本申請(qǐng)要求于2014年10月16日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)No.62/064,668的優(yōu)先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。

背景

包括破囊壺菌(Thraustochytrid)種(species)在內(nèi)的微生物的異養(yǎng)發(fā)酵是產(chǎn)生高價(jià)值油和生物質(zhì)產(chǎn)物的有效方式。在某些培養(yǎng)條件下，微生物合成細(xì)胞內(nèi)油，所述細(xì)胞內(nèi)油可以被提取并用于生產(chǎn)生物燃料(生物柴油、生物噴射燃料等)和營(yíng)養(yǎng)脂質(zhì)(多不飽和脂肪酸，例如DHA、EPA、DPA)。微生物(例如，破囊壺菌種)的生物質(zhì)因高PUFA和蛋白質(zhì)含量而具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且可以用作動(dòng)物飼料的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑。

微生物發(fā)酵工藝主要以分批工藝或補(bǔ)料分批工藝進(jìn)行。分批工藝通常涉及封閉系統(tǒng)培養(yǎng)，其中在特定條件(例如，營(yíng)養(yǎng)物、溫度、壓力等)下使細(xì)胞在固定體積的營(yíng)養(yǎng)物培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至發(fā)酵罐中的特定密度，收獲，并按批處理。在典型的補(bǔ)料分批工藝中，將一種或更多種營(yíng)養(yǎng)物供給或供應(yīng)至發(fā)酵罐，它們?cè)诎l(fā)酵罐中保留直至培養(yǎng)過程結(jié)束。當(dāng)控制一種營(yíng)養(yǎng)物(或多種營(yíng)養(yǎng)物)的濃度影響所需產(chǎn)物的產(chǎn)量或活性時(shí)，補(bǔ)料分批培養(yǎng)工藝可優(yōu)于分批培養(yǎng)工藝。這樣的發(fā)酵工藝通常包括兩個(gè)培養(yǎng)階段：細(xì)胞增殖階段，在此期間所有必需的營(yíng)養(yǎng)物均可用于無限的培養(yǎng)物生長(zhǎng)，隨后是油積累階段，在此期間關(guān)鍵的生長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)物(通常為氮)被有目的地限制在培養(yǎng)基中，同時(shí)提供過量的碳營(yíng)養(yǎng)物并導(dǎo)入油合成。當(dāng)達(dá)到目標(biāo)細(xì)胞濃度和油含量時(shí)，停止發(fā)酵過程并收獲富含油的生物質(zhì)。然后必須對(duì)發(fā)酵罐容納物(vessel)進(jìn)行清潔、滅菌和用新鮮培養(yǎng)基重新分批，并且種子培養(yǎng)物(seed train)需要準(zhǔn)備好用于再次接種生產(chǎn)容納物(例如，分批/補(bǔ)料分批發(fā)酵之間的“周轉(zhuǎn)”操作)。這樣的周轉(zhuǎn)操作通常耗時(shí)間和能量并且限制用于建成的生產(chǎn)工藝的生產(chǎn)容納物的總可用操作時(shí)間?；蛘?，可以采用連續(xù)方法培養(yǎng)微生物，其中將新鮮培養(yǎng)基連續(xù)加入發(fā)酵罐中，同時(shí)連續(xù)除去培養(yǎng)液以保持培養(yǎng)體積恒定。連續(xù)培養(yǎng)工藝可用于將微生物維持在特定的生長(zhǎng)速率或生理穩(wěn)態(tài)，但是可能難以在沒有破壞的情況下維持并且通常用于研究目的，因?yàn)檠a(bǔ)料分批或分批培養(yǎng)傾向于提供更好的結(jié)果(例如，更高的產(chǎn)油率)，并且更易于用于大規(guī)模生產(chǎn)目的。

發(fā)明概述

本文提供了培養(yǎng)微生物的優(yōu)化方法和采用半連續(xù)工藝產(chǎn)生油和促進(jìn)延長(zhǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)率的方法。所述方法包括提供在包含第一碳氮比的培養(yǎng)基中包含一種或更多種微生物的容器，培養(yǎng)所述微生物直至所述培養(yǎng)物達(dá)到閾值指標(biāo)，收獲一部分所述培養(yǎng)物同時(shí)維持所述容器中的大部分培養(yǎng)物，以及向包含含有所述微生物的大部分所述培養(yǎng)物的所述容器中加入包含第二碳氮比的新鮮培養(yǎng)基。

附圖簡(jiǎn)述

圖1是說明典型微生物S型生長(zhǎng)曲線的圖。在該工藝的后期但在培養(yǎng)物達(dá)到靜止期(其可以通過S曲線上的最陡斜率指示)之前，即時(shí)生物質(zhì)/油產(chǎn)率處于其最高水平。

圖2是示出在半連續(xù)條件下生長(zhǎng)的ONC-T18的總生物質(zhì)(■)和油產(chǎn)率的圖。圖2中示出的高產(chǎn)率值遠(yuǎn)超過在典型分批或補(bǔ)料分批工藝下可獲得的值。

圖3是示出連續(xù)發(fā)酵方法對(duì)ONC-T18的作用的圖。連續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致不可持續(xù)的發(fā)酵、生物質(zhì)減少和流出物中的葡萄糖濃度增加。發(fā)酵因管路堵塞而停止。

圖4是示出在半連續(xù)條件下生長(zhǎng)的ONC-T18的總生物質(zhì)(■)和油產(chǎn)率的圖。連續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致不可持續(xù)的發(fā)酵和降低的生物質(zhì)和油產(chǎn)率。

圖5是示出在半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵下生長(zhǎng)的ONC-T18的生物質(zhì)產(chǎn)率的圖。半連續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致延長(zhǎng)的生物質(zhì)產(chǎn)率。

圖6是示出在連續(xù)和半連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)的ONC-T18的即時(shí)生物質(zhì)產(chǎn)率(在給定時(shí)間點(diǎn)確定)的圖。

圖7是示出在連續(xù)和半連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)的ONC-T18的即時(shí)油產(chǎn)率(在給定時(shí)間點(diǎn)確定)的圖。

詳述

本文提供了培養(yǎng)微生物的方法和通過半連續(xù)工藝生產(chǎn)油的方法。與典型的分批、連續(xù)和補(bǔ)料分批工藝相比，該方法導(dǎo)致更高的總體容積生物質(zhì)和油產(chǎn)率。簡(jiǎn)而言之，在初始培養(yǎng)物(例如，種子培養(yǎng)物)中提供微生物，并使用補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝生長(zhǎng)至某一閾值參數(shù)，例如高細(xì)胞濃度和/或高油含量，此時(shí)氮源被限制在培養(yǎng)基中或在培養(yǎng)基中耗盡，碳源為零或接近零，并且生物質(zhì)/油產(chǎn)率在給定微生物的最大范圍內(nèi)。收獲一定體積(例如，工作體積的10％)的培養(yǎng)肉湯，并將相同體積的含有預(yù)定濃度的碳和氮營(yíng)養(yǎng)物以及所有其他必需的礦物營(yíng)養(yǎng)素的新鮮培養(yǎng)基加入到發(fā)酵罐中。在補(bǔ)料培養(yǎng)基(feeding medium)中使用的碳氮比是為了使培養(yǎng)物獲得和維持高油含量。繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)物使用新提供的培養(yǎng)基產(chǎn)生額外的生物質(zhì)和油。培養(yǎng)物生長(zhǎng)直至達(dá)到閾值參數(shù)(例如，碳濃度降低到零或接近零)，并重復(fù)部分肉湯收獲和新鮮培養(yǎng)基供應(yīng)循環(huán)。使用這樣的工藝，可以以半連續(xù)方式生產(chǎn)和收獲含有高油含量的高密度生物質(zhì)，并且該工藝的總持續(xù)時(shí)間比這樣的微生物的任何分批或補(bǔ)料分批模式培養(yǎng)長(zhǎng)得多。具有高油含量的高密度生物質(zhì)的半連續(xù)收獲顯著減少發(fā)酵罐周轉(zhuǎn)時(shí)間、最小化對(duì)發(fā)酵罐容納物周轉(zhuǎn)程序和滅菌程序的需要，因此降低操作成本，并且可導(dǎo)致生物質(zhì)和油的非常高的總體積產(chǎn)率，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過可以通過典型的分批、連續(xù)或補(bǔ)料分批發(fā)酵方法所實(shí)現(xiàn)的該產(chǎn)率。

微生物

本文所述的方法包括從微生物群體中提取脂質(zhì)。本文所述的微生物群體可以是藻類(例如微藻)、真菌(包括酵母)、細(xì)菌或原生生物。任選地，所述微生物包括破囊壺菌目(order Thraustochytriales)的破囊壺菌，更具體地，破囊壺菌屬(Thraustochytrium)的破囊壺菌(Thraustochytriales)。任選地，所述微生物群體包括如美國專利No.5,340,594和5,340,742中所述的破囊壺菌，這兩篇專利通過引用整體并入本文。所述微生物可以是破囊壺菌屬種，例如如美國專利No.8,163,515中所述作為ATCC登錄號(hào)PTA-6245(即，ONC-T18)保藏的破囊壺菌屬種，其通過引用整體并入本文。因此，所述微生物可以具有與SEQ ID NO:1至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更多(例如，包括100％)同一的18s rRNA序列。

用于本文所述方法的微生物可產(chǎn)生多種脂質(zhì)化合物。本文所用術(shù)語脂質(zhì)包括磷脂、游離脂肪酸、脂肪酸酯、三?；视汀㈢薮己顽薮减?、類胡蘿卜素、葉黃素(例如，氧代類胡蘿卜素)、烴和本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其它脂質(zhì)。任選地，脂質(zhì)化合物包括不飽和脂質(zhì)。不飽和脂質(zhì)可以包括多不飽和脂質(zhì)(即，含有至少2個(gè)不飽和碳-碳鍵(例如，雙鍵)的脂質(zhì))或高度不飽和脂質(zhì)(即，含有4個(gè)或更多個(gè)不飽和碳-碳鍵的脂質(zhì))。不飽和脂質(zhì)的實(shí)例包括ω-3和/或ω-6多不飽和脂肪酸，例如二十二碳六烯酸(即，DHA)、二十碳五烯酸(即，EPA)和其它天然存在的不飽和、多不飽和和高度不飽和化合物。

工藝

本文提供了培養(yǎng)微生物的方法。該方法包括提供培養(yǎng)基中一種或更多種微生物的容器，所述培養(yǎng)基具有第一碳氮比；培養(yǎng)所述微生物直至所述培養(yǎng)物達(dá)到閾值指標(biāo)；收獲一部分所述培養(yǎng)物同時(shí)維持容器中的大部分培養(yǎng)物；以及向所述含有具有微生物的大部分培養(yǎng)物的容器中加入具有第二碳氮比的新鮮培養(yǎng)基。

該方法適用于大規(guī)模發(fā)酵以及小規(guī)模發(fā)酵。本文所使用的大規(guī)模發(fā)酵是指發(fā)酵罐中的發(fā)酵，其體積容量(即，工作體積)為至少約1,000L，為頂部空間留下足夠的空間。小規(guī)模發(fā)酵通常指發(fā)酵罐中的發(fā)酵，其體積容量通常不超過約100L，例如5L、10L、50L或100L。本發(fā)明的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝的顯著優(yōu)點(diǎn)是其可以用于以5至10L發(fā)酵罐規(guī)模生產(chǎn)油，并且可擴(kuò)展至任何體積，例如100L、150L、250L、500L、1000L或更多，而不限于此。

如通篇所討論的，本文提供了培養(yǎng)微生物的方法，所述方法包括提供具有包含第一碳氮比的培養(yǎng)基中的一種或更多種微生物的容器。通常，培養(yǎng)基包括濃度為約5g/L至約200g/L的碳源，并且具有約1:1至約40:1的C:N(碳:氮)摩爾比。在所提供的方法中，第一碳氮摩爾比為30:1至60:1。任選地，第一碳氮摩爾比為40:1至50:1。如通篇更詳細(xì)討論的，碳源包括但不限于脂肪酸、脂質(zhì)、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇和氨基糖。任選地，碳源是葡萄糖、果糖或甘油。如通篇更詳細(xì)討論的，氮源包括但不限于銨溶液、銨鹽或胺鹽、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、魚粉、谷氨酸鈉、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。任選地，氮源是硫酸銨。

所提供的方法包括培養(yǎng)微生物直至培養(yǎng)物達(dá)到閾值指標(biāo)。本文所用術(shù)語參數(shù)是指用于監(jiān)測(cè)和控制微生物培養(yǎng)物的進(jìn)程的指標(biāo)或變量。這樣的參數(shù)包括但不限于光密度(OD)、細(xì)胞濃度、二氧化碳產(chǎn)生速率、pH、溶解氧(DO)、時(shí)間、培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的濃度、代謝副產(chǎn)物的積累、溫度、生物質(zhì)產(chǎn)率和油產(chǎn)率。如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解的并且基于本文提供的指導(dǎo)，預(yù)期使用任何合適的參數(shù)或參數(shù)的組合。任選地，所述參數(shù)是培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物的濃度?？梢栽谂囵B(yǎng)基中測(cè)量的合適的營(yíng)養(yǎng)物包括但不限于碳和氮。

所提供的方法包括收獲一部分培養(yǎng)物同時(shí)維持容器中的大部分培養(yǎng)物。在所述方法中，所收獲的部分包含約5％至約20％的培養(yǎng)物。任選地，所收獲的部分包含約10％的培養(yǎng)物。

所提供的方法還包括向包含具有微生物的大部分培養(yǎng)物的容器中加入包含第二碳氮比的新鮮培養(yǎng)基。本文所用術(shù)語大部分是指50％或更多的包含微生物的培養(yǎng)物留在容器中而收獲剩余部分的培養(yǎng)物。在所提供的方法中，第二碳氮比通常高于第一碳氮比。第二碳氮比的范圍可以為約60:1至約95:1。任選地，第二碳氮比為約80:1至約90:1。如通篇更詳細(xì)討論的，碳源包括但不限于脂肪酸、脂質(zhì)、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇和氨基糖。任選地，碳源是葡萄糖、果糖或甘油。如通篇更詳細(xì)討論的，氮源包括但不限于銨溶液、銨鹽或胺鹽、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、魚粉、谷氨酸鈉、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。任選地，氮源是硫酸銨。

所提供的方法任選地包括重復(fù)以下步驟:(i)培養(yǎng)微生物直至培養(yǎng)物達(dá)到閾值指標(biāo)；(ii)收獲一部分所述培養(yǎng)物，同時(shí)維持容器中的大部分培養(yǎng)物；以及(iii)向包含含有微生物的大部分培養(yǎng)物的容器中加入具有第二碳氮比的新鮮培養(yǎng)基。這樣，所提供的方法有利地允許培養(yǎng)物維持更長(zhǎng)時(shí)間段，在此期間，培養(yǎng)物維持高水平的生物質(zhì)和/或油產(chǎn)率。任選地，將培養(yǎng)物維持?jǐn)?shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間段。任選地，將培養(yǎng)物維持至少150至500小時(shí)。例如，培養(yǎng)物可以維持至少250小時(shí)。任選地，將培養(yǎng)物維持一、二、三、四或五周。

所提供的方法允許培養(yǎng)物維持在高水平的生物質(zhì)產(chǎn)率。本文所用術(shù)語“高水平的生物質(zhì)產(chǎn)率”是指高于給定微生物的平均生物質(zhì)產(chǎn)率的水平。通常，平均產(chǎn)率水平傾向于在40g/L-d或更低的范圍內(nèi)，即，0g/L-d至約40g/L-d，但可以根據(jù)微生物而變化。任選地，生物質(zhì)產(chǎn)率包括60g/L-d至180g/L-d。任選地，生物質(zhì)產(chǎn)率包括80g/L-d至130g/L-d。任選地，生物質(zhì)產(chǎn)率包括90g/L-d至100g/L-d。本文所用術(shù)語“高”

所提供的方法還允許培養(yǎng)物維持在高水平的油產(chǎn)率。本文所用術(shù)語“高水平油產(chǎn)率”是指高于給定微生物的平均油產(chǎn)率的水平。通常，平均產(chǎn)率水平傾向于在25g/L-d或更低的范圍內(nèi)，即，0g/L-d至約25g/L-d，但可以根據(jù)微生物而變化。任選地，油產(chǎn)率包括35g/L-d至130g/L-d。任選地，油產(chǎn)率包括60g/L-d至90g/L-d。任選地，油產(chǎn)率包括70g/L-d至80g/L-d。因此，例如，微生物的培養(yǎng)物包含含有60％至85％油的生物質(zhì)。任選地，微生物的培養(yǎng)物包含含有65％至75％油的生物質(zhì)。

術(shù)語高、較高、增加、升高或提高是指高于對(duì)照的增加。術(shù)語低、較低、降低或減少是指低于對(duì)照水平的任何降低。舉例來說，對(duì)照水平是在分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)條件下生長(zhǎng)的生物質(zhì)和/或油產(chǎn)率水平。所提供的方法提供了比使用不同工藝(例如分批、補(bǔ)料分批或連續(xù)工藝)生長(zhǎng)相同微生物時(shí)的水平高的生物質(zhì)和/或油產(chǎn)率水平。生物質(zhì)產(chǎn)率水平可以例如通過假設(shè)24小時(shí)周轉(zhuǎn)時(shí)間包括在總工藝時(shí)間內(nèi)來測(cè)定，在工藝的任意給定時(shí)間點(diǎn)的總生物質(zhì)(X)產(chǎn)率可以計(jì)算為:X(克)/培養(yǎng)物體積(L)/時(shí)間(小時(shí))*24(小時(shí)/天)，最終單位為g/L-天。在任意給定時(shí)間點(diǎn)的總油產(chǎn)率可以以類似的方式計(jì)算為:油(克)/培養(yǎng)物體積(升)/時(shí)間(小時(shí))*24(小時(shí)/天)。

發(fā)酵

所提供的方法包括或可以與根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法培養(yǎng)微生物的另外的步驟結(jié)合使用。例如，可以根據(jù)美國專利公開2009/0117194或2012/0244584中所述的方法培養(yǎng)破囊壺菌，例如，破囊壺菌屬(Thraustochytrium sp.)，這兩篇專利通過引用整體并入本文用于其中所使用的方法或組合物的每個(gè)步驟。微生物在生長(zhǎng)培養(yǎng)基(也稱為“培養(yǎng)基”)中生長(zhǎng)。多種培養(yǎng)基中的任一種可適用于培養(yǎng)本文所述的微生物。任選地，培養(yǎng)基為微生物提供各種營(yíng)養(yǎng)成分，包括碳源和氮源。

破囊壺菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以包括多種碳源中的任一種。碳源的實(shí)例包括脂肪酸、脂質(zhì)、甘油、甘油三酯、碳水化合物、多元醇、氨基糖和任何種類的生物質(zhì)或廢物流。脂肪酸包括例如油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纖維素、半纖維素、果糖、葡萄糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麥芽三糖、麥芽糖、乳糖、糖原、明膠、淀粉(玉米或小麥)、乙酸鹽、m-肌醇(例如，來源于玉米漿)、半乳糖醛酸(例如，衍生自果膠)、L-巖藻糖(例如，衍生自半乳糖)、龍膽二糖、葡糖胺、α-D-葡萄糖-1-磷酸(例如，衍生自葡萄糖)、纖維二糖、糊精、α-環(huán)糊精(例如，衍生自淀粉)和蔗糖(例如，來自糖蜜)。多元醇包括但不限于麥芽糖醇、赤蘚糖醇和阿東糖醇。氨基糖包括但不限于N-乙酰基-D-半乳糖胺、N-乙?；?D-葡萄糖胺和N-乙酰基-β-D-甘露糖胺。任選地，碳源是葡萄糖。如上所述，在所提供的方法中，碳源以高濃度(例如，至少200g/L)提供。

任選地，本文提供的微生物在增加目標(biāo)化合物(例如，油或總脂肪酸(TFA)含量)的生物質(zhì)和/或產(chǎn)量的條件下培養(yǎng)。例如，破囊壺菌通常在鹽水培養(yǎng)基中培養(yǎng)。任選地，破囊壺菌可在具有約0.5g/L至約50.0g/L的鹽濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。任選地，在具有約0.5g/L至約35g/L(例如，約18g/L至約35g/L)的鹽濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)破囊壺菌。任選地，本文所述的破囊壺菌可以在低鹽條件下生長(zhǎng)。例如，破囊壺菌可在具有約0.5g/L至約20g/L(例如，約0.5g/L至約15g/L)的鹽濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基任選地包括NaCl。任選地，培養(yǎng)基包括天然或人造海鹽和/或人造海水。

培養(yǎng)基可以包括不含氯化物的鈉鹽作為鈉源。適合用于本發(fā)明方法的非氯化物鈉鹽的實(shí)例包括但不限于蘇打灰(碳酸鈉和氧化鈉的混合物)、碳酸鈉、碳酸氫鈉、硫酸鈉及其混合物。參見，例如，美國專利No.5,340,742和6,607,900，其各自的全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。例如，總鈉的很大一部分可以由非氯化物鹽提供，使得培養(yǎng)基中總鈉的小于約100％、75％、50％或25％由氯化鈉提供。

任選地，培養(yǎng)基具有小于約3g/L、500mg/L、250mg/L或120mg/L的氯化物濃度。例如，用于所提供的方法的培養(yǎng)基可以具有介于約60mg/L和120mg/L之間且包括約60mg/L和120mg/L的氯化物濃度。

破囊壺菌培養(yǎng)物的培養(yǎng)基可以包括多種氮源中的任一種。示例性氮源包括銨溶液(例如，H₂O中的NH₄)、銨鹽或胺鹽(例如(NH₄)₂SO₄、(NH₄)₃PO₄、NH₄NO₃、NH₄OOCH₂CH₃(NH₄Ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麥芽提取物、魚粉、谷氨酸鈉、大豆提取物、酪蛋白氨基酸和酒糟。合適的培養(yǎng)基中氮源的濃度通常介于約1g/L至約25g/L之間，包括約1g/L和約25g/L。

培養(yǎng)基任選地包括磷酸鹽，例如磷酸鉀或磷酸鈉。培養(yǎng)基中的無機(jī)鹽和痕量營(yíng)養(yǎng)物可以包括硫酸銨、碳酸氫鈉、原釩酸鈉、鉻酸鉀、鉬酸鈉、亞硒酸、硫酸鎳、硫酸銅、硫酸鋅、氯化鈷、氯化鐵、氯化錳氯化鈣和EDTA。可以包括維生素例如鹽酸吡哆醇、鹽酸硫胺素、泛酸鈣、對(duì)氨基苯甲酸、核黃素、煙酸、生物素、葉酸和維生素B12。

可使用酸或堿，在適當(dāng)時(shí)，和/或使用氮源，將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至3.0至10.0之間并且包括3.0和10.0。任選地，將培養(yǎng)基調(diào)節(jié)至如上限定的低pH。培養(yǎng)基可以是無菌的。

通常，用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基是液體培養(yǎng)基。然而，用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基可以是固體培養(yǎng)基。除了如本文所討論的碳和氮源之外，固體培養(yǎng)基還可以含有提供結(jié)構(gòu)支持和/或使得培養(yǎng)基為固體形式的一種或更多種組分(例如，瓊脂或瓊脂糖)。

可以培養(yǎng)細(xì)胞一段時(shí)期。任選地，將細(xì)胞培養(yǎng)1天至60天之間的任何時(shí)間。任選地，將培養(yǎng)物維持?jǐn)?shù)小時(shí)、數(shù)天、數(shù)周或數(shù)月的時(shí)間段。任選地，將培養(yǎng)物維持至少150至500小時(shí)。任選地，將培養(yǎng)物維持至少250小時(shí)。任選地，將培養(yǎng)物維持一、二、三、四或五周。培養(yǎng)任選在約4℃至約30℃、例如約18℃至約28℃的溫度下進(jìn)行。培養(yǎng)可以包括通氣振蕩培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、靜止培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)、連續(xù)培養(yǎng)、輥式分批培養(yǎng)、波培養(yǎng)等。培養(yǎng)可以使用常規(guī)的攪拌-發(fā)酵罐、鼓泡塔發(fā)酵罐(分批或連續(xù)培養(yǎng))、氣升式發(fā)酵罐、波式發(fā)酵罐等進(jìn)行。

培養(yǎng)物可以通過多種方法中的一種或更多種進(jìn)行通氣，包括振蕩。任選地，振蕩范圍為約100rpm至約1000rpm，例如約350rpm至約600rpm或約100至約450rpm。任選地，在產(chǎn)生物質(zhì)階段期間和在產(chǎn)脂質(zhì)階段期間使用不同的振蕩速度對(duì)培養(yǎng)物通氣。替選地或另外地，振蕩速度可根據(jù)培養(yǎng)容納物的類型(例如，燒瓶的形狀或大小)而變化。

可以根據(jù)涉及一種或更多種培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)換的方法通過培養(yǎng)細(xì)胞以獲得更大量的所需化合物來增加所需脂質(zhì)的產(chǎn)量。任選地，首先在使生物質(zhì)最大化的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，隨后將一種或更多種培養(yǎng)條件轉(zhuǎn)換為有利于脂質(zhì)產(chǎn)率的條件。轉(zhuǎn)換的條件可以包括氧濃度、C:N比、溫度及其組合。任選地，進(jìn)行兩階段培養(yǎng)，其中第一階段有利于生物質(zhì)產(chǎn)生(例如，使用高氧(例如，通?；蛳鄬?duì)于第二階段)、低C:N比和環(huán)境溫度)的條件，隨后有利于脂質(zhì)產(chǎn)生的第二階段(例如，與第一階段相比，其中氧減少、C:N比增加且溫度降低)。與先前描述的方法相反，所提供的方法允許在高水平的油或脂質(zhì)產(chǎn)生條件下維持培養(yǎng)長(zhǎng)時(shí)間。

巴氏滅菌

任選地，將所得生物質(zhì)巴氏滅菌以滅活存在于生物質(zhì)中的非期望的物質(zhì)。例如，可以將生物質(zhì)巴氏滅菌以使化合物降解物質(zhì)失活。生物質(zhì)可以存在于發(fā)酵培養(yǎng)基中或從用于巴氏滅菌步驟的發(fā)酵培養(yǎng)基中分離。巴氏滅菌步驟可以通過將生物質(zhì)和/或發(fā)酵培養(yǎng)基加熱至高溫來進(jìn)行。例如，可以將生物質(zhì)和/或發(fā)酵培養(yǎng)基加熱至約50℃至約95℃(例如，約55℃至約90℃或約65℃至約80℃)的溫度。任選地，可以將生物質(zhì)和/或發(fā)酵培養(yǎng)基加熱約30分鐘至約120分鐘(例如，約45分鐘至約90分鐘，或約55分鐘至約75分鐘)。巴氏滅菌可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適的加熱裝置進(jìn)行，例如通過直接蒸汽注射。

任選地，不進(jìn)行巴氏滅菌步驟。換句話說，本文教導(dǎo)的方法任選地缺少巴氏滅菌步驟。

收獲和洗滌

任選地，可以根據(jù)多種方法收獲生物質(zhì)，包括本領(lǐng)域技術(shù)人員目前已知的那些方法。例如，可以使用例如離心(例如，固體彈射離心機(jī))或過濾(例如，交叉流過濾)從發(fā)酵培養(yǎng)基收集生物質(zhì)，任選地使用沉淀劑來加速收集細(xì)胞生物質(zhì)(例如，磷酸鈉或氯化鈣)。

任選地，用水洗滌生物質(zhì)。任選地，生物質(zhì)可以濃縮至高達(dá)約20％的固體。例如，生物質(zhì)可以濃縮至約5％至約20％固體、約7.5％至約15％固體、或約固體至約20％固體或所述范圍內(nèi)的任意百分比。任選地，生物質(zhì)可以濃縮至約20％固體或更少、約19％固體或更少、約18％固體或更少、約17％固體或更少、約16％固體或更少、約15％固體或更少、約14％固體或更少、約13％固體或更少、約12％固體或更少、約11％固體或更少、約10％固體或更少、約9％固體或更少、約8％固體或更少、約7％固體或更少、約6％固體或更少、約5％固體或更少、約4％固體或更少、約3％固體或更少、約2％固體或更少、或者約1％固體或更少。

分離和提取

所提供的方法任選地包括使用多種方法(包括本領(lǐng)域技術(shù)人員目前已知的那些)從生物質(zhì)或微生物中分離多不飽和脂肪酸。例如，分離多不飽和脂肪酸的方法描述于美國專利No.8,163,515中，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文。任選地，在分離多不飽和脂肪酸之前不對(duì)培養(yǎng)基滅菌。任選地，滅菌包括溫度升高。任選地，由微生物產(chǎn)生并由所提供的方法分離的多不飽和脂肪酸是中鏈脂肪酸。任選地，一種或更多種多不飽和脂肪酸選自α亞麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亞麻酸、亞油酸、亞麻酸及其組合。

產(chǎn)物

包括多不飽和脂肪酸(PUFA)的油和根據(jù)本文所述的方法產(chǎn)生的其它脂質(zhì)可以用于利用其生物學(xué)、營(yíng)養(yǎng)或化學(xué)性質(zhì)的多種應(yīng)用中的任一種。因此，所提供的方法任選地包括從所收獲的培養(yǎng)物分離油。任選地，油用于產(chǎn)生燃料，例如生物燃料。任選地，油可以用于藥物、食品補(bǔ)充劑、動(dòng)物飼料添加劑、化妝品等。根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)也可用作生產(chǎn)其它化合物的中間體。

舉例來說，由使用所提供的方法培養(yǎng)的微生物產(chǎn)生的油可以包含脂肪酸。任選地，脂肪酸選自α亞麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亞麻酸、亞油酸、亞麻酸及其組合。任選地，油包含甘油三酯。任選地，油包含選自棕櫚酸(C16:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、棕櫚油酸(C16:1(n-7))、順式異油酸(C18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(C22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(C22:6(n-3))及其組合的脂肪酸。任選地，分離的脂肪酸中二十二碳六烯酸的濃度為總脂肪酸濃度的20％或更少。

任選地，根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)可以摻入到最終產(chǎn)品(例如，食品或飼料補(bǔ)充劑、嬰兒配方食品、藥物、燃料等)中。脂質(zhì)可以摻入其中的合適的食品或飼料補(bǔ)充劑包括飲料如牛奶、水、運(yùn)動(dòng)飲品、能量飲品、茶和果汁；糖果例如糖果、果凍和餅干；含脂肪的食品和飲料例如乳制品；加工食品例如軟米(或粥)；嬰兒配方奶粉；早餐谷物等。任選地，一種或更多種產(chǎn)生的脂質(zhì)可以摻入到膳食補(bǔ)充劑中，例如維生素或多種維生素。任選地，根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)可以包括在膳食補(bǔ)充劑中，并且任選地可以直接摻入食品或飼料(例如，食品補(bǔ)充劑)的組分中。

可以摻入通過本文所述的方法產(chǎn)生的脂質(zhì)的飼料的實(shí)例包括寵物食品，例如貓食、狗食等；水族魚、養(yǎng)殖魚或甲殼類動(dòng)物等的飼料；養(yǎng)殖動(dòng)物(包括在水產(chǎn)養(yǎng)殖中養(yǎng)殖的家畜和魚類或甲殼類動(dòng)物)的飼料?？梢該饺敫鶕?jù)本文所述方法產(chǎn)生的脂質(zhì)的食品或飼料材料優(yōu)選對(duì)于生物體(為預(yù)期接受者)是可口。這種食品或飼料材料可以具有目前已知的用于食品材料(例如，固體、液體、軟質(zhì)物(soft))的任何物理性質(zhì)。

任選地，可以將一種或更多種所產(chǎn)生的化合物(例如，PUFA)摻入營(yíng)養(yǎng)品或藥物中。這樣的營(yíng)養(yǎng)品或藥物的實(shí)例包括各種類型的片劑、膠囊、可飲用試劑等。任選地，營(yíng)養(yǎng)品或藥物適于局部應(yīng)用。劑型可包括例如膠囊、油、顆粒劑、濃縮顆粒劑(granula subtilae)、散劑(pulveres)、片劑、丸劑、錠劑等。

根據(jù)本文所述方法產(chǎn)生的油或脂質(zhì)可以與任何各種其它試劑組合摻入本文所述的產(chǎn)品中。例如，這樣的化合物可以與一種或更多種粘合劑或填料、螯合劑、顏料、鹽、表面活性劑、保濕劑、粘度調(diào)節(jié)劑、增稠劑、軟化劑、香料、防腐劑等或其任意組合相組合。

公開了可以用于所公開的方法和組合物、可以與所公開的方法和組合物結(jié)合使用、可以用于制備所公開的方法和組合物或者是所公開的方法和組合物的產(chǎn)品的材料、組合物和組分。本文公開了這些及其他材料，并且應(yīng)當(dāng)理解，當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、組等時(shí)，盡管可能沒有明確公開這些化合物的各種單獨(dú)和集合組合和排列的具體引用，但是其分別在本文中特別涵蓋和描述。例如，如果公開和討論了一種方法，并且討論了可以對(duì)包括該方法的多種分子數(shù)目進(jìn)行的多種修飾，除非相反地特別指出，否則該方法的各個(gè)組合和排列以及可能的修飾均被特別涵蓋。同樣，也特別涵蓋和公開了這些的任何子集或組合。該概念適用于本公開的所有方面，包括但不限于使用所公開的組合物的方法中的步驟。因此，如果存在可以進(jìn)行的多種另外的步驟，則應(yīng)當(dāng)理解，這些額外的步驟中的每一個(gè)均可以利用所公開的方法的任何特定的方法步驟或方法步驟的組合來進(jìn)行，并且每個(gè)這樣的組合或組合的子集是特別涵蓋的并且應(yīng)當(dāng)被認(rèn)為是公開的。

如通篇所用，范圍(例如1-10)和對(duì)約給定值(例如約1或約10)的引用包括所述一個(gè)或多個(gè)值(例如1和/或10)

本文引用的出版物和其引用的材料特別地通過引用整體并入本文。

以下實(shí)施例旨在進(jìn)一步說明本文所述的方法和組合物的某些方面，并且不旨在限制權(quán)利要求的范圍。

實(shí)施例

用于生產(chǎn)生物質(zhì)和油的半連續(xù)發(fā)酵

在微生物油生產(chǎn)領(lǐng)域中，異養(yǎng)黑暗發(fā)酵通常被認(rèn)為在工藝效率和產(chǎn)物產(chǎn)率方面優(yōu)于自養(yǎng)光養(yǎng)性微生物培養(yǎng)。然而，它常常受到較高的固定資本成本(構(gòu)建基于容納物的發(fā)酵設(shè)備的成本通常遠(yuǎn)高于開放池塘(open-pond)和跑道型(raceway)培養(yǎng)系統(tǒng)的資本成本)的阻礙。使用本文所述的這樣的半連續(xù)生產(chǎn)工藝可以獲得更高的總產(chǎn)率，同時(shí)降低操作成本(最小化生產(chǎn)發(fā)酵罐容納物的周轉(zhuǎn)程序和容納物滅菌程序)。這意味著更好地利用固定資本投資(發(fā)酵罐和相關(guān)投資設(shè)備)和更高的年生產(chǎn)能力。

在補(bǔ)料分批微生物培養(yǎng)期間，培養(yǎng)細(xì)胞/油濃度遵循典型的微生物S形生長(zhǎng)曲線(圖1)，并且即時(shí)生物質(zhì)/油產(chǎn)率在該工藝后期但在培養(yǎng)達(dá)到穩(wěn)定期之前處于其最高水平，其可以由S曲線上最陡的斜率表示(圖1)。然而，典型補(bǔ)料分批培養(yǎng)在培養(yǎng)物通過高即時(shí)產(chǎn)率階段后不久停止，并且總體產(chǎn)率不能非常高，因?yàn)榭梢缘竭_(dá)在高即時(shí)產(chǎn)率階段之前，培養(yǎng)物花費(fèi)大量的工藝時(shí)間通過較低的即時(shí)產(chǎn)率階段。半連續(xù)工藝通過在高濃度下反復(fù)收獲一定體積的培養(yǎng)肉湯(broth)同時(shí)提供新平衡的培養(yǎng)基從而使培養(yǎng)物以更高的速率重復(fù)產(chǎn)生生物質(zhì)和油來利用培養(yǎng)物在高即時(shí)產(chǎn)率階段期間生長(zhǎng)和合成油的能力。

所提供的半連續(xù)工藝在培養(yǎng)物的峰產(chǎn)率水平延長(zhǎng)生長(zhǎng)和油產(chǎn)生。假設(shè)24小時(shí)周轉(zhuǎn)時(shí)間包括在總工藝時(shí)間內(nèi)，在工藝的任意給定時(shí)間點(diǎn)的總生物質(zhì)(X)產(chǎn)率可以計(jì)算為:X(克)/培養(yǎng)物體積(L)/時(shí)間(小時(shí))*24(小時(shí)/天)，最終單位為g/L-天。在任意給定時(shí)間點(diǎn)的總油產(chǎn)率可以以類似的方式計(jì)算為:油(克)/培養(yǎng)物體積(升)/時(shí)間(小時(shí))*24(小時(shí)/天)。如在生物質(zhì)和油生產(chǎn)率的總圖中所見，在典型的補(bǔ)料分批工藝(由67小時(shí)的分界線指示)結(jié)束時(shí)，生物質(zhì)和油產(chǎn)率分別僅為42g/L-d和28g/L-d(圖2)。通過將所提供的半連續(xù)模式下的發(fā)酵延長(zhǎng)至453小時(shí)(19天)，總生物質(zhì)和油產(chǎn)率逐漸增加，并分別達(dá)到96g/L-d和72g/L-d的平臺(tái)(圖2)。這些高產(chǎn)率值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過典型的分批或補(bǔ)料分批工藝可實(shí)現(xiàn)的值。

簡(jiǎn)言之，首先采用補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝使ONC-T18細(xì)胞生長(zhǎng)至高細(xì)胞濃度和高油含量，此時(shí)預(yù)定氮源已在培養(yǎng)基中耗盡，碳源被控制在接近零的水平，并且即時(shí)體積生物質(zhì)/油產(chǎn)率在其最大區(qū)域內(nèi)。收獲一定體積(10％)的培養(yǎng)肉湯，并向發(fā)酵罐中加入相同體積的含有預(yù)定濃度的碳和氮營(yíng)養(yǎng)物以及所有其它必需的礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)物的新鮮培養(yǎng)基，以代替收獲的培養(yǎng)肉湯。補(bǔ)料培養(yǎng)基中的碳和氮也需要處于一定比例以便在培養(yǎng)物中獲得和維持高油含量。對(duì)于圖2，在對(duì)應(yīng)于碳(C)氮(N)比為88:1(摩爾比)的補(bǔ)料培養(yǎng)基中分別使用300g/L和7.5g/L的葡萄糖和硫酸銨((NH4)2SO4)濃度。使用新提供的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)物產(chǎn)生更多的生物質(zhì)和油。一旦碳源已經(jīng)耗盡，重復(fù)部分肉湯收獲和新鮮培養(yǎng)基供應(yīng)循環(huán)。使用這種方法，可以半連續(xù)方式生產(chǎn)和收獲含有高油含量的高密度生物質(zhì)，并且該工藝的總持續(xù)時(shí)間可以比這些微生物的任何分批或補(bǔ)料分批培養(yǎng)模式長(zhǎng)得多。

為了確定所提供的半連續(xù)方法是否優(yōu)于連續(xù)發(fā)酵方法，在連續(xù)培養(yǎng)條件下使用88:1的C:N比使細(xì)胞生長(zhǎng)。結(jié)果示于圖3至7中。具體地，圖3和4示出連續(xù)的發(fā)酵導(dǎo)致不可持續(xù)的發(fā)酵、生物質(zhì)減少和流出物中葡萄糖濃度增加。發(fā)酵因管路堵塞而停止。圖5、6和7示出在半連續(xù)和連續(xù)發(fā)酵條件下生長(zhǎng)的ONC-T18的生物質(zhì)或油產(chǎn)率的比較。半連續(xù)發(fā)酵導(dǎo)致更高的生物質(zhì)和油產(chǎn)率，并允許培養(yǎng)物在高產(chǎn)率條件下維持更長(zhǎng)時(shí)間段。實(shí)際上，在該實(shí)驗(yàn)中，連續(xù)發(fā)酵方法持續(xù)約160小時(shí)，比半連續(xù)發(fā)酵短。

序列表

<110> 瑪拉可再生能源公司

<120> 半連續(xù)培養(yǎng)方法

<130> 095523-0960110 (010WO1)

<150> 62/064,668

<151> 2014-10-16

<160> 1

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 1723

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成構(gòu)建體

<400> 1

gtagtcatac gctcgtctca aagattaagc catgcatgtg taagtataag cgattatact 60

gtgagactgc gaacggctca ttatatcagt tatgatttct tcggtatttt ctttatatgg 120

atacctgcag taattctgga attaatacat gctgagaggg cccgactgtt cgggagggcc 180

gcacttatta gagttgaagc caagtaagat ggtgagtcat gataattgag cagatcgctt 240

gtttggagcg atgaatcgtt tgagtttctg ccccatcagt tgtcgacggt agtgtattgg 300

actacggtga ctataacggg tgacggggag ttagggctcg actccggaga gggagcctga 360

gagacggcta ccacatccaa ggaaggcagc aggcgcgtaa attacccaat gtggactcca 420

cgaggtagtg acgagaaata tcaatgcggg gcgcttcgcg tcttgctatt ggaatgagag 480

caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt 540

aattccagct ccagaagcgt atgctaaagt tgttgcagtt aaaaagctcg tagttgaatt 600

tctggggcgg gagccccggt ctttgcgcga ctgcgctctg tttgccgagc ggctcctctg 660

ccatcctcgc ctcttttttt agtggcgtcg ttcactgtaa ttaaagcaga gtgttccaag 720

caggtcgtat gacctggatg tttattatgg gatgatcaga tagggctcgg gtgctatttt 780

gttggtttgc acatctgagt aatgatgaat aggaacagtt gggggtattc gtatttagga 840

gctagaggtg aaattcttgg atttccgaaa gacgaactac agcgaaggca tttaccaagc 900

atgttttcat taatcaagaa cgaaagtctg gggatcgaag atgattagat accatcgtag 960

tctagaccgt aaacgatgcc gacttgcgat tgcggggtgt ttgtattgga ccctcgcagc 1020

agcacatgag aaatcaaagt ctttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1080

taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg agtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1140

acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagg taggattgac agattgagag ctctttcttg 1200

attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg agtgatttgt ctggttaatt 1260

ccgttaacga acgagacctc ggcctactaa atagcggtgg gtatggcgac atacttgcgt 1320

acgcttctta gagggacatg ttcggtatac gagcaggaag ttcgaggcaa taacaggtct 1380

gtgatgccct tagatgttct gggccgcacg cgcgctacac tgatgggttc aacgggtggt 1440

catcgttgtt cgcagcgagg tgctttgccg gaaggcatgg caaatccttt caacgcccat 1500

cgtgctgggg ctagattttt gcaattatta atctccaacg aggaattcct agtaaacgca 1560

agtcatcagc ttgcattgaa tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac 1620

cgattgaacg gtccgatgaa accatgggat gaccttttga gcgtttgttc gcgagggggg 1680

tcagaactcg ggtgaatctt attgtttaga ggaaggtgaa gtc 1723