本發(fā)明涉及基于腺相關(guān)病毒(aav)的基因療法領(lǐng)域，尤其是涉及使用重組aav轉(zhuǎn)基因載體與免疫抑制劑和/或空aav衣殼的組合。本發(fā)明還提供組合物和基于此組合的成套試劑盒。

發(fā)明背景

腺相關(guān)病毒(aav)載體是首選的基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗鼈儽徽J(rèn)為就人體內(nèi)基因遞送而言具有最佳安全性和有效性。因此，aav載體廣泛用于體內(nèi)基因遞送并顯示對(duì)臨床前模型以及臨床試驗(yàn)安全有效。aav載體在以下疾病的i/ii期研究中獲得成功：血友病b、囊性纖維化、α-1抗胰蛋白酶缺乏癥、帕金森病、杜氏肌營養(yǎng)不良和萊伯氏先天性黑蒙癥(leber’scongenitalamaurosis)(selot等.,currentpharamceuticalbiotechnology,2013,14,1072-1082)。阿利潑金(alipogenetiparvovec)(uniqure)作為治療脂蛋白脂肪酶缺乏癥(lpld)的基因療法已在歐洲獲得銷售許可。盡管基于aav的基因療法有望治療多種疾病，不需要的免疫應(yīng)答(在暴露于野生型aav或基于aav的載體后)可限制aav載體的治療功效。近期，據(jù)報(bào)道在靜脈內(nèi)施用后向aav轉(zhuǎn)基因組合物加入大量空衣殼能克服中和抗體的抑制效果并對(duì)肝的轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)生緩解效應(yīng)(wo2013/078400；wo2013/123503)。

基于aav載體的基因療法也用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)，這是影響～1％人群的慢性炎性疾病。ra病理遍布滑膜關(guān)節(jié)。關(guān)節(jié)的局部性質(zhì)使得體內(nèi)基因療法非常有吸引力。應(yīng)用提供抗炎蛋白質(zhì)的療法，旨在使ra平衡趨向抗炎狀態(tài)。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)內(nèi)施用表達(dá)熒光素酶的aav后，不是所有關(guān)節(jié)有效轉(zhuǎn)導(dǎo)(通常<50％)且在注射的關(guān)節(jié)中的表達(dá)變化很大。為了能在關(guān)節(jié)中持續(xù)局部生成有效劑量的治療性蛋白質(zhì)，尤其是在類風(fēng)濕性滑膜中，需要開發(fā)有效的基因遞送體系。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供raav載體組合物和免疫抑制劑以用于含基因療法的治療，其中所述治療包括向個(gè)體施用所述raav載體組合物和施用所述免疫抑制劑，其中所述raav載體組合物包括raav轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼，空衣殼與raav轉(zhuǎn)基因載體之比是至少1:1。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述raav載體組合物和免疫抑制劑中至少一種局部施用。

在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述raav載體組合物和所述免疫抑制劑中至少一種全身施用。

優(yōu)選地，局部施用所述raav載體組合物，優(yōu)選在含大量先天免疫細(xì)胞的部位，甚至更優(yōu)選地關(guān)節(jié)內(nèi)施用所述raav載體組合物。

在一個(gè)實(shí)施方式中，局部施用所述免疫抑制劑，優(yōu)選在含大量先天免疫細(xì)胞的部位，甚至更優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)局部施用所述免疫抑制劑。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，全身施用所述免疫抑制劑，優(yōu)選肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。

在某些實(shí)施方式中，相繼施用所述raav載體組合物和所述免疫抑制劑，其中優(yōu)選地所述免疫抑制劑在所述raav載體組合物之前施用。

在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑是先天免疫細(xì)胞抑制劑、細(xì)胞穩(wěn)定藥或嘌呤能信號(hào)通路修飾藥物如甲氨蝶呤(非固醇類抗炎藥)和/或免疫抑制生物制劑，如巨噬細(xì)胞消耗抗體(macrophagedepletingantibody)、tnf阻斷劑、il-6阻斷劑和/或il-2阻斷劑。優(yōu)選地，所述免疫抑制劑是先天免疫細(xì)胞抑制劑，優(yōu)選為糖皮質(zhì)激素和/或脂質(zhì)體二膦酸鹽。

在某些實(shí)施方式中，所述raav轉(zhuǎn)基因載體所含的所述轉(zhuǎn)基因編碼治療性蛋白質(zhì)。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述基因療法用于預(yù)防、延遲、治愈、恢復(fù)和/或治療炎性病癥或炎性疾病，且優(yōu)選其中所述轉(zhuǎn)基因編碼治療性抗炎蛋白質(zhì)。優(yōu)選地，所述炎性病癥或疾病是風(fēng)濕性病癥或疾病。優(yōu)選地，所述基因療法用于治療、預(yù)防、延遲、治愈、恢復(fù)和/或治療非炎性病癥或非炎性疾病。

在某些實(shí)施方式中，所述raav載體組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑和/或賦形劑。

在某些實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑包含在所述raav載體組合物內(nèi)。

本發(fā)明還提供組合物，所述組合物包括本文所定義的raav轉(zhuǎn)基因載體和本文所定義的空衣殼，空衣殼與raav轉(zhuǎn)基因載體之比是至少1:1，以及本文所定義的免疫抑制劑。

本發(fā)明還提供成套試劑盒，其包括本文所定義的raav載體組合物和本文所定義的免疫抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容

定義

“raav轉(zhuǎn)基因載體”指重組腺相關(guān)病毒(aav)載體，其用分子方法獲得自野生型aav。raav轉(zhuǎn)基因載體不同于野生型(wt)aav載體，因?yàn)樗谢虿糠植《净蚪M用轉(zhuǎn)基因取代，其相對(duì)于本文進(jìn)一步定義的aav核酸序列是非天然核酸。野生型aav屬于依賴病毒屬(dependovirus)，進(jìn)而屬于細(xì)小病毒(parvovirinae)的亞科，也稱為細(xì)小病毒，其能感染脊椎動(dòng)物。細(xì)小病毒屬于小dna動(dòng)物病毒科，即細(xì)小病毒科。如通過其屬名稱可推斷，依賴病毒的成員的獨(dú)特性在于其通常需要用輔助病毒如腺病毒或皰疹病毒感染以在細(xì)胞培養(yǎng)物中有效感染。依賴病毒屬包括通常感染人的aav，和感染其它溫血?jiǎng)游锏南嚓P(guān)病毒(如牛、犬、馬和綿羊腺相關(guān)病毒)。關(guān)于細(xì)小病毒和細(xì)小病毒科其它成員的進(jìn)一步信息參見kennethi.berns,"parvoviridae:thevirusesandtheirreplication",《fieldsvirology第69章(第3版.1996)。為方便起見，本文通過參考aav進(jìn)一步舉例說明和描述本發(fā)明。然而，應(yīng)理解，本發(fā)明不限于aav，而可以同樣地應(yīng)用于其他細(xì)小病毒。

所有已知aav血清型的基因組結(jié)構(gòu)非常類似。aav基因組是線性、單鏈dna分子，長度小于約5,000個(gè)核苷酸(nt)。末端反向重復(fù)(itr)在獨(dú)特的非結(jié)構(gòu)復(fù)制(rep)蛋白和結(jié)構(gòu)(vp)蛋白的編碼核苷酸序列的側(cè)翼。vp蛋白(vp1、-2和-3)形成衣殼或蛋白質(zhì)外鞘(shell)。末端145nt自身互補(bǔ)并排列成使得可形成穩(wěn)定的分子內(nèi)雙鏈體，其形成t型發(fā)夾。這些發(fā)夾結(jié)構(gòu)的功能是作為病毒dna復(fù)制起點(diǎn)，用作細(xì)胞dna聚合酶復(fù)合物的引物。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的wtaav感染后，rep基因25(即rep78和rep52)分別從p5啟動(dòng)子和p19啟動(dòng)子表達(dá)，兩種rep蛋白都在病毒基因組復(fù)制中起作用。reporf的剪接事件導(dǎo)致實(shí)際上4種rep蛋白(即rep78、rep68、rep52和rep40)的表達(dá)。然而，顯示編碼rep78和rep52蛋白的未剪接mrna在哺乳動(dòng)物中足夠用于aav載體生成。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的wtaav感染對(duì)于衣殼蛋白生成依賴于交替使用2個(gè)剪接受體位點(diǎn)與對(duì)于vp2次優(yōu)使用的acg起始密碼子的組合。

raav轉(zhuǎn)基因載體可缺失一個(gè)或優(yōu)選地所有的野生型aav基因，但可仍包括功能性itr核酸序列。優(yōu)選地，所述raav轉(zhuǎn)基因載體不包括任何編碼病毒蛋白質(zhì)的核苷酸序列，如aav的rep(復(fù)制)或cap(衣殼)基因。功能性itr序列對(duì)aav病毒粒子的復(fù)制、拯救和包裝是必需的。itr序列可以是野生型序列或可與野生型序列有至少80％、85％、90％、95％或100％序列一致性，或可通過例如核苷酸插入、突變、缺失或取代來改變，只要其保持功能。在此背景下，功能性指指導(dǎo)基因組包裝進(jìn)入衣殼外鞘且隨后允許在待轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞或靶細(xì)胞中表達(dá)的能力。通常，野生型aav基因組的末端反向重復(fù)保留在raav轉(zhuǎn)基因載體內(nèi)。itr能克隆自aav病毒基因組或剪切自含aavitr的載體。itr核苷酸序列能使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)在本文所定義的轉(zhuǎn)基因的任一末端連接，或itr之間的野生型aav序列能用所需核苷酸序列取代。所述raav轉(zhuǎn)基因載體優(yōu)選包括至少一種aav血清型的末端反向重復(fù)區(qū)域(itr)的核苷酸序列或與之基本相同的核苷酸序列，和插入兩個(gè)itr之間的至少一種編碼治療性蛋白質(zhì)(在合適調(diào)節(jié)元件控制下)的核苷酸序列。大部分當(dāng)前使用的raav轉(zhuǎn)基因載體采用來自aav血清型2的itr序列。優(yōu)選的itr序列由seqidno:1-6表示，如表1所示。raav轉(zhuǎn)基因載體中存在的最優(yōu)選的itr是aav2itr。raav基因組能包括單鏈或雙鏈(自身互補(bǔ))dna。單鏈核酸分子是有義或反義鏈，2種極性同樣能表達(dá)基因。單鏈raav轉(zhuǎn)基因載體可采用野生型aav血清型2(aav2)itr序列(seqid:24、25)，雙鏈(自身互補(bǔ))raav轉(zhuǎn)基因載體可采用修飾形式的itr(seqid:26、27)。raav轉(zhuǎn)基因載體還可包括標(biāo)記或報(bào)告基因，如編碼例如抗生素抗性基因、熒光蛋白(如gfp)的基因，或編碼化學(xué)、酶學(xué)或本領(lǐng)域已知的其他可檢測(cè)和/或可選擇性產(chǎn)物(如lacz,aph)的基因。

用本領(lǐng)域已知方法生成raav轉(zhuǎn)基因載體，包括aav血清型衣殼和aav基因組itr的任何可能組合，所述方法描述于pan等(j.ofvirology(1999)73:3410-3417),clark等(humangenetherapy(1999)10:1031-1039),wang等(methodsmol.biol.(2011)807:361-404)和grimm(methods(2002)28(2):146-157)，其通過引用納入本文。簡言之，所述方法一般涉及(a)向宿主細(xì)胞引入raav基因組構(gòu)建體，(b)向宿主細(xì)胞引入aav輔助構(gòu)建體，其中所述輔助構(gòu)建體包括自野生型raav基因組缺少的病毒功能，和(c)向宿主細(xì)胞引入輔助病毒構(gòu)建體。所有用于raav載體復(fù)制和包裝的功能需要存在，以實(shí)現(xiàn)raav基因組復(fù)制并包裝入在raav載體。所述引入宿主細(xì)胞能用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)完成，并可以是同時(shí)或相繼完成。最后，所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)到產(chǎn)生raav載體并用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)如cscl梯度(xiao等1996,j.virol.70:8098-8108)純化。純化的raav載體隨后能用于所述方法。能獲得大于每ml10¹²顆粒的高效價(jià)和高純度(沒有可檢測(cè)的輔助和野生型病毒)(clark等同上和flotte等1995,genether.2:29-37)。在itr區(qū)域之間插入raav載體的轉(zhuǎn)基因的總大小一般小于5千堿基(kb)。

編碼所述衣殼蛋白的序列可以是在自然界中發(fā)現(xiàn)的衣殼序列，如aav2、aav5和aav8，其核苷酸和氨基酸序列如seqidno:7-18所示。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述aav衣殼蛋白是aav血清型5或aav血清型8的衣殼蛋白?；蛘撸鲂蛄惺侨嗽斓?，例如該序列可以是雜交形式或可以是密碼子優(yōu)化的，例如通過苜蓿銀紋夜蛾多核型多角體病毒(acmnpv)或草地貪夜蛾(spodopterafrugiperda)的密碼子使用。例如，所述衣殼序列可由aav1的vp2和vp3序列構(gòu)成，而剩余vp1序列則為aav5。所述人造序列可以是合理設(shè)計(jì)或定向進(jìn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。這可包括通過dna重排、易錯(cuò)pcr、生物信息學(xué)合理設(shè)計(jì)、定點(diǎn)飽和突變生成的衣殼庫。所得衣殼是基于現(xiàn)有血清型，但包含改善這類衣殼特性的多個(gè)氨基酸或核苷酸變化。所得衣殼可以是現(xiàn)有血清型不同部分的組合、“重排衣殼”(“shuffledcapsid”)，或包含全新變化，即一或多個(gè)氨基酸或核苷酸添加、缺失或取代，成組排列或遍布基因或蛋白質(zhì)全長。參見例如schaffer和maheshri；《第26屆ieeeembs國際年會(huì)會(huì)議記錄》(proceedingsofthe26thannualinternationalconferenceoftheieeeembs),美國加利福尼亞州舊金山；2004年9月1-5日,2004,3520-3523頁；asuri等(2012)moleculartherapy20(2):329-3389；lisowski等(2014)nature506(7488):382-386，其通過引用納入本文。

在本發(fā)明上下文中，衣殼蛋白外鞘可與raav轉(zhuǎn)基因載體基因組itr屬于不同血清型。本發(fā)明的raav轉(zhuǎn)基因載體可因此通過衣殼蛋白外鞘而殼體化，即二十面體衣殼，其包括一種aav血清型例如aav血清型5的衣殼蛋白質(zhì)(vp1、vp2和/或vp3)，而raav轉(zhuǎn)基因載體所含的itr序列可能是上述任何raav血清型，包括raav5載體。優(yōu)選的野生型衣殼蛋白質(zhì)外鞘序列由seqidno:7-18表示，如表1所示。在一個(gè)實(shí)施方式中，raav轉(zhuǎn)基因載體通過aav血清型5或aav血清型2或aav血清型8的衣殼蛋白質(zhì)外鞘而殼體化，其中所述raav轉(zhuǎn)基因載體中存在的raav基因組或itr來源于aav血清型2或aav血清型5(由seqidno:5和6編碼)或aav血清型8。在此實(shí)施方式中，進(jìn)一步優(yōu)選raav轉(zhuǎn)基因載體通過aav血清型5(更優(yōu)選seqidno:12、13、14，由seqidno:11編碼)的衣殼蛋白質(zhì)外鞘而殼體化，并且所述raav轉(zhuǎn)基因載體中存在的所述raav基因組或itr來源于aav血清型2(更優(yōu)選如seqidno:1、2的單鏈或如seqidno:3、4的雙鏈)。優(yōu)選此實(shí)施方式用于將基因遞送到關(guān)節(jié)。

在另一實(shí)施方式中，優(yōu)選raav轉(zhuǎn)基因載體通過aav血清型8(更優(yōu)選seqidno:16、17、18，由seqidno:15編碼)的衣殼蛋白質(zhì)外鞘而殼體化，并且所述載體中存在的所述raav基因組或itr來源于aav血清型2(更優(yōu)選如seqidno:1、2的單鏈或如seqidno:3、4的雙鏈)。優(yōu)選此實(shí)施方式用于全身遞送。

在另一實(shí)施方式中，優(yōu)選raav轉(zhuǎn)基因載體通過aav血清型2(更優(yōu)選seqidno:8、9、10，由seqidno:7編碼)的衣殼蛋白質(zhì)外鞘而殼體化，并且所述載體中存在的所述raav基因組或itr來源于aav血清型2(更優(yōu)選如seqidno:1、2的單鏈或如seqidno:3、4的雙鏈)。aav5和其它aav血清型的完整基因組已經(jīng)測(cè)序(chiorini等1999,j.ofvirology.第73卷,第2期,1309-1319頁)，核苷酸序列可獲自genbank(登記號(hào)af085716)。因此，aav5的itr核苷酸序列對(duì)技術(shù)人員而言是容易獲得的。aav2的完整基因組可獲自ncbi(ncbi參考序列nc_001401.2)。其能通過本領(lǐng)域已知的化學(xué)合成技術(shù)，使用例如寡核苷酸合成儀，如由應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystemsinc.，美國加利福尼亞州福斯特)供應(yīng)，或通過標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)來克隆或制備。

“血清型”一般在抗體與一種病毒之間相較另一病毒缺乏交叉反應(yīng)性的基礎(chǔ)上定義。這種交叉反應(yīng)性差異通常歸因于衣殼蛋白序列/抗原決定簇的差異(例如歸因于aav血清型的vp1、vp2和/或vp3序列差異)。在傳統(tǒng)定義下，血清型意味著感興趣病毒已經(jīng)針對(duì)特異于所有現(xiàn)有和特征性血清型的血清測(cè)試中和活性，且沒有發(fā)現(xiàn)中和感興趣病毒的抗體。隨著更多天然存在的病毒分離物的發(fā)現(xiàn)和衣殼突變體的生成，可能與任何現(xiàn)有血清型有或沒有血清學(xué)差異。因此，在新aav沒有血清學(xué)差異的情況下，此新aav會(huì)是對(duì)應(yīng)血清型的亞組或變體。在許多情況下，血清學(xué)檢測(cè)中和活性尚需要在有衣殼序列修飾的突變病毒上進(jìn)行，以確定其是否根據(jù)傳統(tǒng)血清型定義屬于另一血清型。因此，為了方便起見和避免重復(fù)，術(shù)語“血清型”廣義上指血清學(xué)上不同的病毒(如aav)以及可能在給定血清型亞組或變體內(nèi)的非血清學(xué)不同的病毒(如aav)。舉例來說，raav轉(zhuǎn)基因載體包括多種天然或非天然出現(xiàn)的血清型。這類非限制性血清型包括aav-1、-2、-3、-4、-5、-6、-7、-8、-9、-10、-11、-rh74、-rh10、aav-dj和aav-2i8。再次，為了方便起見，血清型包括有衣殼序列修飾的aav，其未充分表征為不同血清型，且可實(shí)際上構(gòu)成已知血清型的亞組或變體。

“空aav衣殼”在本文也命名為“空衣殼”，僅由衣殼蛋白構(gòu)成且無病毒核酸基因組?？找職な遣《緲宇w粒，因?yàn)槠渑c一種或多種結(jié)合全載體(含基因組)(如腺相關(guān)病毒，aav)的抗體或清道夫受體結(jié)合，從而優(yōu)選起到誘餌作用以降低針對(duì)病毒載體的免疫應(yīng)答。這種誘餌優(yōu)選用于吸收針對(duì)病毒載體的抗體或清道夫受體，從而在這類抗體或清道夫受體的背景下增加或改善細(xì)胞的病毒載體轉(zhuǎn)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(引入轉(zhuǎn)基因)，并且進(jìn)而增加基因轉(zhuǎn)錄物和/或編碼蛋白的細(xì)胞表達(dá)。例如，空aav8衣殼會(huì)保留與一種或多種結(jié)合aav(如野生型aav8或raav8轉(zhuǎn)基因載體或另一aav血清型)的抗體或清道夫受體結(jié)合的能力。例如，空aav2衣殼會(huì)保留與一種或多種結(jié)合野生型aav8或raav8轉(zhuǎn)基因載體的抗體或清道夫受體結(jié)合的能力?？找職た杀Ａ暨M(jìn)入細(xì)胞的能力，但不需進(jìn)入細(xì)胞，例如，修飾或交聯(lián)空衣殼的衣殼蛋白質(zhì)序列減弱經(jīng)修飾的或交聯(lián)的衣殼進(jìn)入細(xì)胞的能力。因此，相較含轉(zhuǎn)基因的病毒載體，這種空衣殼與細(xì)胞的結(jié)合減少。因此，空衣殼可能未修飾，或經(jīng)修飾并且相較含轉(zhuǎn)基因的病毒載體具有減少的與細(xì)胞的結(jié)合。在特定實(shí)施方式中，空衣殼用交聯(lián)劑處理，或包括顯示與aav受體結(jié)合降低或減少的突變的衣殼。在特定方面，突變的衣殼包括一種或多種突變的衣殼蛋白，如wo2013/078400所公開，即其中一或多個(gè)有助于硫酸乙酰肝素蛋白多糖結(jié)合的精氨酸(r)殘基用不帶電或疏水殘基取代，或任何aav衣殼蛋白如aav2vp1(seqidno:8)和/或vp2(seqidno:9)，其在任何以下位置具有一或多個(gè)精氨酸(r)殘基被取代：451、448、530、585或588(如在任何位置的一或多個(gè)精氨酸(r)殘基被取代：在451位用半胱氨酸取代，在448位用半胱氨酸取代，在530位用丙氨酸取代，在585位用丙氨酸取代或在588位用丙氨酸取代)。

空aav衣殼或空衣殼有時(shí)在aav載體制品中天然發(fā)現(xiàn)。這種天然混合物能根據(jù)本發(fā)明被使用，或若需要，被操縱以增加或減少空衣殼和/或載體的量。不希望受任何理論約束，所述空衣殼可用作誘餌，從而防止raav轉(zhuǎn)基因載體降解。此情況下，空衣殼的量能被調(diào)整成預(yù)期減少抗體或巨噬細(xì)胞的抑制作用的量，所述抗體或巨噬細(xì)胞與意在用于在個(gè)體中載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的raav載體反應(yīng)或結(jié)合。

空衣殼還能獨(dú)立于aav載體制品而生成，若需要，加入aav載體制品或分開施用于個(gè)體。能產(chǎn)生和純化空衣殼、包含衣殼的基因組和衣殼蛋白質(zhì)，并且例如根據(jù)個(gè)體中的aav抗體效價(jià)或血清型確定(任選地調(diào)整)他們的量，并根據(jù)其預(yù)期目的使用或施用。

“先天免疫細(xì)胞”在本文理解成嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞或樹突細(xì)胞，其具有參與對(duì)外來物質(zhì)炎性反應(yīng)的潛力。

“巨噬細(xì)胞”在本文理解成先天免疫細(xì)胞，其在被稱為吞噬作用的過程中吞沒和消化細(xì)胞碎片、外來物質(zhì)、微生物和癌細(xì)胞。

術(shù)語“轉(zhuǎn)基因”用于指相對(duì)aav核酸序列而言的非天然核酸。其用于指能被引入細(xì)胞或生物體的多核苷酸。轉(zhuǎn)基因包括任何多核苷酸，如編碼多肽或蛋白質(zhì)的基因，轉(zhuǎn)錄成抑制性多核苷酸的多核苷酸，或不轉(zhuǎn)錄的多核苷酸(如缺乏表達(dá)控制元件，如驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因可包括至少兩種核苷酸序列，各自不同或編碼不同的治療性分子。所述至少兩種不同的核苷酸序列可由ires(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn))元件連接，其提供在單一啟動(dòng)子控制下的雙順反子轉(zhuǎn)錄物。合適的ires元件描述于例如hsieh等(1995,biochemicalbiophys.res.commun.214:910-917)。此外，所述編碼不同(治療性)多肽或蛋白質(zhì)的至少兩種不同的核苷酸序列可由病毒2a序列連接，以允許來自單一啟動(dòng)子的兩種轉(zhuǎn)基因有效表達(dá)。2a序列的示例包括口蹄疫病毒、馬甲型鼻炎病毒(equinerhinitisavirus)、明脈扁刺蛾β四體病毒(thoseaasignavirus)和豬捷申病毒-1(porcineteschovirus-1)(kim等,plosone(2011)6(4):e18556)。轉(zhuǎn)基因優(yōu)選插入raav基因組內(nèi)或如上所示在itr序列之間。轉(zhuǎn)基因還可以是表達(dá)構(gòu)建體，其包括表達(dá)調(diào)節(jié)元件如啟動(dòng)子或操作性地連接到編碼序列和3’終止序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列。優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因內(nèi)的編碼序列沒有可操作性地連接到類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，轉(zhuǎn)基因內(nèi)的編碼序列沒有可操作性地連接到地塞米松誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

在具有轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中，所述轉(zhuǎn)基因已經(jīng)通過細(xì)胞的raav“轉(zhuǎn)導(dǎo)”來引入/轉(zhuǎn)移/轉(zhuǎn)導(dǎo)。引入轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞或其子代被稱為“經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞。通常，轉(zhuǎn)基因被納入轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞子代或成為發(fā)育自細(xì)胞的生物體的一部分。因此，“經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞(例如，在哺乳動(dòng)物中，如細(xì)胞或組織或器官細(xì)胞)指將外源分子(如多核苷酸或蛋白質(zhì)，例如轉(zhuǎn)基因)納入細(xì)胞后，細(xì)胞中的遺傳變化。因此，例如，“經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的”細(xì)胞是已經(jīng)引入外源分子的細(xì)胞或其子代。所述細(xì)胞能增殖并引入的蛋白被表達(dá)，或核酸被轉(zhuǎn)錄。

“轉(zhuǎn)導(dǎo)”指轉(zhuǎn)基因通過病毒載體轉(zhuǎn)移進(jìn)受體宿主細(xì)胞。通過本發(fā)明的raav轉(zhuǎn)基因載體轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞引起該載體所含的轉(zhuǎn)基因被轉(zhuǎn)入經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。“宿主細(xì)胞”或“靶細(xì)胞”指發(fā)生dna遞送的細(xì)胞，如個(gè)體的滑膜的細(xì)胞(synovialcell)或滑膜細(xì)胞(synoviocyte)。aav載體能轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂和非分裂細(xì)胞。

“基因”或“編碼序列”指編碼特定蛋白質(zhì)的dna或rna區(qū)。編碼序列當(dāng)置于合適調(diào)節(jié)區(qū)(如啟動(dòng)子)的控制下時(shí)，轉(zhuǎn)錄(dna)和翻譯(rna)成多肽。基因可包括數(shù)個(gè)可操作性地連接的片段，如啟動(dòng)子、5’前導(dǎo)序列、內(nèi)含子、編碼序列和3’非編碼序列，包括多腺苷酸化位點(diǎn)或信號(hào)序列。嵌合或重組基因是通常在自然界中不存在的基因，例如其中啟動(dòng)子不與部分或所有轉(zhuǎn)錄dna區(qū)天然相關(guān)的基因?！盎虮磉_(dá)”指其中基因被轉(zhuǎn)錄成rna和/或被翻譯成活性蛋白的過程。

本文所用的術(shù)語“啟動(dòng)子”或“轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列”指核酸片段，其作用在于控制一或多個(gè)編碼序列的轉(zhuǎn)錄，且相對(duì)于所述編碼序列轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的轉(zhuǎn)錄方向而言位于上游，并通過dna依賴性rna聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)的存在、轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和任何其它dna序列(包括但不限于，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、抑制子和激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何其它核苷酸序列，其直接或間接調(diào)節(jié)來自啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄量)來在結(jié)構(gòu)上鑒別。“組成型”啟動(dòng)子是在大部分生理和發(fā)育條件下在大部分組織中有活性的啟動(dòng)子?！罢T導(dǎo)型”啟動(dòng)子是受生理或發(fā)育調(diào)控的啟動(dòng)子，如通過化學(xué)誘導(dǎo)物的應(yīng)用。優(yōu)選的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子是nf-kb響應(yīng)性啟動(dòng)子，其在發(fā)炎后可被誘導(dǎo)。更優(yōu)選的nf-kb反應(yīng)啟動(dòng)子包括seqidno:19?！敖M織特異性”啟動(dòng)子優(yōu)選在特定類型的組織或細(xì)胞中有活性。合適的啟動(dòng)子序列的選擇一般取決于選定用于表達(dá)dna區(qū)段的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的raav和/或轉(zhuǎn)基因內(nèi)的優(yōu)選啟動(dòng)子序列是在類風(fēng)濕性滑膜的細(xì)胞中賦予表達(dá)的啟動(dòng)子，如在內(nèi)膜巨噬細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞和/或其它滑膜細(xì)胞，例如但不限于t細(xì)胞中。例如，優(yōu)選的啟動(dòng)子是已知在滑膜細(xì)胞中表達(dá)的基因的啟動(dòng)子，如cmv啟動(dòng)子(巨細(xì)胞病毒)、il-6基因啟動(dòng)子或sv40啟動(dòng)子、或如本文早前鑒定的nf-κb誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，以及其他易由技術(shù)人員確定的啟動(dòng)子?；蛘?，轉(zhuǎn)基因可操作性地連接到允許有效全身表達(dá)的啟動(dòng)子。合適的啟動(dòng)子序列是cmv啟動(dòng)子、cba(雞β肌動(dòng)蛋白)或肝特異性啟動(dòng)子如人α-1抗胰蛋白酶(haat)或tbg(甲狀腺結(jié)合球蛋白)。優(yōu)選地，所述raav和/或轉(zhuǎn)基因內(nèi)的啟動(dòng)子不是類固醇誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。更優(yōu)選地，所述raav和/或轉(zhuǎn)基因內(nèi)的啟動(dòng)子不是地塞米松誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

本文所用的術(shù)語“可操作性地連接”指以功能關(guān)系連接多核苷酸(或多肽)元件。當(dāng)核酸被置于與另一核酸序列具有功能關(guān)系時(shí)，其“可操作性地連接”。例如，轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列可操作性地連接編碼序列，只要其影響所述編碼序列的轉(zhuǎn)錄?！翱刹僮餍缘剡B接”指所連接的dna序列通常是連續(xù)的，必要時(shí)連續(xù)并在讀框中連接兩個(gè)蛋白質(zhì)的編碼區(qū)。

本文所用的“基因療法”是將核酸序列(如本文所定義的轉(zhuǎn)基因)插入個(gè)體細(xì)胞和/或組織中以治療疾病。轉(zhuǎn)基因可以是功能性突變體等位基因，其取代或補(bǔ)充缺陷基因?；虔煼ㄟ€包括插入本質(zhì)上抑制的轉(zhuǎn)基因，即抑制、減少或降低內(nèi)源基因或蛋白的表達(dá)、活性或功能，如不需要或異常的(如致病)基因或蛋白。這種轉(zhuǎn)基因可以是外源的。外源分子或序列應(yīng)理解成在待治療的細(xì)胞、組織和/或個(gè)體中通常不出現(xiàn)的分子或序列。獲得性和先天性疾病均適合基因療法。

“治療性多肽”或“治療性蛋白質(zhì)”在本文中應(yīng)理解成能對(duì)個(gè)體產(chǎn)生有益效果的多肽或蛋白質(zhì)，優(yōu)選所述個(gè)體是人，更優(yōu)選所述人患有疾病。這類治療性多肽可選自但不限于由酶、輔助因子、細(xì)胞因子、抗體、生長因子、激素和抗炎蛋白質(zhì)組成的組。

本文所用的“治療有效”量是足以緩解(如緩和、減少、降低)至少一種疾病狀態(tài)相關(guān)癥狀的量。或者，“治療有效”量是足以提供使一些個(gè)體的病癥改善的量。

“序列一致性”在本文中定義為兩種或更多種氨基酸(多肽或蛋白)序列或者兩種或更多種核酸(多核苷酸)序列之間的關(guān)系，如通過比較序列測(cè)定。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，序列一致性基于兩個(gè)給定seqidno的全長或其部分計(jì)算。其部分優(yōu)選指兩個(gè)seqidno的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。在本領(lǐng)域中，“一致性”還指氨基酸或核酸序列之間的序列相關(guān)性程度，視情況而定，如由這類序列串之間的匹配所測(cè)定。除非本文另有說明，給定seqidno的一致性或相似性指基于所述序列的全長(即在其全長上或作為整體)的一致性或相似性。

兩種氨基酸序列之間的“相似性”如下測(cè)定：將一種多肽的氨基酸序列和其保守氨基酸取代基與第二多肽的序列進(jìn)行比較?！耙恢滦浴焙汀跋嗨菩浴蹦芡ㄟ^已知方法容易計(jì)算，包括但不限于(《計(jì)算分子生物學(xué)》(computationalmolecularbiology),lesk,a.m.編,紐約的牛津大學(xué)出版社(oxforduniversitypress),1988；《生物計(jì)算：信息學(xué)和基因組項(xiàng)目》(biocomputing:informaticsandgenomeprojects),smith,d.w.編,紐約的學(xué)術(shù)出版社(academicpress),1993；《序列數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)分析》(computeranalysisofsequencedata),第i部分,griffin,a.m.和griffin,h.g.編,新澤西州的胡馬納出版社(humanapress),1994；《分子生物學(xué)的序列分析》(sequenceanalysisinmolecularbiology),vonheine,g.,學(xué)術(shù)出版社,1987；和《序列分析引物》(sequenceanalysisprimer),gribskov,m.和devereux,j.編,紐約的m斯托克頓出版社(mstocktonpress),1991；以及carillo,h.和lipman,d.,siamj.appliedmath.,48:1073(1988)所述的那些。

確定一致性的優(yōu)選方法設(shè)計(jì)成給予所測(cè)序列之間的最大匹配。測(cè)定一致性和相似性的方法編纂在公開可用的計(jì)算機(jī)程序中。測(cè)定兩種序列間一致性和相似性的優(yōu)選計(jì)算機(jī)程序方法包括例如gcg程序包(devereux,j.等,nucleicacidsresearch12(1):387(1984))和bestfit、blastp、blastn及fasta(altschul,s.f.等,j.mol.biol.215:403-410(1990))。blastx程序可公開獲自ncbi和其它來源(《blast手冊(cè)》(blastmanual),altschul,s.等,ncbinlmnihbethesda,md20894；altschul,s.等,j.mol.biol.215:403-410(1990))。熟知的smithwaterman算法也可用于測(cè)定一致性。

用于多肽序列比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下：算法:needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比較矩陣:來自hentikoff和hentikoff的blossum62,proc.natl.acad.sci.usa.89:10915-10919(1992)；缺口罰分:12；和缺口長度罰分(gaplengthpenalty):4。具有這些參數(shù)的有用的程序作為“ogap”程序公開獲自位于威斯康星州麥迪遜的gcg(geneticscomputergroup)。上述參數(shù)是氨基酸比較的默認(rèn)參數(shù)(以及對(duì)于端隙(endgap)沒有罰分)。

用于核酸比較的優(yōu)選參數(shù)包括以下：算法:needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443-453(1970)；比較矩陣:匹配＝+10,錯(cuò)配＝0；缺口罰分:50；缺口長度罰分:3。作為gap程序獲自位于威斯康星州麥迪遜的gcg。上面給出的是核酸比較的默認(rèn)參數(shù)。

任選地，在測(cè)定氨基酸相似性的程度期間，技術(shù)人員還可考慮所謂的“保守”氨基酸取代，這對(duì)技術(shù)人員是清楚的。保守氨基酸取代指具有相似側(cè)鏈的殘基的可互換性。例如，有脂肪族側(cè)鏈的氨基酸組是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；有脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸組是絲氨酸和蘇氨酸；有含酰胺側(cè)鏈的氨基酸組是天冬酰胺和谷氨酰胺；有芳香族側(cè)鏈的氨基酸組是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；有堿性側(cè)鏈的氨基酸組是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；和有含硫側(cè)鏈的氨基酸組是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守氨基酸取代基團(tuán)是：纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。本文所公開的氨基酸序列的取代變體是所公開序列中至少一個(gè)殘基被移出且不同殘基插入其位置的那些。優(yōu)選地，氨基酸變化是保守的。各天然存在氨基酸的優(yōu)選保守取代如下：ala到ser；arg到lys；asn到gln或his；asp到glu；cys到ser或ala；gln到asn；glu到asp；gly到pro；his到asn或gln；ile到leu或val；leu到ile或val；lys到arg；gln或glu；met到leu或ile；phe到met,leu或tyr；ser到thr；thr到ser；trp到tyr；tyr到trp或phe；和val到ile或leu。

本文所用的“滑膜”或“滑膜組織”或“滑膜細(xì)胞”指覆蓋滑膜關(guān)節(jié)的非軟骨表面的細(xì)胞襯里，如進(jìn)一步描述于tak(2000,“檢測(cè)滑膜和滑液”(examinationofthesynoviumandsynovialfluid)收錄于:firesteings,panyanigs,wollheimfa編《類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎》(rheumatoidarthritis)紐約:牛津大學(xué)出版社(oxforduniv.press,inc)55-68)，并通過引用納入本文?；び蓛?nèi)膜襯里層(或滑膜襯里層)和融入關(guān)節(jié)囊的滑膜襯里下層(滑膜下層)組成。內(nèi)膜襯里層包括內(nèi)膜巨噬細(xì)胞(或巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞或a型滑膜細(xì)胞)和成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(fls或b型滑膜細(xì)胞)。因此，“滑膜”可由“滑膜組織”取代或與之同義?；ぜ?xì)胞能包括滑膜中存在的任何細(xì)胞，包括fls和巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞?；ぜ?xì)胞也可以是嗜中性粒細(xì)胞，t、b細(xì)胞和/或結(jié)締組織細(xì)胞，其都可存在于滑膜中。

術(shù)語“類風(fēng)濕性滑膜”或“類風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞”或“類風(fēng)濕性滑膜組織”指患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的個(gè)體關(guān)節(jié)的發(fā)炎滑膜。類風(fēng)濕性滑膜表征為內(nèi)膜襯里增生和在滑膜襯里下層中積聚fls、t細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、b細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和樹突細(xì)胞。這些積聚的細(xì)胞包括在類風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞的定義內(nèi)。

另外，通過不定冠詞“一(a)”或“一(an)”提及要素時(shí)，不排除存在多于一種要素的可能性，除非上下文明確要求有且僅有一種要素。因此，不定冠詞“一(a)”或“一(an)”通常指“至少一”。

詞匯“大致”或“約”當(dāng)與數(shù)值聯(lián)用(大致10，約10)時(shí)，優(yōu)選指該值可以是給定值10，加減該值的10％。

發(fā)明詳述

在第一方面，本發(fā)明提供重組腺相關(guān)病毒(raav)載體組合物。優(yōu)選地，所述raav載體組合物用于或適用于在基因療法中應(yīng)用。本發(fā)明的所述raav載體組合物包括至少一個(gè)本文所定義的raav-轉(zhuǎn)基因載體。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因具有治療活性。

優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)基因編碼治療性(多)肽或治療性蛋白質(zhì)。用于本發(fā)明背景的治療性(多)肽和蛋白質(zhì)包括但不限于：(可溶性)分化簇39(cd39)蛋白質(zhì)、(可溶性)分化簇73(cd73)蛋白質(zhì)、重組抗炎融合蛋白(rain)(cd73-39融合)、白介素-1抑制劑、腫瘤壞死因子-α抑制劑、白介素-12抑制劑、白介素-1受體拮抗劑、白介素-18結(jié)合蛋白、可溶性腫瘤壞死因子-α受體p55或可溶性腫瘤壞死因子-α蛋白75、顯性陰性iκb激酶-β、白介素-4、白介素-10、白介素-13、干擾素-β、血管活性腸肽、囊性纖維化跨膜調(diào)節(jié)蛋白(cftr)、肌養(yǎng)蛋白、抗肌萎縮蛋白相關(guān)蛋白質(zhì)(utrophin)、凝血(凝固)因子(如因子xiii、因子ix、因子x、因子viii、因子viia、蛋白c、因子vii、b區(qū)缺失因子viii或凝血因子的高活性或更長半衰期變體、或凝血因子的活性或失活形式)、單克隆抗體(如針對(duì)腫瘤壞死因子-α或白介素-12)、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞特異性65kda蛋白(rpe65)、紅細(xì)胞生成素、ldl受體、脂蛋白脂肪酶、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶、β-球蛋白、α-球蛋白、血影蛋白、α-抗胰蛋白酶、腺苷脫氨酶(ada)、金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(atp7a或atp7)、磺酰胺酶、參與溶酶體貯積癥(arsa)的酶、次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、p-25葡糖腦苷酯酶、鞘磷脂酶、溶酶體己糖胺酶、支鏈酮酸脫氫酶、激素、生長因子、胰島素樣生長因子1或2、血小板衍生生長因子、表皮生長因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子-3和-4、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子α和β、細(xì)胞因子、干擾素-α、干擾素-γ、白介素-2、白介素-12、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、淋巴毒素、自殺基因產(chǎn)物、單純皰疹病毒胸苷激酶、胞嘧啶脫氨酶、白喉毒素、細(xì)胞色素p450、脫氧胞苷激酶、腫瘤壞死因子、藥物抗性蛋白、腫瘤抑制蛋白(如p53、rb、wt-l、nf1、逢希伯-林道(vonhippel-lindau，vhl)、serca2a、腺瘤性結(jié)腸息肉病(apc))、vegf、微小抗肌萎縮蛋白(microdystrophin)、溶酶體酸性脂肪酶、芳香基硫酸酯酶a和b、atp7a和b、有免疫調(diào)節(jié)特性的肽、致耐受性或免疫原性肽或蛋白tregitope或hcdr1、胰島素、葡糖激酶、鳥苷酸環(huán)化酶2d(lca-gucy2d)、rab護(hù)送蛋白1(無脈絡(luò)膜)、lca5(lca-lebercilin)、鳥氨酸酮酸轉(zhuǎn)氨酶(回旋形萎縮(gyrateatrophy))、視網(wǎng)膜劈裂蛋白(retinoschisin)1(x-性連鎖視網(wǎng)膜先天性裂)、ush1c(尤希爾氏綜合征ic)、x-性連鎖色素性視網(wǎng)膜炎gtpase(xlrp)、mertk(rp的ar形式:色素性視網(wǎng)膜炎)、dfnb1(連接蛋白26耳聾)、achm2、3和4(全色盲)、pkd-1或pkd-2(多囊性腎病)、tpp1、cln2、涉及溶酶體貯積癥的基因產(chǎn)物(如硫酸酯酶、n-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、組織蛋白酶a、gm2-ap、npc1、vpc2，鞘脂激活蛋白)、或者一種或多種鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(talen)、或用于基因組編輯的crisper-cas9蛋白、或用作基因組編輯修復(fù)模板的供體序列以及對(duì)需要其的個(gè)體產(chǎn)生治療性效果的任何其它肽或蛋白。優(yōu)選地，治療性蛋白是治療性抗炎蛋白，優(yōu)選選自由(可溶性)分化簇39(cd39)蛋白、(可溶性)分化簇73(cd73)蛋白、白介素-1抑制劑、腫瘤壞死因子-α抑制劑、白介素-1受體拮抗劑、白介素-18結(jié)合蛋白、可溶性腫瘤壞死因子-α受體p55或可溶性腫瘤壞死因子-α蛋白75、顯性抑制iκb激酶-β、白介素-4、白介素-10、白介素-13、干擾素-β和血管活性腸肽組成的組。

由轉(zhuǎn)基因編碼的更多示例性治療性肽或蛋白包括可用于治療疾病或紊亂的那些，所述疾病或紊亂包括但不限于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎(oa)、痛風(fēng)、脊柱關(guān)節(jié)炎(spondlyarthritis)(spa)、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、包括克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的炎癥性腸病、肝炎、敗血癥、酒精性肝病、和非酒精性脂肪肝、囊性纖維化(和其它肺病)、血友病a、血友病b、地中海貧血、貧血癥和其它血液紊亂、aids、阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓氏病、肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(amyotrophiclateralsclerosis)、癲癇和其它神經(jīng)障礙、癌、糖尿病、肌肉營養(yǎng)不良(如duchenne、becker)、高歇氏病、赫爾勒氏癥、腺苷脫氨酶缺乏、糖原貯積病和其它代謝缺陷、視網(wǎng)膜退行性疾病(和其它眼部疾病)以及實(shí)體器官疾病(如腦、肝、腎、心臟)。

如本文所示，本發(fā)明的所述轉(zhuǎn)基因可以是抑制性和/或反義核酸序列。抑制性、反義、sirna、mirna、shrna、rnai和反義寡核苷酸能調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。這類分子包括能抑制參與調(diào)節(jié)疾病過程的靶基因的表達(dá)，從而減少、抑制或緩解一種或多種疾病的癥狀的那些。

反義包括單、雙或三鏈多核苷酸和肽核酸(pna)，其結(jié)合rna轉(zhuǎn)錄物或dna(如基因組dna)。源自靶基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)如起始位點(diǎn)-10與+10位之間的寡核苷酸是另一具體示例。形成反義的三鏈體能結(jié)合到雙鏈dna，從而抑制基因的轉(zhuǎn)錄?！皉nai”是使用單或雙鏈rna序列以抑制基因表達(dá)(參見例如kennerdell等,cell95:1017(1998)；和fire等,nature,391:806(1998))。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法和應(yīng)用，來自靶基因編碼區(qū)的雙鏈rna序列可用于抑制或阻止基因表達(dá)/轉(zhuǎn)錄。反義和rnai能基于編碼靶基因序列(如htt)的核酸而生成，如編碼哺乳動(dòng)物和人htt的核酸。例如，單或雙鏈核酸(如rna)能靶向htt轉(zhuǎn)錄物(如mrna)。

“sirna”指參與rna干擾過程的治療性分子，所述過程用于序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默或基因敲低。sirna與靶基因的同源mrna序列具有同源性。小干擾rna(sirna)能在體外合成或者通過核糖核酸酶iii從更長的dsrna切割產(chǎn)生，并且是序列特異性mrna降解的調(diào)節(jié)物。sirna或本發(fā)明的其它這類核酸能使用適當(dāng)受保護(hù)的核糖核苷亞磷酰胺和常規(guī)dna/rna合成儀被化學(xué)合成。所述sirna能被合成為2個(gè)分開的互補(bǔ)的rna分子，或具有2個(gè)互補(bǔ)區(qū)的單一rna分子。合成rna分子或合成試劑的商業(yè)供應(yīng)商包括應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(appliedbiosystems，美國加利福尼亞州福斯特)、proligo(德國漢堡)、dharmacon公司(dharmaconresearch，美國科羅拉多州拉斐特)、皮爾斯化學(xué)(一部分perbio科技(perbioscience),美國伊利諾斯州羅克福德)、glenresearch(美國弗吉尼亞州斯特林)、chemgenes(美國馬薩諸塞州亞什蘭)和cruachem(英國格拉斯哥)。用于抑制靶基因mrna的特異sirna構(gòu)建體可以是15-50核苷酸長度，更常是約20-30核苷酸長度。這種核酸分子能使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法容易地納入本文所公開的病毒載體。

可被依據(jù)本發(fā)明的抑制性核酸序列靶向的基因(如基因組dna)或致病基因轉(zhuǎn)錄物(如rna或mrna)的具體非限制性示例包括但不限于：與多核苷酸重復(fù)疾病相關(guān)的致病基因如亨廷頓蛋白(htt)基因，與齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(dentatorubropallidolusyanatropy)相關(guān)的基因(如atrophin1、atni)；脊髓延髓肌萎縮癥中x染色體上的雄激素受體，人ataxin-l、-2、-3和-7，ca,2.1p/q電壓依賴性鈣通道由(cacnaia)編碼，tata結(jié)合蛋白，ataxin8相反鏈(也稱為atxn8os)，脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)中的絲氨酸/蘇氨酸-蛋白磷酸酶2a55kda調(diào)節(jié)亞基bβ同種型(1、2、3、6、7、8、12、17型)，脆性x綜合征中的fmrl(脆性x智力低下i)，脆性x相關(guān)震顫/共濟(jì)失調(diào)綜合征中的fmrl(脆性x智力低下i)，fmrl(脆性x智力低下2)或脆性xe智力低下中的af4/fmr2家族成員2；肌強(qiáng)直性營養(yǎng)不良中的強(qiáng)直素蛋白激酶(myotonin-proteinkinase)(mtpk)；弗里德賴希氏共濟(jì)失調(diào)中的共濟(jì)蛋白；肌萎縮性側(cè)索硬化癥中的超氧化物歧化酶1(sodi)基因的突變體；參與帕金森氏病和/或阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)理的基因；載脂蛋白b(apob)和前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9)(pcsk9)、高膽固醇血癥(hypercoloesterolemia)；hivtat，hiv感染中轉(zhuǎn)錄基因的人免疫缺陷病毒反式激活蛋白；hivtar、hivtar，hiv感染中人免疫缺陷病毒反式激活蛋白響應(yīng)元件基因；hiv感染中的c-c趨化因子受體(ccr5)；rsv感染中的勞斯氏肉瘤病毒(rsv)核衣殼蛋白，丙肝病毒感染中的肝特異性微rna(mir-122)；p53，急性腎損傷或移植腎功能延遲恢復(fù)或腎損傷急性腎衰竭；晚期復(fù)發(fā)性(advancerecurrent)或轉(zhuǎn)移性實(shí)體惡性腫瘤中的蛋白激酶n3(pkn3)；lmp2，lmp2也稱為蛋白酶體亞基β型9(psmb9)，轉(zhuǎn)移性黑素瘤；lmp7，也稱為蛋白酶體亞基β型8(psmb8)，轉(zhuǎn)移性黑素瘤；mecl1也稱為蛋白酶體亞基β型10(psmb10)，轉(zhuǎn)移性黑素瘤；實(shí)體瘤中的血管內(nèi)皮生長因子(vegf)；實(shí)體瘤中的紡錘體驅(qū)動(dòng)蛋白(kinesinspindleprotein)，慢性髓細(xì)胞白血病中的凋亡抑制因子b細(xì)胞cll/淋巴瘤(bcl-2)；實(shí)體瘤中的核糖核苷酸還原酶m2(rrm2)；實(shí)體瘤中的弗林蛋白酶(furin)；肝腫瘤中的極體樣激酶1(plki)，丙肝感染中的二?；视?8?；D(zhuǎn)移酶1(dgati)，家族性腺瘤性息肉病中的β-連環(huán)蛋白；β2腎上腺素能受體，青光眼；rtp801/reddl，也稱為糖尿病黃斑水腫(dme)或年齡相關(guān)的黃斑變性中的dan損傷誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄物4蛋白；年齡相關(guān)的黃斑變性或脈絡(luò)膜新生血管(choroidalneivascularization)中的血管內(nèi)皮生長因子受體i(vegfri)，非動(dòng)脈炎性局部缺血性視神經(jīng)病變中的胱天蛋白酶2；先天性厚甲癥中的角蛋白6an17k突變蛋白；流感感染中的流感病毒a型基因組/基因序列；sars感染中的嚴(yán)重急性呼吸系統(tǒng)綜合癥(sars)冠狀病毒基因組/基因序列；呼吸道合胞體病毒感染中的呼吸道合胞體病毒基因組/基因序列；埃博拉感染中的埃博拉線狀病毒基因組/基因序列；乙肝和丙肝感染中的乙肝和丙肝病毒基因組/基因序列；hsv感染中的單純皰疹病毒(hsv)基因組/基因序列，柯薩奇病毒b3感染中的柯薩奇病毒b3基因組/基因序列；原發(fā)性肌張力障礙(primarydystonia)中沉默基因的致病性等位基因(等位基因特異性沉默)如扭轉(zhuǎn)蛋白a(torsina)(toria)，移植物中特異的泛i型(pan-classi)和hla等位基因；炎性疾病中的促炎性分子(pro-inflammatorymolecule)如il-6、il-1b、tnf或ccl2；或常染色體顯性遺傳性色素性視網(wǎng)膜炎(adrp)中的突變體視紫紅質(zhì)基因(rho)。

優(yōu)選地，所述raav載體組合物包括如上定義的所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和本文所定義的空衣殼。相較本發(fā)明組合物的所述raav-轉(zhuǎn)基因載體，所述空衣殼能屬于相同血清型或不同血清型。優(yōu)選地，所述空衣殼屬于與所述raav-轉(zhuǎn)基因載體相同的血清型。優(yōu)選地，在本發(fā)明raav載體組合物內(nèi)，所述空衣殼屬于與所述raav-轉(zhuǎn)基因載體的衣殼相同的血清型，優(yōu)選是aav2或aav5。然而，本發(fā)明還涵蓋raav載體組合物，其中所述空衣殼相較所述raav-轉(zhuǎn)基因載體的衣殼屬于不同的血清型(例如但不限于aav2空衣殼與具有aav5血清型的衣殼的raav-轉(zhuǎn)基因載體的組合，或相反)。還包括raav載體組合物，其中所述空衣殼具有血清型混合物，例如但不限于aav2和aav5衣殼的混合物。在關(guān)節(jié)內(nèi)施用混合有大量空衣殼的raav-轉(zhuǎn)基因載體后，發(fā)明人報(bào)告關(guān)節(jié)中的轉(zhuǎn)基因表達(dá)增加的效果。優(yōu)選地在組合物內(nèi)存在的raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼，空衣殼與raav-轉(zhuǎn)基因載體之比至少是1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、10:1、15:1、20:1、50:1、100:1或1000:1，優(yōu)選至少5:1(即空衣殼的量是raav轉(zhuǎn)基因載體的量的至少5倍)。所述組合物優(yōu)選包括raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼，空衣殼與raav-轉(zhuǎn)基因載體之比至多是10000:1、5000:1、4000:1、3000:1、2000:1、1000:1、500:1、400:1、300:1、200:1、100:1、90:1、80:1、70:1、60:1、50:1、40:1、30:1、20:1、15:1、10:1或5:1，優(yōu)選至多1000:1。所述組合物優(yōu)選包括raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼，空衣殼與raav轉(zhuǎn)基因載體之比是1:1-100:1、2:1-100:1、5:1-100:1、1:1-20:1、2:1-20:1，或優(yōu)選5:1-20:1。

上文提供實(shí)施方式，其中所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述空衣殼存在于單一組合物內(nèi)。本發(fā)明還涵蓋可選的實(shí)施方式，其中所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼存在于(至少2個(gè)或更多)分開的不同組合物內(nèi)。在此可選的實(shí)施方式中，所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述空衣殼能在時(shí)間(如相繼)和/或位置上分開施用，其中所述位置應(yīng)理解為施用部位。此外，所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述空衣殼能同時(shí)如基本上在同一時(shí)間施用，任選地在分開的位置。如前面實(shí)施方式所示，所有涉及所述轉(zhuǎn)基因和所述空衣殼與raav-轉(zhuǎn)基因載體之比的更多限制對(duì)此實(shí)施方式重復(fù)。

優(yōu)選地，如上定義的所述raav載體組合物與免疫抑制劑聯(lián)用。發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)當(dāng)對(duì)象同時(shí)用免疫抑制劑和raav-轉(zhuǎn)基因治療時(shí)，免疫抑制劑對(duì)aav轉(zhuǎn)基因表達(dá)的效果增加。此效果令人意外，因?yàn)樵诒绢I(lǐng)域，已就aav基因表達(dá)測(cè)試糖皮質(zhì)激素的效果，然而，結(jié)果相當(dāng)令人失望。pfeifer等報(bào)道糖皮質(zhì)激素(地塞米松)對(duì)肺中aav9基因表達(dá)沒有任何顯著效果(pfeifer等,genetherapy(2011)18,1034–1042)。monahan等報(bào)道小鼠中的aav肝基因表達(dá)沒有增加，且在一只狗中的基因表達(dá)增加較小、不明顯(monahan等.,moleculartherapy(2010)18,1907–1916)。此外，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)所述免疫抑制劑以及空載體對(duì)raav轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有令人意外的協(xié)同效應(yīng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑與所述raav載體組合物分開應(yīng)用，分開意味著在部位和/或時(shí)間上分開。在一個(gè)這種實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑和所述raav載體組合物可存在于分開的、不同的組合物內(nèi)。所述免疫抑制劑、所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述空載體可甚至各自存在于分開的、不同的組合物內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑和所述raav載體組合物可存在于單一組合物內(nèi)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述免疫抑制劑存在于單一組合物內(nèi)，且優(yōu)選此組合物與含所述空衣殼的分開的組合物一起用于治療。在甚至另一個(gè)實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑和所述空衣殼存在于單一組合物內(nèi)，且優(yōu)選此組合物與含所述raav-轉(zhuǎn)基因載體的分開的組合物一起用于治療。因此，本發(fā)明還提供含本文所定義的空衣殼和免疫抑制劑的組合物，提供含本文所定義的raav-轉(zhuǎn)基因載體和免疫抑制劑的組合物，以及提供含本文所定義的raav載體組合物和免疫抑制劑的組合物。

優(yōu)選地，本發(fā)明的所述免疫抑制劑是先天免疫細(xì)胞抑制劑，優(yōu)選巨噬細(xì)胞抑制劑。先天免疫細(xì)胞在本文中定義為導(dǎo)致先天免疫細(xì)胞活性和/或先天免疫細(xì)胞數(shù)減少的藥劑。巨噬細(xì)胞抑制劑在本文中定義為導(dǎo)致巨噬細(xì)胞活性和/或巨噬細(xì)胞數(shù)減少的藥劑。優(yōu)選地，本發(fā)明的所述先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞抑制劑導(dǎo)致先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的數(shù)量或活性相較治療前先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的初始數(shù)量或活性減小至少1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、45％、55％、65％、75％、85％、95％，或優(yōu)選100％。先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞活性和/或數(shù)量能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何合適試驗(yàn)檢測(cè)，例如但不限于mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)2,5-二苯基溴化四氮唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazoliumbromide))比色測(cè)定以用于測(cè)試巨噬細(xì)胞的體外細(xì)胞毒性，如ferrari等(journalofimmunologicalmethods,131(1990)165-172)所述，通過測(cè)量細(xì)胞因子水平(如ccl2、tnf)，通過組織學(xué)和組織化學(xué)檢測(cè)方法例如cd68標(biāo)記或通過體內(nèi)磁共振成像(mri)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的超順磁性氧化鐵(spio)攝取，優(yōu)選在靜脈內(nèi)施用超順磁性氧化鐵(spio)后，如yi-xiangj.wang(quant.imagingmedsurg(2011)1:35-40)所綜述。檢測(cè)可以在體外或體內(nèi)。優(yōu)選地，體內(nèi)檢測(cè)是動(dòng)物模型，優(yōu)選大鼠或鼠模型。

優(yōu)選地，所述免疫抑制劑是糖皮質(zhì)激素和/或二膦酸鹽(liposomalbisphosphonate)，優(yōu)選脂質(zhì)體二膦酸鹽。糖皮質(zhì)激素的特定非限制性示例是皮質(zhì)醇、可的松、強(qiáng)的松、潑尼松龍、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)、地塞米松、倍他米松、氟羥脫氫皮醇(triamcinolone)、倍氯米松、醋酸氟氫可的松、醋酸脫氧皮質(zhì)酮和醛固酮(aldosteron)。優(yōu)選地，所述免疫抑制劑是氟羥脫氫皮醇。二膦酸鹽的特定非限制性示例是依替膦酸鹽、氯屈膦酸鹽(clodronte)、替魯膦酸鹽、帕米膦酸鹽(pamidronate)、奈立膦酸鹽(neridronate)、奧帕膦酸鹽、阿侖膦酸鹽(alendronate)、伊班膦酸鹽、利塞膦酸鹽和唑來膦酸鹽(zoledronate)。優(yōu)選地，所述二膦酸鹽是脂質(zhì)體包封的二膦酸鹽或脂質(zhì)體二膦酸鹽，優(yōu)選脂質(zhì)體氯膦酸鹽。所述糖皮質(zhì)激素優(yōu)選不是地塞米松。應(yīng)理解本發(fā)明的炎性或巨噬細(xì)胞抑制劑不限于糖皮質(zhì)激素和/或二膦酸鹽。例如，本發(fā)明的所述炎性或巨噬細(xì)胞抑制劑還能是炎性或巨噬細(xì)胞消耗抗體，如抗f4/80抗體。優(yōu)選地，這類抗體是人或人源化抗體。待用于本發(fā)明的更多相關(guān)免疫抑制劑是細(xì)胞穩(wěn)定藥(cytostaticdrug)(例如烷化劑和/或抗代謝物如甲氨蝶呤)，修飾嘌呤能信號(hào)通路的藥物(例如甲氨蝶呤、腺苷類似物、腺苷受體拮抗劑或激動(dòng)劑)，非固醇類抗炎藥(nsaids，例如布洛芬、雙氯芬酸、美洛昔康、萘普生、乙酰水楊酸)，生物制劑如tnf阻斷劑(例如英夫利昔單抗、依那西普、阿達(dá)木單抗、賽妥珠單抗(certolizumab)、高利單抗(golimumab))、il-6阻斷劑(例如托珠單抗(tocilizumab))、il-2阻斷劑(例如巴利昔單抗、達(dá)利珠單抗(daclizumab))、il-1β阻斷劑(例如阿那白滯素、利洛納塞(rilonacept)、康納單抗(canakinumab))、莫羅單抗(muromonab)、阿巴西普(abatacept)和/或利妥昔單抗和/或其它化合物如羥氯喹、氯喹、來氟米特、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、環(huán)孢霉素、氯金酸納(goldsalt)和青霉胺。

優(yōu)選地，所述raav載體組合物和/或含空衣殼的組合物和/或含免疫抑制劑的組合物還包括藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑和/或賦形劑。例如，這種藥學(xué)上可接受載體、稀釋劑、增溶劑、填充劑、防腐劑和/或賦形劑，示例可參見《雷明頓：藥物科學(xué)和實(shí)踐》(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，第20版；馬里蘭州巴爾的摩:利平科特威廉姆斯.威爾金斯出版社(lippincottwilliams&wilkins),2000。

第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述raav載體組合物用于含基因療法的治療。此外，本發(fā)明提供第一方面所述raav載體組合物在制備基因療法藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供含基因療法的治療方法，其中所述方法包括施用第一方面所述raav載體組合物。

優(yōu)選地，所述基因療法還包括施用本文所定義的免疫抑制劑，其存在于所述raav載體組合物內(nèi)或包含在分開的、不同的組合物內(nèi)，即與所述raav載體組合物分開且不同。施用時(shí)，將本發(fā)明的所述raav載體組合物和/或空衣殼和/或免疫抑制劑遞送給個(gè)體，所述個(gè)體的細(xì)胞、組織或器官，優(yōu)選患有本文所定義的病癥或疾病的個(gè)體。優(yōu)選地，所述raav載體組合物和所述免疫抑制劑同時(shí)施用。同時(shí)施用在本文中應(yīng)被理解為在大致同一時(shí)間施用，優(yōu)選時(shí)間間隔不超過15分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)或24小時(shí)，優(yōu)選時(shí)間間隔不超過15分鐘。在另一實(shí)施方式中，所述raav載體組合物和所述免疫抑制劑相繼施用，其中優(yōu)選所述免疫抑制劑在所述raav載體組合物前施用。優(yōu)選地，所述免疫抑制劑在所述raav載體組合物施用前至少1小時(shí)、3小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)、2天、4天或1周施用。在所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和所述空衣殼存在于分開的組合物的情況中，所述免疫抑制劑可與所述空衣殼同時(shí)或在所述空衣殼前至少15分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、1天、2天或1周施用，且所述空衣殼進(jìn)而與所述raav-轉(zhuǎn)基因載體同時(shí)或在所述raav-轉(zhuǎn)基因載體之前至少15分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)、3小時(shí)、1天、2天或3天內(nèi)施用。

在本文所定義的實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑可重復(fù)施用，即在所述raav載體組合物前和/或與之同時(shí)。如上文所示，優(yōu)選所述raav載體組合物包括大量空衣殼。此外，本發(fā)明涵蓋在分開的、不同的組合物中施用raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼，其在本發(fā)明的方法或應(yīng)用中可同時(shí)或相繼給藥。如果包含于分開的組合物內(nèi)，則所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼優(yōu)選同時(shí)施用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述空衣殼在raav-轉(zhuǎn)基因載體施用前至多3天、2天、1天、24小時(shí)、12小時(shí)、3小時(shí)、2小時(shí)、1小時(shí)、30分鐘、15分鐘或5分鐘施用，優(yōu)選至多24小時(shí)。此外，如果包含于分開的組合物內(nèi)，則所述raav-轉(zhuǎn)基因載體和空衣殼優(yōu)選在同一部位施用。

本發(fā)明的raav載體組合物和/或空衣殼和/或免疫抑制劑可使用本領(lǐng)域已知的合適手段直接或間接施用。本發(fā)明的方法和應(yīng)用包括全身、區(qū)域或局部(locally)，或通過任何途徑例如注射、輸注、口服(如攝入或吸入)或局部(topically)(如經(jīng)皮)遞送和施用所述raav載體組合物和/或空衣殼和/或免疫抑制劑。示范性施用和遞送途徑包括靜脈內(nèi)(i.v.)、關(guān)節(jié)內(nèi)、腹腔內(nèi)(i.p.)、動(dòng)脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胃腸外(parenteral)、皮下、胸膜內(nèi)、局部(topical)、皮、皮內(nèi)、經(jīng)皮、腸胃外的(parenterally)如跨粘膜、顱內(nèi)、脊柱內(nèi)、口服(消化)、粘膜、呼吸系統(tǒng)、鼻內(nèi)、插管、肺內(nèi)、肺腔滴注、頰部、舌下、血管內(nèi)、鞘內(nèi)、腔內(nèi)、電離子透入、眼內(nèi)、眼睛、光學(xué)、腺內(nèi)、器官內(nèi)、淋巴管內(nèi)?？紤]到迄今已實(shí)現(xiàn)的進(jìn)步，可預(yù)期向個(gè)體或所述個(gè)體的細(xì)胞、組織、器官提供本發(fā)明的raav載體組合物和/或空衣殼和/或免疫抑制劑的方法得到改進(jìn)。這種未來改進(jìn)當(dāng)然能納入以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明所提及的效果。當(dāng)施用本發(fā)明的raav載體組合物和/或空衣殼和/或免疫抑制劑時(shí)，優(yōu)選這種組合和/或組合物溶于與遞送方法相容的溶液。對(duì)于靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、鞘內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)和/或心室內(nèi)施用，優(yōu)選溶液是生理鹽溶液。

優(yōu)選地，所述raav載體組合物局部施用，優(yōu)選在含大量先天免疫細(xì)胞浸潤的身體位置，或在存在大量先天免疫細(xì)胞的位置，其中優(yōu)選所述先天免疫細(xì)胞是單核細(xì)胞和/或巨噬細(xì)胞，甚至更優(yōu)選所述先天免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞。先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤或存在大量先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞能通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法評(píng)估，如組織學(xué)和組織化學(xué)方法例如cd68標(biāo)記或檢測(cè)如上所示的靜脈內(nèi)施用后巨噬細(xì)胞spio攝取的mri成像，和/或用于檢測(cè)細(xì)胞因子如il-6、tnf和/或ccl2的方法。優(yōu)選地，在身體特定位置處的顯著先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤在本文中優(yōu)選理解為，所存在的先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞數(shù)量和/或活性與為評(píng)價(jià)如上所定義的先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤的方法的檢測(cè)極限在類似位置的先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞相比，其數(shù)量和/或活性至少為2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍，優(yōu)選至少2倍。優(yōu)選地，身體特定位置處的大量先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤在本文中優(yōu)選理解為所存在的先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤與用治療有效劑量的氟羥脫氫皮醇治療后的類似位置的先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤相比，優(yōu)選用上示先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤的評(píng)價(jià)方法，其數(shù)量和/或活性至少為2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20倍，優(yōu)選至少2倍。所述治療有效劑量優(yōu)選是技術(shù)人員已知?jiǎng)┝?，如口?-16mg/日，肌肉內(nèi)3-48mg/日,根據(jù)關(guān)節(jié)大小關(guān)節(jié)內(nèi)5-40mg。氟羥脫氫皮醇的最大周劑量是75mg。含顯著先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞浸潤或大量先天免疫細(xì)胞或巨噬細(xì)胞的特定非限制性示例是關(guān)節(jié)(關(guān)節(jié)內(nèi))、炎癥部位、關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)、損傷位點(diǎn)、動(dòng)脈粥樣硬化斑塊、腫瘤特別是浸潤性腫瘤、cns(中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或腦)、肺、皮膚、眼睛、腸、肝、脾和脂肪組織。優(yōu)選地，含大量先天免疫細(xì)胞的組織或位點(diǎn)在本文中理解為先天免疫細(xì)胞(優(yōu)選巨噬細(xì)胞)構(gòu)成所述組織或部位的細(xì)胞總量的至少2％(或優(yōu)選至少5％)的組織或部位。

在免疫抑制劑存在于本發(fā)明所述raav載體組合物內(nèi)的情況中，所述免疫抑制劑在與所述raav載體組合物相同的部位施用，即優(yōu)選如上所示的位置。在其中所述免疫抑制劑被包含在不同于所述raav載體組合物的分開的組合物內(nèi)的實(shí)施方式中，所述免疫抑制劑可全身施用，優(yōu)選肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。所述raav載體組合物還可局部施用，優(yōu)選在含大量本文所定義的巨噬細(xì)胞的身體的部位，所述免疫抑制劑全身施用，優(yōu)選肌肉內(nèi)或靜脈內(nèi)。本發(fā)明還涵蓋所述免疫抑制劑和所述raav載體組合物即使存在于不同組合物內(nèi)，在同一位點(diǎn)施用的實(shí)施方式，優(yōu)選局部，更優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)。如本文進(jìn)一步所示，這種不同組合物的施用可以是同時(shí)或相繼施用。

在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明療法用于預(yù)防、延遲、治愈、恢復(fù)和/或治療炎性病癥或炎性疾病。炎性病癥或疾病可以是檢測(cè)到炎癥的任何病癥或疾病。炎癥可通過在個(gè)體樣品中評(píng)估c-反應(yīng)蛋白和/或炎性細(xì)胞因子/趨化因子(例如il-6、il-8或ccl2)的濃度檢測(cè)。c-反應(yīng)蛋白和/或炎性細(xì)胞因子/趨化因子(例如il-6、il-8或ccl2)的濃度的評(píng)估可使用elisa或蛋白質(zhì)印跡在蛋白水平進(jìn)行。c-反應(yīng)蛋白和/或炎性細(xì)胞因子/趨化因子(作為il-6、il-8或ccl2)的濃度的評(píng)估可使用pcr在核酸水平進(jìn)行。所有這些分析為技術(shù)人員已知。在實(shí)驗(yàn)部分中描述用于評(píng)估炎性細(xì)胞因子/趨化因子(例如il-6、il-8或ccl2)存在的分析?？蓹z測(cè)的c-反應(yīng)蛋白和/或炎性細(xì)胞因子/趨化因子(例如il-6、il-8或ccl2)能作為這類炎性疾病或病癥的第一或早期參數(shù)存在?？蓹z測(cè)的c-反應(yīng)蛋白和/或炎性細(xì)胞因子/趨化因子(例如il-6、il-8或ccl2)能在所述炎性疾病或病癥進(jìn)程中的后期存在。

炎性疾病或病癥可定義為任何疾病或病癥，其中atp的水平增加和/或amp的水平增加和/或atpase活性水平的減少(或降低)能在來自個(gè)體的樣品或組織中評(píng)估。炎性疾病或病癥可被定義為任何疾病或病癥，其中預(yù)期腺苷的水平增加可期待緩解與這類炎性疾病或病癥相關(guān)的參數(shù)或癥狀。前面句子中鑒定的增加或減少優(yōu)選如本文所解釋的進(jìn)行評(píng)價(jià)。

炎性病癥、疾病或紊亂的特定非限制性示例是類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)、幼年型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎(oa)、痛風(fēng)、脊柱關(guān)節(jié)炎(spondlyarthritis)(spa)、銀屑病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、包括克羅恩氏病或潰瘍性結(jié)腸炎在內(nèi)的炎癥性腸病、肝炎、敗血癥、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝。炎性病癥或疾病可進(jìn)一步選自但不限于：疼痛、局部缺血性疾病(ischemicdisorder)、青光眼、哮喘、關(guān)節(jié)炎、癌、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病(neurodegenerativedisorders)、慢性障礙(chronicdisorders)、急性炎癥、凝血功能障礙、心力衰竭、血小板功能障礙和炎癥能通過技術(shù)人員已知的方法檢測(cè)的其它障礙(libby,arterisclerthrombvascbiol(2012)32,20145-20151；bending等.,intimmunol(2012)6:339-346；calle和fernandez,diabetesmetab(2012)3:183-191)，優(yōu)選進(jìn)一步選自但不限于：疼痛、局部缺血性疾病、青光眼、關(guān)節(jié)炎、癌、神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病、慢性障礙、急性炎癥、凝血功能障礙、心力衰竭、血小板功能障礙和能檢測(cè)到炎癥的其它障礙。應(yīng)注意即使目前對(duì)骨關(guān)節(jié)炎(oa)是否被視作炎性或非炎性疾病有爭議，骨關(guān)節(jié)炎被視作通過本發(fā)明的方法預(yù)防、延遲、治愈、恢復(fù)和/或治療的病癥。

在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(ra)和其它關(guān)節(jié)炎類型(oa、銀屑病關(guān)節(jié)炎、脊柱關(guān)節(jié)炎(spa)、痛風(fēng))的情況中，炎癥推斷在關(guān)節(jié)和/或軟骨和/或滑膜組織和/或滑膜細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中出現(xiàn)。這些組織和/或細(xì)胞類型各自參與、引起和/或與炎癥相關(guān)。因此，對(duì)于ra和其它關(guān)節(jié)炎類型(oa、銀屑病關(guān)節(jié)炎、spa、痛風(fēng))，將本發(fā)明的所述raav-轉(zhuǎn)基因載體遞送給關(guān)節(jié)和/或軟骨和/或滑膜組織和/或滑膜細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞。優(yōu)選地所述關(guān)節(jié)、軟骨、滑膜組織和/或滑膜細(xì)胞和/或成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞是患有炎性疾病的個(gè)體的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的raav載體組合物局部或全身施用，優(yōu)選靶向上面鑒定的任何細(xì)胞類型。所述施用更優(yōu)選是關(guān)節(jié)內(nèi)。術(shù)語“關(guān)節(jié)內(nèi)”指關(guān)節(jié)內(nèi)部，如膝蓋、肘部、肩膀、踝部、手腕等。因此，關(guān)節(jié)內(nèi)注射是注射到關(guān)節(jié)骨頭之間的空間。在膝蓋中，“關(guān)節(jié)內(nèi)”指股骨與脛骨之間的空間，在膝蓋骨后面和周圍。

對(duì)于ibd和克羅恩氏病，炎癥主要在胃和腸(消化道)出現(xiàn)。因此，就ibd和克羅恩氏病而言，本發(fā)明的所述raav載體組合物能被遞送到胃和/或腸。所述胃和/或腸優(yōu)選是患有這種炎性疾病的個(gè)體的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，所述raav載體組合物局部或全身施用。所述施用更優(yōu)選是局部或全身施用并靶向胃和/或腸。

對(duì)于肝炎和肝病，炎癥主要在肝出現(xiàn)。因此，就肝炎和肝病而言，本發(fā)明的所述raav-轉(zhuǎn)基因載體能被遞送到肝。所述肝優(yōu)選是患有這種炎性疾病的個(gè)體的。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述raav載體組合物局部或全身施用。所述施用更優(yōu)選是局部或全身并靶向肝。

對(duì)于敗血癥，炎癥可以是全身性的。因此，就這類疾病而言，本發(fā)明的所述raav載體組合物全身施用，優(yōu)選靶向這些患者的肝。

實(shí)現(xiàn)治療效果的所述raav-轉(zhuǎn)基因載體劑量(如raav-轉(zhuǎn)基因載體的基因組的劑量/每千克體重(vg/kg))，或轉(zhuǎn)導(dǎo)單位會(huì)根據(jù)數(shù)種因素而變化，包括但不限于：施用途徑、實(shí)現(xiàn)治療效果所需的轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平、所治療的特定疾病、對(duì)raav-轉(zhuǎn)基因載體免疫應(yīng)答的任何宿主、對(duì)轉(zhuǎn)基因或表達(dá)產(chǎn)物(蛋白質(zhì))免疫應(yīng)答的宿主以及所表達(dá)的蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。本領(lǐng)域技術(shù)人員能基于上述因素以及其它因素容易地確定raav-轉(zhuǎn)基因載體劑量范圍以治療具有特定疾病或障礙的患者。一般，劑量范圍是至少1x10⁶、1x10⁷、1x10⁸或更多，例如1x10⁹、1x10¹⁰、1x10¹¹、1x10¹²、1x10¹³或1x10¹⁴、1x10¹⁵、1x10¹⁶或更多的載體基因組/千克個(gè)體體重(vg/kg)以實(shí)現(xiàn)治療效果。

所述免疫抑制劑劑量取決于免疫抑制劑的類型。有效劑量為技術(shù)人員已知。氟羥脫氫皮醇的優(yōu)選治療有效劑量如上所示。氯膦酸鹽的優(yōu)選治療有效劑量優(yōu)選是技術(shù)人員已知的治療有效劑量，如優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)80-320mg/劑，更優(yōu)選關(guān)節(jié)內(nèi)160mg/劑(barrera等2000,arthritis&rheumatism第43(9)卷,1951-1959頁)。

在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，本發(fā)明的所述raav組合物和本發(fā)明的免疫抑制劑作為分別的、不同的組合物的組合或包含在單一組合物內(nèi)，能緩解所治療患者的一種或多種癥狀和/或用本發(fā)明組合或組合物改善所治療患者細(xì)胞或組織的一種或多種特征或參數(shù)。例如，對(duì)于各炎性疾病，技術(shù)人員了解至少一種癥狀、參數(shù)或特征、與所述疾病相關(guān)的所述參數(shù)或特征的值以及如何評(píng)估其中的每一個(gè)。下面我們給出類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的特異參數(shù)。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是優(yōu)選在評(píng)估疾病活動(dòng)度評(píng)分(das)指標(biāo)或相關(guān)das28(vanriel,bestpractice&researchclinicalrheumatology(2001)15:67-76)后診斷的疾病，包括測(cè)量個(gè)體的數(shù)個(gè)參數(shù)和癥狀。所述指標(biāo)評(píng)估可通過臨床醫(yī)生檢查個(gè)體來進(jìn)行。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方式中，當(dāng)本發(fā)明組合或組合物能誘導(dǎo)das或das28顯著變化時(shí)，本發(fā)明組合或組合物能緩解所治療患者的一種或多種癥狀和/或用本發(fā)明組合或組合物改善所治療患者細(xì)胞或組織的一種或多種特征或參數(shù)。還描述評(píng)估類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的其它方法(vanriel,bestpractice&researchclinicalrheumatology(2001)15:67-76；和gestera.m.等，baillière’sclinicalimmunology(1999)13:629-644)。如果用本發(fā)明組合和/或組合物治療至少一周、一個(gè)月、六個(gè)月、一年或更長后，含本發(fā)明組合或組合物的藥物能改善一個(gè)參數(shù)，所述參數(shù)的值相較治療開始前的該參數(shù)的值改進(jìn)至少1％、2％、5％、10％或更多。如果用本發(fā)明組合和/或組合物治療至少一周、一個(gè)月、六個(gè)月、一年或更長后，含本發(fā)明組合或組合物的藥物能緩解患者或所述患者細(xì)胞、組織或器官的一種癥狀或一個(gè)特征，所述癥狀或特征不再能檢測(cè)到。

本發(fā)明用于人和獸醫(yī)應(yīng)用。合適個(gè)體包括哺乳動(dòng)物如人。本文所用的術(shù)語“哺乳動(dòng)物”包括但不限于：人、牛、綿羊、山羊、馬、貓、犬、兔等。最優(yōu)選人個(gè)體。人個(gè)體包括胎兒、新生兒、嬰兒、青少年和成人個(gè)體。最優(yōu)選患有本文所示任何類型或疾病或病癥的人個(gè)體。

在第三方面，本發(fā)明提供成套試劑盒，其包括第一方面所述的raav載體組合物和第一方面所定義的免疫抑制劑。優(yōu)選地，所述成套試劑盒還包括所述raav載體組合物和所述免疫抑制劑的劑量方案說明書。這些說明優(yōu)選指示實(shí)現(xiàn)所需效果的劑型使用和在特定時(shí)間段服用的劑型量，優(yōu)選如本文第二方面所詳細(xì)說明的。所述制劑可通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法以單位劑型方便地存在。優(yōu)選地，所述raav載體組合物和免疫抑制劑各在分開的單位(或其倍數(shù))中包裝，它們的量對(duì)應(yīng)于單一給藥(或其倍數(shù))的相關(guān)劑量方案。所述包裝可采用任何合適形式，例如小瓶、安瓿或用于注射筆的藥筒。優(yōu)選地，所述成套試劑盒若用于治療，則包括本文所定義的基因療法。

本說明書引用的所有專利和文獻(xiàn)參考資料通過引用全文納入本文。本文鑒定的各實(shí)施方式可組合在一起，除非另有說明。

表1：本申請(qǐng)中鑒定的大部分序列的列表

附圖簡要說明

圖1：通過在關(guān)節(jié)炎開始前后施用載體對(duì)熒光素酶表達(dá)的影響。誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后，小鼠(每組n＝5)在關(guān)節(jié)炎開始前第17天或關(guān)節(jié)炎開始后第24天于關(guān)節(jié)內(nèi)注射有1.5e10vg的raav5-轉(zhuǎn)基因載體，該載體編碼熒光素酶基因(raav.cmv.fluc5)。在載體注射后3天以及之后每周進(jìn)行成像，直至4周(組第24天)或5周(組第17天)。插圖：表達(dá)正信號(hào)的膝關(guān)節(jié)百分?jǐn)?shù)。就至少一次及時(shí)測(cè)量而言，正信號(hào)定義為高于對(duì)照膝關(guān)節(jié)的值的上限的1.5倍的值。每組的發(fā)光顯示為平均數(shù)；誤差線，sem。

圖2：加入脂質(zhì)體氯膦酸鹽、氟羥脫氫皮醇和空衣殼對(duì)raav5-熒光素酶表達(dá)的影響。誘發(fā)關(guān)節(jié)炎后，小鼠(每組n＝5)關(guān)節(jié)內(nèi)注射有1.5e10vg的raav5.cmv.fluc載體。在載體注射后3天以及之后每周進(jìn)行成像，直至4周。(a)加入脂質(zhì)體氯膦酸鹽(5μl/gi.v.)和氟羥脫氫皮醇(5mg/kgi.m.)導(dǎo)致更高水平的發(fā)光。(b)以5:1比例(空與全之比)加入空aav5衣殼和含衣殼的基因組改善了熒光素酶的表達(dá)。(c)表達(dá)正信號(hào)的膝關(guān)節(jié)的百分?jǐn)?shù)提高4-9倍。(d)臨床評(píng)分在氟羥脫氫皮醇治療動(dòng)物中顯示減少趨勢(shì)和在脂質(zhì)體氯膦酸鹽治療動(dòng)物中顯示初始減少趨勢(shì)。

圖3：加入空衣殼和/或氟羥脫氫皮醇對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)raav5-熒光素酶表達(dá)的改善。在cia模型中，小鼠(每組n＝13)注射有1.5e10vg的raav5.cmv.fluc載體(關(guān)節(jié)內(nèi))，有或沒有加入空aav5衣殼(空與全之比為5:1)或氟羥脫氫皮醇(5mg/kgi.m.)。每周跟蹤小鼠，持續(xù)1個(gè)月且之后每月一次，直至6個(gè)月。(a)關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度在各時(shí)間點(diǎn)打分并計(jì)算臨床評(píng)分。最初，關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度在氟羥脫氫皮醇治療組中較低。(b)所有組的發(fā)光增加直至4個(gè)月，然后保持穩(wěn)定。(c)廣義估計(jì)方程(generalizedestimatingequations)分析顯示當(dāng)加入氟羥脫氫皮醇和空衣殼時(shí)，發(fā)光顯著提高。每組的臨床評(píng)分和發(fā)光顯示為平均數(shù)；誤差棒，sem。

圖4：比較局部和全身氟羥脫氫皮醇施用。在cia模型(n＝18)中，在局部施用(i.a.)raav5.cmv.fluc載體(1.5e10vg)+空aav5衣殼(空:全比例為5:1)(關(guān)節(jié)內(nèi))前2天，局部(i.a.)或全身(i.m.)施用氟羥脫氫皮醇(5mg/kg)(或鹽水)。隨著時(shí)間跟蹤熒光素酶表達(dá)。

圖5：氟羥脫氫皮醇對(duì)脾尺寸和不同組織中細(xì)胞群的影響。在數(shù)組中誘發(fā)關(guān)節(jié)炎(每組n＝5)，氟羥脫氫皮醇(5mg/kg)或鹽水作為對(duì)照在第22天(載體施用前2天)肌肉內(nèi)施用。氟羥脫氫皮醇施用后48小時(shí)，通過流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry)分析組織。a)鹽水和氟羥脫氫皮醇治療動(dòng)物的脾中的巨噬細(xì)胞(f4/80+,cd68+)的百分?jǐn)?shù)相似，而氟羥脫氫皮醇組的滑膜(b)中巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)減少。c-d)氟羥脫氫皮醇治療動(dòng)物的脾重量顯著降低；圖表和照片顯示氟羥脫氫皮醇/鹽水施用后3天處死的組的脾。

圖6：以2種不同比例(5:1和20:1)加入空衣殼改善關(guān)節(jié)內(nèi)raav5-熒光素酶表達(dá)。健康小鼠(每組n＝7)關(guān)節(jié)內(nèi)注射有raav5.cmv.fluc(1.5e10vg)，空aav5衣殼在2組中以不同比例加入。每周測(cè)量熒光素酶表達(dá)，直至4周后處死小鼠。(a)每組第4周的發(fā)光顯示為平均數(shù)；誤差棒，sem。相較僅接受含載體的基因組的對(duì)照組(單尾未配對(duì)t檢驗(yàn))，在加入空衣殼的組中，*p<0.05和**p<0.01。

圖7：氣囊滑膜炎癥模型(airpouchmodelofsynovialinflammation)(apsi)中的熒光素酶表達(dá)。raav5.cmv.fluc(3.16e11vg)在氣囊形成后d0、d11或d18給予小鼠(n＝5)氣囊。氟羥脫氫皮醇治療組中，氟羥脫氫皮醇在d9通過i.m.注射給藥(5mg/kg)，然后在d11給予載體。在d30，殺死所有小鼠，移出氣囊膜并進(jìn)行熒光素酶檢測(cè)。每組的熒光素酶表達(dá)顯示為平均數(shù)和sem。黑色水平線指示熒光素酶檢測(cè)極限。顯示任何可檢測(cè)熒光素酶表達(dá)的唯一組是當(dāng)載體在d0注射或當(dāng)氟羥脫氫皮醇在載體前2天給藥時(shí)。

圖8：空衣殼和氟羥脫氫皮醇在健康小鼠中對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)aav5基因表達(dá)的影響。在i.m.給予鹽水(nacl)或氟羥脫氫皮醇前2天，健康小鼠(每組n＝17，總共34個(gè)注射關(guān)節(jié))關(guān)節(jié)內(nèi)注射有raav5-cmv-fluc(1.26e10vg/關(guān)節(jié))+/-空aav5衣殼(空與全之比為5:1)。每周通過ivis測(cè)量熒光素酶表達(dá)，直至第8周。a)所有組隨著時(shí)間的熒光素酶測(cè)量。b)所有組在第8周的熒光素酶表達(dá)。所示數(shù)據(jù)是每組平均數(shù)+sem。*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001，如單尾mannwhitney檢驗(yàn)所測(cè)定。

圖9：空衣殼和氟羥脫氫皮醇在健康小鼠中對(duì)關(guān)節(jié)內(nèi)aav2基因表達(dá)的影響。在i.m.施用鹽水(nacl)或氟羥脫氫皮醇前2天，健康小鼠(每組n＝17，總共34個(gè)注射關(guān)節(jié))關(guān)節(jié)內(nèi)注射有raav2-cmv-fluc(1.26e10vg/關(guān)節(jié))+/-空aav2衣殼(空與全之比為5:1)。每周通過ivis測(cè)量熒光素酶表達(dá)，直至第4周。a)所有組隨著時(shí)間的熒光素酶測(cè)量。b)所有組在第4周的熒光素酶表達(dá)。所示數(shù)據(jù)是每組平均數(shù)+sem。**p<0.01,***p<0.001，如單尾mannwhitney檢驗(yàn)所測(cè)定。

圖10：aav2與aav5衣殼(vp1)比對(duì)。序列顯示57％一致性，如帶下劃線的氨基酸所示。

本發(fā)明進(jìn)一步通過以下實(shí)施例解釋。這些實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍，但僅用于闡明本發(fā)明。

實(shí)施例

方法

載體生成和空衣殼

生成raav5-轉(zhuǎn)基因載體(實(shí)施例1-7)或raav2-轉(zhuǎn)基因載體(實(shí)施例8)，其編碼如前所述[matsushita等；genether1998:5；938]的帶有巨細(xì)胞病毒(cmv)啟動(dòng)子(raav5.cmv.fluc；賓夕法尼亞州費(fèi)城的費(fèi)城兒童醫(yī)院)的螢火蟲熒光素酶(fluc)。簡言之，所述質(zhì)粒編碼cmv啟動(dòng)子控制下的fluc基因和人生長激素聚腺苷酸化信號(hào)。轉(zhuǎn)基因盒側(cè)翼是aav-2末端反向重復(fù)并被包裝在來自aav5的衣殼中[gaogp等；pnas2002；11854]。含有基因組的載體和空aav衣殼粒子通過聯(lián)合色譜與氯化銫密度梯度離心來純化[ayusoe,mingozzif等；genether2010:17；503]。載體效價(jià)由qpcr測(cè)定并表示為載體基因組/ml(vg/ml)。

小鼠中的體內(nèi)成像實(shí)驗(yàn)

在5個(gè)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中在雄性dba小鼠中(8-12周齡；荷蘭奧爾斯特的hsd(harlanspraguedawley,horst,thenetherlands))研究關(guān)節(jié)內(nèi)raav5表達(dá)。小鼠的2個(gè)膝關(guān)節(jié)(有或沒有注射踝關(guān)節(jié))注射有raav5.cmv.fluc，定期檢測(cè)熒光素酶表達(dá)(從5天直至6個(gè)月)。對(duì)于沒有關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物，載體在第1天給予，在關(guān)節(jié)炎動(dòng)物中，載體在免疫接種后、疾病開始時(shí)的第17或24天注射。動(dòng)物接受每膝關(guān)節(jié)1.26e10-1.5e10vg(5μl體積)和每踝關(guān)節(jié)0.75e10vg(2.5μl體積)?？找職づc含基因組的粒子在數(shù)組中以5:1或20:1的比例共同施用(比例表示為空衣殼與含基因組的載體之比)。組由5-18只動(dòng)物組成。

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎

膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(cia)通過皮內(nèi)注射100μlii型膠原(2mg/ml)方式來誘導(dǎo)，所述膠原在cfa中1:1稀釋(礦物油和熱滅活結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)2mg/ml))(美國華盛頓州雷德蒙德的chondrex公司(chondrexinc.))。第21天，腹腔施用加強(qiáng)注射，含有溶于100μlnacl的100μgii型膠原。

關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度從第18天開始每3周用半定量計(jì)分系統(tǒng)評(píng)分，各小鼠的爪單獨(dú)分析(0-正常；1-1個(gè)關(guān)節(jié)腫脹和/或紅斑；2–多關(guān)節(jié)腫脹；3–所有關(guān)節(jié)腫脹；4–全爪腫脹和至少一個(gè)以下癥狀：僵硬，功能喪失)。

氣囊滑膜炎癥(apsi)模型

氣囊如前所述形成(o′boyle等(2009)fasebj.23(11):3906-3916)。簡言之，3ml空氣皮下注入各動(dòng)物的背部。必要時(shí)，氣囊通過再注入空氣保持膨脹。raav5.cmv.fluc載體(3.16e11vg)在氣囊形成后的d0、d11或d18以1ml體積給予到囊內(nèi)。對(duì)于氟羥脫氫皮醇處理的動(dòng)物，在d11施用載體前2天通過i.m.注射施用氟羥脫氫皮醇(5mg/kg)。在d30，處死小鼠，移出氣囊膜并速凍。冷凍氣囊組織在被動(dòng)裂解緩沖液(普洛麥格(promega))中勻化，熒光素酶通過標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶分析來測(cè)量(普洛麥格)。

巨噬細(xì)胞抑制

在施用載體前2天，肌肉內(nèi)(i.m.)施用氟羥脫氫皮醇，類似在ra患者中的應(yīng)用。ra患者以每kg體重0.4-1.0mg的劑量接受氟羥脫氫皮醇?？紤]小鼠代謝速率更快(因子12.5)，使用5mg/kg體重的劑量，以50μl體積施用。對(duì)照組接受用50μlnacl的i.m.注射。第四個(gè)實(shí)驗(yàn)中，i.m.氟羥脫氫皮醇與施用載體前2天關(guān)節(jié)內(nèi)(i.a.)施用作比較，采用可比較的劑量(5μl體積)。對(duì)照組接受用5μlnacl的i.a.注射。

熒光素酶表達(dá)成像

在施用載體后不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)量熒光素酶表達(dá)，在不同實(shí)驗(yàn)中從第3天直至6個(gè)月。d-熒光素鉀-鹽底物(美國馬薩諸塞州霍普金頓的caliper生命科學(xué)公司(caliperlifesciences))腹膜內(nèi)注射(150mg/kg體重，體積約200μl)。在5分鐘施用底物后，10分鐘后使用冷卻電荷耦合裝置(ccd)攝像系統(tǒng)(photonimager，法國巴黎的生物空間實(shí)驗(yàn)室(biospacelab))獲取光子計(jì)數(shù)，。各光子計(jì)數(shù)期后立即獲得光表面圖像以提供動(dòng)物解剖視圖。圖像處理和信號(hào)強(qiáng)度定量及分析用m3vision(生物空間實(shí)驗(yàn)室)進(jìn)行。圖像展示為偽彩色(pseudo-color)光子計(jì)數(shù)圖，疊加在灰度解剖的白光圖上，允許評(píng)估生物發(fā)光強(qiáng)度和其解剖源。通過在膝關(guān)節(jié)區(qū)畫出橢圓roi，來定義感興趣區(qū)(roi)。roi表面積保持恒定。計(jì)算每秒每平方厘米每球面度的發(fā)射光子數(shù)作為熒光素酶活性量度。

一般動(dòng)物情況和道德聲明

免疫接種、關(guān)節(jié)內(nèi)注射和體內(nèi)成像在異氟烷麻醉(3％異氟烷和氧)下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在異氟烷麻醉下通過心臟穿刺然后頸椎脫臼來處死動(dòng)物，之后收集后爪、血、淋巴結(jié)和脾。研究由阿姆斯特丹大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)(荷蘭阿姆斯特丹；許可證編號(hào)：art102881,art102656,art102793,art102948和art103021)評(píng)審和批準(zhǔn)，并嚴(yán)格根據(jù)荷蘭動(dòng)物福利法(wetopdierproeven)的建議完成。動(dòng)物維持于阿姆斯特丹大學(xué)無病原體條件下的動(dòng)物設(shè)施中。

流式細(xì)胞術(shù)

脾和滑膜中的巨噬細(xì)胞通過流式細(xì)胞術(shù)分析。簡言之，滑膜細(xì)胞(synovialcells)如下提?。簭年P(guān)節(jié)刮下細(xì)胞，然后用liberase/dnase在37℃消化30min。隨后洗滌(pbs/edta)細(xì)胞并通過細(xì)胞篩網(wǎng)?；ぜ?xì)胞(synovialcells)離心(1400rpm,5min,4℃)并重懸于facs緩沖液(pbs+1％bsa)。由于滑膜中的細(xì)胞數(shù)低，集合來自各組的所有動(dòng)物。通過機(jī)械破碎和經(jīng)細(xì)胞篩網(wǎng)沖洗細(xì)胞分離脾細(xì)胞。紅細(xì)胞如下裂解：加入rbc裂解緩沖液(生命技術(shù)公司(lifetechnologies))，然后冰上孵育10分鐘。細(xì)胞離心并重懸于facs緩沖液。細(xì)胞(集合的滑膜或脾細(xì)胞(1e6細(xì)胞))用5％正常小鼠血清(sanquin)封閉并用f4/80-apc和cd68-fitc標(biāo)記抗體(bd生物科學(xué)(bdbiosciences))染色。在bdcanto2上獲取數(shù)據(jù)并用flowjo軟件(俄勒岡州阿什蘭的flowjollc)分析。

統(tǒng)計(jì)分析

隨著時(shí)間的發(fā)光用廣義估計(jì)方程(generalizedestimatingequations)(gee)研究以允許縱向分析(包括所有可用的縱向數(shù)據(jù)且允許數(shù)目不等的重復(fù)測(cè)量)(twisk(2004)eur.j.epidemiol.19(8):769-776)。所有其它統(tǒng)計(jì)用graphpadprism(美國加利福尼亞州的jajolla)分析。對(duì)于所有試驗(yàn)，p值<0.05的差異視作顯著。

實(shí)施例1

炎癥影響關(guān)節(jié)內(nèi)raav5轉(zhuǎn)基因表達(dá)

已知成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(synoviocytes)(fls)在ra患者的發(fā)炎關(guān)節(jié)中明顯增加(bartok和firestein,immunolrev,201)。這對(duì)于ra小鼠模型也如此，包括膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(cia)模型。由于fls是關(guān)節(jié)中aav5的主要靶細(xì)胞，我們假設(shè)在cia模型中炎癥開始后施用raav5-轉(zhuǎn)基因載體會(huì)導(dǎo)致更高的表達(dá)，這歸因于更高數(shù)目的轉(zhuǎn)導(dǎo)fls。為檢驗(yàn)此假設(shè)，在關(guān)節(jié)炎開始前(d17)或后(d24)向cia小鼠關(guān)節(jié)內(nèi)施用raav5-轉(zhuǎn)基因載體，所述載體編碼螢火蟲熒光素酶基因(raav5.cmv.fluc)。令人意外的是，此實(shí)驗(yàn)顯示相較炎癥開始前(第17天)施用載體，炎癥開始后(第24天)施用raav5-轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)致各關(guān)節(jié)表達(dá)更低以及表達(dá)轉(zhuǎn)基因的關(guān)節(jié)百分?jǐn)?shù)更少(圖1)。

實(shí)施例2

免疫抑制劑改善raav5轉(zhuǎn)基因表達(dá)

對(duì)于關(guān)節(jié)發(fā)炎動(dòng)物中表達(dá)減少的解釋可能是載體在其能轉(zhuǎn)導(dǎo)靶細(xì)胞前降解或中和。炎癥期間，不僅fls數(shù)量增加，而且巨噬細(xì)胞的數(shù)目和活化也增加，因此我們假設(shè)表達(dá)減少可能是由于巨噬細(xì)胞對(duì)載體的中和(例如，經(jīng)吞噬作用或通過可溶性因子(補(bǔ)體)調(diào)理)。為調(diào)查此可能性，我們研究施用影響巨噬細(xì)胞活性/數(shù)目的藥劑是否對(duì)raav5轉(zhuǎn)基因表達(dá)產(chǎn)生影響。氟羥脫氫皮醇(一種糖皮質(zhì)激素)通過抑制巨噬細(xì)胞活化和增殖來發(fā)揮作用[faucias,daledc,balowje；anninternmed1976；84；304-15]。其是常用于人的藥理學(xué)藥劑，例如用于治療ra患者關(guān)節(jié)的急性炎癥。也已知全身施用糖皮質(zhì)激素可通過降低ra患者滑膜組織中的巨噬細(xì)胞數(shù)目和活性來發(fā)揮局部作用[gerlagdm等；arthritisrheum2004；50(12):3783]。用于消耗巨噬細(xì)胞的第二試劑是含氯膦酸鹽的脂質(zhì)體[vanroijen和hendrikx,methodsinmolecularmedicine(605)189-203頁,2010]。2種藥劑在施用載體前48小時(shí)于分開的組中施用。

氟羥脫氫皮醇和脂質(zhì)體氯膦酸鹽在4周時(shí)間段內(nèi)中提高raav5.cmv.fluc表達(dá)，顯示消耗或抑制巨噬細(xì)胞導(dǎo)致基因表達(dá)增加(圖2a)。

我們假設(shè)另一防止巨噬細(xì)胞載體中和的方法可以是在施用載體后加入空衣殼粒子。這些空衣殼能作為誘餌防止含基因組的載體降解并因此增加全病毒粒子能到達(dá)靶細(xì)胞的可能性。當(dāng)空(aav5)衣殼以5:1比例(空與全之比)加入含全基因組的衣殼時(shí)，表達(dá)顯著提高(圖2b)。這些數(shù)據(jù)支持我們的假設(shè)：載體可能被巨噬細(xì)胞中和。在所有3個(gè)組中，還發(fā)現(xiàn)陽性關(guān)節(jié)百分?jǐn)?shù)增加(圖2c)。

由于氟羥脫氫皮醇是抗炎劑，密切監(jiān)測(cè)關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度。氟羥脫氫皮醇處理的小鼠顯示關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度降低的趨勢(shì)(圖2d)。

實(shí)施例3

氟羥脫氫皮醇和誘餌衣殼對(duì)raav5-轉(zhuǎn)基因表達(dá)具有協(xié)同效應(yīng)

我們?nèi)缓筮M(jìn)行長期隨訪研究以評(píng)估提高表達(dá)的持續(xù)時(shí)間。研究顯示藥物抑制和空誘餌衣殼的組合導(dǎo)致基因表達(dá)協(xié)同增強(qiáng)。如所預(yù)期，由于其抗炎效果，直至第4周氟羥脫氫皮醇處理組中的關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度更低(圖3a)。組之間的長期關(guān)節(jié)炎活動(dòng)度(arthritisactivity)相當(dāng)。監(jiān)測(cè)6個(gè)月時(shí)間段的熒光素酶表達(dá)，初始增加后保持穩(wěn)定直至1個(gè)月(圖3b)。用廣義估計(jì)方程(gee)縱向分析加入氟羥脫氫皮醇和/或空衣殼的效果，這允許我們包括所有可用的縱向數(shù)據(jù)且允許數(shù)目不等的重復(fù)測(cè)量。當(dāng)加入2種化合物(5.85比例；p＝0.001)時(shí)，觀察到發(fā)光顯著增加?；衔锓謩e顯示表達(dá)增加的趨勢(shì)(不顯著)。這顯示氟羥脫氫皮醇和空衣殼的組合對(duì)基因表達(dá)增加具有協(xié)同效應(yīng)。

在健康與關(guān)節(jié)炎小鼠中觀察到類似表達(dá)水平(數(shù)據(jù)未顯示)。由于技術(shù)問題，8周時(shí)間點(diǎn)無ivis數(shù)據(jù)。由于達(dá)到人道終點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前，處死總共15只動(dòng)物(每組2-4只)。

由于關(guān)節(jié)內(nèi)施用氟羥脫氫皮醇是ra患者的標(biāo)準(zhǔn)護(hù)理，我們想要確定氟羥脫氫皮醇施用途徑(全身相比局部)是否對(duì)功效產(chǎn)生任何效果。為研究這個(gè)問題，在i.a.施用raav5.cmv.fluc載體和空衣殼的組合物前2天，局部(關(guān)節(jié)內(nèi)(i.a.))(或鹽水作為對(duì)照)或全身(肌肉內(nèi)(i.m.))給予小鼠(n＝18)氟羥脫氫皮醇，空衣殼:raav5.cmv.fluc載體之比是5:1。如圖4可見，氟羥脫氫皮醇預(yù)處理動(dòng)物引起基因表達(dá)增強(qiáng)。無論氟羥脫氫皮醇是全身(i.m.)還是局部(i.a.)給藥，這都如此，表明氟羥脫氫皮醇給藥途徑不是功效的關(guān)鍵因素。

實(shí)施例4

氟羥脫氫皮醇對(duì)脾與滑膜中巨噬細(xì)胞的影響不同

為進(jìn)一步研究氟羥脫氫皮醇對(duì)轉(zhuǎn)基因表達(dá)影響的作用機(jī)制，對(duì)滑膜組織和脾細(xì)胞進(jìn)行離體分析以評(píng)估對(duì)巨噬細(xì)胞以及其它細(xì)胞類型數(shù)目和活性的影響。氟羥脫氫皮醇施用后48小時(shí)，通過facs分析比較氟羥脫氫皮醇與nacl處理的動(dòng)物之間不同組織的細(xì)胞群。

值得注意的是，盡管脾中的巨噬細(xì)胞(cd68+,f4-80+)的相對(duì)百分比在剩余氟羥脫氫皮醇處理動(dòng)物中保持類似(相較鹽水)(圖5a)，脾絕對(duì)體積在氟羥脫氫皮醇處理后第25天減少(4倍)(p＝0.0011)(圖5c和d)，到第29天差異減小。與脾相反，滑膜中的巨噬細(xì)胞百分比在氟羥脫氫皮醇處理后減少(圖5b)。應(yīng)注意，考慮到能提取自滑膜的細(xì)胞數(shù)少，我們不得不收集所有在一組中的動(dòng)物以獲得足夠細(xì)胞計(jì)數(shù)。

實(shí)施例5

aav空衣殼在沒有炎癥和預(yù)存體液免疫的情況下提高轉(zhuǎn)基因表達(dá)

所有先前實(shí)驗(yàn)都在cia模型中進(jìn)行，其中動(dòng)物在施用載體時(shí)經(jīng)歷明顯關(guān)節(jié)炎癥。隨后我們決定研究是否也能在健康關(guān)節(jié)中發(fā)現(xiàn)熒光素酶表達(dá)增強(qiáng)。

當(dāng)空衣殼分別以2種不同比例加入含基因組的粒子時(shí)，即空衣殼與raav5.cmv.fluc載體之比分別是5:1和20:1，我們觀察到發(fā)光的劑量依賴性增加(圖6)。從注射熒光素酶后第3天開始，在向含基因組的載體以劑量依賴性方式加入空衣殼后，表達(dá)增加(圖6)。在以5:1空衣殼與全衣殼比例注射到動(dòng)物中，平均增加4.8倍(p<0.01)。20:1比例(空與全之比)使表達(dá)提高多至20倍(<0.05)。

實(shí)施例6

回避/抑制巨噬細(xì)胞可允許氣囊滑膜炎癥(apsi)模型中的表達(dá)

氣囊滑膜炎癥(apsi)模型最初開發(fā)作為在小鼠中模擬人滑膜的方式。其涉及在小鼠背部皮膚下注入空氣。6-7天后，襯膜會(huì)在此氣囊周圍形成。此襯里非常類似在關(guān)節(jié)腔周圍形成的滑膜襯里，主要由成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成。當(dāng)表達(dá)熒光素酶的aav在d7(形成氣囊襯里后)施用在氣囊內(nèi)，我們未能發(fā)現(xiàn)任何表達(dá)，即使采用高載體劑量(數(shù)據(jù)未顯示)。我們假設(shè)也許襯里氣囊膜的巨噬細(xì)胞抑制載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)(與關(guān)節(jié)內(nèi)注射載體我們所觀察到的類似)。我們通過如下檢驗(yàn)此假設(shè)：a)施用載體前2天施用氟羥脫氫皮醇，或b)巨噬細(xì)胞浸潤到氣囊襯里前，在d0施用載體。如圖7可見，僅當(dāng)巨噬細(xì)胞受抑制(如氟羥脫氫皮醇)或被避免(在d0施用載體)時(shí)，觀察到熒光素酶表達(dá)。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持巨噬細(xì)胞不利于aav轉(zhuǎn)導(dǎo)的假設(shè)以及希望得到避免/抑制巨噬細(xì)胞對(duì)aav中和的策略。

實(shí)施例7

空衣殼與氟羥脫氫皮醇的組合提高關(guān)節(jié)內(nèi)aav5基因表達(dá)

由于我們已顯示空誘餌衣殼與氟羥脫氫皮醇的組合有效增加cia小鼠發(fā)炎關(guān)節(jié)的基因表達(dá)(實(shí)施例3)，且我們已顯示單獨(dú)空衣殼能增加健康關(guān)節(jié)的關(guān)節(jié)內(nèi)基因表達(dá)(實(shí)施例5)，我們想要確定空誘餌衣殼與氟羥脫氫皮醇的組合是否會(huì)在甚至沒有炎癥(健康關(guān)節(jié))的情況下提高基因表達(dá)。為確定此問題，向小鼠組(n＝18)i.m.施用(50μl總體積)氟羥脫氫皮醇(5mg/kg)或鹽水(對(duì)照)。隨后通過關(guān)節(jié)內(nèi)注入雙膝(5μl總體積)向組施用aav5-cmv-fluc(1.26e10vg/關(guān)節(jié))或aav5-cmv-fluc+空aav5衣殼(空:全之比＝5:1)。熒光素酶表達(dá)通過活動(dòng)物ivis成像監(jiān)測(cè)。如圖8可見，空誘餌衣殼與氟羥脫氫皮醇處理的動(dòng)物都顯示基因表達(dá)相較用單獨(dú)載體的動(dòng)物增加?？找職づc氟羥脫氫皮醇的組合使基因表達(dá)水平增長最高，與發(fā)炎(cia)關(guān)節(jié)中觀察到的類似。這些數(shù)據(jù)表明氟羥脫氫皮醇與空衣殼的組合不僅有效增加患病關(guān)節(jié)的表達(dá)，而且能增加健康關(guān)節(jié)的表達(dá)。這些結(jié)果支持以下假設(shè)：滑膜襯里中(甚至在健康關(guān)節(jié)中)的高巨噬細(xì)胞數(shù)抑制aav介導(dǎo)的表達(dá)，以及加入誘餌衣殼粒子和/或抑制巨噬細(xì)胞活性能克服此抑制，導(dǎo)致基因表達(dá)增加。

實(shí)施例8

空衣殼與氟羥脫氫皮醇的組合對(duì)aav5非特異，但提高來自其它血清型的關(guān)節(jié)內(nèi)基因表達(dá)

因此，我們的研究迄今為止聚焦于aav5，因?yàn)榇搜逍蛯?duì)關(guān)節(jié)有優(yōu)秀的趨向性，然而我們假設(shè)aav的巨噬細(xì)胞中和是非血清型特異性的。這是由于通過巨噬細(xì)胞aav更新是采用清道夫受體的普遍現(xiàn)象，并因而不應(yīng)限于任何一種血清型或無論任何病毒類型，因?yàn)橐阎奘杉?xì)胞攝取廣泛范圍的病毒和細(xì)菌。

為檢驗(yàn)此假設(shè)，我們進(jìn)行實(shí)驗(yàn)評(píng)估氟羥脫氫皮醇和空衣殼是否能提高來自與aav5大不相同的血清型(aav2)的基因表達(dá)。aav5和aav2在氨基酸水平僅共有57％同源性(見圖10)，使得他們成為已知aav中最不同的兩種血清型。

為確定此問題，我們進(jìn)行與實(shí)施例7相同的實(shí)驗(yàn)，然而我們使用aav2載體來取代aav5。向小鼠組(n＝18)i.m.施用(50μl總體積)氟羥脫氫皮醇(5mg/kg)或鹽水(對(duì)照)。隨后通過關(guān)節(jié)內(nèi)注入雙膝(5μl總體積)，向組施用aav2-cmv-fluc(1.26e10vg/關(guān)節(jié))或aav2-cmv-fluc+空aav2衣殼(空:全之比＝5:1)。熒光素酶表達(dá)通過活動(dòng)物ivis成像監(jiān)測(cè)。如圖9可見，與aav5所見結(jié)果類似，空誘餌衣殼與氟羥脫氫皮醇處理的動(dòng)物都顯示與施用aav2后用單獨(dú)載體的動(dòng)物相比增加的基因表達(dá)?？找職づc氟羥脫氫皮醇的組合使基因表達(dá)水平增長最高，與aav5處理動(dòng)物中觀察到的類似。這些數(shù)據(jù)表明氟羥脫氫皮醇與空衣殼的組合不僅有效增加用aav5的表達(dá)，而且對(duì)其它不同的血清型有效，如aav2。因此，顯然通過巨噬細(xì)胞抑制來提高基因表達(dá)不限于aav5，而適用于所有aav血清型。

考慮到空aav2和aav5衣殼都能增加基因表達(dá)，推斷此表達(dá)提高并非特異于特定衣殼血清型。我們因此得出結(jié)論，空衣殼的血清型不需與含全基因組的載體具有相同血清型，且任何空衣殼血清型(天然或突變)應(yīng)能提高來自任何其它aav載體血清型(天然或突變)的關(guān)節(jié)內(nèi)表達(dá)。

序列表

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<120>基于aav的基因療法

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