發(fā)明領(lǐng)域

本文提供使用具有光敏封閉基團(tuán)的可檢測地標(biāo)記的鏈終止核苷酸和光斷裂光的脈沖，在多個孔中用于核酸通過合成測序的系統(tǒng)和方法。在某些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)和方法提供多個包含初始去封閉時段，接著掃描光時段的去封閉-掃描循環(huán)，其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：1)去封閉時段短于掃描時段；2)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中，使作為引物的一部分的光敏基團(tuán)去封閉；或3)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。這樣較短的去封閉時段有助于防止在掃描之前添加一個以上的核苷酸至引物(例如，提高準(zhǔn)確度)。

背景

在用具有光敏封閉基團(tuán)的可檢測地標(biāo)記的核苷酸的通過合成測序中，完全去封閉所需的時段是相對長的，而核苷酸摻入的時段是相對快速的。由于相對長的去封閉時間，另外的核苷酸在它們可被掃描和檢測之前可被摻入到引物序列的末端。因此，測序反應(yīng)的準(zhǔn)確度可能受到損害。

發(fā)明簡述

本文提供使用具有光敏封閉基團(tuán)的可檢測地標(biāo)記的鏈終止核苷酸和光斷裂光的脈沖，在多個孔中用于核酸通過合成測序的系統(tǒng)和方法。在某些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)和方法提供多個包含初始去封閉時段，接著掃描光時段的去封閉-掃描循環(huán)，其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：1)去封閉時段短于掃描時段；2)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中，使作為引物的一部分的光敏基團(tuán)去封閉；或3)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。這樣較短的去封閉時段，在一些實(shí)施方案中，有助于防止在掃描之前添加一個以上的核苷酸至引物(例如，提高準(zhǔn)確度)。

在一些實(shí)施方案中，本文提供用于光斷裂和掃描核苷酸類似物的系統(tǒng)，其包含：a)包含多個孔的基層，其各自包含，或被配置以包含，包含模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)第一可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和b)光系統(tǒng)組件，所述組件包含：i)與多個孔光通信的光源，其被配置以提供：a)光斷裂光輸入，其當(dāng)光敏封閉基團(tuán)是引物的一部分時裂解光敏封閉基團(tuán)；和b)掃描輸入光，其在第一核苷酸類似物通過聚合酶加入到引物后，提供來自第一可檢測的部分的光學(xué)信號；和ii)光控制組件，其激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，其中每個去封閉-掃描循環(huán)包含初始去封閉時段，其中至少部分的光斷裂光輸入被傳輸?shù)蕉鄠€孔，和隨后的掃描時段，其中至少部分的掃描光輸入被傳輸?shù)蕉鄠€孔，且其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：a)去封閉時段短于掃描時段；b)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中，使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和c)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。

在某些實(shí)施方案中，本文提供包含光組件的系統(tǒng)，其中光組件被配置與基層組件光學(xué)接口，其中基層組件包含多個孔，其中各孔包含，或被配置以包含含有模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和其中光組件包含：a)與多個孔光通信的光源，其提供：a)光斷裂光輸入，其在光敏封閉基團(tuán)是引物的一部分時裂解光敏封閉基團(tuán)；和b)掃描輸入光，其在第一核苷酸類似物通過聚合酶加入到引物后，從第一可檢測的部分產(chǎn)生光信號；和b)光控制組件，其激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，其中每個去封閉-掃描循環(huán)包含初始去封閉時段，其中至少部分的光斷裂光輸入被傳輸?shù)蕉鄠€孔，和隨后的掃描時段，其中至少部分的掃描光輸入被傳輸?shù)蕉鄠€孔，和其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：i)去封閉時段短于掃描時段；ii)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中，使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和iii)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。

在特定的實(shí)施方案中，本文提供使用系統(tǒng)來光斷裂和檢測核苷酸類似物的方法，所述系統(tǒng)包含：i)包含多個孔的基層，其中各孔包含含有模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)第一可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和ii)光系統(tǒng)組件，其包含：a)與多個孔光通信的光源，其中光源提供：i)光斷裂光輸入；和ii)掃描光輸入；b)光控制組件，其激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，所述循環(huán)包含：i)初始去封閉時段，其中至少部分的光斷裂光輸入被傳輸?shù)娇?，和ii)隨后的掃描時段，其中至少部分的掃描光輸入被傳輸?shù)娇?，iii)與多個光學(xué)傳感孔光通信的檢測器組件，其中該方法包括：和b)激活光控制組件以致光源組件提供多個去封閉-掃描循環(huán)，所述循環(huán)在光敏封閉基團(tuán)為引物的一部分時，在至少一些孔中使光敏封閉基團(tuán)去封閉，并在第一核苷酸類似物通過聚合酶加入到引物中后，在多個孔中從可檢測的部分生成光學(xué)信號，其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：a)去封閉時段短于掃描時段；b)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中，使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和c)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec；和c)用檢測器組件在多個孔中，從在多個去封閉-掃描循環(huán)的每一個期間生成的可檢測部分檢測光學(xué)信號。

在一些實(shí)施方案中，本文提供包含光組件的系統(tǒng)，其中光組件被配置與基層組件光學(xué)接口，其中基層組件包含多個孔(例如，光學(xué)傳感孔)，其中每個孔的大小適合提供內(nèi)部波導(dǎo)(例如，零模式波導(dǎo))和/或被光耦合至外部波導(dǎo)(例如，平面波導(dǎo))，其中各孔包含，或被配置以包含，含有模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和其中光組件包含：a)與內(nèi)部和/或外部波導(dǎo)光通信的光源，其中光源被配置以提供：a)光斷裂光輸入，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第一電磁波(例如，隱失波(evanescentwave))，其在光敏封閉基團(tuán)為引物的一部分時能夠裂解光敏封閉基團(tuán)；和b)掃描輸入光，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第二電磁波(例如，隱失波)，其在第一核苷酸類似物加入到引物后，能夠從可檢測的部分產(chǎn)生光學(xué)信號；和b)光控制組件，其被配置以激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，其中每個去封閉-掃描循環(huán)包含初始去封閉時段，其中光斷裂光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，和隨后的掃描時段，其中掃描光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，且其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：a)去封閉時段短于掃描時段；b)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個光學(xué)傳感孔中使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和c)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。

在某些實(shí)施方案中，本文提供用于光斷裂和掃描核苷酸類似物的系統(tǒng)，其包含：a)包含多個光學(xué)傳感孔的基層，其中每個光學(xué)傳感孔的大小適合提供內(nèi)部波導(dǎo)和/或被光耦合至外部波導(dǎo)，其中每個光學(xué)傳感孔包含，或被配置以包含含有模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)第一可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和b)光系統(tǒng)組件，其包含：i)與內(nèi)部和/或外部波導(dǎo)光通信的光源，其中光源被配置以提供：a)光斷裂光輸入，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第一電磁波(例如，隱失波)，第一電磁波在光敏封閉基團(tuán)是引物的一部分時，能夠裂解光敏封閉基團(tuán)；和b)掃描輸入光，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第二電磁波(例如，隱失波)，第二電磁波能夠在第一核苷酸類似物通過聚合酶加入到引物后，從第一可檢測的部分產(chǎn)生光學(xué)信號；和ii)光控制組件，其被配置以激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，其中每個去封閉-掃描循環(huán)包含初始去封閉時段，其中光斷裂光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，和隨后的掃描時段，其中掃描光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，和其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：a)去封閉時段短于掃描時段；b)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個光學(xué)傳感孔中，使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和c)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。

在特定的實(shí)施方案中，本文提供使用系統(tǒng)光斷裂和檢測核苷酸類似物的方法，所述系統(tǒng)包含：i)包含多個光學(xué)傳感孔的基層，其中每個光學(xué)傳感孔的大小適合提供內(nèi)部波導(dǎo)和/或被光耦合至外部波導(dǎo)，其中每個光學(xué)傳感孔包含含有模板核酸、聚合酶、雜交至模板的引物和第一核苷酸類似物的反應(yīng)混合物，其中引物包含具有終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)的3’末端核苷酸類似物，和其中第一核苷酸類似物包含：i)第一可檢測的部分，和ii)終止鏈延伸的光敏封閉基團(tuán)；和ii)光系統(tǒng)組件，其包含：a)與內(nèi)部和/或外部波導(dǎo)光通信的光源，其中光源提供：i)光斷裂光輸入，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第一電磁波；和ii)掃描輸入光，其在被傳輸?shù)絻?nèi)部或外部波導(dǎo)時，在光學(xué)傳感孔中生成第二電磁波；b)光控制組件，其被配置以激活光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)，所述循環(huán)包含：i)初始去封閉時段，其中光斷裂光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，和ii)隨后的掃描時段，其中掃描光輸入被傳輸?shù)絻?nèi)部和/或外部波導(dǎo)，iii)與多個光學(xué)傳感孔光通信的檢測器組件，其中該方法包括：激活光控制組件以致光源組件提供多個去封閉-掃描循環(huán)，所述循環(huán)在光敏封閉基團(tuán)為引物的一部分時，在至少一些光學(xué)傳感孔中使光敏封閉基團(tuán)去封閉，并在第一核苷酸類似物通過聚合酶加入到引物后，在多個光學(xué)傳感孔中，從可檢測的部分生成光學(xué)信號，其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：a)去封閉時段短于掃描時段；b)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個光學(xué)傳感孔中，使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉；和c)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec；和c)在多個光學(xué)傳感孔中，用檢測器組件從在多個去封閉-掃描循環(huán)的每一個期間生成的可檢測的部分檢測光學(xué)信號。

在特定的實(shí)施方案中，所述檢測提供在多個孔的至少一些中的至少部分模板核酸的序列信息(例如，5個堿基…10個堿基…或更多個堿基的身份；或模板的完全序列)。在某些實(shí)施方案中，光控制組件包含用戶界面，和其中激活由用戶通過用戶界面執(zhí)行。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，用戶界面包含計(jì)算機(jī)鍵盤和/或計(jì)算機(jī)鼠標(biāo)。在特定的實(shí)施方案中，所述方法無需任何洗滌步驟進(jìn)行(例如，在整個通過合成測序反應(yīng)期間，在孔中的單一反應(yīng)混合物)。

在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含c)與多個孔光通信的檢測器組件，其能夠從多個孔檢測光學(xué)信號。在某些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含濾波器，其中所述光學(xué)信號通過所述濾波器，然后用所述檢測器檢測。在某些實(shí)施方案中，光控制組件包含計(jì)算機(jī)處理器和嵌入計(jì)算機(jī)處理器中的計(jì)算機(jī)程序，其中計(jì)算機(jī)程序控制光源以致產(chǎn)生多個去封閉-掃描循環(huán)。

在特定的實(shí)施方案中，基層由選自以下的材料構(gòu)成：透明玻璃、透明塑料、氧化硅鈦、氧化鈦、氧化鉭、氧化鈮、氧化鉿、氧化鋁、氧化鋯、氮化硅、氮化鋁、氮化鈦、聚碳酸酯(pc)、pmma或su8。在其它實(shí)施方案中，多個孔包含至少5個孔(例如，至少5…25…100…250…500…1000…2000…4000…8000…50,000…或更多個孔)。

在特定的實(shí)施方案中，多個孔的大小適合提供內(nèi)部波導(dǎo)(例如，在所述孔底部的內(nèi)部波導(dǎo))。在某些實(shí)施方案中，多個孔的每一個包含零模式波導(dǎo)。在特定的實(shí)施方案中，系統(tǒng)還包含一個或多個外部波導(dǎo)(例如，對于多個光學(xué)傳感孔的每一個的外部波導(dǎo))。在特定的實(shí)施方案中，多個孔具有200納升和10仄升(zeptoliter)之間的容積。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多個孔被光耦合至外部波導(dǎo)。在另外的實(shí)施方案中，每個孔包含反應(yīng)混合物。

在某些實(shí)施方案中，在多個孔的每一個中的模板核酸是測序庫的一部分(例如，人類基因組測序庫)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)與作為第一核苷酸類似物的一部分的光敏封閉基團(tuán)相同或不同。在其它實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還包含第二核苷酸類似物(例如，第二類型的核苷酸類似物)，其包含光敏鎖定基團(tuán)和與第一可檢測的部分不同的第二可檢測的部分，其中第一和第二核苷酸類似物具有不同的堿基(例如，選自鳥嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤和胸腺嘧啶)。在其它實(shí)施方案中，聚合酶包含phi29聚合酶或其突變體。

在另外的實(shí)施方案中，第一可檢測的部分包含熒光染料。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，光敏封閉基團(tuán)選自：o-硝基芐基封閉基團(tuán)、硝基藜蘆基、1-芘基甲基、6-硝基藜蘆基氧基羰基、二甲基二甲氧基芐基氧基羰基、2-硝基芐基氧基羰基、5-溴-7-硝基二氫吲哚基、o-羥基-α-甲基-肉桂?；⒓谆?、6-硝基藜蘆基氧基羰基、甲基-6-硝基胡椒基氧基羰基，和2-氧基亞甲基蒽醌、二甲氧基芐基氧基羰基、5-溴-7-硝基二氫吲哚基、o-羥基-α-甲基肉桂酰基，和2-氧基亞甲基蒽醌(anthriquinone)。

在另外的實(shí)施方案中，光源包含被配置以生成光斷裂光輸入的第一光生成組件，和被配置以生成掃描光輸入的第二光生成組件。在其它實(shí)施方案中，光源包含被配置以交替生成光斷裂光輸入和掃描光輸入二者的光生成組件。在另外的實(shí)施方案中，光斷裂光輸入具有300nm和2000nm之間(例如，300nm…500nm…800nm…1200nm…1500nm…和2000nm)的波長。在其它實(shí)施方案中，掃描光輸入具有230nm和1000nm之間的波長(例如，230nm…450…680…850…和1000nm)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，光斷裂光輸入具有不同于掃描光輸入波長的波長。

在某些實(shí)施方案中，外部波導(dǎo)包含一個或多個平面波導(dǎo)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，多個孔被光耦合至外部波導(dǎo)，其中外部波導(dǎo)是與全部多個孔光通信的一個波導(dǎo)，或其中外部波導(dǎo)是與多個孔一一對應(yīng)的多個波導(dǎo)。

在另外的實(shí)施方案中，第一和/或第二電磁波包含隱失波或行場波(travelingfieldwave)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，光控制組件包含允許用戶激活光源的用戶界面。在另外的實(shí)施方案中，多個去封閉-掃描循環(huán)是至少5個去封閉-掃描循環(huán)(例如，至少5…10…15…25…100…1000或更多個)。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，去封閉時段短于掃描時段。在另外的實(shí)施方案中，去封閉時段比掃描時段短5%(例如，短5%…15%…25%…50%…68%…75%…90%…95%…或99%)。

在特定的實(shí)施方案中，去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，去封閉時段僅僅足夠長至在約7-12%，或約12-25%，或約25-55%的多個孔中使作為引物的一部分的光敏封閉基團(tuán)去封閉。在某些實(shí)施方案中，去封閉時段在15和150msec之間(例如，15…25…50…75…100…125…和150msec)和掃描時間是至少200msec(例如，至少200msec…500msec…750msec…1秒…1.5秒…2秒…5秒…10秒…或更長)。

附圖簡述

圖1顯示對于許多l(xiāng)asergendntp類似物的dt50(使50%的分子去封閉所需的時間)。

圖2顯示對于封閉的堿基((s)-叔丁基-5-甲氧基-2-硝基芐基dntp)的衰減曲線，t1/2為750msec。

圖3顯示，基于圖2中的曲線，需要4.6秒的去保護(hù)時間使98.5%的dntp去保護(hù)。

圖4顯示100msec的快速光脈沖，例如，可被用來消除假性堿基添加的問題。

圖5顯示，鑒于標(biāo)準(zhǔn)dna聚合酶在表面的延伸速率是大約5堿基/秒，預(yù)期在100msec脈沖后摻入的新堿基將是相對快速的。

圖6顯示去保護(hù)的動力學(xué)可自標(biāo)準(zhǔn)的衰減曲線推導(dǎo)，導(dǎo)致在該圖中所示的去保護(hù)率。

圖7顯示3個頻閃循環(huán)，在以下實(shí)施例1中描述的二項(xiàng)展開式模型中使用10⁶個分子。

圖8a-i模擬如在實(shí)施例1中描述的在表面上以10⁶個靶分子開始的35個頻閃循環(huán)。圖8a模擬循環(huán)0，其中在表面上有10⁶個分子等待去封閉。在循環(huán)1(在圖8b中顯示)，在表面上的10⁶個分子的8.8%將被去保護(hù)和延展(深黑色/藍(lán)色條)，而91.2%將保留封閉(淺色條)。圖8c顯示了5個循環(huán)，圖8d顯示了10個循環(huán)，圖8e顯示了15個循環(huán)，和圖8f顯示了20個循環(huán)。圖8f顯示一個正態(tài)分布開始出現(xiàn)。如圖8g(25個循環(huán))中所示，隨每個連續(xù)的循環(huán)，分布曲線正緩慢向右移動，而分布本身正慢慢遞減并變得更加分散。圖8h顯示30個循環(huán)后的分布。如在圖8i(35個循環(huán))中所示，正態(tài)分布繼續(xù)遞減和分散，很像在高拷貝數(shù)時的泊松分布(poissondistribution)。在圖8i中的35個循環(huán)代表約3分鐘的測序運(yùn)行時間。

圖9顯示延展循環(huán)數(shù)至400個循環(huán)(仍使用100msec頻閃的去封閉光)的結(jié)果，其中每條曲線代表10個頻閃循環(huán)后的分布。

圖10顯示使用50msec頻閃，延展循環(huán)數(shù)至400個循環(huán)的結(jié)果，其中4.4%的可利用的光敏堿基被去封閉。

圖11顯示如果50%的分子在100msec脈沖期間去封閉的期望分布(與8.8%對照)。每條曲線代表10個頻閃循環(huán)后的分布。

圖12顯示用于通過去保護(hù)光的短脈沖檢測均聚物的數(shù)學(xué)模型。

詳細(xì)描述

本文提供使用具有光敏封閉基團(tuán)的可檢測地標(biāo)記的鏈終止核苷酸和光斷裂光的脈沖，在多個孔中用于核酸通過合成測序的系統(tǒng)和方法。在某些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)和方法提供多個包含初始去封閉時段，接著光掃描時段的去封閉-掃描循環(huán)，其中在每個去封閉-掃描循環(huán)中，至少一個以下事件發(fā)生：1)去封閉時段短于掃描時段；2)去封閉時段僅僅足夠長至在不到所有的多個孔中使作為引物的一部分的光敏基團(tuán)去封閉；或3)去封閉時段是在25和150msec之間和掃描時間是至少200msec。這樣較短的去封閉時段有助于防止在掃描之前添加一個以上的核苷酸至引物(例如，提高準(zhǔn)確度)。

本說明書不限于與本文提供的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)一起使用的測序方法的類型。在某些實(shí)施方案中，使用通過合成測序方法。示例性測序方法在下文進(jìn)一步詳細(xì)描述。在某些實(shí)施方案中，本文描述的去封閉-掃描循環(huán)與采用零模式波導(dǎo)(例如，如由pacificbiosciences生產(chǎn))的測序方法一起使用。在示例性實(shí)施方案中，使用零模式波導(dǎo)zmwg和光-可去封閉的核苷酸的通過合成測序方法被用來使單一流體通過合成測序過程成為可能。使用zmwg，例如，以檢測在聚合酶的受體部位的可檢測地(例如，熒光)標(biāo)記的核苷酸和選擇性地去封閉這種核苷酸，同時不使在zmwg的照明區(qū)域外的反應(yīng)緩沖液中的核苷酸去封閉。這樣的方法允許單一分子通過合成測序。挑戰(zhàn)是去封閉(相對緩慢)和核苷酸摻入(相對快速)的時間域可能是與準(zhǔn)確測序不兼容的，因?yàn)轭~外的核苷酸可能在相對較長的去封閉步驟期間被摻入。

本說明書克服這樣的時限和準(zhǔn)確性的問題。例如，本文描述的去封閉-掃描循環(huán)將去封閉時間分散至脈沖，隨后讀數(shù)。例如，如果花費(fèi)5秒以有效地去封閉在聚合酶中的99%的核苷酸和200msec以摻入核苷酸，則脈沖(用光斷裂光)短暫的一段時間，例如，50msec，然后讀出堿基(使用掃描光和檢測器)。這樣，核苷酸序列的變化被檢出，而去封閉時間，例如，顯著地短于摻入時間。此外，在某些實(shí)施方案中，檢測仍等待接受下一個核苷酸的分子作為未標(biāo)記的核苷酸，以便能夠?qū)ν畚镄蛄袦?zhǔn)確測序。在這點(diǎn)上，本文描述的系統(tǒng)和方法在光去封閉和核苷酸摻入的時間域不相容時，允許單一流體(例如，無需洗滌)單一分子通過合成測序。

如上指明的，本說明書不限于可利用本文描述的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)的任何特定的測序技術(shù)。在某些實(shí)施方案中，通過合成測序方法利用波導(dǎo)(例如，平面、零模式波導(dǎo)等)。在某些實(shí)施方案中，這樣的方法在以下出版物中描述：美國專利號7,476,504；美國專利號8,747,751；專利公布號20110306143；和專利公布號20120156100；其全部通過引用以其整體結(jié)合到本文中。這4篇出版物(包括附圖和附圖說明)通過引用特別地結(jié)合到本文中，如同在本文中全面提出一樣。

此外，本說明書不限于可采用本文描述的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)的任何特定的測序技術(shù)。所用的一個實(shí)時單一分子測序系統(tǒng)是由pacificbiosciences開發(fā)的，其采用零模式波導(dǎo)(zeromodewaveguides)(zmw)，并描述于voelkerdingetal.,clinicalchem.,55:641-658,2009；macleanetal.,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號7,170,050；美國專利號7,302,146；美國專利號7,313,308；美國專利號7,476,503中；其全部通過引用結(jié)合到本文中。一般來說，這樣的方法利用直徑50-100nm的反應(yīng)孔并包含大約20仄升(10x10^-21l)的反應(yīng)體積。測序反應(yīng)使用固定化模板，修飾的phi29dna聚合酶，和高局部濃度的熒光標(biāo)記的dntp進(jìn)行。高局部濃度和連續(xù)的反應(yīng)條件允許通過熒光信號檢測，使用激光激發(fā)、光學(xué)波導(dǎo)和ccd相機(jī)，實(shí)時捕獲摻入事件。采用這種技術(shù)，dna測序一般在smrt芯片上進(jìn)行，各自包含數(shù)千個零模式波導(dǎo)(zmw)。zmw是直徑數(shù)十納米的洞/孔，在沉積于二氧化硅基層上的100nm的金屬薄膜中制作。每個zmw成為提供僅僅20仄升(10^-21升)的檢測體積的納米光子可視化室。以這樣的體積，單一分子的活性在數(shù)以千計(jì)的標(biāo)記的核苷酸的背景中被檢出。當(dāng)進(jìn)行通過合成測序時，zmw提供觀察dna聚合酶的窗口。在每個室內(nèi)，單一dna聚合酶分子附著于底面，以致它永久駐留在檢測體積內(nèi)。磷酸連接的核苷酸(將用本文描述的系統(tǒng)和方法中的光敏封閉基團(tuán)封閉)，每種類型用不同顏色的熒光團(tuán)標(biāo)記，然后以高濃度引入反應(yīng)溶液，其提高酶速度、準(zhǔn)確度和持續(xù)合成能力。由于小尺寸的zmw，即使在這些高的、生物相關(guān)的濃度下，檢測體積僅僅在很少部分的時間由核苷酸占據(jù)。此外，對檢測體積的訪問是快速的，僅持續(xù)數(shù)微秒，因?yàn)閿U(kuò)散必須攜帶核苷酸的距離非常小。結(jié)果是非常低的背景。

可適合于采用本文提供的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)的其它方法和系統(tǒng)描述于，例如，美國專利號7,405,281，題目為"熒光核苷酸類似物及其應(yīng)用(fluorescentnucleotideanalogsandusestherefor)"；7,315,019，題目為"光學(xué)限制陣列及其應(yīng)用(arraysofopticalconfinementsandusesthereof)"；7,313,308，題目為"分子的光學(xué)分析(opticalanalysisofmolecules)"；7,302,146，題目為"用于分子分析的儀器和方法(apparatusandmethodforanalysisofmolecules)"，和7,170,050，題目為"用于分子光學(xué)分析的儀器和方法(apparatusandmethodforopticalanalysisofmolecules)"；美國專利公布號20080212960，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20080206764，題目為"用于單一分子檢測的flowcell系統(tǒng)(flowcellsystemforsinglemoleculedetection)",20080199932，題目為"活性表面偶聯(lián)的聚合酶(activesurfacecoupledpolymerases)"；20080199874，題目為"微小環(huán)狀dna的可控制的鏈斷開(controllablestrandscissionofminicircledna)"；20080176769，題目為"其上布置有局部化分子的物品及其生產(chǎn)方法(articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)"；20080176316，題目為"減輕分析反應(yīng)中的光損害(mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)"；20080176241，題目為"減輕分析反應(yīng)中的光損害(mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)"；20080165346，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20080160531，題目為"混合材料基層的均勻表面及其制造和使用方法(uniformsurfacesforhybridmaterialsubstratesandmethodsformakingandusingsame)"；20080157005，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20080153100，題目為"其上布置有局部化分子的物品及其生產(chǎn)方法(articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)"；20080153095，題目為"荷電開關(guān)核苷酸(chargeswitchnucleotides)"；20080152281，題目為"用于分析材料的基層、系統(tǒng)和方法(substrates,systemsandmethodsforanalyzingmaterials)"；20080152280，題目為"用于分析材料的基層、系統(tǒng)和方法(substrates,systemsandmethodsforanalyzingmaterials)"；20080145278，題目為"混合材料基層的均勻表面及其制造和使用方法(uniformsurfacesforhybridmaterialsubstratesandmethodsformakingandusingsame)"；20080128627，題目為"用于分析材料的基層、系統(tǒng)和方法(substrates,systemsandmethodsforanalyzingmaterials)"；20080108082，題目為''用于促進(jìn)核酸測序的聚合酶和試劑(polymeraseenzymesandreagentsforenhancednucleicacidsequencing)"；20080095488，題目為"用于執(zhí)行分析反應(yīng)的基層(substratesforperforminganalyticalreactions)"；20080080059，題目為"模塊化的光學(xué)組件和并有所述組件的系統(tǒng)(modularopticalcomponentsandsystemsincorporatingsame)"；20080050747，題目為"其上布置有局部化分子的物品及其生產(chǎn)和使用方法(articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingandusingsame)"；20080032301，題目為"其上布置有局部化分子的物品及其生產(chǎn)方法(articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)"；20080030628，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20080009007，題目為"引物延伸的受控啟動(controlledinitiationofprimerextension)",20070238679，題目為"其上布置有局部化分子的物品及其生產(chǎn)方法(articleshavinglocalizedmoleculesdisposedthereonandmethodsofproducingsame)"；20070231804，題目為"用于監(jiān)測酶活性的方法、系統(tǒng)和組合物及其應(yīng)用(methods,systemsandcompositionsformonitoringenzymeactivityandapplicationsthereof')"；20070206187，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20070196846，題目為"用于核苷酸類似物摻入的聚合酶(polymerasesfornucleotideanalogueincorporation)",20070188750，題目為"用于來自多個來源的光學(xué)信號的同時實(shí)時監(jiān)測的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsforsimultaneousreal-timemonitoringofopticalsignalsfrommultiplesources)"；20070161017，題目為''減輕分析反應(yīng)中的光損害(mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)"；20070141598，題目為"核苷酸組合物及其用途(nucleotidecompositionsandusesthereof)"；20070134128，題目為"混合材料基層的均勻表面及其制造和使用方法(uniformsurfacesforhybridmaterialsubstratesandmethodsformakingandusingsame)"；20070128133，題目為"減輕分析反應(yīng)中的光損害(mitigationofphotodamageinanalyticalreactions)"；20070077564，題目為"反應(yīng)性表面、基層及其生產(chǎn)方法(reactivesurfaces,substratesandmethodsofproducingsame)"；20070072196，題目為"熒光核苷酸類似物及其用途(fluorescentnucleotideanalogsandusestherefore)"，和20070036511，題目為"監(jiān)測來自單一來源的多個光學(xué)信號的方法和系統(tǒng)(methodsandsystemsformonitoringmultipleopticalsignalsfromasinglesource)"，和korlachetai.(2008)"零模式波導(dǎo)納米結(jié)構(gòu)中單一dna聚合酶分子的靶向固定化的選擇鋁鈍化處理(selectivealuminumpassivationfortargetedimmobilizationofsinglednapolymerasemoleculesinzero-modewaveguidenanostructures)"proc.nat'i.acad.sci.u.s.a.105(4):11761181-其全部通過引用以其整體結(jié)合到本文中。

可適合于采用本文描述的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)的其它測序方法是本領(lǐng)域已知的，包括基于熒光的測序方法(見，例如，birrenetal.,基因組分析：分析dna(genomeanalysis:analyzingdna),1,coldspringharbor,n.y.；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。在一些實(shí)施方案中，采用本領(lǐng)域理解的自動測序技術(shù)。在一些實(shí)施方案中，dna測序通過平行寡核苷酸延伸獲得(見，例如，授權(quán)于macevicz等的美國專利號5,750,341，和授權(quán)于macevicz等的美國專利號6,306,597，其二者通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。測序技術(shù)的另外的例子包括churchpolony技術(shù)(mitra等,2003,analyticalbiochemistry320,55-65；shendure等,2005science309,1728-1732；美國專利號6,432,360、美國專利號6,485,944、美國專利號6,511,803；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，454picotiter焦磷酸測序技術(shù)(margulies等,2005nature437,376-380；us20050130173；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，solexa單堿基添加技術(shù)(bennett等,2005,pharmacogenomics,6,373-382；美國專利號6,787,308；美國專利號6,833,246；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，lynx大規(guī)模并行信號測序技術(shù)(brenner等(2000).nat.biotechnol.18:630-634；美國專利號5,695,934；美國專利號5,714,330；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)和adessipcr集落技術(shù)(adessi等(2000).nucleicacidres.28,e87；wo00018957；通過引用以其整體結(jié)合到本文中)。

可適合于采用本文描述的光敏封閉的核苷酸和去封閉-掃描循環(huán)的另一種測序方法是solexa/illumina平臺。在solexa/illumina平臺中(voelkerding等,clinicalchem.,55:641-658,2009；maclean等,naturerev.microbiol.,7:287-296；美國專利號6,833,246；美國專利號7,115,400；美國專利號6,969,488；每個通過引用以其整體結(jié)合到本文中)，測序數(shù)據(jù)以較短長度讀數(shù)的形式產(chǎn)生。在該方法中，單鏈片段化的dna經(jīng)末端修復(fù)以生成5'-磷酸化鈍端，隨后將單一a堿基經(jīng)klenow介導(dǎo)添加至片段的3'末端。a-添加促進(jìn)t-突出端銜接子寡核苷酸的添加，其被隨后用來捕獲在流動池表面上的模板-銜接子分子，所述池嵌有寡核苷酸錨。錨被用作pcr引物，但由于模板的長度及其接近其它附近的錨寡核苷酸，由pcr的延伸導(dǎo)致分子與相鄰錨寡核苷酸雜交的弓形結(jié)構(gòu)(“archingover”)，在流動池表面上形成橋結(jié)構(gòu)。dna的這些環(huán)被變性和裂解。然后正向鏈用可逆染料終止子測序。摻入的核苷酸的序列通過檢測摻入后熒光測定，在dntp添加的下一個循環(huán)之前除去每個熒光團(tuán)和封閉基團(tuán)(block)。序列讀數(shù)長度范圍為從36個核苷酸至超過50個核苷酸，每次分析運(yùn)行的總輸出超過10億核苷酸對。

實(shí)施例

實(shí)施例1

封閉核苷酸的去保護(hù)時間

最新一代的lasergen’sdntp保護(hù)的類似物具有大約750msec的dt50(使50%的分子去封閉所需的時間)。3種lasergendntp類似物的dt50示于圖1。750msec的t1/2給出在圖2中所示的在溶液中的衰減曲線?；谶@種曲線，需要4.6秒的去保護(hù)時間使98.5%的dntp去保護(hù)(如在圖3中所示)。這需要每個循環(huán)使用標(biāo)準(zhǔn)“洗滌”方法，其中未摻入的核苷酸在去保護(hù)之前除去。如在圖4中所示，例如，使用100msec的快速光脈沖，以消除假性堿基添加的問題。因此，快速光脈沖，接著較長讀出時間(對于單一分子)一般將堿基延伸限制于僅僅單個堿基，從而增加測序準(zhǔn)確性。

鑒于標(biāo)準(zhǔn)dna聚合酶在表面上的延伸速率是大約5堿基/秒，在100msec脈沖后摻入的新堿基是相對快速的，如在圖5中的時間順序所示。僅僅為了證實(shí)的目的，圖5使用5秒的任意檢測時間。

在這種情況下，去保護(hù)的動力學(xué)自標(biāo)準(zhǔn)衰減曲線推導(dǎo)。這導(dǎo)致在圖6中所示的去保護(hù)率。

堿基添加機(jī)制，對于這個實(shí)施例，可以使用二項(xiàng)展開式方程建模：

在這種情況下，x=在100msec光脈沖后保持封閉的分子的分?jǐn)?shù)；y=100msec光脈沖后去保護(hù)的分子的分?jǐn)?shù)；和n=循環(huán)數(shù)。對于本實(shí)施例，x=0.9121；和y=0.0879。對于每個頻閃循環(huán)，這一比率保持不變，因?yàn)榭偣?0⁶個分子在每個檢測期后具有現(xiàn)有的堿基或者新的堿基。3個頻閃循環(huán)，在二項(xiàng)展開式模型中使用10⁶個分子，示于圖7中。

在本假設(shè)的例子中，頻閃器閃光與5-秒的檢測步驟交互混雜。連續(xù)地產(chǎn)生多個頻閃器閃光(檢測讀數(shù)前)未進(jìn)行，因?yàn)檫@將不產(chǎn)生超過長的去保護(hù)時間的任何優(yōu)勢。對于這個實(shí)施例一般假定，足夠的光使表面模擬在溶液中的去保護(hù)動力學(xué)。在這個實(shí)施例中，每個光脈沖將使表面上的8.8%的分子去保護(hù)(自衰減曲線)。核苷酸添加在去保護(hù)后快速發(fā)生。

圖8(a-i)在表面上用10⁶個靶分子開始，模擬35個頻閃循環(huán)。圖8a模擬循環(huán)0，其中在表面上有10⁶個分子等待去封閉。在循環(huán)1(在圖8b顯示)，在表面上的10⁶個分子的8.8%被去保護(hù)并延伸(深黑色/藍(lán)色條)，而91.2%保持封閉(淺色條)。圖8c顯示5個循環(huán)，圖8d顯示10個循環(huán)，圖8e顯示15個循環(huán)，和圖8f顯示20個循環(huán)。圖8f顯示正態(tài)分布正開始出現(xiàn)。如圖8g(25個循環(huán))中所示，隨著每個連續(xù)的循環(huán)，分布曲線正慢慢向右移動，而分布本身正慢慢遞減并變得更加分散。圖8h顯示30個循環(huán)后的分布。如在圖8i(35個循環(huán))中所示，正態(tài)分布繼續(xù)遞減和分散，很像在高拷貝數(shù)時的泊松分布(poissondistribution)。在圖8i中的35個循環(huán)代表約3分鐘的測序運(yùn)行時間。圖9顯示延展循環(huán)數(shù)至400個循環(huán)(仍使用100msec頻閃的去封閉光)的結(jié)果，其中每條曲線代表10個頻閃循環(huán)后的分布。圖10顯示使用50msec頻閃，延展循環(huán)數(shù)至400個循環(huán)的結(jié)果，其中4.4%的可利用的光敏堿基被去封閉。圖11顯示如果50%的分子在100msec脈沖期間去封閉的期望分布(與8.8%對照)。每條曲線代表10個頻閃循環(huán)后的分布。

使用去保護(hù)光的短脈沖可有利地用來檢測均聚物。檢測均聚物的能力取決于在統(tǒng)計(jì)抽樣中檢測小的變化的能力。均聚物減少在每個檢測步驟中堿基改變的數(shù)量。用于檢測均聚物的數(shù)學(xué)模型示于圖12中。

雖然本發(fā)明已結(jié)合特別優(yōu)選的實(shí)施方案進(jìn)行了描述，但應(yīng)該理解，要求保護(hù)的本發(fā)明不應(yīng)不適當(dāng)?shù)叵抻谶@樣的特別的實(shí)施方案。在不背離本發(fā)明的范圍和精神的情況下，本發(fā)明的所述方法和組合物的各種修飾和變化對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。事實(shí)上，相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員理解的執(zhí)行本發(fā)明的所述方式的各種修改意欲在以下權(quán)利要求書的范圍內(nèi)。本申請?zhí)峒暗乃谐霭嫖锖蛯＠ㄟ^引用結(jié)合到本文中。