái)來(lái)實(shí)現(xiàn)分級(jí)或分類。對(duì)可實(shí)施本發(fā)明的腫瘤分級(jí)方法的引物或平臺(tái)的修飾，諸如測(cè)序引物長(zhǎng)度或雜交位置的不同，均落入本公開的范圍。如上所述，第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊分別與測(cè)試模塊特異性相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因的至少一個(gè)突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，并提供適用于后續(xù)腫瘤階段分級(jí)或組織樣品類型的結(jié)果。更具體地，在多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一測(cè)試模塊與med12基因、tert基因和/或rara基因中的突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)。更優(yōu)選地，第一模塊與med12基因、tert基因和/或rara基因相關(guān)聯(lián)的多于一個(gè)的突變的檢測(cè)有關(guān)。例如，med12基因可檢測(cè)到并與第一測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的突變可以是位于med12基因的外顯子2的位置-8處，位于med12基因cdna密碼子44的錯(cuò)義突變或位于med12基因cdna密碼子36處的錯(cuò)義突變等剪切位點(diǎn)突變中的任何一個(gè)。類似地，與第一測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的rara基因的可檢測(cè)突變可以是在其翻譯的多肽中，導(dǎo)致錯(cuò)義突變p.f286del、p.f287l、p.n299h、p.r394q、p.l409del和/或p.g289r中的任何一種。此外，tert基因中待檢測(cè)的突變優(yōu)選位于啟動(dòng)子區(qū)。例如，位于tert基因的啟動(dòng)子區(qū)的-124和/或-146處的突變導(dǎo)致錯(cuò)義突變。根據(jù)所公開的方法的許多實(shí)施例，第二測(cè)試模塊優(yōu)選與位于flna基因、setd2基因和/或mll2基因中的可檢測(cè)的預(yù)定突變體相關(guān)聯(lián)。更具體地，與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的flna基因檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)突變通常在其翻譯的多肽中產(chǎn)生p.a1191t、p.s1199l、p.p1244s、p.1687-1688tv>m和/或p.s1186w。與setd2基因相關(guān)并與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的突變?yōu)楫a(chǎn)生top.r1674-1675ea>d、p.k1587fs、p.q1545*、p.y1605fs和/或p.f1651fs的任何單一或聯(lián)合突變，可從setd2翻譯。類似地，要檢測(cè)的并與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的mll2基因的突變通常是引起失活突變的任何突變，例如在由mll2基因編碼的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.v5482fs、p.q1139*、p.g2668fs、p.q3814*和/或p.l3457fs。對(duì)于少數(shù)優(yōu)選實(shí)施例，除了flna基因、setd2基因和/或mll2基因相關(guān)聯(lián)之外，本公開方法的第二測(cè)試模塊可以進(jìn)一步與其他基因的突變相關(guān)聯(lián)。這些可推斷或指示乳腺腫瘤類型或階段的，具有感興趣突變的額外的基因，可以與第二測(cè)試模塊相關(guān)，為bcl-6輔抑制因子蛋白(bcor)基因和有絲分裂原激活蛋白激酶kinasekinase1(map3k1)基因。在本公開的方法的一些實(shí)施例中，第二測(cè)試模塊可以被配置為檢測(cè)除了flna基因、setd2基因和/或mll2基因之外的受試者的基因突變的存在。例如，第二測(cè)試模塊可安排為發(fā)現(xiàn)受試者的b細(xì)胞淋巴瘤因子6輔抑制因子(bcor)基因中的失活突變，如p.k460*、p.w534*和/或p.k175fs，或體細(xì)胞突變，如受試者的有絲分裂原激活蛋白激酶kinasekinase1(map3k1)基因中的p.m312fs和/或p.q409fs。為了更好地分級(jí)或鑒定乳腺組織樣品的腫瘤時(shí)期，執(zhí)行一種或多種基于核酸的測(cè)定還可以包括與檢測(cè)nf1基因突變、rb1基因突變和/或pik3ca基因突變相關(guān)聯(lián)的第三測(cè)試模塊。借助于第三測(cè)試模塊，本公開的方法可以進(jìn)一步分級(jí)或鑒定那些已經(jīng)進(jìn)入邊界惡性或惡性階段的葉狀腫瘤的組織樣品。優(yōu)選地，與第三測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的nf1基因的突變是在其可翻譯多肽中發(fā)現(xiàn)的關(guān)于p.k1014*、p.r416*和/或p.d2283fs的突變。第三測(cè)試模塊中靶向nf1基因的這些突變引起無(wú)義突變或移碼突變，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。類似地，與第三測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的rb1基因的突變是在其可翻譯多肽中發(fā)現(xiàn)的關(guān)于p.q504*、p.n316fs和/或p.p796fs的突變。這些rb1基因的突變也會(huì)引起無(wú)義或移碼突變。對(duì)于pik3ca基因，與第三測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的感興趣的突變主要涉及p.h1047r/l，其為錯(cuò)義突變。除nf1基因、rb1基因和/或pik3ca基因的突變之外，本公開方法的其它實(shí)施例可以具有通過(guò)第三測(cè)試模塊發(fā)現(xiàn)的其它相關(guān)聯(lián)基因的更多突變。隨著覆蓋更多突變位點(diǎn)，本公開的方法能夠提供更高的準(zhǔn)確性，及時(shí)檢測(cè)、診斷、分類、分組或識(shí)別受試者腫瘤發(fā)展的各個(gè)階段。第三測(cè)試模塊可以用于檢測(cè)由表皮生長(zhǎng)因子受體(egfr)基因編碼的多肽中與p.l62r相關(guān)聯(lián)的頻發(fā)突變，磷酸酶張力蛋白同源物(pten)基因編碼的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.i33del相關(guān)的非移碼缺失突變，腫瘤蛋白p53(tp53)基因編碼的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.294fs或p.c229fs相關(guān)的失活移碼突變，erb-b2受體酪氨酸激酶4(erbb4)基因編碼的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.w407r相關(guān)的體細(xì)胞突變，和/或受試者胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(igf1r)基因的復(fù)制。根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施例，所述第一、第二和/或第三模塊被制成只要檢測(cè)到與特定測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的基因的至少一個(gè)預(yù)定突變就產(chǎn)生肯定結(jié)果，反之亦然。例如，第一測(cè)試模塊響應(yīng)于受試者的乳腺組織的med12基因、tert基因和/或rara基因中檢測(cè)到的至少一個(gè)突變而產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。相反，在沒(méi)有與med12基因、tert基因和/或rara基因相關(guān)聯(lián)的任何可檢測(cè)的預(yù)定突變的情況下，第一測(cè)試模塊產(chǎn)生陰性結(jié)果。類似的原理適用于第二和第三測(cè)試模塊，以在腫瘤分級(jí)鑒定中實(shí)現(xiàn)本公開的方法。在許多優(yōu)選實(shí)施例中，在測(cè)試模塊中考慮的基因的每個(gè)突變可以在不同的已知原理或平臺(tái)下進(jìn)行單獨(dú)的基于核酸的測(cè)定，以進(jìn)行檢測(cè)或鑒定。對(duì)于這些實(shí)施例，所涉及的基因的各個(gè)突變的基于核酸的測(cè)定可以不是并行進(jìn)行的，而是將每個(gè)測(cè)定產(chǎn)生的結(jié)果檢索或收集到相關(guān)聯(lián)的測(cè)試模塊中以計(jì)算或產(chǎn)生其結(jié)果。根據(jù)其他優(yōu)選實(shí)施例，本公開的方法可以同時(shí)運(yùn)行類似的測(cè)試，以在相同平臺(tái)的單個(gè)操作中檢測(cè)分別與不同模塊相關(guān)聯(lián)的基因的突變或等位基因，將每個(gè)分析的突變的結(jié)果與預(yù)定模塊相關(guān)聯(lián)，用于計(jì)算隨后腫瘤分級(jí)的結(jié)果。根據(jù)前文，盡管為了成本和/或節(jié)省時(shí)間，優(yōu)選通過(guò)一個(gè)平臺(tái)鑒定相關(guān)基因的感興趣的突變，本文所述的基于核酸的測(cè)定法不受限于單個(gè)操作平臺(tái)或機(jī)制。如在前面的描述中所闡述的，本公開的方法響應(yīng)所使用的測(cè)試模塊計(jì)算、生成或發(fā)出的結(jié)果，有效分級(jí)腫瘤的類型。根據(jù)多個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果分別為陽(yáng)性和陰性時(shí)，本公開的方法認(rèn)為乳腺組織樣品的腫瘤類型為纖維腺瘤。本公開的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，與fa的早期發(fā)作相關(guān)的生物標(biāo)記可以與受試者的med12、tert基因和/或rara基因中可檢測(cè)的突變相關(guān)。同時(shí)，fa樣品通常不含任何與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的那些基因中的可檢測(cè)突變，例如flna、setd2、mll2、bcor、map3k1。類似地，在第一和第二測(cè)試模塊分別為陽(yáng)性和陰性結(jié)果之外，當(dāng)?shù)谌K遞送陰性結(jié)果時(shí)，本公開還將分析的乳腺組織關(guān)聯(lián)為fa，表明在這些與第三模塊關(guān)聯(lián)的基因中不能檢測(cè)到顯著的感興趣的突變。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施例，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果都為陽(yáng)性時(shí)，本公開的方法可以將腫瘤的類型視為葉狀腫瘤?；谒M(jìn)行的測(cè)試和實(shí)驗(yàn)，本公開認(rèn)識(shí)到葉狀腫瘤的發(fā)生似乎具有與第一和第二測(cè)試模塊均相關(guān)的基因的突變。特別地，除了確定與第一測(cè)試模塊相關(guān)的基因中的感興趣突變之外，符合flna、setd2、mll2、bcor或map3k1基因中存在考慮過(guò)突變的，乳腺組織樣品的腫瘤類型可以方便地被認(rèn)為是葉狀腫瘤。為了進(jìn)一步區(qū)分或分級(jí)經(jīng)過(guò)鑒定的葉狀腫瘤，在一些優(yōu)選實(shí)施例中，本公開除了在第一和第二模塊中存在的那些外，還引出第三測(cè)試模塊，以檢測(cè)受試者的額外基因的突變。特別地，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊、第二測(cè)試模塊和第三測(cè)試模塊的結(jié)果全部為陽(yáng)性時(shí)，所獲得的乳腺組織的腫瘤類型被認(rèn)為是惡性葉狀腫瘤，意味著所獲取的樣品在每個(gè)測(cè)試模塊中至少攜帶一個(gè)突變的基因。具有測(cè)試模塊陽(yáng)性結(jié)果的樣品或測(cè)試的受試者，在與特定測(cè)試模塊相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因中也可能存在兩個(gè)或多個(gè)突變。另一方面，當(dāng)?shù)谌郎y(cè)試模塊的結(jié)果為陰性，且第一和第二測(cè)試模塊的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，本公開的方法優(yōu)選將乳腺組織樣品的腫瘤的類型視為良性葉狀腫瘤。本公開的另一方面涉及一種用于鑒定受試者的乳腺組織中的腫瘤類型的試劑盒。優(yōu)選地，該試劑盒包括至少一個(gè)能夠進(jìn)行一種或多種基于核酸的測(cè)定的平臺(tái)，依據(jù)第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊鑒定從受試者獲得的乳腺組織中存在的突變，第一和第二測(cè)試模塊中的每一個(gè)均與一個(gè)或多個(gè)基因中的至少一個(gè)預(yù)定突變的檢測(cè)相關(guān)聯(lián)，并且配置為提供與組織中檢測(cè)到至少一個(gè)預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性結(jié)果或與樣品中不存在可檢測(cè)的預(yù)定突變相對(duì)應(yīng)的陰性結(jié)果，所述第一測(cè)試模塊與med12基因突變、tert和/或rara基因突變的檢測(cè)相關(guān)，所述第二測(cè)試模塊與flna基因突變，setd2基因突變和/或mll2基因突變的檢測(cè)相關(guān)。本公開的試劑盒可用的用于鑒定或輔助鑒定這些突變的至少一個(gè)平臺(tái)可以是但不限于溫度梯度凝膠電泳、毛細(xì)管電泳、擴(kuò)增受阻突變體系聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(arms-pcr)、動(dòng)態(tài)等位基因特異性雜交(dash)、用于下一代測(cè)序(ngs)的靶捕獲、高密度寡核苷酸snp陣列或限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(rflp)。根據(jù)本公開試劑盒的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例，測(cè)試模塊中考慮的基因的每個(gè)突變可以進(jìn)行單獨(dú)的基于核酸的測(cè)定，所述測(cè)定在至少一個(gè)上述平臺(tái)中執(zhí)行，以檢測(cè)或鑒定。在一些實(shí)施例中，所涉及的基因的各個(gè)突變的基于核酸的測(cè)定可以不是并行進(jìn)行的，而是將每個(gè)測(cè)定產(chǎn)生的結(jié)果檢索或收集到相關(guān)聯(lián)的測(cè)試模塊中以計(jì)算或產(chǎn)生其結(jié)果。在另一些優(yōu)選的實(shí)施例中，本公開的試劑盒可用于，至少一部分，同時(shí)運(yùn)行類似的測(cè)試，以在單一平臺(tái)下檢測(cè)分別與不同模塊相關(guān)聯(lián)的基因的突變或等位基因，將每個(gè)分析的突變的結(jié)果與預(yù)定模塊相關(guān)聯(lián)，用于計(jì)算隨后腫瘤分級(jí)的結(jié)果。在更優(yōu)選的實(shí)施例中，本公開試劑盒的基于核酸的測(cè)定包括測(cè)序感興趣的基因。測(cè)序可以在自乳腺組織分離出的dna或rna材料擴(kuò)增和/或復(fù)制的多核苷酸上進(jìn)行。更具體地，本公開中采用的用于實(shí)現(xiàn)突變鑒定或檢測(cè)的測(cè)序方法可以是sanger測(cè)序和/或標(biāo)記擴(kuò)增超深度測(cè)序，其有效并且能夠高度精確和可靠地得出識(shí)別測(cè)試模塊中設(shè)置的感興趣的突變。根據(jù)前面的描述，本公開的試劑盒的第一測(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊分別與測(cè)試模塊特異性相關(guān)的一個(gè)或多個(gè)基因的至少一個(gè)突變的檢測(cè)相關(guān)，并提供適用于后續(xù)腫瘤階段分級(jí)或組織樣品類型的結(jié)果。更具體地，在本公開試劑盒的多個(gè)優(yōu)選實(shí)施例中，第一測(cè)試模塊與med12基因、tert基因和/或rara基因中的突變的檢測(cè)相關(guān)。更優(yōu)選地，第一模塊與med12基因、tert基因和/或rara基因相關(guān)的多于一個(gè)的突變的檢測(cè)有關(guān)。例如，med12基因可檢測(cè)到并與第一測(cè)試模塊相關(guān)的突變可以是位于med12基因的外顯子2的位置-8處，位于med12基因cdna密碼子44的錯(cuò)義突變或位于med12基因cdna密碼子36處的錯(cuò)義突變等剪切位點(diǎn)突變中的任何一個(gè)。類似地，與第一測(cè)試模塊相關(guān)的rara基因的可檢測(cè)突變可以是在其翻譯的多肽中導(dǎo)致p.f286del、p.f287l、p.n299h、p.r394q、p.l409del和/或p.g289r錯(cuò)義突變中的任何一種。對(duì)于tert基因，待檢測(cè)的突變優(yōu)選位于啟動(dòng)子區(qū)。例如，導(dǎo)致錯(cuò)義突變的位于tert基因的啟動(dòng)子區(qū)的-124和/或-146處的突變。根據(jù)一些優(yōu)選的實(shí)施例，第二測(cè)試模塊優(yōu)選與位于flna基因、setd2基因和/或mll2基因中的可檢測(cè)的預(yù)定突變體相關(guān)聯(lián)。更具體地，與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的flna基因檢測(cè)的一個(gè)或多個(gè)突變，為與受試者flna基因翻譯的多肽中p.a1191t、p.s1199l、p.p1244s、p.1687-1688tv>m和/或p.s1186w相應(yīng)的突變。與setd2基因相關(guān)并與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的突變?yōu)槠洚a(chǎn)生多肽中發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致p.r1674-1675ea>d、p.k1587fs、p.q1545*、p.y1605fs和/或p.f1651fs的任何單一或聯(lián)合突變。類似地，要檢測(cè)的并與第二測(cè)試模塊相關(guān)聯(lián)的mll2基因的突變通常是引起失活突變的任何突變，例如在由mll2基因編碼的多肽中發(fā)現(xiàn)的p.v5482fs、p.q1139*、p.g2668fs、p.q3814*和/或p.l3457fs。對(duì)于少數(shù)優(yōu)選實(shí)施例，除了flna基因、setd2基因和/或mll2基因相關(guān)聯(lián)之外，本公開試劑盒的第二測(cè)試模塊可以進(jìn)一步與其他基因的突變相關(guān)聯(lián)。這些可推斷或指示乳腺腫瘤類型或階段的，具有感興趣突變的額外的基因，可以與第二測(cè)試模塊相關(guān)，為bcl-6輔抑制因子蛋白(bcor)基因和有絲分裂原激活蛋白激酶kinasekinase1(map3k1)基因。本公開的試劑盒有助于利用來(lái)自測(cè)試模塊的模式、成果或結(jié)果，基于預(yù)定和相關(guān)基因，對(duì)組織樣品的腫瘤分期或類型進(jìn)行分級(jí)。優(yōu)選地，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果分別為陽(yáng)性和陰性時(shí)，乳腺組織樣品的腫瘤的類型被認(rèn)為是纖維腺瘤。相反，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊和第二測(cè)試模塊的結(jié)果均為陽(yáng)性時(shí)，被測(cè)乳腺組織的腫瘤類型被認(rèn)為是良性葉狀腫瘤。在更多優(yōu)選的實(shí)施方式中，本公開試劑盒可以進(jìn)一步包括與檢測(cè)nf1基因突變、rb1基因突變和/或pik3ca基因突變相關(guān)的第三測(cè)試模塊。借助于第三測(cè)試模塊，本公開的試劑盒有助于進(jìn)一步分級(jí)或鑒定那些已經(jīng)進(jìn)入邊界惡性或惡性階段的葉狀腫瘤的組織樣品的腫瘤類型。優(yōu)選地，與第三測(cè)試模塊相關(guān)的nf1基因的突變是在其可翻譯多肽中發(fā)現(xiàn)的關(guān)于p.k1014*、p.r416*和/或p.d2283fs的突變。類似地，與第三測(cè)試模塊相關(guān)的rb1基因的突變是在其編碼多肽中發(fā)現(xiàn)的關(guān)于p.q504*、p.n316fs和/或p.p796fs的突變。對(duì)于pik3ca基因，與第三測(cè)試模塊相關(guān)的感興趣的突變通常涉及導(dǎo)致編碼多肽的p.h1047r/l的突變。因此，當(dāng)?shù)谝粶y(cè)試模塊、第二測(cè)試模塊和第三測(cè)試模塊的結(jié)果都是陽(yáng)性時(shí)，通過(guò)本公開的試劑盒將獲得的乳腺組織的腫瘤類型視為惡性葉狀腫瘤，意味著所獲取的樣品在每個(gè)測(cè)試模塊中至少攜帶一個(gè)突變的基因。另一方面，當(dāng)?shù)谌郎y(cè)試模塊的結(jié)果為陰性，且第一和第二測(cè)試模塊的結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，本公開的試劑盒優(yōu)選使得試劑盒的使用者將乳腺組織樣品的腫瘤類型視為良性葉狀腫瘤。為了加速本公開試劑盒的結(jié)果的產(chǎn)生，優(yōu)選將測(cè)試模塊配置為對(duì)應(yīng)任何陽(yáng)性結(jié)果發(fā)射可檢測(cè)的或可視的信號(hào)，反之亦然。只要識(shí)別與給定模塊相關(guān)聯(lián)的一個(gè)感興趣的突變，將產(chǎn)生機(jī)器或用戶可讀信號(hào)，以突出所獲得的陽(yáng)性結(jié)果。例如，本公開的試劑盒可以采用一種實(shí)施例，以dna芯片的形式，其上錨定多種多核苷酸，以便容易地與靶基因片段雜交，潛在地結(jié)合從乳腺組織樣品擴(kuò)增出的感興趣的突變。測(cè)試模塊可以是芯片上的一組多核苷酸或?qū)Ｓ脜^(qū)域。dna芯片上屬于特定測(cè)試模塊的離散點(diǎn)，附著專門設(shè)計(jì)為在嚴(yán)格條件下僅特異性雜交具有感興趣突變的靶基因片段的多核苷酸，成功的雜交出現(xiàn)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生微陣列機(jī)器可讀的信號(hào)，以通知并將感興趣突變的檢測(cè)關(guān)聯(lián)到該特定測(cè)試模塊以產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。基于乳腺活檢的物理性檢查，上述方法和/或試劑盒除了可以進(jìn)行常規(guī)腫瘤分級(jí)或分類，還可以進(jìn)行支持性診斷，無(wú)論是否進(jìn)一步染色。如果組織學(xué)檢查和本公開的方法和/或試劑盒的結(jié)果之間存在差異，那么醫(yī)生可能必須重新檢查組織樣品。例如，三個(gè)測(cè)試模塊均為陽(yáng)性結(jié)果，被認(rèn)為是fa或良性pt的樣品，應(yīng)由醫(yī)生進(jìn)行重新檢查。在本公開的實(shí)驗(yàn)中清楚地顯示，fa或良性pt樣品應(yīng)不含任與本公開的方法和/或試劑盒的第三模塊相關(guān)基因中所存在的何突變。物理或組織學(xué)檢查的結(jié)果極有可能是假陰性。由于誤診結(jié)果導(dǎo)致的延誤治療，可能危及受檢對(duì)象的健康狀況。本公開的方法和/或試劑盒提供了額外的機(jī)制，來(lái)防止主觀的、主要依賴于執(zhí)行醫(yī)生經(jīng)驗(yàn)的組織學(xué)檢查所產(chǎn)生的假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。以下示例旨在進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，而不意圖將本發(fā)明限于本文所述的具體實(shí)施例。示例1根據(jù)臨床特征和手術(shù)切除腫瘤的組織病理學(xué)檢查，對(duì)纖維上皮腫瘤進(jìn)行了診斷和分型。所有病例均由至少2名乳腺病理學(xué)專家進(jìn)行組織學(xué)檢查。診斷和分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)基于世衛(wèi)組織的乳腺腫瘤分類的建議1。簡(jiǎn)而言之，當(dāng)纖維上皮腫瘤顯示具有伴隨基質(zhì)超細(xì)胞性的類葉葉狀體的夸張的管內(nèi)模式時(shí)，診斷為葉狀腫瘤。當(dāng)病變顯示出輕度的基質(zhì)細(xì)胞性、最小核異型性、邊界推進(jìn)、每10個(gè)高倍視野有4個(gè)或更少的有絲分裂、無(wú)基質(zhì)過(guò)度生長(zhǎng)時(shí)，診斷為良性的葉狀腫瘤。當(dāng)有明顯的基質(zhì)細(xì)胞性和異型性、存在基質(zhì)過(guò)度生長(zhǎng)和滲透性邊緣、每10個(gè)高倍視野的有絲分裂活性為10個(gè)或更多時(shí)，可以診斷為惡性葉狀腫瘤。具有中間特征的腫瘤被認(rèn)為是邊界性。由21fa和79個(gè)pt組成的所有100例均為新鮮冷凍的組織。本研究中使用的樣品的詳細(xì)情況見(jiàn)下表1。其中69例為正常組織。研究中還包括另外5例ffpe(福爾馬林固定石蠟包埋)片，其中包括并發(fā)(n＝3)和縱向(n＝2)個(gè)例，后來(lái)被納入研究。表1.纖維上皮腫瘤患者的臨床特征腫瘤和全血均獲自知情同意手術(shù)切除纖維上皮腫瘤的患者。新鮮冷凍組織的基因組dna(gdna)采用qiagen血液和細(xì)胞培養(yǎng)dna試劑盒提取和純化。基因組dna產(chǎn)量和質(zhì)量使用picogreentm熒光分析以及瓊脂糖凝膠電泳圖像的目視檢查來(lái)測(cè)定。對(duì)于來(lái)自并發(fā)或縱向纖維上皮腫瘤的ffpe樣品，使用qiagenffpe組織試劑盒。示例2全外顯子組測(cè)序在22個(gè)匹配的腫瘤-正常對(duì)的葉狀腫瘤中進(jìn)行。使用推薦設(shè)置，使用covaristms2(covaris)系統(tǒng)將全基因組dna分段。使用truseq配對(duì)末端基因組dna試劑盒(illumina)進(jìn)行測(cè)序接頭連接。為了富集編碼序列，我們根據(jù)制造商推薦的方案使用了truseq外顯子組測(cè)序試劑盒(illumina)。隨后在illuminahiseq2000儀器上對(duì)富集的外顯子組庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，以產(chǎn)生76bp的配對(duì)末端讀數(shù)。如先前的工作46所述，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，包括序列比對(duì)、變異調(diào)用以及候選體細(xì)胞變體的鑒定。過(guò)濾變體，僅保留被至少15個(gè)讀數(shù)覆蓋且具有至少三個(gè)變體讀取的那些。此外，排除那些具有低于5％的變異等位基因頻率(vafs)的。丟棄插入缺失重疊的簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)域。在igv基因組瀏覽器47中目視檢查所有剩余的候選變體，以排除可能的種系突變和測(cè)序的人為假象。在外顯子組測(cè)序中鑒定的同義突變包括在下表2中。表2.從22例葉狀體的全外顯子組測(cè)序鑒定的同義突變的列表使用platinumtaq聚合酶(lifetechnologies)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr程序包括95℃10分鐘的1個(gè)循環(huán)，95℃30秒的35個(gè)循環(huán)，58℃30秒，72℃1分鐘以及72℃10分鐘的1個(gè)循環(huán)。使用bigdyeterminatorv.3.1試劑盒(appliedbiosystems)用于生成的pcr擴(kuò)增子的雙向測(cè)序，并使用abiprism3730遺傳分析儀(appliedbiosystems)對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分級(jí)。使用lasergene10.1(dnastar)將測(cè)序記錄與參考序列比對(duì)，并進(jìn)行肉眼分析。本公開選擇了60個(gè)推定的體細(xì)胞突變，用于sanger驗(yàn)證(包括腫瘤和正常樣品)，其包括頻發(fā)突變的基因、癌癥相關(guān)基因以及隨機(jī)選擇的基因中的突變。其中54例突變成功驗(yàn)證，4例被發(fā)現(xiàn)為假陽(yáng)性，2例測(cè)序失敗，表明真陽(yáng)性率為90％。經(jīng)驗(yàn)證的突變?cè)诒?中用星號(hào)突出顯示。表3.從22例葉狀腫瘤的全外顯子組測(cè)序鑒定的候選體細(xì)胞突變的列表注意：頻發(fā)基因?yàn)榇煮w并經(jīng)sanger測(cè)序驗(yàn)證*由sanger測(cè)序驗(yàn)證的突變本發(fā)明進(jìn)行了22個(gè)匹配的腫瘤-正常成對(duì)的pt的全外顯子組測(cè)序，包括10個(gè)良性，8個(gè)邊界以及4個(gè)惡性pt(表1)。測(cè)序pt外顯子組以及成對(duì)的正常樣品，平均覆蓋面為66倍的，平均78％的堿基被至少20個(gè)讀數(shù)所覆蓋(表2)。本公開的發(fā)明人在310個(gè)基因中總共鑒定了333個(gè)非同義或剪切位點(diǎn)體細(xì)胞突變。感興趣的頻發(fā)突變(在至少兩例中突變)和單突變的sanger測(cè)序獲得了90％的驗(yàn)證率(表3)。盡管與以前本發(fā)明人進(jìn)行的fa研究相比(66xvs124x)，pt中非沉默體細(xì)胞突變/病例的中位數(shù)高于fa(13vs5，p<0.001)，如圖3a所示。pt中的相對(duì)較低的突變計(jì)數(shù)與其他間質(zhì)腫瘤如肉瘤和平滑肌瘤24-26的突變計(jì)數(shù)相當(dāng)。pt中每兆堿基中平均非同義突變率為0.192(ns/s比＝3.2，圖3b)，主要突變特征是npcpg位點(diǎn)的c>t取代，如圖3c所示。示例3使用suredesign工具(agilent)設(shè)計(jì)了一組50個(gè)選定的基因(包括pt發(fā)現(xiàn)群組中的頻發(fā)突變基因，fa2中突變的基因以及與乳腺癌相關(guān)的基因20)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用針對(duì)illumina多路測(cè)序平臺(tái)(illumina)的sureselectxt2靶向富集系統(tǒng)，從68個(gè)成對(duì)的腫瘤-正常樣品以及32個(gè)腫瘤提取的dna制備測(cè)序文庫(kù)。隨后在illuminahiseq2000測(cè)序平臺(tái)上對(duì)富集靶標(biāo)的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序以產(chǎn)生76bp的配對(duì)末端讀數(shù)。對(duì)于成對(duì)的腫瘤-正常樣品，進(jìn)行如外顯子組測(cè)序分析部分中所述的分析。此外，由于更高的測(cè)序覆蓋度(目標(biāo)區(qū)域樣品的平均覆蓋度至少為228x)，使用strelka48(illumina)體細(xì)胞變體呼叫者以鑒定低等位基因頻率變體(至少3％)。在igv中目視檢查所有候選變體，以確認(rèn)它們可能是體細(xì)胞。對(duì)于只有腫瘤樣本的患者，只考慮在成對(duì)的腫瘤-正常樣品中頻發(fā)突變的基因變體。本公開還對(duì)snv(至少5％)和indels(至少10％)使用更嚴(yán)格的變體等位基因頻率截止。丟棄變體重疊的簡(jiǎn)單重復(fù)區(qū)域，以及dbsnp49(版本137)條目的變體。變體還經(jīng)內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)過(guò)濾，該內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)由包含大約512個(gè)東亞外顯子組鑒定的種系變異，以進(jìn)一步除去可能的種系多態(tài)性。這些變體也經(jīng)igv目視檢查，以排除可能的測(cè)序假象。為了驗(yàn)證pt外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)，本公開的發(fā)明人在100個(gè)纖維上皮腫瘤(21個(gè)fa，34個(gè)良性，35個(gè)邊界和10個(gè)惡性pt，如表1所示)的患病人群中進(jìn)行靶向深度測(cè)序，其中包括來(lái)自檢測(cè)組的22例。本發(fā)明總共測(cè)序了50個(gè)基因，包括在我們檢測(cè)組中感興趣基因的頻發(fā)突變的和單突變，以及先前報(bào)道的在fas2和bcs20-22,27中突變的基因。目標(biāo)基因的平均覆蓋度為524x(最小為228x)。本公開承認(rèn)在pt的外顯子組測(cè)序中相對(duì)低的平均覆蓋深度(66x)是本研究的一個(gè)局限，并且可能導(dǎo)致序列變體的不足。這得到進(jìn)一步觀察的支持，通過(guò)靶向測(cè)序(20％變體頻率的截止)鑒定出的59個(gè)突變中有11個(gè)被外顯子組測(cè)序所遺漏，導(dǎo)致18.6％的假陰性率，可能是由于覆蓋度低。此外，由于pt的稀少性和相對(duì)較小的檢測(cè)組，本研究可能錯(cuò)過(guò)了在患者中低頻發(fā)生的突變，因?yàn)檫@些突變將被排除在目標(biāo)測(cè)序組之外。示例4使用oncocnv28獲得靶向測(cè)序研究中每個(gè)基因的拷貝數(shù)估計(jì)值。簡(jiǎn)言之，每個(gè)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋深度信息從bam文件生成，并針對(duì)正常樣本池以及gc含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。然后匯總探針?biāo)娇截悢?shù)估計(jì)值，以獲得基因水平拷貝數(shù)的估計(jì)值?？截悢?shù)估計(jì)值小于1.5或超過(guò)3的基因被認(rèn)為具有拷貝數(shù)增加或損失。我們使用control-freec29識(shí)別我們的外顯子組測(cè)序隊(duì)列中的拷貝數(shù)變更(cnas)以及具有l(wèi)oh的區(qū)域。為了研究點(diǎn)突變的潛在功能，我們分別進(jìn)行了sift50，polyphen251，chasm52和provean53等突變預(yù)測(cè)算法。功能突變?cè)诒?中顯示為破壞的或可能有破壞的和有害的。癌癥特異性突變顯示為司機(jī)或乘客。中性突變顯示為可耐受的或良性。表4.通過(guò)靶向測(cè)序檢測(cè)到的100個(gè)纖維上皮腫瘤中的體細(xì)胞突變注意：頻發(fā)基因?yàn)榇煮w*無(wú)成對(duì)正常組織的樣品使用cosmicv69版本***chasmp值<0.05(司機(jī))>0.05(乘客)#在外顯子組測(cè)序中檢測(cè)，并通過(guò)sanger測(cè)序驗(yàn)證cdna+gdna。存在于靶向測(cè)序中但由于鏈偏差而不被認(rèn)為的變體讀數(shù)。**由于等位基因頻率在腫瘤樣本中>45％且<55％而被濾除，但由于該突變已被確認(rèn)為其他成對(duì)樣品中的體細(xì)胞突變，仍保留(并且也列在cosmic中)從如上所述進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，本公開鑒定了如圖1a總結(jié)的纖維上皮腫瘤中的20個(gè)頻發(fā)突變基因。另外，本公開使用oncocnv28檢測(cè)靶基因的拷貝數(shù)變更。獲得的結(jié)果如圖1a、圖3d以及表6所揭示，證實(shí)了使用control-freec29的具有外顯子組測(cè)序數(shù)據(jù)的樣品中突變的雜合性缺失(loh)模式。表5.100個(gè)纖維上皮腫瘤中50個(gè)靶基因的拷貝數(shù)變更樣本編號(hào)基因符號(hào)轉(zhuǎn)錄物編號(hào)染色體起始終止拷貝數(shù)p-值q-值樣品1076egfrccds5514.1chr75508691155273341181.56e-153.27e-14樣品1056egfrccds5514.1chr7550869115527334111.52.23e-154.24e-14樣品1076nf1ccds42292.1chr17294222972970122119.78e-342.25e-32樣品1078nf1ccds42292.1chr17294222972959242111.88e-184.52e-17樣品1078nf1ccds42292.1chr17296528132966589201.89e-084.16e-07樣品1074ptenccds31238.1chr10896241758972525612.84e-055.10e-04樣品1011setd2ccds2749.2chr3470585434720546816.35e-171.27e-15樣品1078tp53ccds45606.1chr177569531757996514.82e-079.64e-06注意：拷貝數(shù)估計(jì)值小于1.5或超過(guò)10的基因被認(rèn)為具有拷貝數(shù)損失或增加。對(duì)于拷貝數(shù)變更，僅包括腫瘤抑制基因的損失和致癌基因的擴(kuò)增。p-值和q-值由oncocnv算法生成。在纖維上皮腫瘤中的頻發(fā)性突變的比較揭示了乳腺纖維上皮腫瘤譜中不同階段相關(guān)的突變和通路的不同模式，如圖1a和1b所示。首先，在纖維上皮腫瘤的所有階段都經(jīng)常發(fā)現(xiàn)med12和rara(核視黃酸受體α)的突變，分別發(fā)生在73％和32％的腫瘤中。確認(rèn)早期研究，纖維上皮腫瘤中的med12外顯子2突變與子宮平滑肌瘤中報(bào)道的相同，但與前列腺和腎上腺皮質(zhì)癌30,31中發(fā)現(xiàn)的med12突變的模式和位置都是不同的。值得注意的是，本公開還在超過(guò)三分之一纖維上皮腫瘤中觀察到rara突變(圖2b)。在本研究之前，pml-rara的體細(xì)胞錯(cuò)義突變僅在抗藥性急性早幼粒細(xì)胞白血病(apl)32有報(bào)道，或低頻(<5％)地散在于其他實(shí)體瘤。纖維上皮性rara突變?cè)诤思に厥荏w配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(lbd)內(nèi)高度聚集，包括錯(cuò)義突變和框內(nèi)缺失，與這些可能影響rara與其他結(jié)合伴侶之間相互作用的突變一致。有趣的是，med12和rara都與雌激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和雌激素調(diào)控轉(zhuǎn)錄33,34相關(guān)，med12和rara突變的共同發(fā)生率高于預(yù)期的隨機(jī)機(jī)率(置換檢驗(yàn)p-值＝0.0046,100000次試驗(yàn))。這些結(jié)果表明，pts和fas可能共有共同的起因，其中med12和rara突變是可能相互作用或協(xié)作導(dǎo)致這種腫瘤類型的激素失調(diào)的早期事件。其次，本公開還觀察到pt中(良性，邊界和惡性)存在flna、setd2、mll2、bcor和map3k1的新突變，這在fa中很少存在(圖1a，fisher的確切檢驗(yàn)值與fa＝1e-04相比)。這一發(fā)現(xiàn)表明pt腫瘤發(fā)生可能涉及這些額外突變的基因。其中，flna特別新穎。x染色體基因flna編碼細(xì)絲蛋白a、一種f-肌動(dòng)蛋白交聯(lián)蛋白，其通過(guò)與整合素受體35相互作用，作為支架蛋白調(diào)節(jié)參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和入侵的信號(hào)事件。纖維上皮腫瘤中的flna突變(28％，28/100)特別的在f-肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)被觀察到，尤其在免疫球蛋白(ig)樣重復(fù)9-15結(jié)構(gòu)域(80％，24/30)36中。相反，如圖5a和圖5b所示，報(bào)道發(fā)現(xiàn)bc的flna突變主要影響其他ig樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域而不是的f-肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)。這些結(jié)果顯示flna在pt中的功能作用可能與在bc中不同。使用cdnasanger測(cè)序，本公開確認(rèn)了flna突變轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)，表明flna突變可能在活性x染色體上發(fā)生。除了flna外，超過(guò)三分之一(35％)的pt還具有兩種染色質(zhì)修飾酶中的至少一種的突變；setd2(21％)和mll2(12％)(fisher測(cè)試p-值與fa＝0.0058相比，進(jìn)一步參見(jiàn)圖1a)。setd2和mll2突變顯示典型的腫瘤抑制因子功能缺失突變模式，包括失活突變和缺失37,38。setd2和mll2都是介導(dǎo)表觀遺傳調(diào)控的組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶，并且這些基因的失活可能通過(guò)染色質(zhì)修飾導(dǎo)致異常的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。再次，與良性pt相比，邊界和惡性pt也在nf1、rb1、tp53、pik3ca、erbb4和egfr中表現(xiàn)出額外的突變，這些是已知具有轉(zhuǎn)化能力的癌癥-驅(qū)動(dòng)基因。這些基因的拷貝數(shù)變更(cnas)也在邊界/惡性pt中發(fā)現(xiàn)。這些發(fā)現(xiàn)與以前的研究一致，發(fā)現(xiàn)tp53和rb1在惡性pts39-41中被解除調(diào)節(jié)。有趣的是，雖然各個(gè)癌癥相關(guān)基因的變異頻率很低，但29％(13/45)的邊界/惡性pt顯示出可能的驅(qū)動(dòng)變異(定義為cosmic頻發(fā)性突變和功能喪失突變(無(wú)義/移碼)或高水平cnas)，在至少一個(gè)癌癥相關(guān)基因中。相比之下，55個(gè)fa和良性pt(0/55,0％)在這些基因中沒(méi)有一個(gè)遺傳變異(fisher的確切檢驗(yàn)，p-value＝1.02e-05)。這些結(jié)果表明這些癌癥相關(guān)基因可能參與高等級(jí)的pt亞型。值得注意的是，兩個(gè)腫瘤明顯的包含真正的pik3ca激活突變(h1047r/l)，兩個(gè)腫瘤具有高水平的egfr擴(kuò)增，如圖6a和圖6b所示的?？偠灾?，這些發(fā)現(xiàn)為纖維上皮腫瘤的各種亞型的腫瘤發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)提供了重要的見(jiàn)解。示例5如fa，pt是纖維上皮腫瘤，包括上皮和基質(zhì)隔室的混合物。為了確定在本研究中鑒定的pt相關(guān)突變的位置和分布，本公開進(jìn)一步在發(fā)現(xiàn)系列的6個(gè)pt上進(jìn)行激光捕獲顯微切割(lcm)。分離的上皮和基質(zhì)組分分別進(jìn)行med12、rara、flna、setd2、brca1和pik3ca中的突變分析，后兩個(gè)基因在bc中經(jīng)常突變，但在pt中較少(見(jiàn)下一段)。簡(jiǎn)言之，將6個(gè)葉狀腫瘤的新鮮冷凍組織嵌入最佳切割溫度(oct)化合物(tissue-tek，sakurafinetek)中，并在microtome-cryostat(leica)中切片(8μm厚)，安裝在pen膜載玻片(lifetechnologies)，然后在-80℃保存至需要。根據(jù)制造商的建議，將載玻片脫水并用histogene染色。將染色的載玻片裝載到激光捕獲顯微鏡載物臺(tái)(arcturusxttm激光捕獲顯微切割(lcm)系統(tǒng))上。然后將capsuretmmacrolcm帽(cap)(lifetechnologies)自動(dòng)放置在組織的選定區(qū)域上。一旦軟件突出顯示的感興趣的細(xì)胞被用戶驗(yàn)證，機(jī)器將使用近紅外激光或紫外線脈沖自動(dòng)將突出顯示的細(xì)胞解剖，將其轉(zhuǎn)移到capsuretmmacrolcm帽上。使用qiagenffpedna組織試劑盒，按照制造商的方案直接從lcm帽中提取dna，并進(jìn)行以下改變。將每個(gè)樣品蓋與裂解緩沖液(atl&蛋白酶k)在500μl微量離心機(jī)中在60℃孵育5小時(shí)，并在90℃下進(jìn)行酶失活10分鐘。洗脫的dna直接用于pcr和測(cè)序。本公開內(nèi)容發(fā)現(xiàn)，所有pt相關(guān)突變都存在于基質(zhì)細(xì)胞中，而不存在于上皮細(xì)胞中。這些觀察結(jié)果與以前在fas中的研究一致，其中med12突變僅在腫瘤基質(zhì)2中檢測(cè)到，表明fas和pts可能源于基質(zhì)細(xì)胞而不是上皮細(xì)胞，盡管它們具有雙相上皮-基質(zhì)形態(tài)學(xué)外觀。然而，需要注意，目前的結(jié)果并不排除在纖維上皮腫瘤的上皮細(xì)胞間也存在遺傳變異的可能性。通過(guò)使用oncocnv分析，本公開中在21％的纖維上皮腫瘤中觀察到chr1q中的loh，與先前的研究一致42。此外，在pt43中經(jīng)常觀察到上皮變異，并且如表6所示，組織病理學(xué)評(píng)估表明，49％的pt(32/65，具有可評(píng)估的上皮隔室)可顯示中度至充分發(fā)展的導(dǎo)管增生，一種上皮表型4。因此，乳腺纖維上皮腫瘤發(fā)展可能涉及這些腫瘤的上皮和基質(zhì)隔室之間的復(fù)雜相互作用，需要進(jìn)一步的研究。表6.葉狀腫瘤中的上皮增生與bc相比，纖維上皮腫瘤中的突變譜和頻率之間的比較顯示出如圖7中總結(jié)的顯著差異。med12、rara、flna、setd2和mll2在fa和pt中通常突變，但在bcs中不常突變，而tp53、pik3ca、gata3和cdh1突變?cè)诶w維上皮腫瘤中是罕見(jiàn)的，但在bcs中普遍存在。這些突變模式以及纖維上皮相關(guān)的驅(qū)動(dòng)突變的基質(zhì)定位表明bc和乳腺纖維上皮腫瘤之間存在明顯的分子致病機(jī)制，支持現(xiàn)有的指導(dǎo)，認(rèn)為這兩種腫瘤類型是不同的疾病實(shí)體，應(yīng)該被不同地管理。示例6將全長(zhǎng)raracdna用3×flag標(biāo)記克隆到pcdna3.1中。使用quikchangeiixl定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?agilent)引入患者衍生的突變，如制造商的說(shuō)明書所述。通過(guò)使用rare(視黃酸反應(yīng)元件)cignal報(bào)道分析試劑盒(qiagen)的熒光素酶測(cè)定來(lái)評(píng)估野生型和突變型rara的轉(zhuǎn)錄活性。用來(lái)自試劑盒的rare報(bào)告構(gòu)建體和海腎(renilla)熒光素酶構(gòu)建體，以及如上所述的野生型或突變型rara質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。然后將轉(zhuǎn)染的細(xì)胞與指定濃度的ra孵育24小時(shí)。根據(jù)制造商的說(shuō)明書，使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)(promega)進(jìn)行熒光酶測(cè)定。結(jié)果被標(biāo)準(zhǔn)化為共表達(dá)海腎。對(duì)于哺乳動(dòng)物雙雜交測(cè)定，將rara配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域克隆到pact載體(promega)中以產(chǎn)生誘餌質(zhì)粒，將編碼ncor1蛋白cornr1肽區(qū)(thrlitladhicqiitqdfarnqv)的cdna序列插入pbind中，從而產(chǎn)生獵物質(zhì)粒。用checkmate哺乳動(dòng)物雙雜交系統(tǒng)(promega)，按照制造商的方案進(jìn)行哺乳動(dòng)物雙雜交篩選。簡(jiǎn)言之，用指定濃度的ra處理轉(zhuǎn)染的hek293t細(xì)胞24小時(shí)，并測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果被標(biāo)準(zhǔn)化為共表達(dá)海腎。如圖4a所示，鑒于纖維上皮腫瘤中特異性的高頻率的rara突變，本研究隨后對(duì)其功能重要性進(jìn)行了調(diào)查。以前的研究已經(jīng)確定，rara是可以與共抑制子和共激活蛋白相互作用以調(diào)節(jié)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。圖4b所示的結(jié)果顯示，攜帶野生型和突變的rara基因的纖維上皮腫瘤之間的rara表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。然而，通過(guò)計(jì)算分析，幾乎所有的rara錯(cuò)義突變都被歸類為破壞的或有害的，顯示它們具有生物學(xué)意義。為了檢查rara突變對(duì)rara介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活的影響，本公開以具有rare(視黃酸反應(yīng)元件)報(bào)道構(gòu)建體和表達(dá)野生型rara或rara突變(f286del、s287l、n299h和r394q)的cdna載體轉(zhuǎn)染hek293細(xì)胞。然后在視黃酸(ra)刺激前、后測(cè)量rara轉(zhuǎn)錄活性。在表達(dá)野生型rara的細(xì)胞中，用ra刺激引起rare相關(guān)轉(zhuǎn)錄的顯著增加。相比之下，即使在ra刺激之后，表達(dá)rara突變形式的細(xì)胞也顯示出明顯的轉(zhuǎn)錄活性的減弱，如圖4c所示。本公開假設(shè)，rara突變體轉(zhuǎn)錄活性的減弱，可能至少部分地，來(lái)自引起rara與共抑制蛋白的結(jié)合增強(qiáng)的這些突變。為了測(cè)試這種可能性，本公開使用哺乳動(dòng)物雙雜交測(cè)定來(lái)探測(cè)野生型和突變型rara蛋白與ncor1共抑制因子(已知的rara相互作用者)44的相互作用。與野生型rara相比，rara突變體在ra刺激之前和之后都表現(xiàn)出與ncor1的更高的結(jié)合信號(hào)，如圖4d所示，這表明突變體rara是更有效的共抑制因子的招募者?？傊?，這些結(jié)果表明，在乳腺纖維上皮腫瘤中，rara中的聚集突變可能促進(jìn)rara與共抑制因子的相互作用，從而改變r(jià)ara靶基因的轉(zhuǎn)錄。示例7為了證實(shí)突變體flna的表達(dá)，本研究還用可得到的新鮮冷凍組織對(duì)三個(gè)flna突變體樣品的cdna進(jìn)行了測(cè)序。根據(jù)制造商推薦的方案，使用來(lái)自invitrogen的superscriptiiifirst-strandsynthesissupermix將一百個(gè)rna轉(zhuǎn)化為cdna。根據(jù)表7中列出的引物進(jìn)行pcr。如上所述，為了對(duì)基因組dnasanger測(cè)序，進(jìn)行pcr擴(kuò)增、測(cè)序和分級(jí)。表7.用于flnacdna測(cè)序的引物引物正向序列5'-->3'反向序列5'-->3'flna-a1191+y1235ctcttcgctgacacccacatcctccacactgaactcagtggtggflna-g1578cccagaccgtcaattatgtgccgggatctcgtcaccaccgtact最后，本公開研究了fas是否以線性方式進(jìn)展到惡性pt，如以前的研究6-10中提出的。使用相同的50基因目標(biāo)組，實(shí)驗(yàn)測(cè)定了從同樣患者(n＝3)分離的成對(duì)的并發(fā)fa和pt樣區(qū)域。本公開還分析了來(lái)自兩名起始診斷為fas，但隨后pt樣復(fù)發(fā)患者的成對(duì)的縱向腫瘤。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，即使在相同的患者中，較高級(jí)別的pts比成對(duì)的fa區(qū)域具有的突變更多，特別是在表8和圖10b所示的癌癥相關(guān)基因中。在這些患者中，兩名患者，其中一名為并發(fā)的，一名為縱向的，具有配對(duì)fa和pt共享共同的突變，與線性進(jìn)展一致。然而，第三名患者(縱向的)顯示具有不同med12突變的fa和pt損傷，支持多病灶起源。剩余的兩個(gè)并發(fā)病例在fa中沒(méi)有顯示突變，因此被認(rèn)為是非信息性的?？傮w而言，這些觀察結(jié)果表明，乳腺纖維上皮腫瘤發(fā)展可能并不總是遵循嚴(yán)格的線性進(jìn)展模型，而是也可能由同一乳房中獨(dú)立病變產(chǎn)生的多病灶方式引起。本公開描述的乳腺纖維上皮腫瘤的基因組藍(lán)圖可能具有顯著的臨床意義。如前所述，pt的診斷和組織病理學(xué)分類常常對(duì)病理學(xué)家提出挑戰(zhàn)。本公開內(nèi)容為基于乳腺纖維上皮腫瘤的基因組學(xué)分類提供了基礎(chǔ)，當(dāng)與組織病理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合使用時(shí)，其可以增加診斷準(zhǔn)確性。例如，基于所獲得的測(cè)序數(shù)據(jù)，先前在組織學(xué)上被分類為良性fa的樣品004被發(fā)現(xiàn)除了具有med12、rara和flna突變之外(參見(jiàn)圖9)，還具有r1b截?cái)嗪蚭gfr激活突變，符合邊界/惡性pt特征。該病例隨后由2名乳腺病理學(xué)專家重新評(píng)估，并確認(rèn)為臨界pt。這種情況支持有序突變分析可能提高分類纖維上皮腫瘤的能力的觀念，特別是與惡性狀態(tài)相關(guān)的腫瘤。除了診斷之外，本發(fā)明還揭示pt的候選治療靶標(biāo)。具體來(lái)說(shuō)，pik3ca中的典型活化突變和egfr的高水平擴(kuò)增僅在較高級(jí)pt患者中發(fā)現(xiàn)，顯示egfr-和pi3k靶向治療的潛在治療機(jī)會(huì)。這對(duì)于侵略性惡性pt尤其重要，對(duì)于侵略性惡性pt，除了手術(shù)之外，目前還沒(méi)有有效的治療選擇。同樣令人感興趣的是影響med12和rara的突變，其在纖維上皮腫瘤中頻度很高，并且可能影響核激素受體信號(hào)34,45。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)首次確定了實(shí)體瘤中錯(cuò)義rara錯(cuò)義突變的作用，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了rara在纖維上皮腫瘤中的重要性。因此，這些基因可能代表潛在的治療靶點(diǎn)。雖然所公開的方法和試劑盒已經(jīng)以其特定程度的優(yōu)選形式進(jìn)行了描述，但是應(yīng)當(dāng)理解，本公開的優(yōu)選形式僅作為示例給出，在不脫離本公開的范圍的情況下，可以對(duì)構(gòu)造的細(xì)節(jié)和部件的組合和布置進(jìn)行諸多變化。參考文獻(xiàn)1.lakhani,s.,ellis,i.,schnitt,s.,tan,p.&vandevijver,m.worldhealthorganisationclassificationoftumorsofthebreast,vol4.,142-147(internationalagencyforresearchoncancer,lyon,2012).2.lim,w.k.etal.exomesequencingidentifieshighlyrecurrentmed12somaticmutationsinbreastfibroadenoma.natgenet46,877-80(2014).3.coriatynelson,z.,ray,r.m.,gao,d.l.&thomas,d.b.riskfactorsforfibroadenomainacohortoffemaletextileworkersinshanghai,china.amjepidemiol156,599-605(2002).4.tan,p.h.etal.phyllodestumorsofthebreast:theroleofpathologicparameters.amjclinpathol123,529-40(2005).5.krishnamurthy,s.,ashfaq,r.,shin,h.j.&sneige,n.distinctionofphyllodestumorfromfibroadenoma:areappraisalofanoldproblem.cancer90,342-9(2000).6.hodges,k.b.etal.evidencefortransformationoffibroadenomaofthebreasttomalignantphyllodestumor.applimmunohistochemmolmorphol17,345-50(2009).7.kuijper,a.etal.analysisoftheprogressionoffibroepithelialtumoursofthebreastbypcr-basedclonalityassay.jpathol197,575-81(2002).8.noguchi,s.etal.progressionoffibroadenomatophyllodestumordemonstratedbyclonalanalysis.cancer76,1779-85(1995).9.kasami,m.etal.monoclonalityinfibroadenomaswithcomplexhistologyandphyllodalfeatures.breastcancerrestreat50,185-91(1998).10.abe,m.etal.malignanttransformationofbreastfibroadenomatomalignantphyllodestumor:long-termoutcomeof36malignantphyllodestumors.breastcancer18,268-72(2011).11.cani,a.k.etal.next-gensequencingexposesfrequentmed12mutationsandactionabletherapeutictargetsinphyllodestumors.molcancerres13,613-9(2015).12.yoshida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