本發(fā)明涉及由碳水化合物給料(例如谷類)共同制備和分離真菌蛋白和乙醇。本發(fā)明還提供用于由碳水化合物給料共同制備真菌蛋白的發(fā)酵系統(tǒng)。

背景技術：

畜牧業(yè)滿足了對肉類和乳制品的快速增長的消費者導向的需求，并且使用大約70％的用于放牧和飼料作物生產的全部全球農業(yè)用地。然而，增長的人口和對肉類和乳制品的變化的飲食偏好將會對全球農業(yè)用地產生增加的需求。

生物技術為以較低環(huán)境影響更高效率地制備的肉類替代品提供了一些可能性。明顯的實例是通過葡萄糖糖漿的需氧發(fā)酵制備的真菌蛋白(quorn)。其目前作為(相對昂貴的)健康素食替代物銷售。其較高的成本與精制原料(葡萄糖糖漿)的使用有關，并且高固定成本與專用適度產量的工廠的投資成本有關，并且能量成本與需氧發(fā)酵有關。

家畜飼料主要包含提供大多數碳水化合物的谷類(玉米、小麥)，連同為最佳營養(yǎng)提高蛋白質含量的蛋白質增強物(主要來源豆粕)。大約40％的谷物用作家畜飼料。大豆的農業(yè)產率通常明顯低于谷類。

從谷物原料發(fā)酵通常將碳水化合物轉化，剩下在蛋白質中濃縮的干酒糟及其可溶物(distillerdriedgrainswithsolubles,ddgs)殘余物。其在家畜飼料中用作高蛋白質組分，然而其較低的可消化性限制了其混合比。

全球生物乙醇產量超過6千萬tepa，2個主要來源是谷類(尤其是轉化其產量的大約40％的美國玉米)和巴西甘蔗的發(fā)酵。來自谷類(玉米/小麥)的生物乙醇的經濟(排除政府激勵)和環(huán)境益處是微乎其微的。存在與關于陸地使用和能源安全的食物v燃料壓力有關的明顯的政治問題。

us4447534描述了使用酵母制備乙醇的方法，其中生長條件的控制可以增加酵母和因此的衍生自酵母的單細胞蛋白質的收率。

silva等人(wastemanagement,31(2011),108-114)描述了借助酵母菌如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)和近平滑假絲酵母(candidaparapsilosis)使用酒精生產的殘余物和用于蛋白質生產的生物乙醇的方法。單細胞蛋白形式酵母可用作用于動物飼料的補充蛋白質的來源。

wo2009/079183描述了用于改善在谷粒發(fā)酵制備酒精之后殘留的飼料廢料產物的營養(yǎng)品質的方法?？梢杂媚軌驅⒗w維素和/或半纖維素分解為一種或多種糖類并且進而使用一種或多種糖增殖的微生物將廢料產物發(fā)酵。因為微生物含有蛋白質，它們的增殖用于增加廢料產物的蛋白質含量。雖然描述了包括細菌、酵母菌和真菌在內的各種微生物，但是不存在在廢料產物的分離中提供任何單細胞蛋白的教導。

將會理想的是能夠提供一種系統(tǒng)，其可以被調整為能夠在其他材料的分離中制備真菌蛋白和乙醇二者，同時任選能夠基于所需要求如普遍的經濟和/或社會經濟擔憂而改變每種副產物的量。

提供用于分離的真菌蛋白和/或乙醇的制備、任選共同制備的方法在本發(fā)明的目的之內。

發(fā)明概述

在第一方面中，提供一種能夠由碳水化合物給料制備和分離來源于絲狀真菌的真菌蛋白和乙醇的綜合系統(tǒng)。

碳水化合物給料可以是混合的或單一的給料。

將根據以上理解的是，可以交換真菌蛋白和乙醇制備的順序，以使得可以在真菌蛋白之前制備乙醇，并且反之亦然。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，首先制備真菌蛋白，接著制備乙醇。如上所述，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)就可以制備的真菌蛋白或乙醇的量而言是綜合的和可控的。通過用于獲得真菌蛋白或乙醇的底物和生長條件(尤其是氧含量)的控制，可以以可控方式改變所制備的真菌蛋白或乙醇的量。因此，例如，取決于普遍的商業(yè)要求，可以改變根據本發(fā)明制備的真菌蛋白與乙醇的比率。這可以手動、半自動或完全自動實現(xiàn)。例如，在自動或半自動過程中，用戶可以向用戶可編程接口中指出或輸入例如所需的真菌蛋白與乙醇的比率，并且之后系統(tǒng)可以控制底物通量和生長條件，從而實現(xiàn)所需的真菌蛋白與乙醇的比率。

如在本文中所提及的真菌蛋白應被理解為由絲狀真菌如包括fusariumvenenatum的鐮刀菌屬(fusarium)物種具體制備的單細胞蛋白的形式。

單一給料可以包含多種可代謝底物，通常為一種或多種含有碳水化合物的底物。優(yōu)選地，給料包含一種或多種谷物材料。本發(fā)明的系統(tǒng)可以與可能需要為真菌蛋白制備過程和乙醇制備過程提供的單獨的給料的非綜合系統(tǒng)相區(qū)別。

真菌蛋白可以通過底物材料的需氧消化獲得。乙醇可以通過底物材料的厭氧發(fā)酵制備，盡管任選地，可以在厭氧消化期間存在需氧消化的初期階段從而允許能夠生成乙醇的一種或多種微生物的生長。

在一個實施方案中，用于在制備真菌蛋白和乙醇中使用的一種或多種微生物是不同的。在這樣的實施方案中，能夠制備真菌蛋白的一種或多種微生物是鐮刀菌屬物種，如fusariumvenenatum并且能夠制備乙醇的一種或多種微生物是酵母菌屬物種，如釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)。發(fā)明人已經觀察到，對于單一類型的微生物來說，可以能夠制備真菌蛋白和之后的乙醇二者。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明的綜合方法采用單一類型的微生物以制備真菌蛋白和乙醇二者。這樣的單一類型的微生物可以是鐮刀菌屬物種如f.venenatum或多個物種。

在另一個方面中，提供一種用于由谷物材料共同制備真菌蛋白和乙醇的綜合方法，所述方法包括下列步驟：

a)提供包含一種或多種谷物材料的含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液；

b)用微生物使所述含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液的至少一部分發(fā)酵，從而分別獲得真菌蛋白或乙醇并且獲得部分發(fā)酵的培養(yǎng)液；

c)將真菌蛋白或乙醇與所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液分開/分離；

d)用微生物使所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液的至少一部分任選地與未發(fā)酵的含水的可發(fā)酵培養(yǎng)液的一部分一起發(fā)酵，從而分別獲得乙醇或真菌蛋白并且獲得廢發(fā)酵殘余物；和

e)將乙醇或真菌蛋白與所述廢發(fā)酵殘余物分離。

所述部分發(fā)酵的培養(yǎng)液可以來源于已經經歷了初期發(fā)酵的初期發(fā)酵培養(yǎng)液從而制備真菌蛋白或乙醇。部分發(fā)酵的培養(yǎng)液能夠被發(fā)酵從而制備第二產物，即乙醇或真菌蛋白，這取決于已經首先制備了什么。

將會根據以上理解的是，可以交換真菌蛋白和乙醇制備的順序，以使得可以在真菌蛋白之前制備乙醇，并且反之亦然。然而，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，首先制備真菌蛋白，接著制備乙醇。

本發(fā)明的方法可以以分批、連續(xù)或半連續(xù)方式進行。

所述方法還可以包括將廢發(fā)酵殘余物(也被稱為酒糟(stillage))分開以獲得濕固體級分和可溶性級分的步驟。可以將可溶性級分濃縮并且可以將所得漿液與濕固體級分合并，可以將其干燥從而獲得被稱為干酒糟及其可溶物(drieddistillersgrainswithsolubles，ddgs)的物質。

通常，所述一種或多種谷物材料可以包括小麥、玉米、大麥、水稻、高粱、薺麥、燕麥、黑麥等。谷物可以是食品級品質的或者事實上可以是不再適用于人類消耗的物質。可以使用前述實例中的一種，或者可以在本發(fā)明中采用包含兩種以上類型的谷類的混合物。本發(fā)明并非意在限于可以采用的一種類型或多種類型的谷物，并且這可以僅取決于當時的普遍的經濟因素和/或地理因素和因此的可得性因素。

可以對一種或多種谷物材料進行碾磨、研磨和/或切割處理，從而將谷物材料分解為較小片段并且還可以釋放可以存在于谷物中的蛋白質、糖類和其他材料中的一些?？梢詫⒎纸獾牟牧吓c水混合至例如170-500比50g/l的濃度，并且按需要調節(jié)ph，從而提供發(fā)酵培養(yǎng)液。

可以通過采用凝膠化、液化和/或糖化中的一種或多種對可以存在于發(fā)酵培養(yǎng)液中的任何淀粉進行水解或部分水解。發(fā)現(xiàn)淀粉在自然界中是耐酶分解的不溶性、不可分散顆粒。凝膠化是淀粉顆粒在熱量和水的存在下的溶脹。此時，如果不加入α淀粉酶以將淀粉部分水解為糊精，淀粉或研磨的谷物漿料顯著增稠并且將會難以處理。含有糊精的溶液通常更多地是液體或液化的。α淀粉酶用于降低溶液的粘度并且還用于制備較低分子大小的底物。對于將糊精水解為葡萄糖的葡糖淀粉酶的有效作用來說，較低分子大小的底物分子是所需的。

可以加入酶如α淀粉酶和葡糖淀粉酶，從而將存在的淀粉分解或水解。α淀粉酶是細菌的熱穩(wěn)定內淀粉酶。其將淀粉分子中隨機位置的α-1,4鍵水解以迅速降低凝膠化淀粉溶液的粘度。這種酶是含金屬離子的蛋白質并且在使用期間為了最大活性和穩(wěn)定性需要少量的鈣離子。所述酶不能水解α-1,6鍵，但是可以在支鏈淀粉繞過這些分支點。反應的產物是糊精-短葡萄糖鏈，以及少量的葡萄糖和麥芽糖。

由真菌產生的葡糖淀粉酶是外淀粉酶。其從分子的非還原性末端開始水解麥芽糖和糊精。葡糖淀粉酶水解α-1,4和α-1,6鍵二者以將糊精完全降解為葡萄糖。酶在ph3.5-4.5活性最優(yōu)。通常，可以以固體物質的0.25-1.5％w/w的濃度加入α淀粉酶，并且可以以固體物質的0.25-3％w/w的濃度加入葡糖淀粉酶。在酶消化之后，可以對發(fā)酵培養(yǎng)液進行熱處理，從而破壞酶并且殺死可能存在并且可能干擾后續(xù)工藝步驟的任何細菌。

然而，酶的加入、ph的調節(jié)和所需的加熱和冷卻明顯地增加了成本并且因此可以是不合乎需要的。發(fā)明人已經觀察到微生物如fusariumvenenatum(f.venenatum)可以進行利用未水解谷物谷粒淀粉溶液的發(fā)酵。因為常規(guī)的真菌蛋白制備通常需要葡萄糖作為起始碳源，意外的是，可以使用未經過淀粉水解的材料制備真菌蛋白。當在不必須進行液化和/或糖化步驟的情況下進行本發(fā)明的方法時，這可以導致大幅的成本節(jié)約。

使用絲狀真菌如f.venenatum進行真菌蛋白制備以將可發(fā)酵培養(yǎng)液內的材料發(fā)酵。如上所述的淀粉的水解可以或可以不在進行發(fā)酵之前進行?？梢詾榱擞行У恼婢鞍装l(fā)酵提供氮和營養(yǎng)物質如vogel鹽的適合的來源(補充有40g的葡萄糖的大約1l的vogel鹽)。其可以在發(fā)酵之前和/或期間加入。

可以理想的是在發(fā)酵期間包括消泡劑，從而使可能由于例如存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中的蛋白質而出現(xiàn)的任何發(fā)泡最小化。例如，可以以高達1％(v/v)的濃度加入油菜籽油。其不僅可以充當消泡劑，而且油菜籽油還可以用作碳源并且因此可以被發(fā)酵?？梢詢H需在發(fā)酵的開始加入消泡劑，如油菜籽油。

作為需氧發(fā)酵過程，真菌蛋白的制備需要加入作為空氣或氧的氧源。連同對其他發(fā)酵條件的控制，曝氣的程度將會影響碳水化合物向真菌蛋白和乙醇的相對轉化并且可以用于影響轉化率。制備兩種產物(真菌蛋白和乙醇)的綜合方法允許在真菌蛋白發(fā)酵期間不需要使乙醇(其在常規(guī)真菌蛋白發(fā)酵中將會是廢料副產物)最小化的運行條件?？梢砸赃B續(xù)或分階段操作的方式選擇性地改變有利于真菌蛋白/乙醇制備的條件。理想地，可以將運行條件分階段以匹配更加能量密集的向真菌蛋白的需氧發(fā)酵的程度，并且能量供應分階段以匹配可再生能量可得性的每天能量循環(huán)。

真菌蛋白和/或乙醇發(fā)酵可以作為分批、半連續(xù)、或連續(xù)過程進行。連續(xù)過程可以提供在維持最佳穩(wěn)態(tài)控制條件和與連續(xù)分離過程連接的能力方面的優(yōu)點。一旦完成，可以對真菌蛋白和廢發(fā)酵培養(yǎng)基進行熱處理，從而移除/破壞可能存在的核酸，如rna。例如，之后可以將真菌蛋白與廢發(fā)酵培養(yǎng)基分開/分離，如通過離心或過濾，并且之后干燥。之后可以進一步處理干燥的真菌蛋白材料，從而提供適合的食品級材料?？梢詫⒄婢鞍装l(fā)酵廢液(與分離的淀粉水解產物和/或分離的蛋白質/纖維固體合并)進一步發(fā)酵以用于乙醇制備?？梢允褂冕劸平湍?s.cerevisiae)從而將材料發(fā)酵并且制備乙醇。在finn等人(2006)中描述了典型的過程。

一旦已經進行發(fā)酵并且制備乙醇，則需要將乙醇與存在的其他材料分開/分離。這可以通過例如在(cardonaandsanchez,2007)中描述的連續(xù)蒸餾過程實現(xiàn)。這為乙醇提供了高純度，例如其可以通過經過分子篩而進一步純化，從而移除水并且將乙醇進一步濃縮。

在蒸餾過程期間移除的不含乙醇的材料包括通常被稱為酒糟的固體和可溶性物質。可以通過例如壓制或離心將這種固體和可溶性物質分離，從而提供濕固體物質和液體?？梢詫窆腆w物質進一步干燥并且可以將液體濃縮，從而提供漿液?？梢詥为毣蚪M合使用干燥的固體和漿液，從而提供被稱為干酒糟及其可溶物(ddgs)的物質。

可以看出，本發(fā)明提供了一種方法，其能夠將較低等級/價值的材料轉化為真菌蛋白(其可以用作人類食物來源)；乙醇(其可以用作生物燃料)；和廢料，如ddgs(其可以用作動物飼料)。

詳細描述

現(xiàn)在將通過非限制性實例的方式和參照附圖進一步描述本發(fā)明，所述附圖示出：

圖1示出了來自用于乙醇制備的現(xiàn)有方法的典型構造的示意性流程圖；圖2至圖8示出了來自其中可以由谷粒原料共同制備真菌蛋白和乙醇的根據本發(fā)明的許多實例系統(tǒng)構造的示意性流程圖。

圖1-用于乙醇制備的現(xiàn)有方法的典型構造的流程圖。

圖2-用于使用兩種微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的流程圖。

圖3-用于使用兩種微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的另一個流程圖。

圖4-用于使用兩種微生物和不同原料的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的另一個流程圖。

圖5-用于使用單一微生物(需氧發(fā)酵，之后厭氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的可能的綜合構造的流程圖。

圖6-用于使用單一微生物(厭氧發(fā)酵，之后需氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的流程圖。

圖7-用于使用單一微生物的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的流程圖。

圖8-用于使用單一微生物(厭氧發(fā)酵，之后需氧發(fā)酵)的真菌蛋白和乙醇制備的共同制備方法的綜合構造的流程圖。

圖9-f.venenatum在最低vogel培養(yǎng)基(燒瓶1-3)和補充有vogel鹽的小麥水解產物(燒瓶4-6)中的生長的比較。將在30℃和150rpm下在定軌搖床上溫育。一式三份進行實驗并且估算生物質。在72h之后選取樣品(實驗1)。

圖10-利用補充有vogel鹽的小麥水解產物的f.venenatum(vw＝1.5-l)的分批發(fā)酵。示出了在整個發(fā)酵過程中干燥生物質(●)、葡萄糖(▲)和乙醇(×)趨勢(實驗1)。

圖11-在不具有酶(●)、具有0.5％w/wα淀粉酶(δ)和具有0.5％w/wα淀粉酶和1％w/w葡糖淀粉酶二者(□)的情況下在定軌搖床上在28℃和150rpm下的搖瓶中生長的f.venenatum在70g/l含有面粉的水解產物中的生長。在24、48和72小時之后選取樣品并且一式三份分析生物質含量(實驗1)。

圖12-具有mypg和補充有vogel鹽的小麥水解產物的釀酒酵母搖瓶的光密度(od)和干細胞重量。將燒瓶在30℃和250rpm下溫育并且所有均含有20g/l葡萄糖作為碳源。使它們生長并且一式三份分析(實驗2)。

圖13-分別使用mypg和小麥水解產物的借助釀酒酵母的乙醇發(fā)酵。描繪了在整個發(fā)酵過程中的光學密度。在發(fā)酵罐1(●)和發(fā)酵罐2(○)中使用mypg，而在發(fā)酵罐3(□)和發(fā)酵罐4(δ)中使用補充有vogel鹽的小麥水解產物。在8-18h之間曝氣為0.82vvm，否則為0vvm。將溫度維持恒定在30℃并且ph在5.5(實驗2)。

圖14-分別使用mypg和小麥水解產物的借助釀酒酵母的乙醇發(fā)酵。示出了在整個發(fā)酵過程中的干燥生物質增加。在發(fā)酵罐1(●)和發(fā)酵罐2(○)中使用mypg，而在發(fā)酵罐3(□)和發(fā)酵罐4(δ)中使用補充有vogel鹽的小麥水解產物。在8-18h之間曝氣為0.82vvm，否則為0vvm。將溫度維持恒定在30℃并且ph在5.5(實驗2)。

圖15-使用f.venenatum的綜合方法的第一發(fā)酵的干細胞重量(dcw)和葡萄糖趨勢(實驗3)。

圖16-使用釀酒酵母的綜合生物方法的第二部分的干細胞重量(dcw)、葡萄糖和乙醇趨勢。

圖17-使用不同曝氣曲線的fusariumvenenatum發(fā)酵的干細胞重量趨勢的比較(實驗4)。

圖18-在整個fusariumvenenatum發(fā)酵過程中利用不同氧供給的乙醇制備(實驗4)。

圖19-在整個f.venenatum發(fā)酵過程中利用不同發(fā)酵培養(yǎng)基和不同氧供給的葡萄糖濃度的趨勢(實驗4)。

圖20-在f.venenatum發(fā)酵的時間進程期間的溶解氧(do,％)曲線(實驗4)。

將使用以下要點從而解釋各種組分和在圖1-8中例示出的方法中進行的步驟：

谷粒碾磨物理分解谷粒以實現(xiàn)在下游處理中的淀粉提?。?/p>

液化是從谷粒中提取并且水解淀粉以獲得適用于物理處理和發(fā)酵的水溶性碳水化合物的過程。通常使用酶，將谷粒與水混合并且加熱。加熱過程使用于發(fā)酵的溶液進一步滅菌；

通過傾析、過濾或離心進行固體蛋白質和纖維的分離以提供適用于真菌蛋白發(fā)酵的可溶性碳水化合物溶液。該步驟在常規(guī)乙醇生物精制中不是必需的，因為可以從漿料中蒸餾發(fā)酵產物乙醇；

需氧發(fā)酵提供真菌蛋白的發(fā)酵生長。該操作可以以分批或連續(xù)方式進行。在受控條件下冷卻的情況下將氮源(例如氨)、營養(yǎng)物質和空氣/氧供給至發(fā)酵罐以促進真菌蛋白生長。通過經由過程變量如底物通量或/和氧水平操控生理條件，可以控制條件以優(yōu)化真菌蛋白生長速率/選擇性或者實現(xiàn)真菌蛋白與乙醇的優(yōu)選比率；

真菌蛋白發(fā)酵釀造的熱處理和分離提供分離的(通過過濾或離心)和干燥的固體主體真菌蛋白產物。進行混合物的熱處理以降低產物的核酸(rna)含量；

進行厭氧發(fā)酵以將殘留的碳水化合物轉化為乙醇。這可以使用真菌蛋白和常規(guī)的釀酒的酵母(例如，釀酒酵母(s.cerevisiae))之一或二者進行；

蒸餾用于將乙醇與發(fā)酵混合物分離；

干燥從蒸餾的乙醇中移除殘留的水以滿足生物乙醇燃料的要求。這常規(guī)上使用分子篩進行；

固體蛋白質/纖維與谷粒的分離產生通常用作家畜飼料的高蛋白產物。當連同結合了發(fā)酵混合物的可溶性組分的來自蒸餾的蒸發(fā)的殘余物一起分離和干燥時，其通常被稱為干酒糟及其可溶物(ddgs)。

示出了用于單獨制備生物乙醇的本領域中已知的代表性過程。在該過程中，僅描述了用于生物乙醇的制備的厭氧過程。

如可以從-8中例示出的各種過程中看到的，本發(fā)明提供其中移除不溶性物質如蛋白質和纖維的分離階段，從而提供適用于后續(xù)發(fā)酵的包含溶解的碳水化合物的溶液。

在圖2-8中描繪的各種實施方案中，提供一種綜合方法，其可以制備乙醇和真菌蛋白二者，以及可以用作動物飼料產品的廢料，干酒糟及其可溶物(ddgs)。

實施例部分：

實驗過程

1.1微生物和培養(yǎng)條件

在真菌蛋白(和乙醇)發(fā)酵中使用的微生物是從atcc購買的絲狀真菌f.venenatuma3/5(20334)。主培養(yǎng)物通過接種含有來自馬鈴薯葡萄糖瓊脂(pda)板的具有40g/l葡萄糖的最低vogel培養(yǎng)基的液體培養(yǎng)物而制備。它們在定軌搖床上在150rpm和28℃下溫育72h，之后將20％甘油加入至培養(yǎng)物中并且將它們在-80℃儲存在低溫小藥瓶中。此外，將pda板在溫育器中在30℃和0％co2下生長并且之后在4℃儲存。

為了乙醇發(fā)酵，還使用酵母釀酒酵母(由斯特拉斯克萊德藥學和生物醫(yī)學科學研究所的培養(yǎng)物保藏中心提供)。其在含有下列各項的1l的mypg培養(yǎng)基中生長：3g麥芽提取物、3g酵母提取物、5g蛋白胨和10g葡萄糖，然而葡萄糖在高壓滅菌之后加入從而防止美拉德反應(maillardreaction)。將ph調節(jié)為5.5并且使培養(yǎng)基凝固，加入15g/l瓊脂。將平板用接種環(huán)接種并且在溫育器中在30℃下溫育24h，并且之后在4℃儲存。通過接種液體培養(yǎng)物并且將其在定軌搖床上在30℃和250rpm下溫育24h，之后加入20％甘油并且在-80℃儲存在低溫小藥瓶中，制備主培養(yǎng)物。

1.2接種物制備

通過將來自-80℃細胞庫的解凍的小瓶接種至200ml試樣量的vogels培養(yǎng)基中來制備f.venenatum的接種物。將培養(yǎng)物在30度溫育二十四小時的時間段。將50ml試樣量的該培養(yǎng)物(提供10％v/v的接種物)移除并且轉移至離心管。將其以8000rpm離心10分鐘的時間段。將上清液移除并且加入等體積的無菌蒸餾水以使f.venenatum的粒料重懸。之后將其與之前一樣以8000rpm離心10分鐘的時間段。再次將上清液移除并且將fusariumvenentum粒料在20ml試樣量的無菌小麥培養(yǎng)基中重懸。該試樣量用于通過注射器隔膜端口將生物反應器接種。

釀酒酵母接種物的制備遵循類似的方法。將來自細胞庫的小瓶解凍并且用于接種含有mypg培養(yǎng)基的200ml燒瓶。當細胞密度已經達到足夠的水平(大約1au的光密度)時，按照與對f.venenatum接種物所進行的相同的操作，將50ml試樣量的培養(yǎng)物離心，用蒸餾水洗滌，并且在小麥培養(yǎng)基中重懸。

1.3培養(yǎng)基制備

1.3.1確定成分培養(yǎng)基

根據vogel(1956)制備用于發(fā)酵和搖瓶的確定成分培養(yǎng)基。使用葡萄糖代替碳源蔗糖，并且使用40g/l而不是15g/l。

1l的培養(yǎng)基含有：2.17g檸檬酸三鈉、5g磷酸二氫鉀、2g硝酸銨、0.2g七水合硫酸鎂、0.1g二水合氯化鈣、0.25mg生物素和5ml微量元素溶液。

對于微量元素溶液來說，將以下微量元素溶解于95ml蒸餾水中：5g一水合檸檬酸、5g七水合硫酸鋅、1g六水合硫酸鐵銨、0.25g五水合硫酸銅、0.05g一水合硫酸錳、0.05g硼酸和0.05g二水合鉬酸鈉。

1.3.2小麥水解產物(wh)

使用ika分析磨機將小麥谷粒碾磨為面粉材料。將該面粉溶解在加熱至90℃的蒸餾水中，并且最終面粉濃度在70g/l的區(qū)域內。一旦在溶液中，即將系統(tǒng)的ph調節(jié)為7，之后以所加入的小麥面粉的1％w/w的加載量加入α淀粉酶。將該溶液維持在90℃并且攪拌1小時的時間段。之后使溶液冷卻，同時仍然攪拌，直到達到在50℃的區(qū)域內的溫度。之后使用1m鹽酸將溶液的ph調節(jié)為4.6-4.8。之后以相對于所加入的小麥面粉的量1％w/w的加載量再次加入葡糖淀粉酶。之后在振蕩溫育器中在50℃和100rpm下將該溶液溫育16小時的時間段。

之后將酶處理的培養(yǎng)基冷卻至室溫，轉移至離心管并且以6,000rpm離心10分鐘的時間段。使用buchner漏斗使上清液經過0.2μm濾紙并且收集濾液用于發(fā)酵過程。之后再次將濾液高壓滅菌。參照panagiotopoulos等人(2009)、gadonna-widehem等人(2012)和由sigma提供的酶數據表，進行淀粉水解的操作。

1.4生物質估算

針對在發(fā)酵期間選取的樣品中的每一個估算f.venenatum和釀酒酵母的生物質水平。

使用微纖維過濾器實現(xiàn)f.venenatum細胞重量估算。將玻璃微纖維過濾器編號并且記錄干燥過濾器的質量。將過濾器放置在buchner漏斗中并且使1ml試樣量的發(fā)酵樣品經過過濾器。對于每個樣品一式三份重復該過程。隨后將過濾器放置在佩特里培養(yǎng)皿(petridish)中并且在烘箱中在50℃下干燥24小時的時間段。之后將過濾器再次稱重，并且如果需要，再次干燥，直到觀察到穩(wěn)定讀數。通過減去之前記錄的空過濾器的重量來計算生物質。因為一式三份進行該過程，報告的值是三個記錄的重量的平均值。

使用eppendorf管進行釀酒酵母干細胞重量估算。將eppendorf管在干燥器中干燥并且記錄干燥空管的重量。將1ml試樣量的發(fā)酵樣品移液至管中，并且之后以6000rpm離心10分鐘的時間段。將上清液移除并且將細胞沉淀干燥。將管再次稱重，直到觀察到穩(wěn)定讀數，并且減去空管的質量以得到所存在的細胞的質量。因為使用了1ml試樣量的發(fā)酵樣品，提及在這里確定的值作為以g/ml表示的干細胞重量。再次一式三份分析所有樣品，并且所提及的值是三次重復的平均值。

1.5葡萄糖量化

使用ysi生物化學分析儀測量在每個樣品中存在的葡萄糖濃度。早期樣品需要應用在x10區(qū)域內的稀釋因數，從而將葡萄糖濃度降低至生物化學分析儀能夠重復量化的水平。在酵母菌屬發(fā)酵期間，可以直接分析稍后的樣品，而不需要進行任何稀釋步驟。

1.6乙醇量化

使用高效液相色譜(hplc)法實現(xiàn)在樣品中的乙醇的量化。使用rezexroa-h⁺有機酸色譜柱和0.005n硫酸流動相以1ml/分鐘的流量實現(xiàn)分離。借助折射率檢測器進行檢測。

1.7搖瓶培養(yǎng)

在含有200ml或40ml培養(yǎng)基(mypg或具有vogel鹽的小麥水解產物)的500ml或100ml錐形瓶中進行搖瓶培養(yǎng)物培養(yǎng)。在針對f.venenatum培養(yǎng)物設定為150rpm和28℃和針對釀酒酵母培養(yǎng)物設定為30℃和250rpm的垂直振動器上將燒瓶溫育。

1.8生物反應器分批培養(yǎng)

1.8.1f.venenatum分批培養(yǎng)

在下面描述的兩個不同發(fā)酵系統(tǒng)中進行真菌蛋白分批發(fā)酵。發(fā)酵溫度是28℃并且用2m氫氧化鈉將ph控制為6。為了0％的o2值用不含氧的氮氣校準do探針并且用壓縮空氣進行斜率校準。在發(fā)酵條件下進行探針校準。接種物，在垂直振動器上在28℃和150rpm下生長的72小時搖瓶培養(yǎng)物，占最終發(fā)酵體積的10％v/v。用于發(fā)酵的培養(yǎng)基是mediumn(vogel1956)或補充有vogel鹽的小麥水解產物。在使用小麥水解產物作為發(fā)酵培養(yǎng)基的情況中，無論何時需要，均使用油菜籽油作為消泡劑。

1.8.1.1applikon

該發(fā)酵系統(tǒng)的硼硅酸鹽容器具有2l的總容量并且在1.5l的工作容量下以2:1的高度與直徑的比率進行發(fā)酵。發(fā)酵罐配備有四個可移除擋板和兩個六刃rushton葉輪，由頂部applikonp100電動機驅動。通過經由位于葉輪下方的環(huán)形噴頭噴射過濾空氣來釋放曝氣。用mettlertoledoph探針測量ph，并且為了確定溶解氧，使用mettlertoledodo探針。使用applikon加熱套管加熱發(fā)酵罐。系統(tǒng)還配備有溫度探針和冷凝器以防止蒸發(fā)。將applikonbio-consoleadi1035單元與applikonbio-controladi1031控制單元組合使用以控制參數。與該發(fā)酵系統(tǒng)一起使用的攪拌是600rpm。

1.8.2乙醇發(fā)酵

在以下詳細描述的兩個不同發(fā)酵系統(tǒng)中進行乙醇發(fā)酵。所使用的攪拌是500rpm并且將溫度控制在30℃。在發(fā)酵條件下進行po2探針校準。通過用不含氧的氮氣曝氣來設定0％的o2值并且用壓縮空氣校準探針的斜率。用2m硫酸和25％v/v氨將ph控制為5.5的值。在8和18小時的發(fā)酵時間之間，僅以0.82vvm將發(fā)酵培養(yǎng)基曝氣。接種物，24小時搖瓶培養(yǎng)物(30℃，250rpm)，占最終發(fā)酵體積的5％v/v。為了在發(fā)酵期間控制發(fā)泡，根據需要加入ppg。

1.8.2.1具有dcu3(b.braunbiotech)的biostatc(c15-3)

不銹鋼發(fā)酵罐具有22l的總容量和允許加熱或冷卻發(fā)酵罐的雙壁。其是側壁觀察窗口并且配備有四個擋板以及在環(huán)形噴頭上方的三個六刃rushton葉輪。po2探針以及ph探針來自mettlertoledo。高度與直徑的比率是3:1，其中直徑為21cm并且高度為57cm。dcu-3單元允許對發(fā)酵進行控制和監(jiān)測。在酸和堿泵的幫助下控制ph。此外，系統(tǒng)配備有根據需

要使用的消泡泵。

1.8.2.2dasgip(eppendorf)

發(fā)酵系統(tǒng)允許進行四個平行發(fā)酵，其可以被獨立地控制。平底發(fā)酵罐容器具有9cm的直徑和24cm的高度，其等于3:1的高度與直徑的比率。容器具有400-1500ml的工作容量。頂部驅動器攪動兩個六刃rushton葉輪。通過將空氣經由l噴頭泵送通過無菌過濾器實現(xiàn)曝氣。系統(tǒng)完全配備有加熱容器的主單元、酸和堿泵、ph和po2檢測單元、溫度檢測器、尾氣分析、和攪拌控制。

結果

1.9小麥培養(yǎng)基

按照所概述的操作(1.3)得到用于該發(fā)酵的小麥培養(yǎng)基。這種特別的培養(yǎng)基制備使用溶解于2l蒸餾水中的具有146g小麥面粉的加載量的“rcs”鑒定的批次的小麥。在該過程中使用1.46g的α淀粉酶和1.5g的葡糖淀粉酶的酶加載量。

在表1中列出了在培養(yǎng)基制備中的各種階段使用ysi生物化學分析儀測量的葡萄糖濃度。

表1-在小麥培養(yǎng)基的酶處理期間的各種階段的葡萄糖濃度。

進行以下實驗以支持本發(fā)明。

表2-支持本發(fā)明的實驗。

1.10實驗1

1.10.1目標&目的

這個實驗的目的是研究使用于使用碳水化合物給料(小麥水解產物)的真菌蛋白制備的f.venenatum生長的可行性。

1.10.2實驗條件

首先在小麥水解產物中并且之后在葡萄糖中(兩種培養(yǎng)基均補充有vogel鹽)使f.venenatum的搖瓶培養(yǎng)物生長以比較在兩種不同培養(yǎng)基中的生長曲線。一式三份完成并且分析搖瓶。在72小時之后選取樣品并且分析生物質和葡萄糖含量(9)。

用于真菌蛋白發(fā)酵的發(fā)酵設置是：以1slpm曝氣并且將攪拌器速度設定為1000rpm。將溫度維持在28℃，將ph設定為6并且用最終發(fā)酵體積的10％v/v的72h搖瓶培養(yǎng)物接種發(fā)酵罐。用于發(fā)酵的小麥水解產物補充有vogel鹽。第一發(fā)酵揭示了在發(fā)酵開始時強烈的泡沫積累的問題。這導致了泡沫中生物質的累積，并且總之僅在發(fā)酵培養(yǎng)基的頂部生長，而不是在溶液中。據推測發(fā)泡由小麥水解產物中的蛋白質導致，并且因為在之前的發(fā)酵中使用的最低vogel培養(yǎng)基不含有蛋白質，在之前的分批發(fā)酵中發(fā)泡不是問題，并且此外在當前使用的工業(yè)過程中也未帶來問題。

為了克服該問題，使用油菜籽油作為消泡劑。選擇油菜籽油，因為其可以在食品級產物中使用并且將會是經濟的溶液。其也可以被鐮刀菌屬用作碳源，這將會引起較高的收率，并且因為發(fā)泡僅在過程開始時是明顯的問題，在稍后的時間點這將不會是問題。

因為單獨使用油菜籽油作為消泡劑不能克服接種物在發(fā)酵罐中的液面的頂部上累積的問題，使用曝氣和攪拌特征。詳細地，這意味著，在1.5小時的時間進程期間緩慢地提高攪拌和曝氣。所使用的攪拌和曝氣速率在以下表中示出。

表3-使用小麥水解產物的f.venenatum的分批發(fā)酵的攪拌和曝氣特征。描繪了提高參數時的時間點。

1.10.3結果

通過使用該特征，進行了成功的分批發(fā)酵，其可以在10中看到。在該發(fā)酵中的最大達到的生物質是8.97g/l，考慮到49.46g/l的起始葡萄糖濃度，其得到18.1％的收率。這個達到的收率僅為在使用最低vogel培養(yǎng)基的分批發(fā)酵中達到的收率的一半。這很可能是由于嚴重限制生長的在發(fā)酵開始時的強烈的氧限制。溶解氧在發(fā)酵開始時迅速降低，因為曝氣和攪拌在開始時非常低，這對于向發(fā)酵培養(yǎng)基中的氧傳遞來說是不利的(數據未示出)。通過改善氧供給，可以達到較高的真菌蛋白收率，同時在發(fā)酵期間還制備了9.98g/l乙醇作為副產物。未預期在該發(fā)酵期間這樣的高水平的乙醇的制備，并且將會完成進一步的實驗以研究培養(yǎng)條件對通過f.venenatum共同制備乙醇和真菌蛋白的影響(章節(jié)1.13)。

1.10.3.1在部分水解的培養(yǎng)基(未使用酶)中的f.venenatum生長

由于關于工藝的經濟效益和購買水解酶的高成本和歸因于加熱/冷卻步驟和ph調整的水解過程的高成本的因素，考慮使用僅在水中溶解的小麥面粉或僅通過進行液化步驟部分水解的小麥。為了研究這將會對鐮刀菌屬菌株的生長具有什么影響，使鐮刀菌屬在搖瓶中在補充有vogel鹽的不同水解產物中生長。為此目的，將70g/l小麥面粉溶解在90℃水中，并且之后在一個樣品中僅用0.5％w/wα淀粉酶進行液化步驟并且在另一個樣品中進行額外使用1％w/w葡糖淀粉酶的液化和糖化步驟二者。第三個樣品不含有任何酶。用hplc分析三個培養(yǎng)基并且將其用于搖瓶實驗。

不同的水解產物的hplc分析顯示，只有經歷了液化和糖化步驟二者的水解產物含有葡萄糖并且70g/l小麥面粉得到48g/l葡萄糖。在含有補充有vogel鹽的200ml培養(yǎng)基的500ml搖瓶中一式三份進行實驗，并且在24、48和72小時之后選取樣品并且一式三份進行分析。

這個實驗的結果顯示，f.venenatum可以在僅由加入了vogel鹽的小麥水解產物組成的培養(yǎng)基中等同良好地生長(11)。因此推斷，其使用溶液中的淀粉作為碳源。完全水解的培養(yǎng)基中生長稍快，據推測其由對在鐮刀菌屬中制備淀粉酶以使用淀粉作為能量來源的需求引起。hplc數據(未示出)表明，即使在不具有任何酶的培養(yǎng)基中也存在二糖，其可以在溫育開始時使用并且這可能是為何在前24小時中不能觀察到生長的差異的原因。在72小時之后，在所有瓶中的生物質為大約7g/l干燥生物質，并且沒有值得注意的差異。

1.11實驗2

1.11.1目標&目的

為了表明真菌蛋白發(fā)酵和乙醇發(fā)酵的過程的綜合是可能的，進行初步實驗以證實釀酒酵母在小麥水解產物中生長(章節(jié)1.10.3.1)。還在真菌蛋白發(fā)酵的濾液中使酵母生長，以觀察是否存在生長并且確定f.venenatum是否產生抑制釀酒酵母的生長的任何物質(章節(jié)1.11.3.2)。

1.11.2實驗條件

1.11.3結果

1.11.3.1釀酒酵母在小麥水解產物中的生長

進行搖瓶實驗。為此目的，將100ml搖瓶用40ml培養(yǎng)基填充并且在250rpm和30℃下生長24h。一式三份使瓶生長并且進行分析。在2中描繪了od和干燥生物質測定的結果。

該實驗的結果顯示，釀酒酵母在補充有vogel鹽的水解的小麥中等同良好地生長并且因此過程的綜合是可能的?？梢酝茰y，小麥水解產物含有蛋白質和釀酒酵母生長所需的其他營養(yǎng)物質，因為僅含有葡萄糖和vogel鹽的培養(yǎng)基不能促進相同的生長。

1.11.3.2使用小麥水解產物的釀酒酵母的分批發(fā)酵

為了表明兩個發(fā)酵過程的綜合是可能的，進行使用小麥水解產物的釀酒酵母的發(fā)酵。所使用的發(fā)酵系統(tǒng)是dasgip(eppendorf)，其允許同時進行四個發(fā)酵。使用mypg進行兩個發(fā)酵作為對照，并且使用補充有vogel鹽的小麥水解產物(35g/l面粉、0.5％w/wα淀粉酶、1％w/w葡糖淀粉酶)進行兩個發(fā)酵。工作容量是800ml并且進行發(fā)酵24小時，而僅在發(fā)酵時間的8至18小時之間存在0.82vvm的曝氣。通過測量光密度和測定干燥生物質來監(jiān)測酵母的生長。

在發(fā)酵的時間進程期間，所有四個發(fā)酵的光密度趨勢和干燥生物質趨勢二者未顯示出明顯的差異，2和3。

樣品的hplc分析得到以下初始葡萄糖濃度和最終乙醇濃度的值。此外，計算葡萄糖向乙醇的轉化的收率。使用wh的發(fā)酵的收率稍高，但是通常，兩個發(fā)酵的趨勢是相似的。

表4：在釀酒酵母發(fā)酵開始時的葡萄糖濃度和最大乙醇濃度的分析。計算葡萄糖向乙醇的轉化的收率。

1.12實驗3

1.12.1目標&目的

這個實驗的目的是證明用于使用過期飼料級小麥作為生長培養(yǎng)基制備真菌蛋白(f.venenatum)和乙醇(使用釀酒酵母)的綜合生物方法的可行性。之前進行的實驗已經表明，可以在水解的小麥培養(yǎng)基上成功地使鐮刀菌屬和酵母菌屬二者生長(章節(jié)1.10和1.11)。這個實驗建立于這些發(fā)現(xiàn)之上，試圖使鐮刀菌屬生長至獲得足夠的生物質同時葡萄糖仍然存在于系統(tǒng)中以被釀酒酵母進一步利用的程度。

1.12.2實驗條件

1.12.2.1發(fā)酵過程

在表5中詳述了實驗條件。

表5-實驗3的實驗條件。

1.12.3取樣&結果

在接種后以及在整個發(fā)酵過程中的各個時間點立刻移除培養(yǎng)基的樣品。

使用ysi生物化學分析儀(1.5)針對所收集的樣品中的每一個估算葡萄糖濃度以及每種生物的生物質水平(1.4)。因為一式三份對其進行分析，報告的值是三次重復的平均值(5和圖16)。

使用hplc法(1.6)實現(xiàn)樣品中的乙醇量化并且還在6中詳述了結果。

1.12.4討論

這個實驗證明了將兩個目標發(fā)酵過程綜合的能力。第一階段證明了使f.venenatum生長至在10g/l的區(qū)域內的生物質水平的能力。之后收獲該生物質并且將仍然含有在20g/l的區(qū)域內的葡萄糖的培養(yǎng)基再次滅菌。該培養(yǎng)基之后用釀酒酵母接種并且隨后實現(xiàn)該生物的生長。在大約16小時的時間段之后，使培養(yǎng)物氧匱乏以促進乙醇的制備。繼續(xù)發(fā)酵，直到達到大約四十小時的總發(fā)酵時間，在各個時間點選取樣品以用于使用先進的hplc法的乙醇量化(1.6)。

在fusariumvenentaum的發(fā)酵期間未檢測到乙醇(數據未示出)。在接種和釀酒酵母的初期生長之后，在樣品中注意到乙醇(大約5g/l)，6。

這說明了使用過期飼料級小麥作為生長培養(yǎng)基的綜合兩個生物方法——用于真菌蛋白制備的fusariumvenenantum發(fā)酵以及隨后的釀酒酵母發(fā)酵和乙醇制備的途徑的可行性。應當進行方法的優(yōu)化以通過發(fā)酵制備最大收率的真菌蛋白和乙醇，從而提高總體過程效率。

1.12.5結論

結果已經證明，用于制備所需產物的兩個生物方法的綜合是可能的。

1.13實驗4

在嘗試證明用于使用過期飼料級小麥作為生長培養(yǎng)基用fusariumvenenatum制備真菌蛋白(作為食物)和乙醇(作為燃料)的生物方法的可行性中，進行多個發(fā)酵。

1.13.1目標&目的

該實驗的目的是證明將fusariumvenenatum用于使用水解的飼料級小麥作為底物制備真菌蛋白和乙醇二者的生物方法的可行性。

在進行之前，實驗已經表明，取決于所使用的曝氣曲線，fusariumvenenatum產生生物質或乙醇。為此目的，使用三個不同的曝氣曲線，從而確定生物質和乙醇制備的差異。使用利用vogel培養(yǎng)基(vm)的對照發(fā)酵并且在整個發(fā)酵過程中對其進行曝氣。

用無氧限制的相同級聯(lián)對所有四個發(fā)酵的發(fā)酵時間的前20小時進行曝氣。在20小時之后，對發(fā)酵一(vm1)和二(wh2)進一步曝氣，而在20小時的發(fā)酵之后通過將曝氣設定為0.1vvm來對發(fā)酵三(wh3)進行氧限制。對于發(fā)酵四(wh4)來說，關閉曝氣，這導致氧匱乏(oxygenstarvation)。在表6中描繪了所應用的條件。

表6-用于研究氧限制的影響的每個發(fā)酵條件的概述。

1.13.2實驗條件

根據1.3制備在發(fā)酵二、三和四中使用的小麥水解產物。

1.13.3取樣&結果

在接種前和剛接種后選取培養(yǎng)基的樣品。之后在整個發(fā)酵過程中每天兩次選取樣品。記錄樣品的詳情、它們的時間和各個監(jiān)測的工藝參數。

使用ysi生物化學分析儀(1.5)針對所收集的樣品中的每一個估算葡萄糖濃度以及每種生物的生物質水平(1.4)。因為一式三份對其進行分析，報告的值是三次重復的平均值。使用1.6中描述的hplc法實現(xiàn)樣品中的乙醇量化。

1.13.3.1發(fā)酵1

在對fusariumvenenatum無氧限制的情況下進行發(fā)酵一。使用該發(fā)酵作為對照，由于該原因，使用具有葡萄糖作為碳源的vogel培養(yǎng)基代替小麥水解產物作為發(fā)酵培養(yǎng)基。其目的是比較不同培養(yǎng)基之間的生長并且確定可能的差異。預期在發(fā)酵中在無氧限制的情況下得到更多的生物質并且未檢測到大量的乙醇。

1.13.3.1.1實驗條件

在表7中概述了用于該發(fā)酵過程的實驗參數。該發(fā)酵充當對照并且與發(fā)酵二進行比較。

表7-發(fā)酵一的實驗條件。

1.13.3.1.2結果

在發(fā)酵一中，在其中達到22g/l干燥生物質的水平的發(fā)酵的前20小時中制備大多數生物質。在96小時之后，當存在25g/l干燥生物質時，在發(fā)酵的最后達到最大干燥生物質。在整個發(fā)酵過程中未檢測到乙醇。在20小時之后，對于鐮刀菌屬，僅可獲得最初43.5g/l的0.4g/l的葡萄糖?？梢栽?、8和9中看到干燥生物質、乙醇和葡萄糖水平的趨勢。

1.13.3.1.3結論

如預期的，在該發(fā)酵中未產生乙醇，而其得到25g/l的大量的生物質?？梢酝ㄟ^將底物進料至發(fā)酵罐中并且收獲生物質來增加生物質制備。隨著增加生物質，可以觀察到增加的粘度，這阻止了混合和氧傳遞。因此，收獲生物質可以有益于生物質的制備。

1.13.3.2發(fā)酵2

在發(fā)酵二中使用的底物補充有vogel鹽的小麥水解產物，其也在發(fā)酵三(1.13.3.3)和四(1.13.3.4)中使用。其在整個發(fā)酵過程中不是氧限制的。將該發(fā)酵與發(fā)酵一進行比較，從而得到關于所使用的培養(yǎng)基之間收率差異的結論。與使用vogel培養(yǎng)基的發(fā)酵一相比，預期從該發(fā)酵中得到相近的結果。

1.13.3.2.1發(fā)酵過程

在發(fā)酵二中，使用小麥水解產物作為發(fā)酵培養(yǎng)基。將溶解氧的設定點設定為30％。在表8中詳述了另外的實驗條件。

表8-發(fā)酵二的實驗條件。

1.13.3.2.2結果

在7、8和9中示出了使用小麥水解產物和無氧限制的發(fā)酵的干燥生物質、乙醇和葡萄糖趨勢。盡管在27小時之后葡萄糖水平達到0.13g/l，在44小時之后達到21g/l的最大干燥生物質濃度。乙醇僅在20小時之后存在，但是之后可以用作碳源，并且在發(fā)酵的另外過程中不能檢測到乙醇。

1.13.3.2.3結論

該發(fā)酵得到與第一發(fā)酵近似相同的生物質水平。最初葡萄糖水平較低，這解釋了所達到的生物質水平的差異。此外，除20小時的樣品外，在整個發(fā)酵中未檢測到乙醇。

1.13.3.3發(fā)酵3

在發(fā)酵三中，研究了氧限制對乙醇制備的影響。將結果與之前的發(fā)酵進行比較，尤其是與具有氧匱乏條件的發(fā)酵(發(fā)酵四)進行比較。應當提供針對氧的存在對乙醇制備的影響的進一步的認識。

1.13.3.3.1實驗條件

在表9中詳述了實驗條件。使用補充有vogel鹽的小麥水解產物作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并且在20小時階段的無氧限制之后，將曝氣設定為0.1vvm，從而氧限制條件。

表9-發(fā)酵三的實驗條件。

1.13.3.3.2結果

在發(fā)酵三中，起始葡萄糖濃度是34.5g/l并且在27小時之后葡萄糖從發(fā)酵培養(yǎng)基中耗盡。與在具有在75小時的發(fā)酵時間之后檢測到的11g/l的最大值的在無氧限制下的發(fā)酵(發(fā)酵1和2)中相比，所制備的生物質低得多。在44小時之后乙醇制備達到其最高值4.8g/l?？梢栽?、8和9中看到在整個發(fā)酵過程中的底物和產物的趨勢。

1.13.3.3.3結論

在發(fā)酵三中(在氧限制條件下)，在前24h期間在氧限制條件下制備主要量的乙醇。在發(fā)酵的稍后階段期間，乙醇濃度降低，說明其被生物用作碳源。

1.13.3.4發(fā)酵4

在發(fā)酵四中，研究了在20小時的最初生長階段之后生物的多大的氧匱乏將會影響所制備的乙醇的量。預期在氧匱乏階段期間得到較低水平的生物質，但是得到乙醇制備的大幅增加。

1.13.3.4.1實驗條件

在表10中詳述了用于發(fā)酵四的實驗條件。使用小麥水解產物作為發(fā)酵培養(yǎng)基，并且在20小時的無氧限制之后，將曝氣設定為0vvm，從而使鐮刀菌屬氧匱乏。

表10-發(fā)酵四的實驗條件。

1.13.3.4.2結果

在整個發(fā)酵過程中以常規(guī)間隔選取樣品。發(fā)酵四具有32.5g/l的起始葡萄糖濃度并且在27小時之后耗盡。干燥生物質也在27小時之后到達峰值(10g/l)。乙醇濃度在發(fā)酵的最后處于其最高值并且達到11.7g/l。在7、8和9中描繪了所確定的參數的詳細情況。

1.13.3.4.3結論

來自該發(fā)酵的結果表明，氧匱乏對乙醇制備是有利的。在將曝氣關閉之后，生物質不再增加而是降低，直到發(fā)酵結束。盡管生物質濃度降低，乙醇在發(fā)酵的匱乏階段期間繼續(xù)增加并且在過程最后達到其最高水平。葡萄糖在27小時之后耗盡，可能的是，在小麥水解產物中存在的其他低聚糖用于乙醇的制備。

1.13.3.5實驗4結論

為了理解不同的曝氣曲線對生物質和乙醇制備的影響，對發(fā)酵的工藝參數進行比較。在7中可以看到，非常清楚，氧限制和氧匱乏的發(fā)酵比未氧限制的發(fā)酵制備明顯較少的干燥生物質。然而，在小麥水解產物發(fā)酵的曝氣階段期間(前20h)，生長速率近似相同(0.34g/l.h)，顯示出過程的再現(xiàn)性。

此外，研究了在不同發(fā)酵中的第二產物乙醇的制備。在這些發(fā)酵中，觀察到，氧匱乏導致明顯增加的乙醇制備(8)，這與在其他發(fā)酵中達到的乙醇水平明顯不同。在20小時之后，使用小麥水解產物進行的所有發(fā)酵(發(fā)酵2-4)顯示出相同量的乙醇，這與使用vogel培養(yǎng)基進行的發(fā)酵(發(fā)酵1)不同。只有氧匱乏的發(fā)酵在發(fā)酵最后在發(fā)酵培養(yǎng)基中顯示出乙醇。

在8中，描繪了在整個發(fā)酵過程中的葡萄糖濃度。在小麥水解產物中的起始葡萄糖濃度比在vogel培養(yǎng)基中稍低，然而在所有發(fā)酵中的消耗率是大約0.40g/l*h。在曝氣階段期間(表11)和在整個過程時間期間(表12)計算基于葡萄糖的生物質和乙醇收率，從而獲得較好的發(fā)酵的比較。

表11-在用于將葡萄糖轉化為生物質和乙醇的發(fā)酵的曝氣階段(前20h)期間的過程收率，以及生物質和乙醇生產率。

縮寫：vm1：vogel培養(yǎng)基，無氧限制；wh2：小麥水解產物，無氧限制；wh3：小麥水解產物，氧限制；wh4：小麥水解產物，氧匱乏。ydcw/glc：基于葡萄糖的生物質收率，yetoh/glc：基于葡萄糖的乙醇收率，pdcw：生物質生產率，petoh：乙醇生產率

如預期的，在曝氣階段期間，與在使用小麥水解產物的發(fā)酵(發(fā)酵二-四)中相比，發(fā)酵一(vm1)顯示出基于葡萄糖的較高的生物質的轉化。生物質生產率在vogel培養(yǎng)基(發(fā)酵一，vm1)中也高3倍，說明葡萄糖在確定成分培養(yǎng)基(vm)中更高效率地轉化為生物質。然而，即使在過程的該階段期間，也有利于在小麥水解產物培養(yǎng)基(發(fā)酵二-四)中的乙醇制備。

在表12中可以看到，盡管在發(fā)酵二期間的生物質水平比在發(fā)酵一中低，葡萄糖向生物質的轉化的總體產率是相似的(～50％)。此外，葡萄糖向乙醇的最高轉化和最高乙醇生產率在氧匱乏條件下(wh4)。這意味著，與生物質制備(在無氧限制條件下最高)相比，這些條件有利于乙醇制備。

表12-葡萄糖向生物質和乙醇轉化的總過程收率，以及生物質和乙醇生產率(總體過程時間96h)。

縮寫：vm1：vogel培養(yǎng)基，無氧限制；wh2：小麥水解產物，無氧限制；wh3：小麥水解產物，氧限制；wh4：小麥水解產物，氧匱乏。ydcw/glc：基于葡萄糖的生物質收率，yetoh/glc：基于葡萄糖的乙醇收率，pdcw：生物質生產率，petoh：乙醇生產率

連同監(jiān)測底物和產物濃度，監(jiān)測另外的工藝參數。在中描繪了溶解氧濃度，其提供對發(fā)酵培養(yǎng)基中氧水平的認識。在20小時之后，當降低曝氣時，對發(fā)酵三和四進行氧限制。

1.13.3.6結論

在該報告中所示的結果證明，使用fusariumvenenatum由飼料級小麥水解產物制備生物質以及乙醇的假設是可行的。此外，還第一次證明了，過程控制(即，操控曝氣條件)有利于生物質制備(無氧限制條件)或乙醇制備(氧匱乏條件)。在可以使生物氧匱乏并且因此可以開始乙醇的發(fā)酵之前，可以以曝氣存在足夠長以獲得足夠生物質濃度的方式進行過程優(yōu)化。

具有氧匱乏條件的過程對高乙醇收率來說似乎是優(yōu)選的。即使在非常低的生物質水平的情況下，也可以在不存在氧的情況下(發(fā)酵四)制備(并且有利于)大量的乙醇?？梢栽谝掖贾苽潆A段開始之前(過程的前20h)收獲大量生物質。因此，通過操控工藝條件，可以調節(jié)該方法，從而得到所需產物。

使用單一生物用于制備兩種產物(生物質和乙醇)具有巨大經濟優(yōu)勢和下游處理優(yōu)勢?？梢愿鶕婢鞍?生物質)或乙醇的需求通過使曝氣階段延長或縮短來調整制造方法?？梢酝ㄟ^收獲生物質并且向發(fā)酵中進料更多的小麥水解產物來進一步改善該方法。在不需要曝氣的情況下制備乙醇將會大幅降低制備成本并且因此將會影響總體工藝經濟效益。

參考文獻

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