本申請要求2014年6月19日提交的系列號為62/014,594的美國臨時專利申請的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容引入本文以供參考。

授予信息

本發(fā)明是在由美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)授予的資助號為F31CA180642-01的政府資助下做出的。政府對本發(fā)明享有一定的權(quán)利。

1.技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及可用于評估EZH2抑制劑在受試者中產(chǎn)生抗癌作用的可能性的生物標(biāo)志物。因此，這些生物標(biāo)志物可用于治療癌癥患者的方法中。

2.

背景技術(shù)：

BRCA1相關(guān)蛋白-1(BAP1)是參與從蛋白質(zhì)中除去泛素的泛素羧基末端水解酶。BAP1通過乳腺癌1型易感蛋白(BRCA1)的RING指結(jié)構(gòu)域結(jié)合BRCA1，并且可以充當(dāng)腫瘤抑制子。BAP1參與轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)、細(xì)胞周期和生長的調(diào)節(jié)、對DNA損傷和染色質(zhì)動力學(xué)的應(yīng)答?；蚪M測序研究表明BAP1的種系突變可以與腫瘤易感綜合征(TPDS)相關(guān)聯(lián)，這涉及增加的癌癥風(fēng)險，包括惡性間皮瘤、葡萄膜黑色素瘤和皮膚黑色素瘤。進(jìn)一步的研究已經(jīng)確定種系BAP1突變與其他癌癥包括肺腺癌和腎細(xì)胞癌相關(guān)。一些BAP1突變的患者的預(yù)后相當(dāng)差，沒有確認(rèn)的有效治療，同時許多惡性間皮瘤的患者將死于他們的疾病。腎細(xì)胞癌患者的BAP1突變預(yù)測預(yù)后不良，葡萄膜黑色素瘤患者的BAP1突變預(yù)測更高的風(fēng)險組和轉(zhuǎn)移。

zeste同系物2增強子(EZH2)是Polyeomb-組(PcG)家族的成員，該家族成員通過組蛋白蛋白質(zhì)的甲基化來參與調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。已經(jīng)開發(fā)了特異性靶向EZH2的藥物，并且這種藥物在具有多種腫瘤的患者中的效果已經(jīng)成為研究的活躍領(lǐng)域。目前EZH2抑制劑正在具有活化EZH2的突變的淋巴瘤患者中臨床測試。因此，本領(lǐng)域需要治療BAP1突變的患者，并需要生物標(biāo)志物，其將用于確定何時應(yīng)當(dāng)使用EZH2抑制劑來治療癌癥。

3.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明涉及一種或多種生物標(biāo)志物用于評價EZH2抑制劑在受試者中產(chǎn)生抗癌作用的可能性的用途。其至少部分基于以下發(fā)現(xiàn)：BAP1活性的喪失導(dǎo)致EZH2表達(dá)和活性的上調(diào)。

因此，在非限制性實施方式中，本發(fā)明提供用于測定患者的樣品中一種或多種生物標(biāo)志物例如BAP1生物標(biāo)志物的存在的檢測方法和試劑盒，以及在選擇癌癥患者的治療方案中和在治療癌癥患者的方法中使用這種測定的方法。

本發(fā)明提供一種用于測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的方法。在非限制性實施方式中，該方法包括測定癌癥的一個或多個細(xì)胞中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)，其中如果BAP1生物標(biāo)志物與參考對照水平相比在癌癥中不存在或以更低水平表達(dá)，則施用治療有效量的EZH2抑制劑以產(chǎn)生抗癌作用。在某些非限制性實施方式中，可以通過免疫熒光、蛋白質(zhì)印跡(Western Blot)、原位雜交或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)來測定BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)。在某些實施方式中，該方法可以進(jìn)一步包括測定樣品中EZH2、SUZ12和/或L3MBTL2的表達(dá)水平。

本發(fā)明還提供用于治療患有癌癥的受試者的方法。在某些非限制性實施方式中，該方法包括從受試者獲得癌癥樣品，并測定樣品中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)水平和/或EZH2和/或SUZ12的表達(dá)水平，其中如果BAP1生物標(biāo)志物不存在或以低于BAP1參考對照水平的水平表達(dá)和/或如果EZH2和/或SUZ12的表達(dá)與EZH2和/或SUZ12參考對照水平相比增加，則開始用治療有效量的EZH2抑制劑治療所述受試者。

本發(fā)明還提供用于測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的方法。在非限制性實施方式中，該方法包括從受試者獲得癌癥樣品，并且測定樣品中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中如果BAP1生物標(biāo)志物與參考對照水平相比在癌癥中不存在或以更低水平表達(dá)，則EZH2抑制劑更可能對癌癥具有抗癌作用。在某些實施方式中，BAP1生物標(biāo)志物是BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物。在某些實施方式中，BAP1生物標(biāo)志物是BAP1核酸生物標(biāo)志物。

本發(fā)明還提供預(yù)測患者中癌癥對EZH2抑制劑的敏感性的方法。在非限制性實施方式中，該方法包括從所述患者獲得癌癥樣品，并且測定樣品包含的細(xì)胞中BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中如果BAP1生物標(biāo)志物與參考對照水平相比不存在或表達(dá)水平降低，則預(yù)測癌癥對EZH2抑制劑敏感。

在某些實施方式中，癌癥可以是惡性間皮瘤、葡萄膜黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、非黑色素瘤皮膚癌、腦膜瘤、膽管癌(cholangiocarcinoma)、平滑肌肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、胰腺癌、副神經(jīng)節(jié)瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、黑素細(xì)胞BAP1突變的非典型皮內(nèi)腫瘤(MBAIT)、急性骨髓性白血病、骨髓增生異常綜合征或膀胱癌。

本發(fā)明提供用于測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的試劑盒。在非限制性實施方式中，試劑盒包含用于檢測BAP1生物標(biāo)志物的工具。在某些實施方式中，用于檢測BAP1生物標(biāo)志物的工具包括一種或多種包裝的引物、探針、陣列/微陣列、生物標(biāo)志物特異性抗體和/或珠。在某些實施方式中，用于檢測BAP1生物標(biāo)志物的工具包括用于檢測BAP1生物標(biāo)志物的一種或多種抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實施方式中，試劑盒還包含用于檢測EZH2和/或SUZ12表達(dá)的一種或多種引物、探針、陣列/微陣列、生物標(biāo)志物特異性抗體和/或珠。

4.附圖說明

圖1.體外BAP1缺失上調(diào)組蛋白H3K27me3。

圖2.EZH2在BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞中過表達(dá)。

圖3.BAP1表達(dá)的獲得/缺失導(dǎo)致PRC2亞基表達(dá)的改變。

圖4.EZH2的抑制降低了間皮瘤異種移植物中的腫瘤體積。

圖5A-L.條件造血缺失Bap1的表征。(a)TCGA AML(急性骨髓性白血病)和(b)間皮瘤患者中BAP1、ASXL1、ASXL2和ASXL3的平均基因表達(dá)，其表示為歸一化讀數(shù)的具有標(biāo)準(zhǔn)誤差的算術(shù)平均值。(c)通過qRT-PCR在C57/B6H小鼠的造血細(xì)胞的純化群體中的Bap1表達(dá)。LT-HSC，長期造血干細(xì)胞(HSC)，(Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48^-)；ST-HSC，短期HSC(Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺CD150⁺CD48⁺)；MPP，多能祖細(xì)胞(Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺CD150^-CD48⁺)；LSK，Lin^-Sca-1⁺c-Kit⁺；MP，髓樣祖細(xì)胞(Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺)；GMP，粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD34⁺Fcγ⁺)；CMP，共同髓樣祖細(xì)胞(Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD34⁺Fcγ^1o)；MEP，巨噬細(xì)胞紅細(xì)胞祖細(xì)胞(Lin^-Sca-1^-c-Kit⁺CD34^-Fcγ^-)；MONO，單核細(xì)胞(Macl⁺Gr1^-)；PMN，(多形核中性粒細(xì)胞，Macl⁺Gr1⁺)；T細(xì)胞，CD3⁺，和B細(xì)胞，B220⁺。(d)從EUCOMM聯(lián)合會獲得的鼠胚胎干細(xì)胞中的Bap1靶向方案。在嵌合體產(chǎn)生后，將小鼠與轉(zhuǎn)基因FLPE小鼠雜交以切除提前終止盒(premature stop cassette)。然后將小鼠雜交成Mx1-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠。在polyIpolyC(pIpC)處理后4周確認(rèn)基因型和切除的基因分型方案。(e)在用(pIpC)處理以誘導(dǎo)切除的對照和Bap1KO小鼠的外周血中白細(xì)胞的計數(shù)和(f)骨髓細(xì)胞(Macl⁺Gr1⁺)的流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。在pIpC誘導(dǎo)的切除后，對照和Bap1KO小鼠骨髓中紅細(xì)胞前體(CD71⁺Ter119⁺)(g)在外周血中的紅細(xì)胞壓積的百分比和(h)流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。(i)對照和Bap1KO骨髓髓樣祖細(xì)胞群體(Lin^-c-Kit⁺Scal^-)的相對頻率。在活的譜系-陰性群體上設(shè)門細(xì)胞。(j)在對照和Bap1KO小鼠中骨髓髓樣祖細(xì)胞群體(GMP、CMP、MEP)的相對定量。(k)表明祖細(xì)胞和GMP擴增的示例對照和骨髓動物的流量圖(Flow plot)。(l)循環(huán)祖細(xì)胞(Ki67/DAPI染色)的流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)；對于所有實驗：n＝5只CON小鼠和n＝8只Bap1KO小鼠。

圖6A-L.Bap1缺失與Asxl1缺失相比導(dǎo)致差異通路激活，和增加的H3K27me3。(a)在條件缺失Bap1并通過對照(同窩出生的Bap1f/f小鼠，CON)和Bap1敲除(Mx1-Cre Bap1f/f小鼠，Bap1KO)骨髓的蛋白質(zhì)印跡驗證Bap1缺失之后三周的脾臟圖像。(b)比較Bap1和Asxl1KO小鼠中髓樣祖細(xì)胞基因表達(dá)的維恩圖(Venn Diagrams)，p<0.05；比較包括在相同方向上的基因重疊和基因改變。(c)在Bap1KO和對照小鼠(n＝3)的分選的粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP；Lin^-c-Kit⁺Sca1^-CD34⁺Fcγ⁺)中的HoxA簇實時定量qPCR(qRT-PCR)。(d)歸一化到總組蛋白H3的來自Bap1KO以及對照的c-Kit⁺富集的骨髓細(xì)胞的純化組蛋白的質(zhì)譜分析。(e)來自Bap1KO和對照骨髓的純化組蛋白中H3K27me3和總H3的蛋白質(zhì)印跡。(f)在CON和Bap1KO樣品中得出(call)的H3K27me3寬結(jié)構(gòu)域(broad domain)的數(shù)目。維恩圖顯示出獨特且重疊的寬結(jié)構(gòu)域。(g)顯示在c-Kit富集的骨髓細(xì)胞(n＝2)中的歸一化H3K27me3讀數(shù)的箱型圖(Box plot)。(h)繪制寬結(jié)構(gòu)域密度，其作為與CON和Bap1KO樣品中得出的H3K27me3結(jié)構(gòu)域的距離的函數(shù)。(i)GSEA顯示與下調(diào)基因的基因表達(dá)相關(guān)性。(j)H3K27me3ChIP-seq在HOXA基因座處的局部圖。(k)如通過比率(KO/CON)對p值顯示的火山圖(volcano plot)中顯示的分選的GMP細(xì)胞中的H3K27me3ChIP-Seq得出的峰(peak calling)。(l)指定的基因標(biāo)記(signature)對H3K27me3結(jié)合基因和RNA-Seq的顯著性。統(tǒng)計學(xué)用Student t檢驗計算；*p<0.05，**p<0.005；報告±標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEM)值。

圖7A-C.Bap1和Asxl1缺失導(dǎo)致相反的基因表達(dá)變化。(a)對照與Bap1KO小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP；Lin^-c-Kit⁺Sca1^-CD34⁺Fcγ⁺)中的差異表達(dá)基因的RNA-Seq數(shù)據(jù)；用DESeq2分析的細(xì)胞(cutoff p值p<0.05)。熱圖(Heatmap)表示基因表達(dá)的增加(紅色)和減少(藍(lán)色)。(b)GSEA分析Bap1KO和Asxl1KO的正向和負(fù)向富集的基因集(geneset)的數(shù)目，達(dá)到FDR<0.25(上圖)。通過RNA-Seq描述在Bap1KO和Asxl1KO髓樣祖細(xì)胞中相反富集的基因集的維恩圖(底部)。(c)在Bap1KO和Asxl1KO祖細(xì)胞中相反富集和統(tǒng)計學(xué)顯著的HoxA簇基因集的GSEA，顯示p值和FDR值。

圖8A-C.Bap1缺失增強PRC2活性。(a)從Bap1KO和對照小鼠的骨髓細(xì)胞純化的組蛋白中歸一化到H3的H3K27me3的EL1SA，(b)相關(guān)于基因轉(zhuǎn)錄起始位點(啟動子、外顯子、內(nèi)含子、下游(+/-2kb)、遠(yuǎn)端(2-5kb)和基因間(>50kb))得出的H3K27me3-寬結(jié)構(gòu)域的百分比。(c)分析來自分選的骨髓群體的已公布的RNA-Seq(Lara-Astiaso等人，2014)，并與使用GSEA分析Bap1缺失后差異下調(diào)且標(biāo)記有H3K27me3的基因進(jìn)行比較。下調(diào)并且由H3K27me3標(biāo)記的基因只與造血祖細(xì)胞群體相關(guān)，表明這些可能是相關(guān)的目標(biāo)群體。這些數(shù)據(jù)是在Bap1KO小鼠模型中觀察到的祖細(xì)胞擴增的解釋。

圖9A-C.體外BAP1擾動導(dǎo)致H3K27me3的變化。(a)用兩個獨立的BAP1shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)的SET2細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡，其顯示純化的組蛋白和全細(xì)胞提取物的BAP1敲減中的H3K27me3水平。(b)用對照和Bap1KO骨髓細(xì)胞進(jìn)行的甲基纖維素檢測。將BAP1cDNA構(gòu)建體重新引入對照和Bap1缺失的細(xì)胞中。對H3K27me3進(jìn)行組蛋白ELISA檢測。用于評估BAP1構(gòu)建體表達(dá)的定量qPCR。(c)在Bap1缺陷型鼠細(xì)胞中重新引入BAP1和去泛素化酶突變體BAP1C91A。對H3K27me3和總H3進(jìn)行組蛋白的蛋白質(zhì)印跡。顯示構(gòu)建體表達(dá)水平的定量qPCR。

圖10A-D.Bap1/Ezh2化合物KO小鼠的表征。(a)各種Bap1/Ezh2基因型的骨髓病理學(xué)。(b)對所指基因型(CD71、Ter119)中的紅細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)染色和定量。(I-IV)表示紅細(xì)胞分化的階段，其中I是最不成熟的，IV是最成熟的。在右側(cè)的代表性流量圖對這些表型的定量。(c)pIpC后4周，所指基因型的脾臟大小。(d)pIpC后4周，所指基因型的白細(xì)胞計數(shù)。

圖11A-K.Bap1缺失誘導(dǎo)的增殖由Ezh2的缺失解除。(a)自Bap1KO、Ezh2KO、Bap1/Ezh2KO和對照小鼠的骨髓純化的組蛋白中H3K27me3水平的蛋白質(zhì)印跡。pIpC后3周，小鼠的指示基因型的(b)脾臟的代表性圖像和(c)脾臟重量的計數(shù)。通過Hemavet定量的(d)外周血白細(xì)胞計數(shù)和(e)紅細(xì)胞壓積的百分比。(f)髓樣祖細(xì)胞(Lin^-c-Kit⁺Sca1^-)和(g)成熟髓樣細(xì)胞(Macl⁺Grl⁺)的流式細(xì)胞術(shù)計數(shù)。(h)使用Ki67和DAPI染色(n＝3/組)在髓樣祖細(xì)胞中的細(xì)胞周期分析。(i)每天兩次500mg/kg EPZ011989治療16天的小鼠(n＝5/組)中的H3K27me3水平的蛋白質(zhì)印跡。(j)治療后的脾臟重量和(k)白細(xì)胞計數(shù)。除非另有說明，n＝5/CON，n＝5/Ezh2KO，n＝8/Bap1KO和n＝11/Bap1/Ezh2KO，統(tǒng)計學(xué)用Student t檢驗計算；*p<0.05，**p<0.005；報告±SEM值。

圖12A-C.在Bap1KO動物中的組蛋白分析。(a)如通過qPCR評估的對照和Bap1KO細(xì)胞中的EZH2轉(zhuǎn)錄。將細(xì)胞用空載體或BAP1過表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)。(b)在對照和Bap1KO動物c-kit富集的骨髓細(xì)胞中的組蛋白質(zhì)譜，n＝2。(c)在過表達(dá)FLAG標(biāo)記的BAP1、ASXL1和Bmi1的293T細(xì)胞中的H4K20me1ChIP-qPCR實驗。

圖13A-L.BAP1耗盡導(dǎo)致PRC2組分表達(dá)的增加、增加的H4K20me1和L3MBTL2的去泛素化。(a)在SET2細(xì)胞中內(nèi)源性EZH2和BAP1的免疫共沉淀，然后通過蛋白質(zhì)印跡分析(在核酸酶(benzonase)存在下進(jìn)行以抑制依賴于DNA的相互作用)。(b)通過qRT-PCR的分選的粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP；Lin^-c-Kit⁺Sca-1^-CD34⁺Fcγ⁺)中的Bap1、Ezh2和Suz12表達(dá)。(c)Bap1KO和對照小鼠的骨髓細(xì)胞中Bap1和Ezh2的蛋白質(zhì)印跡分析。(d)組蛋白質(zhì)譜實驗的H4K20me1定量。BAP1野生型(MSTO-211H、Meso10)和缺失的突變型細(xì)胞系H226、催化突變型H2452中(e)通過Cell Titer Glo活性檢測所評估的細(xì)胞活力和(f)SETD8過表達(dá)實驗的膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)檢測。(g)SETD8過表達(dá)的BAP1突變型細(xì)胞中SETD8和EZH2的定量qPCR。(h)BAP1野生型細(xì)胞系中SETD8和EZH2的蛋白質(zhì)印跡分析。(i)用DMSO或5、10、20μM BVT594治療的細(xì)胞的Cell Titer Glo測定。(j)在BAP1野生型(Met5a、JMN)和突變型間皮瘤細(xì)胞系(H226、H2452、H28)中的L3MBTL2和BAP1表達(dá)。(k)過表達(dá)Myc-His標(biāo)記的泛素和L3MBTL2cDNA和不同水平的BAP1(0、5μg、2.5μg和1μg)的293T細(xì)胞。使用Ni-珠和一系列嚴(yán)格洗滌進(jìn)行免疫共沉淀實驗。(l)描述BAP1的調(diào)節(jié)導(dǎo)致對染色質(zhì)和基因表達(dá)的作用的模型。統(tǒng)計學(xué)用Student t檢驗計算；*p<0.05，**p<0.005；報告±SEM值。

圖14A-B.BAP1、ASXL1、HCF-1和OGT結(jié)合的分析。(a)BAP1、ASXL1、HCF-1和OGT ChIP-Seq的K-均值聚類分析。(b)在BAP1結(jié)合簇中的Homer從頭(de novo)基序分析。

圖15A-I.L3MBTL2和BAP1共調(diào)節(jié)EZH2。(a)在對照和Bap1KO骨髓細(xì)胞中Bap1和L3mblt2的表達(dá)。(b)通過qPCR在GMP中L3mbtl2的表達(dá)。(c)用25μM MG132處理的H226和H2452細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡。使用含有2％SDS的裂解緩沖液提取不溶性組分。(d)在過表達(dá)L3MBTL2的細(xì)胞系中EZH2的表達(dá)。(e)用含有1.9kB EZH2啟動子的構(gòu)建體和海腎(Renilla)對照載體瞬時轉(zhuǎn)染到具有空載體、BAP1或L3MBTL2表達(dá)載體的293T細(xì)胞中，進(jìn)行EZH2啟動子活性測定。在這些情況的每一個中，螢火蟲熒光素酶活性歸一化為海腎活性。(f)兩種獨立的發(fā)夾結(jié)構(gòu)(hairpin)用于在SET2細(xì)胞中敲減L3MBTL2蛋白。對L3MBTL2、EZH2和肌動蛋白進(jìn)行包括短和長時間曝光的蛋白質(zhì)印跡分析。(g)L3MBTL2的ChIP，然后是293T細(xì)胞中的EZH2、SUZ12、E2F6(陽性對照)、PHF20(陽性對照)和MORC3(陰性對照)基因座的qPCR。(h)抗FLAG ChIP，然后是在過表達(dá)FLAG-L3MBTL2或FLAG-BAP1的293T細(xì)胞中的EZH2基因座處的qPCR。JAM2是陽性對照。與沒有FLAG過表達(dá)的293T細(xì)胞比較。(i)在293T細(xì)胞中各自IP后的L3MBTL2和BAP1的蛋白質(zhì)印跡。包括瓊脂糖DNA凝膠以顯示DNA消化。

圖16A-H.BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞系和異種移植模型對EZH2抑制敏感。(a)與匹配的正常對照相比，TCGA間皮瘤患者中EZH2轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。(b)在BAP1野生型和表達(dá)空載體或靶向EZH2的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的突變型細(xì)胞系中的膜聯(lián)蛋白V測定。(c)間皮瘤細(xì)胞系中膜聯(lián)蛋白V實驗的定量。(d)植入NOD-SCID小鼠中的表達(dá)EZH2發(fā)夾結(jié)構(gòu)的Meso10和H226細(xì)胞系的腫瘤大小，n＝6/組。(e)用1.25μM EPZ011989治療2周后的2D Cell Titer Glo活力測定。(f)用1.25μM EPZ011989治療3周后的3D Cell Titer Glo活力測定。植入NOD-SCID小鼠并用載體或500mg/kg BID EPZ011989治療的(g)BAP1突變型(MSTO和Meso10)或(h)野生型細(xì)胞(H226和H2452)的腫瘤大小形成。每周3次測量腫瘤，n＝6/組。通過提取的腫瘤中的組蛋白蛋白質(zhì)印跡評估靶抑制(在各個圖中顯示)。用載體和EPZ011989治療的H2452細(xì)胞的肺部病理學(xué)。箭頭指示大量轉(zhuǎn)移的腫瘤。統(tǒng)計學(xué)用Student t檢驗計算；*p<0.05，**p<0.005；報告±SEM值。

圖17.在分選的群體和整個骨髓中PRC2組分表達(dá)增加。

圖18.在BAP1KO小鼠中H3K27me3局部和全局增加。通過在對照和BAP1KO骨髓上進(jìn)行酸提取然后進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡來評估BAP1KO動物中的組蛋白甲基化。染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-Seq)也在cKit富集的骨髓上完成。用RNA測序數(shù)據(jù)與ChIP-Seq疊合分析，表明在BAP1KO小鼠中下調(diào)的基因越來越多地標(biāo)記有H3K27me3。在BAP1KO小鼠中，觀察到H3K27me3在EZH2靶基因如HOXA基因座處增加。

圖19.在BAP1KO細(xì)胞中H3K27me2/3的上調(diào)以H3K27me0/1為代價發(fā)生。

圖20A-D.BAP1突變型細(xì)胞系對EZH2抑制最敏感。(a)過表達(dá)EZH2的Meso10細(xì)胞系在注射到NOD-SCID小鼠的側(cè)部后逐漸增殖，(b)EZH2在MSTO-211H和Meso10細(xì)胞系中過表達(dá)。隨著EZH2過表達(dá)，細(xì)胞系對EZP011989變得越來越敏感。(c)當(dāng)用EZH2抑制劑GSK126治療時，BAP1突變型細(xì)胞的侵襲性變得更小。(d)用GSK126治療后細(xì)胞系H226中E-鈣粘蛋白(E-Cadherin)表達(dá)增加。

圖21A-C.BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞系和異種移植模型對EZH2抑制敏感。(a)每天用150mg/kg的GSK126或載體(每組n＝10只小鼠)治療的H2452異種移植物的腫瘤體積。每組的5只小鼠在治療16天后安樂死以評估H3K27me3缺失。剩余的小鼠在試驗的剩余時間進(jìn)行治療。(b)體內(nèi)治療小鼠治療16天后的腫瘤中H3K27me3水平的組蛋白ELISA和蛋白質(zhì)印跡分析。(c)從載體治療和GSK126治療的小鼠中提取的腫瘤的H&E染色、Ki67染色和TUNEL染色，10倍放大。

5.具體實施方式

為了清楚而不是當(dāng)作限制，將本發(fā)明的詳細(xì)描述分為以下子部分：

(i)BAP1生物標(biāo)志物；

(ii)EZH2抑制劑；

(iii)癌癥靶標(biāo)；

(iv)生物標(biāo)志物檢測；

(v)使用方法；和

(vi)試劑盒。

5.1BAP1生物標(biāo)志物

本文使用的術(shù)語“生物標(biāo)志物”包括與受試者中的BRCA1相關(guān)蛋白-1的活性水平相關(guān)的核酸和蛋白質(zhì)，所述BRCA1相關(guān)蛋白-1在本文中表示為BAP1。

本文可互換使用的“患者”或“受試者”是指人或非人受試者。非人受試者的非限制性實例包括非人靈長類、狗、貓、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、豬、家禽、馬、牛、山羊、綿羊、鯨類等。

在某些非限制性實施方式中，公開的BAP1生物標(biāo)志物可以是核酸。例如但不限于，生物標(biāo)志物可以是脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，例如mRNA。

在某些非限制性實施方式中，BAP1核酸生物標(biāo)志物可以是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NG_031859.1或NM_004656所示序列的人BAP1核酸，或編碼具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_004647所示氨基酸序列的BAP1蛋白分子的核酸。

在具體的非限制性實施方式中，BAP1核酸生物標(biāo)志物可以是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NM_027088所示序列的小鼠BAP1核酸，或編碼具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_081364.1所示氨基酸序列的BAP1蛋白分子的核酸。

在具體的非限制性實施方式中，BAP1核酸生物標(biāo)志物是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NM_001107292.1所示序列的大鼠BAP1核酸，或編碼具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_001100762.1所示氨基酸序列的BAP1蛋白分子的核酸。

在某些非限制性實施方式中，BAP1生物標(biāo)志物可以是蛋白質(zhì)。

在具體的非限制性實施方式中，BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物可以是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_004647所示氨基酸序列的人BAP1蛋白。

在具體的非限制性實施方式中，BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_081364.1所示氨基酸序列的小鼠BAP1蛋白。

在具體的非限制性實施方式中，BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物是具有如NCB1數(shù)據(jù)庫登錄號NP_001100762.1所示氨基酸序列的大鼠BAP1蛋白。

在某些實施方式中，將BAP1生物標(biāo)志物的水平與參考對照水平進(jìn)行比較。本文可互換使用的BAP1的“參考對照水平”或“參考對照表達(dá)水平”可以使用例如參考對照樣品來確立。參考對照樣品的非限制性實例包括具有野生型BAP1活性的正常和/或健康細(xì)胞。在某些實施方式中，BAP1的參考對照水平可以使用例如位于患者腫瘤附近的正常細(xì)胞，例如良性細(xì)胞來確立。

在本發(fā)明的某些非限制性實施方式中，可以通過評價BAP1功能來評價BAP1生物標(biāo)志物的水平，其中BAP1表達(dá)水平與BAP1功能水平直接成正比。在一個非限制性實例中，BAP1的功能可以是EZH2表達(dá)(例如，EZH2蛋白表達(dá)或核酸表達(dá))的下調(diào)。例如但不限于，可以通過測定與EZH2參考對照水平相比受試者的癌細(xì)胞中EZH2的表達(dá)水平來測定BAP1生物標(biāo)志物的水平。在某些實施方式中，可以使用具有野生型和/或正常EZH2活性和/或正常BAP1活性的正常和/或健康細(xì)胞確立EZH2參考對照水平。在某些非限制性實施方式中，EZH2是具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NG_032043.1、NM_004456.4、NM_001203249.1、NM_152998.2、NM_001203247.1和/或NM_001203248.1所示序列的人EZH2核酸，或編碼具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_001190176.1、NP_001190177.1、NP_001190178.1、NP_004447.2和/或NP_694543.1所示氨基酸序列的EZH2蛋白分子的核酸。在一個具體的非限制性實施方式中，EZH2是具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_001190176.1、NP_001190177.1、NP_001190178.1、NP_004447.2和/或NP_694543.1所示氨基酸序列的人EZH2蛋白。

在一個非限制性實例中，BAP1的功能可以是SUZ12表達(dá)(例如，SUZ12蛋白表達(dá)或核酸表達(dá))的調(diào)節(jié)。在某些非限制性實施方式中，可以通過測定與SUZ12參考對照水平相比受試者的癌細(xì)胞中SUZ12的表達(dá)水平來測定BAP1生物標(biāo)志物的水平。在某些實施方式中，可以使用具有野生型和/或正常SUZ12活性和/或正常BAP1活性的正常和/或健康細(xì)胞來確立SUZ12參考對照水平。在某些非限制性實施方式中，SUZ12是具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NM_015355.2所示序列的人SUZ12核酸，或編碼具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_056170.2所示氨基酸序列的SUZ12蛋白分子的核酸。在一個具體的非限制性實施方式中，SUZ12是具有如NCBI數(shù)據(jù)庫登錄號NP_056170.2所示氨基酸序列的人SUZ12蛋白。

其中與參考對照表達(dá)水平的比較在本文中是指相對于相同物種內(nèi)的參考對照表達(dá)水平來評估生物標(biāo)志物。例如，將人BAP1生物標(biāo)志物表達(dá)水平和/或存在與人BAP1參考對照水平進(jìn)行比較。

在特定的非限制性實施方式中，BAP1生物標(biāo)志物的不存在和/或降低的表達(dá)是指檢測到相對于參考對照水平小于約90％、小于約80％、小于約70％、小于約60％、小于約50％、小于約40％、小于約30％的表達(dá)。

5.2EZH2抑制劑

EZH2抑制劑的非限制性實例包括抑制和/或降低EZH2的表達(dá)和/或活性的化合物、分子、化學(xué)品、多肽、蛋白質(zhì)。EZH2抑制劑的另外的非限制性實例包括S-腺苷基-甲硫氨酸競爭性小分子抑制劑。在特定的非限制性實施方式中，EZH2抑制劑衍生自四甲基哌啶基化合物。其它非限制性實例包括UNC1999、3-去氮腺嘌呤A(DZNep)、EI1、EPZ-5676、EPZ-6438、GSK343、EPZ005687、EPZ011989和GSK126。

EZH2抑制劑的其它非限制性實例描述于Garapaty-Rao等，Chemistry and Biology，20：第1-11頁(2013)，PCT專利申請?zhí)朩O2013/138361、WO 2013/049770和WO 2003/070887，以及美國專利申請?zhí)朥S 2014/0275081、US 2012/0071418、US 2014/0128393和US2011/0251216中，其內(nèi)容是將其全部內(nèi)容引入本文以供參考。

EZH2抑制劑的其它非限制性實例包括特異性抑制EZH2的表達(dá)或活性的核酶、反義寡核苷酸、shRNA分子和siRNA分子。EZH2抑制劑的一個非限制性實例包括與EZH2核酸序列的至少一部分同源的反義、shRNA或siRNA核酸序列，其中所述部分相對于EZH2序列的同源性為至少約75％或至少約80％或至少約85％或至少約90％或至少約95％或至少約98％，其中百分比的同源性可以通過例如BLAST或FASTA軟件測定。在某些非限制性實施方式中，互補部分可以構(gòu)成至少10個核苷酸或至少15個核苷酸或至少20個核苷酸或至少25個核苷酸或至少30個核苷酸，并且反義核酸、shRNA或siRNA分子的長度可以至多15或至多20或至多25或至多30或至多35或至多40或至多45或至多50或至多75或至多100個核苷酸。反義、shRNA或siRNA分子可以包含DNA或非典型或非天然存在的殘基，例如但不限于硫代磷酸酯殘基。

在某些非限制性實施方式中，EZH2抑制劑可以單獨使用或與一種或多種抗癌劑組合使用?？拱﹦┛梢允蔷哂锌拱┳饔玫娜魏畏肿?、化合物化學(xué)品或組合物?？拱﹦┌ǖ幌抻诨焺?、放療劑、細(xì)胞因子、抗血管生成劑、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑或抗癌免疫毒素比如抗體?！芭c...組合”是指作為治療方案或計劃的一部分將EZH2抑制劑和一種或多種抗癌劑施用給受試者。這些術(shù)語不要求EZH2抑制劑和一種或多種抗癌劑在施用前物理結(jié)合，也不要求它們在相同的時間范圍內(nèi)施用。

5.3癌癥靶標(biāo)

屬于本發(fā)明公開的主題的癌癥的非限制性實例包括惡性間皮瘤、葡萄膜黑色素瘤、腎細(xì)胞癌、皮膚黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、非黑色素瘤皮膚癌、腦膜瘤、膽管癌、平滑肌肉瘤、神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤、胰腺癌、副神經(jīng)節(jié)瘤、惡性纖維組織細(xì)胞瘤、骨髓增生異常綜合征、急性骨髓性白血病、黑素細(xì)胞BAP1突變的非典型皮內(nèi)腫瘤(MBAIT)和膀胱癌。

5.4生物標(biāo)志物檢測

定性和定量地檢測和/或測定BAP1核酸生物標(biāo)志物、EZH2核酸、L3MBTL2核酸或SUZ12核酸的表達(dá)水平的方法包括但不限于，包括常規(guī)PCR、qPCR和數(shù)字PCR的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、原位雜交(例如但不限于熒光原位雜交(“FISH”))、凝膠電泳、測序和序列分析、微陣列分析和本領(lǐng)域已知的其它技術(shù)。

在某些實施方式中，檢測方法可以是實時PCR(RT-PCR)、定量PCR、熒光PCR、RT-MSP(RT甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))、DNA的PicoGreen^TM(Molecular Probes，Eugene，OR)檢測、放射免疫測定或DNA的直接放射性標(biāo)記。例如但不限于，可以將核酸生物標(biāo)志物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)；或者，如在美國專利號為5,322,770中所述的，單一酶可用于兩個步驟，或者如R.L.Marshall等人，PCR Methods and Applications 4：80-84(1994)所述，可以將生物標(biāo)志物反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進(jìn)行對稱缺口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-AGLCR)。用于所公開方法的引物的非限制性實例在表1中示出。

在某些實施方式中，實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)用于評價生物標(biāo)志物的mRNA水平。生物標(biāo)志物和對照mRNA的水平可以在癌組織或細(xì)胞以及相鄰的良性組織中定量。在某些實施方式中，一種或多種生物標(biāo)志物的水平可以在生物樣品中定量。

在非限制性實施方式中，進(jìn)行本發(fā)明的檢測方法可以不依賴于擴增，例如不產(chǎn)生靶序列的任何拷貝或復(fù)制、不涉及任何聚合酶、或不需要任何熱循環(huán)。在某些實施方式中，本發(fā)明的檢測可以使用在2006年6月19日提交的系列號為11/471,025的美國申請中描述的QuantiGene^TM方法所示的原理來進(jìn)行，并且該申請引入本文以供參考。

在某些實施方式中，可以使用原位雜交可視化，其中放射性標(biāo)記的反義RNA探針與生物樣品例如活檢樣品的薄切片雜交、洗滌、用RNA酶切割并暴露于敏感性乳劑用于放射自顯影。樣品可以用蘇木精染色以顯示樣品的組織學(xué)組成，并且用合適的濾光器的暗場成像顯示顯影的乳劑。也可以使用非放射性標(biāo)記比如地高辛。

在某些非限制性實施方式中，可以通過熒光原位雜交(FISH)進(jìn)行核酸生物標(biāo)志物表達(dá)的評價。FISH是可以直接鑒定細(xì)胞中DNA或RNA的特定區(qū)域的技術(shù)，因此使得能夠目測測定組織樣品中的生物標(biāo)志物表達(dá)。FISH方法具有以下優(yōu)點，如更客觀的評分系統(tǒng)和內(nèi)置的內(nèi)部對照的存在，該內(nèi)部對照由相同樣品中的所有非腫瘤細(xì)胞中存在的生物標(biāo)志物基因信號組成。FISH是一種可以相對快速和靈敏、并且也可以自動化的直接的原位技術(shù)。當(dāng)單獨通過FISH難以測定生物標(biāo)志物的表達(dá)水平時，可以將免疫組織化學(xué)與FISH方法相結(jié)合。

在某些實施方式中，可以在DNA陣列、芯片或微陣列上檢測核酸生物標(biāo)志物的表達(dá)。將生物標(biāo)志物對應(yīng)的寡核苷酸固定在芯片上，然后將芯片與從受試者獲得的生物樣品例如腫瘤樣品的標(biāo)記核酸雜交。包含生物標(biāo)志物轉(zhuǎn)錄物的樣品獲得陽性雜交信號。制備DNA陣列的方法及其應(yīng)用是本領(lǐng)域公知的。(參見，例如美國專利號6,618,6796、6,379,897、6,664,377、6,451,536、548,257；美國專利申請?zhí)?0030157485和Schena等人1995Science 20：467-470；Gerhold等人1999Trends in Biochem.Sci.24，168-173；和Lennon等人2000Drug discovery Today 5：59-65，其全部內(nèi)容引入本文以供參考)。也可以進(jìn)行基因表達(dá)的連續(xù)分析(SAGE)(參見，例如美國專利申請?zhí)?0030215858)。

在某些實施方式中，為了監(jiān)測核酸生物標(biāo)志物例如BAP1mRNA的表達(dá)水平，可以從待測生物樣品中提取mRNA、逆轉(zhuǎn)錄并可以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的cDNA探針。然后將標(biāo)記的cDNA探針應(yīng)用于能夠與生物標(biāo)志物雜交的微陣列，允許探針與微陣列雜交并掃描載玻片以測量熒光強度。該強度與雜交強度和生物標(biāo)志物的表達(dá)水平相關(guān)。

用于檢測核酸生物標(biāo)志物的探針的類型包括cDNA、核糖核酸探針、合成的寡核苷酸和基因組探針。使用的探針的類型通常由具體情況決定，例如，比如核糖核酸探針用于原位雜交，而cDNA用于RNA印跡法。在某些非限制性實施方式中，探針針對具體生物標(biāo)志物RNA獨特的核苷酸區(qū)域。探針可以所需的一樣短，以差異性識別具體生物標(biāo)志物mRNA轉(zhuǎn)錄物，并且可以短至例如15個堿基。也可以使用至少17個堿基、18個堿基和20個堿基的探針。在某些實施方式中，引物和探針在嚴(yán)格條件下與具有對應(yīng)于靶基因的核苷酸序列的核酸片段特異性雜交。本文使用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”是指只有在序列之間存在至少95％或至少97％的同一性時才會發(fā)生雜交。

探針標(biāo)記的形式可以是任何合適的形式，比如使用例如³²P和³⁵S的放射性同位素、或熒光團?？梢酝ㄟ^使用適當(dāng)?shù)臉?biāo)記的堿基來實現(xiàn)用放射性同位素的標(biāo)記，無論所述探針是化學(xué)合成還是生物合成的。

用于檢測和/或測定蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物例如BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物、EZH2蛋白、L3MBTL2蛋白或SUZ12蛋白的水平的方法，對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的，并且包括但不限于質(zhì)譜技術(shù)、一維或二維凝膠分析系統(tǒng)、色譜、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)、酶免疫測定法(EIA)、蛋白質(zhì)印跡、免疫沉淀和免疫組織化學(xué)。這些方法使用抗體或抗體等同物來檢測蛋白質(zhì)，或使用生物物理技術(shù)。也可以使用抗體陣列或蛋白質(zhì)芯片，參見，例如美國專利申請?zhí)?003/0013208、2002/0155493、2003/0017515以及美國專利號6,329,209和6,365,418，其全部內(nèi)容引入本文以供參考。

在某些非限制性實施方式中，用于測量蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物表達(dá)的檢測方法包括以下步驟：將生物樣品例如組織樣品與選擇性結(jié)合生物標(biāo)志物的抗體或其變體(例如，片段)接觸，以及檢測抗體或其變體是否結(jié)合樣品。該方法還可以包括將樣品與第二抗體例如標(biāo)記的抗體接觸。該方法還可以包括例如一個或多個洗滌步驟，以除去一種或多種試劑。

在某些非限制性實施方式中，蛋白質(zhì)印跡可用于檢測和定量生物標(biāo)志物蛋白質(zhì)表達(dá)水平。細(xì)胞可以在裂解緩沖液中勻漿以形成裂解物，然后進(jìn)行SDS-PAGE并印跡至膜，比如硝酸纖維素濾膜。然后將抗體(未標(biāo)記的)與膜接觸，并通過二次免疫試劑例如標(biāo)記的蛋白A或抗免疫球蛋白(合適的標(biāo)記包括¹²⁵I、辣根過氧化物酶和堿性磷酸酶)來分析。也可以使用色譜檢測。在某些實施方式中，可以使用增強的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(例如，來自PerkinElmer Life Sciences,Boston,Mass.)，用抗生物標(biāo)志物的抗體進(jìn)行免疫檢測。然后可以將膜剝離，并用對照蛋白例如肌動蛋白特異性的對照抗體再印跡。

免疫組織化學(xué)可用于檢測例如在活檢樣品中的生物標(biāo)志物的表達(dá)和/或存在?？梢詫⒑线m的抗體與例如細(xì)胞薄層接觸，接著洗滌以除去未結(jié)合的抗體，然后與標(biāo)記的第二抗體接觸?？梢酝ㄟ^熒光標(biāo)志物、比如過氧化物酶的酶類、抗生物素蛋白或放射性標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記。該試驗可以使用顯微鏡可視地評分，并且可以對結(jié)果進(jìn)行定量。基于機器或自動成像系統(tǒng)也可用于測量生物標(biāo)志物的免疫染色結(jié)果。

適合用于免疫組織化學(xué)的各種自動化的樣品處理、掃描和分析系統(tǒng)在本領(lǐng)域中是可獲得的。這樣的系統(tǒng)可以包括自動化的染色(參見，例如Benchmark系統(tǒng)，Ventana Medical Systems，Inc.)和顯微鏡掃描、計算機化的圖像分析、連續(xù)切片比較(以對樣品的方向和大小中的變量進(jìn)行控制)、數(shù)字報告生成，以及樣品(比如放置組織切片的載玻片)的存檔和跟蹤。細(xì)胞成像系統(tǒng)是商業(yè)上可獲得的，其將常規(guī)光學(xué)顯微鏡與數(shù)字圖像處理系統(tǒng)相結(jié)合以對細(xì)胞和組織包括免疫染色的樣品進(jìn)行定量分析。參見，例如CAS-200系統(tǒng)(Becton，Dickinson&Co.)。

針對生物標(biāo)志物的標(biāo)記抗體也可以用于成像目的，例如，以檢測受試者的細(xì)胞中生物標(biāo)志物的存在。合適的標(biāo)記包括放射性同位素，碘(¹²⁵I、¹²¹I)、碳(¹⁴C)、硫(³⁵S)、氚(³H)、銦(¹¹²In)和锝(99mTc)，熒光標(biāo)記比如熒光素和羅丹明，以及生物素?？梢允褂貌煌拿副热邕^氧化物酶、堿性磷酸酶或不同的色原體比如DAB、AEC或Fast Red來顯現(xiàn)免疫酶相互作用。標(biāo)記的抗體或抗體片段將優(yōu)先聚集在包含生物標(biāo)志物的細(xì)胞的位置處。然后可以使用已知的技術(shù)檢測標(biāo)記的抗體或其變體，例如抗體片段。

抗體包括與待檢測的生物標(biāo)志物足夠有力并特異性結(jié)合的、無論天然或合成的、全長或其片段、單克隆或多克隆的任何抗體?？贵w可以具有至多約10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M、10^-10M、10^-11M和10^-12M的K_d。短語“特異性結(jié)合”是指，例如抗體與表位或抗原或抗原決定簇的結(jié)合，其結(jié)合方式為可以用相同或相似的表位、抗原或抗原決定簇的第二制備物置換或競爭該結(jié)合。

可以使用的抗體及其衍生物包括多克隆或單克隆抗體、合成的和工程化的抗體、嵌合的、人的、人源化的、靈長類化的(CDR移植)、鑲嵌化的(veneered)或單鏈抗體、相產(chǎn)生的抗體(phase produced antibody)(例如，來自噬菌體展示文庫)、以及抗體的功能性結(jié)合片段。例如，可以使用能夠結(jié)合生物標(biāo)志物或其部分的抗體片段，其包括但不限于Fv、Fab、Fab’和F(ab’)₂片段。這樣的片段可以通過酶剪切或通過重組技術(shù)產(chǎn)生。市售的BAP1抗體的非限制性實例包括來自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)的SC-8132、SC-48386、SC-13576、SC-28236、SC-8133和SC-28383，來自Abcam(Cambridge，England)的Ab167250和來自Sigma-Aldrich(St.Louis，MO)的HPA028814。市售的EZH2抗體的非限制性實例包括來自Active Motif(Carlsbad，CA)的Cat No.39933、39875和39901，來自Millipore(Billerica，MA)的07-689，和來自Thermo Fisher Scientific(Waltham，MA)的PA1-46476和PA5-24594。市售的SUZ12抗體的非限制性實例包括來自Abcam的Ab12073。市售的L3MBTL2抗體的非限制性實例包括來自Active Motif的39569。

在某些非限制性實施方式中，使用除抗體之外的特異性結(jié)合多肽的試劑，比如肽?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法，例如肽噬菌體展示文庫，來鑒定特異性結(jié)合的肽。通常，可以使用能夠檢測生物標(biāo)志物多肽的一種試劑，從而檢測生物標(biāo)志物的存在和/或進(jìn)行定量。本文定義的“試劑”是指能夠鑒定或檢測生物樣品中的生物標(biāo)志物(例如，鑒定或檢測生物標(biāo)志物的mRNA、生物標(biāo)志物的DNA、生物標(biāo)志物的蛋白質(zhì))的物質(zhì)。

此外，可以使用質(zhì)譜比如MALDI/TOF(飛行時間)、SELDI/TOF、液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)、氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)、高效液相色譜-質(zhì)譜(HPLC-MS)、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜、核磁共振光譜或串聯(lián)質(zhì)譜(例如MS/MS、MS/MS/MS、ESI-MS/MS等)來檢測生物標(biāo)志物。參見，例如美國專利申請?zhí)?003/0199001、2003/0134304、2003/0077616，其全部內(nèi)容引入本文以供參考。

質(zhì)譜方法是本領(lǐng)域公知的，并且已經(jīng)用于定量和/或鑒定生物分子，比如蛋白質(zhì)(參見，例如Li等人(2000)Tibtech 18：151-160；Rowley等人(2000)Methods 20：383-397；和Kuster和Mann(1998)Curr.Opin.Structural Biol.8：393-400)。而且，已經(jīng)開發(fā)了允許對分離的蛋白質(zhì)進(jìn)行至少部分從頭測序的質(zhì)譜技術(shù)。Chait等人，Science 262：89-92(1993)；Keough等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.96：7131-6(1999)；綜述見Bergman，EXS 88：133-44(2000)。

檢測生物標(biāo)志物或其它物質(zhì)的存在通常包括檢測信號強度。這可以依次反映結(jié)合于底物的多肽的數(shù)量和特性。例如，在某些實施方式中，可以比較(例如，可視化地或通過計算機分析)來自第一樣品和第二樣品的光譜的峰值的信號強度，以測定具體生物標(biāo)志物的相對量。軟件程序比如Biomarker Wizard程序(Ciphergen Biosystems,Inc.，F(xiàn)remont，Calif.)可用于幫助分析質(zhì)譜。

用于測定樣品中的核酸和/或蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物表達(dá)的其它方法描述于例如美國專利號6,271,002；美國專利號6,218,122；美國專利號6,218,114；和美國專利號6,004,755；和Wang等人，J.Clin.Oncol.，22(9)：1564-1671(2004)；和Schena等人，Science，270：467-470(1995)；所有這些的全部內(nèi)容引入本文以供參考。

5.5使用方法

在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明提供了確定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的方法，其包括測定BAP1生物標(biāo)志物例如BAP1核酸和/或蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的存在、不存在和/或表達(dá)水平。用于測定BAP1生物標(biāo)志物的存在、不存在和/或表達(dá)水平的方法在上文5.4節(jié)中闡述。適合于治療的癌癥在上文5.3節(jié)中描述。EZH2抑制劑在上文5.2節(jié)中描述。

在某些實施方式中，本公開提供在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的方法，其包括測定癌癥細(xì)胞是否包含BAP1生物標(biāo)志物，其中如果BAP1生物標(biāo)志物與參考對照水平相比在癌癥中不存在和/或以更低水平表達(dá)，則施用治療有效量的EZH2抑制劑以產(chǎn)生抗癌作用?；蛘撸绻l(fā)現(xiàn)BAP1生物標(biāo)志物以相對于參考對照水平相同或更高的水平表達(dá)，則施用不是EZH2抑制劑的試劑進(jìn)行替代療法。

“治療有效量”是指能夠?qū)崿F(xiàn)一種或多種抗癌作用、延長存活和/或延長直至復(fù)發(fā)的時期的量。

“抗癌作用”是指聚集的癌細(xì)胞塊的減少、癌細(xì)胞生長速率的降低、癌細(xì)胞增殖的減少、腫瘤塊的減少、腫瘤體積的減少、腫瘤細(xì)胞增殖的減少、腫瘤生長速率的降低和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的減少。在某些實施方式中，抗癌作用可以指被診斷患有癌癥的患者的完全應(yīng)答、部分應(yīng)答、穩(wěn)定的疾病(無進(jìn)展或復(fù)發(fā))、具有更晚的復(fù)發(fā)或無進(jìn)展存活的應(yīng)答。

在某些實施方式中，本公開提供在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的方法，其包括測定癌癥的一個或多個細(xì)胞中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中如果BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與參考對照水平相比在細(xì)胞中不存在和/或以更低水平表達(dá)，則施用治療有效量的EZH2抑制劑以產(chǎn)生抗癌作用。在某些實施方式中，參考對照是位于癌癥鄰近處的正常細(xì)胞例如良性細(xì)胞中的BAP1水平。

在某些非限制性實施方式中，癌癥樣品和/或參考對照樣品中的BAP1水平可針對兩種樣品中存在的核酸和/或蛋白質(zhì)進(jìn)行歸一化，例如參考蛋白或核酸比如管家基因和/或蛋白質(zhì)，以允許比較。例如，但不限于，參考蛋白或核酸可以是肌動蛋白或微管蛋白。

在某些非限制性實施方式中，本公開提供預(yù)測患者中的癌癥對EZH2抑制劑的敏感性的方法，其包括從患者獲得癌癥的樣品，并且測定樣品包含的細(xì)胞中BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中如果BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與參考對照水平相比不存在或表達(dá)降低，則預(yù)測癌癥對EZH2抑制劑敏感。在某些實施方式中，如果預(yù)測患者的癌癥對EZH2抑制劑敏感，則可以用EZH2抑制劑治療患者。在某些實施方式中，如果預(yù)測患者的癌癥對EZH2抑制劑不敏感，則可以用不是EZH2抑制劑的試劑治療患者。

在某些非限制性實施方式中，本公開提供治療患有癌癥的受試者的方法。例如但不限于，該方法包括從受試者獲得癌癥的樣品，并測定樣品中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)水平，其中如果BAP1生物標(biāo)志物不存在或以低于BAP1參考對照水平的水平表達(dá)，則用治療有效量的EZH2抑制劑開始治療受試者?；蛘?，如果發(fā)現(xiàn)BAP1生物標(biāo)志物以相對于參考對照水平相同或更高的水平表達(dá)，則可用不是EZH2抑制劑的試劑治療受試者。

在某些實施方式中，本發(fā)明的方法還包括檢測樣品中EZH2、L3MBTL2和/或SUZ12的表達(dá)水平。例如但不限于，可以檢測EZH2、L3MBTL2和/或SUZ12的mRNA和/或蛋白質(zhì)表達(dá)水平。在某些實施方式中，用于治療患有癌癥的受試者的方法包括，從受試者獲得癌癥的樣品，并且測定樣品中BAP1生物標(biāo)志物的表達(dá)水平以及EZH2、L3MBTL2和/或SUZ12的表達(dá)水平，其中如果BAP1生物標(biāo)志物不存在或以低于BAP1參考對照水平的水平表達(dá)，并且EZH2和/或SUZ12的表達(dá)與EZH2和/或SUZ12參考對照水平相比增加(和/或L3MBTL2的表達(dá)與L3MBTL2參考對照水平相比降低)，則用治療有效量的EZH2抑制劑開始治療受試者。在某些實施方式中，可以在用EZH2抑制劑治療之前和之后收集樣品，并且可以比較樣品的EZH2表達(dá)水平。

在某些非限制性實施方式中，樣品包括但不限于培養(yǎng)中的細(xì)胞、細(xì)胞上清液、細(xì)胞裂解物、血清、血漿、生物流體(例如血液、血漿、血清、糞便、尿、淋巴液、腹水、導(dǎo)管沖洗液、乳頭抽吸液、唾液、支氣管肺泡灌洗液、眼淚和腦脊液)和組織樣品。樣品來源可以是實體組織(例如，來自新鮮、冷凍和/或保存的器官或腫瘤樣品、組織樣品、活體組織切片或抽吸物)、血液或任何血液成分、體液(比如，例如尿、淋巴、腦脊髓液、羊水、腹水或組織間液)、或來自個體的細(xì)胞，包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞。在某些非限制性的實施方式中，樣品獲自腫瘤。在某些實施方式中，樣品可以是“臨床樣品”，其是來自患者的樣品。

5.6試劑盒

在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明提供了用于確定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的試劑盒，其包含用于檢測前述部分所示的BAP1生物標(biāo)志物的工具。所述試劑盒還包括描述使用試劑盒以測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌效果的說明書或支持材料，和/或提及描述其的網(wǎng)站或出版物。

試劑盒的類型包括但不限于包裝的生物標(biāo)志物特異性的探針和引物組(例如TaqMan探針/引物組)、陣列/微陣列、生物標(biāo)志物特異性的抗體、生物標(biāo)志物特異性的珠，其還包含一個或多個探針、引物或用于檢測本發(fā)明的一種或多種生物標(biāo)志物的其它試劑。

在某些非限制性實施方式中，本發(fā)明提供了用于測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的試劑盒，其包含用于檢測BAP1核酸生物標(biāo)志物的存在的工具。

在具體的非限制性實施方式中，試劑盒可包含適合于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或核酸測序的一對寡核苷酸引物，用于檢測待鑒定的核酸生物標(biāo)志物。一對引物可包含與上述生物標(biāo)志物互補的核苷酸序列，并且具有足夠長度以與所述生物標(biāo)志物選擇性雜交?；蛘?，互補核苷酸可選擇性地與生物標(biāo)志物位置5’和/或3’足夠接近的特定區(qū)域雜交，以進(jìn)行PCR和/或測序。試劑盒中可包含多種生物標(biāo)志物特異性的引物，以同時檢測多于一種生物標(biāo)志物。試劑盒還可以包含一種或多種聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶和核苷酸堿基，其中核苷酸堿基還可以被可檢測地標(biāo)記。

在某些非限制性實施方式中，引物的長度可以是至少約10個核苷酸或至少約15個核苷酸或至少約20個核苷酸，和/或至多約200個核苷酸或至多約150個核苷酸或至多約100個核苷酸或至多約75個核苷酸或至多約50個核苷酸。引物的非限制性實例在表1中提供。例如但不限于，本公開的引物可以包含表1中公開的一個或多個序列。

在另一個非限制性實施方式中，寡核苷酸引物可固定在固體表面、基板或支持物上，例如固定在核酸微陣列上，其中每個寡核苷酸引物與固體表面或支持物結(jié)合的位置是已知的和可鑒定的。寡核苷酸可以固定到基板，比如玻璃、塑料、紙、尼龍或其它類型的膜、濾器、芯片、珠或任何其它合適的固體支持物上。多核苷酸可以直接在基板上合成，或者分離于基板合成，然后固定在基板上。使用已知的方法制備陣列。

在具體的非限制性實施方式中，試劑盒可包含至少一種適于原位雜交或原位熒光雜交的核酸探針，用于檢測待鑒定的生物標(biāo)志物。此類試劑盒通常包含一種或多種對各種生物標(biāo)志物具有特異性的寡核苷酸探針。用于測試多種生物標(biāo)志物的工具可任選地包含在單一試劑盒中。

在某些實施方式中，試劑盒可包括容器(包括適用于在本方法的自動化實施中使用的微量滴定板)，每個容器具有方法中使用的各種試劑(通常為濃縮形式)一種或多種，包括例如，預(yù)制的微陣列、緩沖液、適當(dāng)?shù)娜姿岷塑?例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP，或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、以及一個或多個本發(fā)明的探針和引物(例如，適當(dāng)長度的連接到與RNA聚合酶反應(yīng)的啟動子的聚(T)或隨機引物)。

在非限制性實施方式中，本發(fā)明提供用于測定EZH2抑制劑是否可能在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的試劑盒，其包含用于檢測BAP1蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物水平的工具。

在非限制性實施方式中，試劑盒可包含至少一種抗體或其抗原結(jié)合片段，用于待鑒定的生物標(biāo)志物的免疫檢測?？梢允褂萌绫绢I(lǐng)域技術(shù)人員通常已知的常規(guī)的免疫技術(shù)制備特異性靶向生物標(biāo)志物的多克隆和單克隆抗體。試劑盒的免疫檢測試劑可包括與給定抗體或抗原本身相關(guān)的或連接的可檢測標(biāo)記。此類可檢測標(biāo)記包括例如化學(xué)發(fā)光或熒光的分子(若丹明、熒光素、綠色熒光蛋白、熒光素酶、Cy3、Cy5或ROX)、放射性標(biāo)記(³H、³⁵S、³²P、¹⁴C或¹³¹I)或酶(堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶)。

在另一個非限制性實施方式中，可提供一種或多種生物標(biāo)志物特異性的抗體結(jié)合于固體支持物，比如柱基質(zhì)、陣列或微量滴定板的孔?；蛘?，支持物可以作為試劑盒的單獨元件提供。

在某些非限制性實施方式中，當(dāng)試劑盒中的測量工具使用陣列時，上述生物標(biāo)志物的組可構(gòu)成呈現(xiàn)在微陣列上的生物標(biāo)志物的種類的至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％。

在某些非限制性實施方式中，本公開的試劑盒可包含用于檢測樣品中EZH2表達(dá)水平的一種或多種探針、引物、抗體或其他檢測試劑。例如，試劑盒可以包含用于檢測生物樣品中EZH2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的抗體或其片段。

在某些非限制性實施方式中，本公開的試劑盒可包含用于檢測樣品中SUZ12表達(dá)水平的一種或多種探針、引物、抗體或其它檢測試劑。例如，試劑盒可以包含用于檢測生物樣品中SUZ12的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的抗體或其片段。

在某些非限制性實施方式中，本公開的試劑盒可包含用于檢測樣品中L3MBTL2的表達(dá)水平的一種或多種探針、引物、抗體或其它檢測試劑。例如，試劑盒可以包含用于檢測生物樣品中L3MBTL2的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的抗體或其片段。

試劑盒還可包含用于允許在癌癥樣品中的生物標(biāo)志物水平與參考對照樣品中的生物標(biāo)志物水平之間進(jìn)行比較的工具。例如但不限于，本公開的試劑盒包含一種或多種用于檢測參考蛋白或mRNA的探針、引物、抗體或其它檢測試劑，其可以用于將樣品中一種或多種生物標(biāo)志物的表達(dá)水平歸一化以允許比較。參考蛋白例如管家蛋白的非限制性實例包括α-或β-微管蛋白、肌動蛋白、絲切蛋白、黏著斑蛋白和GADPH。

在某些非限制性實施方式中，試劑盒還可以包括使用試劑盒檢測目的生物標(biāo)志物的說明書。例如，說明書可以描述，與參考對照水平相比，本文所述的來自患者的癌癥樣品中的BAP1生物標(biāo)志物的不存在和/或更低的表達(dá)提示著EZH2抑制劑在癌癥中產(chǎn)生抗癌作用的可能性增加。

在某些實施方式中，本公開的試劑盒還可以包含一種或多種EZH2抑制劑。EZH2抑制劑的非限制性實例公開于5.2節(jié)中。

提供以下實施例以更充分地說明本公開，但不應(yīng)解釋為限制本公開的范圍。

6.實施例1：體外BAP1的缺失導(dǎo)致EZH2表達(dá)和活性增加

在該實施例中，在體外研究了BAP1活性的喪失導(dǎo)致疾病狀態(tài)的機制。

6.1.結(jié)果

用靶向BAP1的shRNA轉(zhuǎn)導(dǎo)SET2細(xì)胞，以在體外減少BAP1表達(dá)。如通過蛋白質(zhì)印跡驗證的，BAP1表達(dá)的降低導(dǎo)致組蛋白3在K27的三甲基化(H3K27me3)增加(圖1)。也參見圖9A。BAP1蛋白表達(dá)在BaF3細(xì)胞中耗減，同時通過蛋白質(zhì)印跡證實了BAP1缺失，并進(jìn)行組蛋白質(zhì)譜。BaF3細(xì)胞中的BAP1敲減顯示H3K27me3增加(圖1)。

已經(jīng)顯示BAP1在實體瘤比如在惡性間皮瘤和葡萄膜黑色素瘤中高度突變(Carbone等人，2012)。與具有野生型BAP1活性的細(xì)胞相比，在BAP1中具有突變例如H28純合性缺失、H2452純合性錯義和H226缺失突變的間皮瘤細(xì)胞中，觀察到EZH2表達(dá)的上調(diào)(圖2)。此外，BAP1在293T細(xì)胞中的體外過表達(dá)導(dǎo)致EZH2和SUZ12表達(dá)的減少，而BAP1表達(dá)的喪失導(dǎo)致SUZ12表達(dá)的上調(diào)(圖3)。

6.2.討論

如上所述，BAP1蛋白表達(dá)的喪失導(dǎo)致由EZH2引起的抑制性染色質(zhì)標(biāo)志H3K27me3的增加，以及在體外癌細(xì)胞系體系中EZH2和SUZ12的表達(dá)的增加。目前EZH2抑制劑正在具有EZH2激活性突變的淋巴瘤患者中進(jìn)行臨床測試。因此，BAP1突變狀態(tài)可以有助于鑒定可能對EZH2抑制劑治療應(yīng)答的患者，這可能有效地延長BAP1-突變患者的存活。

7.實施例2：體內(nèi)BAP1的缺失導(dǎo)致EZH2表達(dá)和活性增加

7.1方法和材料

引物：

表1

動物：所有動物都來自紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心(Memorial Sloan Kettering Cancer Center)。所有動物程序根據(jù)實驗動物的護理和使用指南完成，并由紀(jì)念斯隆凱特琳癌癥中心的機構(gòu)動物護理和使用委員會批準(zhǔn)。

Bap1-缺陷型和Bap1/Ezh2-缺陷型小鼠的產(chǎn)生：

靶向Bap1的外顯子6-12的胚胎干細(xì)胞獲自歐洲條件性小鼠聯(lián)盟(European Conditional Mouse Consortium)。上游插入包含lacZ和新霉素盒的Frt-側(cè)翼過早終止盒。將ES細(xì)胞克隆擴增并注射到原代胚泡中。將產(chǎn)生的小鼠與Flp-缺失子種系(The Jackson Laboratory)雜交以切除Frt-側(cè)翼盒。隨后將這些小鼠與IFN-α可誘導(dǎo)的Mx1-cre轉(zhuǎn)基因小鼠(The Jackson Laboratory)雜交，以評估造血系統(tǒng)中Bap1的誘導(dǎo)性缺失的影響。通過使用引物BAP1-上游(actgcagcaatgtggatctg(SEQ ID NO.1))、BAP1-下游(gaaaaggtctgacccagatca(SEQ ID NO.2)，使用以下參數(shù)：95℃10分鐘，然后94℃10秒、65℃40秒和72℃1分鐘進(jìn)行40個循環(huán)，然后72℃5分鐘，進(jìn)行PCR，對Bap1fl/fl、Bap1fl/+和Bap1+/+同窩小鼠進(jìn)行分型。通過PCR在300bp檢測WT等位基因，同時在500bp檢測敲入的(floxed)等位基因。通過使用引物的PCR來確認(rèn)IFN-α誘導(dǎo)后的切除，以檢測敲入的和切除的條帶：BAP1-F(actgcagcaatgtggatctg(SEQ ID NO.1))、BAP1-F2(gcgcaacgcaattaatgata(SEQ ID NO.3))和BAP1-R(cagtgtccagaatggctcaa(SEQ ID NO.4))，使用上面列出的相同PCR參數(shù)。將Mx1-Cre-Bap1f/f小鼠與Ezh2f/f小鼠12雜交。Mx-cre Bap1f/f條件和Bap1f/f對照小鼠接受200μL的1mg/mL polyI:polyC溶液的四次腹膜內(nèi)注射。切除兩周后，使用肝素化的微紅細(xì)胞壓積毛細(xì)管(Thermo Fisher Scientific)通過眼眶后出血收集外周血。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)制造商的說明書使用HemaVet確認(rèn)切除并獲得外周血計數(shù)。用蘇木精-伊紅(H&E)對福爾馬林固定的石蠟包埋的組織切片進(jìn)行染色。通過PCR基因組切割和蛋白質(zhì)印跡分析證實Bap1的缺失。將尾部提交給Transnetyx基因分型服務(wù)(Cordova，TN)，用于敲入的和切除的Ezh2等位基因的基于qPCR的基因分型。通過蛋白質(zhì)印跡證實切除。

異種移植物和體內(nèi)施用EPZ011989：用在基質(zhì)膠和培養(yǎng)基的1:1混合物中的6×10⁶～10×10⁶間質(zhì)瘤細(xì)胞系(MSTO-211H、Meso10、H226和H2452)在側(cè)部皮下注射10周齡NOD-SCID小鼠組。當(dāng)腫瘤達(dá)到約60～80mm³的尺寸時，開始用載體(0.5％NaCMC+0.1％Tween-80的水溶液)或EPZ011989治療。在實驗期間，將EPZ011989或載體給予濃度為500mg/kg的口服BID。使用卡尺在三維中評估腫瘤體積。治療后提取腫瘤或肺組織，并用于蛋白質(zhì)印跡以評估靶標(biāo)抑制。產(chǎn)生預(yù)先建立的標(biāo)準(zhǔn)以在如果在移植后沒有形成腫瘤(比相同組的移植動物的平均值小75％)時排除小鼠異種移植物實驗。藥物試驗不排除動物。對于所有異種移植物藥物研究，跟蹤腫瘤大小10天，并且在此時用于腫瘤大小跟蹤的小鼠是隨機的。在polyI:polyC之后3周，利用CBC分析隨機化進(jìn)行遺傳性Bap1KO EPZ011989試驗，并確認(rèn)WBC計數(shù)平均值在載體和治療組中是相等的。每組5只動物用載體(如上所述)或500mg/kg EPZ011989BID口服治療16天。研究者在這些實驗中未被盲化。

組織學(xué)分析：將小鼠處死并尸檢，然后將切開的組織樣品在4％多聚甲醛中固定24小時，脫水，并包埋在石蠟中。將石蠟塊以4μm切片并用H&E、Ki67、E-鈣粘蛋白或TUNEL染色。使用Axio Observer Al顯微鏡(Carl Zeiss)獲取圖像。

細(xì)胞培養(yǎng)：293T細(xì)胞在補充有10％胎牛血清(FBS)和非必需氨基酸的杜爾伯科改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)(DMEM)中培養(yǎng)。將人白血病細(xì)胞系(SET2)和人間皮瘤細(xì)胞系(JMN、Met5a、MSTO-211H、H2373、H226、H2452)在補充有10％FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MSTO-211H獲自ATCC，而其余間皮瘤系是來自Prasad Adusumilli的慷慨惠贈。

RNA分離、SMARTer擴增、質(zhì)子轉(zhuǎn)錄組(Proton Transcriptome)測序和分析：使用FACS Aria對骨髓細(xì)胞進(jìn)行GMP(Lin^-c-Kit⁺Sca1^-CD34⁺Fcγ⁺)的FACS分選。使用TRIzol RNA Isolation Reagents(cat#15596-026，Life Technologies)提取來自200-500K細(xì)胞的總RNA。通過使用RNA 6000pico試劑盒和bioAnalyzer(Agilent)分析20～50pg的每個樣品，在擴增前確保RNA的質(zhì)量。隨后使用 Universal Low Input RNA Kit for Sequencing(Clonetech Laboratory，cat#634940)，根據(jù)制造商提供的說明擴增10ng高質(zhì)量(RIN>8)總RNA。根據(jù)Ion Total RNA-Seq Kit v2方案(Life Technologies)，用16個循環(huán)的PCR，將擴增材料進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組文庫(Library)制備。將樣品編碼并使用離子一觸式系統(tǒng)II和ION PI^TM Template OT2 200kit v2Kit(Life Technologies)制備模板陽性ION PI^TMION SPHERE^TM顆粒(ISP)。在質(zhì)子(Proton)測序系統(tǒng)上使用200bp版本2化學(xué)，對富集的顆粒進(jìn)行測序。平均每個樣品產(chǎn)生七～八千萬個讀數(shù)，并且76～82％的讀數(shù)映射至mRNA堿基。RAW輸出BAM使用PICARD Sam2Fastq轉(zhuǎn)換回FASTQ。然后首先使用rnaStar將讀數(shù)映射到小鼠基因組。使用的基因組是MM9，其與來自ENSEMBL的基因組(Mus_musculus.NCBIM37.67)接合并具有49的讀取短懸端(read overhang)。然后使用BWA MEM(版本0.7.5a)將任何未映射讀數(shù)映射到MM9。然后將兩個映射的BAM合并和分選，并使用htseq計數(shù)(htseq-count)(選項-s y-m intersection-strict)和相同的基因模型(Mus_musculus.NCBIM37.67)計算基因水平計數(shù)。將原始數(shù)據(jù)以下列登錄號GSE61360上傳到GEO數(shù)據(jù)庫。

組蛋白提取、組蛋白ELISA、組蛋白蛋白質(zhì)印跡和組蛋白LC/MS：通過標(biāo)準(zhǔn)提取技術(shù)或使用Active Motif Histone Extraction Minikit(40026)過夜提取組蛋白。使用三甲基K27Elisa Kit(Active Motif，53106)，歸一化到H3K27me3標(biāo)準(zhǔn)曲線和總H3蛋白進(jìn)行組蛋白ELISA。用3～5μg組蛋白進(jìn)行組織蛋白質(zhì)印跡。對于組蛋白LC/MS，裂解1200萬的對照和Bap1KO細(xì)胞，分離核，并使用0.4N H₂SO₄提取組蛋白，并使用丙酸酐進(jìn)行化學(xué)衍生化，如前所述²⁶。然后用胰蛋白酶消化組蛋白，并通過納米-液相色譜(75μm i.d.，15cm長，填充有MagicC 18aq介質(zhì)，dp 3μ)與TSQ Quantum Ultra質(zhì)譜儀偶聯(lián)進(jìn)行分離。使用Skyline27分析數(shù)據(jù)，并通過峰面積進(jìn)行相對定量。

染色質(zhì)制備和免疫沉淀、ChIP文庫制備和測序以及ChIP-Seq數(shù)據(jù)的分析：使用EasySep Mouse Hematopoietic cell富集試劑盒(Stem Cell Technologies，19756)將骨髓細(xì)胞富集c-kit⁺細(xì)胞。將5×10⁶細(xì)胞固定在1％無甲醇的甲醛溶液中，然后重懸于SDS裂解緩沖液中。在E220聚焦超聲發(fā)生器(Covaris)中將裂解物超聲處理成100～500個堿基對的所需片段大小分布。如先前所述(Krivtsov等人，2008)，使用各自在約400,000個細(xì)胞上的抗三甲基H3K27(Cell Signaling，9733)、抗單甲基H4K20(Abcam，9051)和IgG(Santa Cruz，2027)進(jìn)行IP反應(yīng)。使用如其他地方所述的Direct ChIP方案(O’Geen等人，2011)，在SX-8G IP-STAR Compact Automated System(Diagenode)上進(jìn)行ChIP試驗。然后將洗脫的染色質(zhì)片段去交聯(lián)，并使用Agencourt AMPure XP珠(Beckman Coulter)純化DNA片段。

在SX-8G IP-STAR Compact Automated System(Diagenode)上，根據(jù)制造商的說明書，使用用于Illumina(New England Biolabs)和TruSeq Adaptors(Illumina)的NEBNext ChIP-Seq Library Prep Master Mix Set從ChIP富集和輸入的DNA制備編碼文庫。使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(New England Biolabs)和TruSeq PCR Primers(Illumina)擴增文庫，然后使用AMPure XP珠純化以去除接頭二聚體，并在HiSeq 2000(Illumina)上多重化。

在使用bowtie2采用默認(rèn)參數(shù)對齊到小鼠集mm9之前，使用‘trim galore’將讀數(shù)優(yōu)質(zhì)化并適當(dāng)剪掉(adapter-trimmed)。具有相同起始位置和取向的比對的讀數(shù)重疊成單次讀取，隨后進(jìn)行分析。通過將每個讀數(shù)擴展到平均文庫片段大小，然后使用BEDTools套件計算密度來創(chuàng)建密度分布圖。使用具有默認(rèn)參數(shù)的MACS 1.4發(fā)現(xiàn)富集區(qū)域，并對匹配的輸入庫評分。將所有基因組瀏覽器軌跡和讀取密度表歸一化至測序深度。為了比較對照和KO條件中的ChIP-seq樣品，使用曼-惠特尼U檢驗(Mann-Whitney U test)或t檢驗來測試每個條件三個重復(fù)的信號。在具有kmeans聚類軟件包的Matlab中對歸一化計數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析。在Homer中使用findMotifsGenome程序的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行基序分析。

蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀：在以下緩沖液中：150mM NaCl、20mM Tris(pH 7.4)、5mM EDTA、1％Triton、蛋白酶抑制劑(protease arrest)(EMD)和磷酸酶抑制劑(Calbiochem)，將細(xì)胞裂解用于蛋白質(zhì)印跡和免疫沉淀實驗。為了在核酸酶(benzonase)存在下進(jìn)行免疫沉淀，將細(xì)胞在BC-300緩沖液：20mM Tris(pH 7.4)、10％甘油、300mM KCl、0.1％NP-40中裂解。將澄清的裂解物用MgCl₂處理至2.5mM，并以1250U/mL加入核酸酶(benzonase)。裂解物在旋轉(zhuǎn)下孵育1小時，通過加入5mM EDTA終止反應(yīng)。在開始免疫沉淀實驗之前，通過將裂解物在溴化乙錠凝膠上跑膠來確認(rèn)DNA消化。使用的抗體包括：BAP1(C-4；Santa Cruz sc-28383)、EZH2(Active Motif，39933；Active Motif，39901或Millipore，07-689)、SUZ12(Abcam，Ab12073)、ASXL1(N-13；Santa Cruz sc-85283)、L3MBTL2(Active Motif，39569)、Myc-Tag(Cell Signaling，2276)、微管蛋白(Sigma，T9026)、H3K27me3(Abcam，6002或Millipore，07-449)、H3(Abcam，Ab1791)和H4K20me1(Abcam，Ab9051)。

流式細(xì)胞術(shù)分析和抗體：活的骨髓和脾臟細(xì)胞的表面標(biāo)志物染色通過首先用氯化銨-碳酸氫鉀裂解緩沖液裂解細(xì)胞然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細(xì)胞來進(jìn)行。在冰上將細(xì)胞用PBS中的抗體染色20分鐘。對于造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞染色，細(xì)胞用包括CD4(RM4-5)、CD3(17A2)、B220(RA3-6B2)、NK1.1(PK136)、Gr-1(RB6-8C5)、Cd11b(M1/70)和Ter119的譜系聯(lián)用來染色，允許成熟譜系排除在分析之外。細(xì)胞也用針對c-Kit(2B8)、Sca-1(D7)、FcγRII/III(2.4G2)和CD34(RAM34)的抗體染色。為了評估成熟單核細(xì)胞的組成，使用Mac1、Gr-1、B220和CD4/CD3。通過用上述造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞混合物染色細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期分析。使用FIX和PERM試劑盒(Invitrogen cat#GAS-003)固定細(xì)胞。固定后，用Ki67染色細(xì)胞，然后在LSR Fortessa上分析前，用DAPI染色細(xì)胞。

質(zhì)粒：人FLAG-L3MBTL2的cDNA全長克隆獲得自Addgene(Plasmid 28232)。Myc-His標(biāo)簽的泛素構(gòu)建體是來自Xuejun Jiang的慷慨惠贈。HA-FLAG BAP1的cDNA人全長克隆獲得自Addgene(Plasmid 22539)。3X FLAG標(biāo)簽的BAP1構(gòu)建體是來自Marc Ladanyi的慷慨惠贈。去泛素酶突變構(gòu)建體(C91A、C91S)使用Agilent定點誘變試劑盒產(chǎn)生，并通過全長DNA測序確認(rèn)。短發(fā)夾RNA獲自在pLKO.1嘌呤霉素載體中的RNAi Consortium(TRC)。短發(fā)夾序列如下：人BAP1(TRC寡核苷酸ID：TRCN0000078702和TRCN0000078698)、小鼠BAP1(TRCN0000030719和TRCN0000030720)、人L3MBTL2(TRCN0000021724和TRCN0000021726)以及編碼熒光素酶的shRNA(shLUC)的對照pLKO.1-嘌呤霉素載體。

泛素試驗：將HEK293T細(xì)胞接種在10-cm培養(yǎng)皿中，24小時后用4μg Myc-His-Ubi表達(dá)構(gòu)建體和對照、1μg L3MBTL2和/或1～10μg BAP1-GFP過表達(dá)構(gòu)建體進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。轉(zhuǎn)染后48小時，將細(xì)胞在基于鹽酸胍的裂解緩沖液：6M胍、0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris(pH 8.0)和10mM BME中裂解。His-Ubi蛋白通過在室溫下通過20μL Ni-NTA瓊脂糖(Qiagen)孵育4小時來純化。珠子用1mL的4種洗滌緩沖液：緩沖液A：6M胍、0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris(pH 8.0)、10mM BME和0.2％Triton-X；緩沖液B：8M脲、0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris(pH8.0)、10mM BME和0.2％Triton-X；緩沖液C：0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris(pH 6.3)、10mM BME和0.2％Triton-X；以及緩沖液D：0.1M NaH₂PO₄、10mM Tris(pH 6.3)、10mM BME和0.1％Triton-X依次洗滌。所有緩沖液補充有15mM咪唑。通過用補充有咪唑的2x SDS Laemmli緩沖液煮沸，從珠中純化His-標(biāo)簽的蛋白質(zhì)。然后通過蛋白質(zhì)印跡分析蛋白質(zhì)。

體外集落形成試驗：使用FACSAria將細(xì)胞進(jìn)行Lin^-c-Kit⁺Sca1⁺細(xì)胞分選。一式兩份將100個細(xì)胞鋪板在甲基纖維素(MethoCult GF M3434，Stem Cell Technologies)中。在鋪板后14天計數(shù)菌落，并通過用PBS洗滌收集菌落，然后裂解細(xì)胞用于RNA和組蛋白提取。

瞬時轉(zhuǎn)染：用指定的構(gòu)建體用X-treme基因轉(zhuǎn)染試劑(Roche)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后48～72小時提取蛋白質(zhì)和/或組蛋白。

侵襲試驗：將間皮瘤細(xì)胞(MSTO-211H、H2373、H226和H2452)接種在T75燒瓶(100,000個細(xì)胞)中。12小時后，將鋪板的細(xì)胞用GSK126(0～2μM)(Chemitek)處理，然后讓其增殖7天。然后將250,000個處理的細(xì)胞置于無血清培養(yǎng)基中的Matrigel侵襲室(BD Biosciences，cat#354480)的頂部，而下室含有具有血清的培養(yǎng)基。22小時后，膜底部的細(xì)胞用結(jié)晶紫染色并用ImageJ定量。

熒光素酶試驗：除了EV、BAP1和L3MBTL2構(gòu)建體外，用pGL3EZH2啟動子報告構(gòu)建體(來自Naomi Goldfinger的慷慨惠贈)和Switchgear Renilla對照構(gòu)建體瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。使用DualLuciferase Reporter Assay System(Promega)評估細(xì)胞的熒光素酶活性。將細(xì)胞接種在24孔板中，并用200ng pGL3-EZH2-熒光素酶、200ng海腎熒光素酶對照構(gòu)建體和500ng實驗構(gòu)建體共轉(zhuǎn)染。在轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞孵育48小時，在室溫下裂解15分鐘，并在發(fā)光計上評價熒光素酶活性。將螢火蟲熒光素酶讀數(shù)歸一化到海腎轉(zhuǎn)染對照。

統(tǒng)計分析：除非在上下文中有所描述，否則使用具有Welch校正的Student t檢驗來分析統(tǒng)計學(xué)顯著性。使用Prizm GraphPad軟件用于統(tǒng)計計算。使用SEM計算誤差，*p<0.05，**p<0.005。

7.2結(jié)果

基因組研究確定在不同惡性腫瘤中腫瘤抑制基因ASXL1和BAP1的體細(xì)胞突變。果蠅(Drosophila)ASXL1同源物Asx和BAP1同源物Calypso形成一個去除H2AK119Ub的復(fù)合物(Scheuermann等人，2010)。然而，BAP1-ASXL1復(fù)合物未顯示在BAP1突變體轉(zhuǎn)化中起作用。ASXL1中的失活突變最常見于髓性惡性腫瘤中(Abdel-Wahab等人，2011；Bejar等人，2011；Gelsi-Boyer等人，2009)，而重復(fù)發(fā)生的BAP1突變通常在間皮瘤(Bott等人，2011)、腎細(xì)胞癌(Pena-Llopis等人，2012)和轉(zhuǎn)移性葡萄膜黑色素瘤(Harbour等人，2010)中觀察到，提示著BAP1和ASXL1在腫瘤抑制中具有不同的作用。這些突變譜不能由差異組織特異性的BAP1和ASXL1表達(dá)來解釋(圖5A-C)。本實施例鑒定BAP1缺失導(dǎo)致轉(zhuǎn)化的機制，不依賴于ASXL1，并鑒定在BAP1突變癌細(xì)胞中的治療缺陷。

最近的研究表明，Bap1的體細(xì)胞缺失可以促進(jìn)造血轉(zhuǎn)化(Dey等人，2012)。研究了條件Bap1缺失對造血細(xì)胞中基因表達(dá)和染色質(zhì)狀態(tài)的影響(圖5A、B)。Bap1的條件缺失使用圖5D中所示的方案產(chǎn)生。使用成年動物誘導(dǎo)后驅(qū)動造血組織中的Bap1缺失的重組酶MX-Cre。Bap1缺失導(dǎo)致具有脾腫大(圖6A)、白細(xì)胞增多(圖5E、F)、貧血(圖5G、H)和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞祖細(xì)胞(GMP)擴增(圖5I-K)的完全滲透性骨髓增生性疾病。例如，在Bap1敲除(KO)小鼠中，觀察到脾臟的大小(例如重量和長度)在尺寸上大于BAP1野生型小鼠(圖6A、10C和11C)。還觀察到Bap1缺陷型髓樣祖細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展的增加(圖5L)。RNA測序分析揭示Bap1缺陷型GMP中大多數(shù)差異表達(dá)的基因具有降低的表達(dá)(p-adj<0.001)(圖7A)。盡管觀察到在Bap1和Asxl1KO祖細(xì)胞中的差異表達(dá)的基因集之間的顯著重疊，但是在許多情況下觀察到對基因表達(dá)的矛盾的反作用(圖6B)。基因集富集分析(GSEA)鑒定了Bap1和Asxl1KO祖細(xì)胞中富集的逆向影響基因集(Abdel-Wahab等人，2013)(圖7B)。ASXL1沉默導(dǎo)致HoxA簇基因的表達(dá)增加，與PRC2活性降低一致(Abdel-Wahab等人，2012)。相比之下，在Bap1缺陷性細(xì)胞中觀察到HoxA基因成員的表達(dá)降低(圖6C)和HoxA基因標(biāo)志物的表達(dá)降低(圖7C)。這些數(shù)據(jù)表明Asxl1和Bap1的缺失對基因調(diào)節(jié)具有相反的作用。

ASXL1與PRC2復(fù)合物直接相互作用，并且ASXL1耗減使全局和位點特異性的H3K27me3減少(Abdel-Wahab等，2012)。鑒于Asxl1和Bap1缺失對基因表達(dá)的不同影響，研究了Bap1缺失對H3K27me3的影響。通過組蛋白質(zhì)譜(圖6D)、蛋白質(zhì)印跡(圖6E)和ELISA(圖8A)，在Bap1KO細(xì)胞中H3K27me3水平增加。H3K27me3染色質(zhì)免疫沉淀測序(ChIP-Seq)顯示Bap1KO小鼠中H3K27me3的全面增加(圖6F)、H3K27me3寬結(jié)構(gòu)域數(shù)目增加(Beguelin等人，2013)(圖6G)，以及“擴展”到附近基因座的H3K27me3寬結(jié)構(gòu)域增加(圖6H)。這種H3K27me3增加和擴展在Bap1KO細(xì)胞的HoxA基因座中很好地呈現(xiàn)(圖6I)。在Bap1KO細(xì)胞中標(biāo)記有H3K27me3的位點主要發(fā)生在基因啟動子區(qū)域(圖8B)，并且具有H3K27me3-占據(jù)的啟動子的基因富集以增強抑制(FDR<0.001)(圖6J)。在純化的GMP中觀察到類似發(fā)現(xiàn)(圖6K)。由Bap1KO相關(guān)的H3K27me3和基因抑制而失調(diào)的基因參與EZH2依賴性調(diào)節(jié)、譜系定向/分化和增殖(圖6L、圖8C)。BAP1沉默增加H3K27me3(圖9A)，并且在Bap1缺陷型細(xì)胞中BAP1的重新表達(dá)降低H3K27me3水平(圖9B)。相比之下，去泛素化酶缺陷型BAP1等位基因不減少H3K27me3(圖9C)，證明H3K27me3中的改變是由于BAP1催化活性。

接下來，PRC2介導(dǎo)的H3K27me3對BAP1依賴性轉(zhuǎn)化的作用通過研究Ezh2缺失(Su等人，2003)對體內(nèi)轉(zhuǎn)化的影響來評估。與Bap1敲除小鼠相比，Ezh2缺失減少Bap1/Ezh2缺陷型小鼠中的H3K27me3水平(圖11A)。Ezh2缺失消除由Bap1缺失誘導(dǎo)的髓性惡性腫瘤(圖10A)，具有具有減少的脾腫大(圖11B、C)、白細(xì)胞增多(圖11D)和貧血(圖11E)。伴隨的Bap1/Ezh2缺失減少了髓樣祖細(xì)胞擴張(圖11F)、減少了Macl⁺Gr1⁺髓樣細(xì)胞的比例(圖11G)并且恢復(fù)紅細(xì)胞分化(CD71⁺Ter119⁺)(圖10B)。觀察到Bap1/Ezh2缺陷型祖細(xì)胞的減少的增殖(圖11H)。Ezh2單倍體不足使Bap1缺陷型骨髓增生減弱，但并沒有消除(圖10C、10D)，與Ezh2的劑量依賴性需求一致。與遺傳數(shù)據(jù)一致，用小分子抑制劑EPZ011989(Campbell等，2015)治療Bap1KO小鼠減少H3K27me3、脾腫大和白細(xì)胞計數(shù)(圖11I-K)。這些數(shù)據(jù)表明PRC2，特別是Ezh2活性，是Bap1缺陷型骨髓轉(zhuǎn)化所需的。

接下來，研究了Bap1缺失使H3K27me3水平增加的機制。與報道的ASXL1和BAP1之間以及ASXL1和PRC2之間的相互作用相比，通過免疫共沉淀(co-IP)沒有鑒定到BAP1和EZH2之間的相互作用(圖13A)。觀察到Ezh2和Suz12的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的增加(圖13B、C)，與Bap1在調(diào)節(jié)PRC2表達(dá)中的作用一致。此外，與野生型BAP1小鼠相比，來自Bap1KO小鼠的整個骨髓的分選的Lin^-Sca⁺Kit⁺細(xì)胞(含有造血干細(xì)胞的群體)的分析顯示出Suz12和Ezh2RNA表達(dá)的顯著增加(圖17)。而且，與對照細(xì)胞相比，在Bap1KO細(xì)胞中，全骨髓蛋白質(zhì)印跡顯示EZH2和SUZ12的蛋白質(zhì)表達(dá)增加(圖17)。在Bap1KO骨髓細(xì)胞中再表達(dá)BAP1，將Ezh2mRNA表達(dá)降低至正常水平(圖12A)。假設(shè)Bap1缺失可能直接改變其他組蛋白標(biāo)志，這將隨后改變包括EZH2的關(guān)鍵靶基因座的染色質(zhì)狀態(tài)。與其它測量的組蛋白標(biāo)志(圖12B)相比，組蛋白質(zhì)譜顯示Bap1KO細(xì)胞中H4K20me1的顯著減少(圖13D)。不是ASXL1或BMI1，而是BAP1的表達(dá)增加了EZH2基因座處的H4K20me1(圖12C)。因此假設(shè)，H4K20me1標(biāo)志物的喪失可能在BAP1-依賴性基因表達(dá)中具有重要的作用。SETD8是唯一已知的評價H4K20me1的甲基轉(zhuǎn)移酶(Nishioka等人，2002)。在BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞(H226、H2452)中SETD8的表達(dá)增加細(xì)胞凋亡并減少增殖，而野生型(MSTO-21H和Meso10)細(xì)胞不受影響(圖13E、F)。在間皮瘤細(xì)胞中SETD8的過表達(dá)降低EZH2mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)(圖13G、H)。BAP1野生型細(xì)胞系對SETD8抑制劑(Blum等人，2014)(BVT594)比BAP1-突變型細(xì)胞系更敏感(圖13I)。

假設(shè)BAP1使調(diào)節(jié)H4K20me1的染色質(zhì)調(diào)節(jié)子去泛素化。ChIP-Seq數(shù)據(jù)的分析(Abdel-Wahab等人，2013；Dey等人，2012)鑒定了具有Bap1占據(jù)但不具有Asxl1結(jié)合的基因簇(簇1)，并富集用于E盒基序(圖14A、B)。先前的研究表明，非典型多梳蛋白L3MBTL1和L3MBTL2結(jié)合E盒基序，并且可以結(jié)合和維持H4K20me1(Guo等人，2009；Qin等人，2012；Trojer等人，2011；Trojer等人，2007)。L3mbtl1缺陷型小鼠沒有明顯的表型(Qin等人，2010)，而L3mbtl2缺陷型小鼠是胚胎致死的，類似于在Bap1缺失的時候(Dey等人，2012；Qin等人，2012)。因此，研究了Bap1缺失是否導(dǎo)致L3mbtl2表達(dá)的改變。與BAP1野生型間皮瘤細(xì)胞相比，在BAP1KO造血細(xì)胞(圖15A、B)和BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞中，L3mbt12蛋白質(zhì)而不是RNA表達(dá)降低(圖13J)。L3MBTL2泛素化在表達(dá)BAP1的細(xì)胞中減少(圖13K)，并且蛋白酶體抑制劑治療增加了L3MBTL2在BAP1突變型細(xì)胞中的穩(wěn)定性(圖15C)。L3MBTL2表達(dá)降低具有和不具有BAP1共表達(dá)的EZH2蛋白水平(圖15D)，并且BAP 1的表達(dá)或L3MBTL2過表達(dá)降低EZH2啟動子活性(圖15E)。相反，L3MBTL2沉默增加EZH2的表達(dá)(圖15F)。在表達(dá)L3MBTL2和BAP1的細(xì)胞中觀察到在EZH2基因座處L3MBTL2和BAP1的富集(圖15G、H)。不受特定理論的束縛，這些數(shù)據(jù)表明BAP1和L3MBTL2相互作用(圖15I)并共占據(jù)EZH2基因座。BAP1缺失導(dǎo)致L3MBTL2穩(wěn)定性降低和EZH2轉(zhuǎn)錄輸出增加(圖13L)。

TCGA數(shù)據(jù)的分析揭示，EZH2mRNA表達(dá)在間皮瘤中增加(圖16A)。接下來，評估EZH2抑制是否可能抑制BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞系的存活。EZH2沉默誘導(dǎo)BAP1突變型細(xì)胞系中的凋亡，而野生型細(xì)胞系繼續(xù)增殖(圖16B、C)。EZH2沉默消除BAP1突變型而非野生型細(xì)胞系的體內(nèi)腫瘤形成(圖16D)。EZH2在BAP1野生型細(xì)胞系中的過表達(dá)增加了增殖(圖20A)以及對EZH2抑制的敏感性(圖20B)。BAP1突變型細(xì)胞系在體外2D(圖16E)和3D培養(yǎng)(圖16F)中對EZH2抑制(EPZ011989)更敏感。接下來，評估EZH2抑制在體內(nèi)的影響。與載體治療的小鼠相比，EZH2抑制顯著降低了BAP1突變型腫瘤大小(圖16G)，而盡管對H3K27me3具有類似的作用，野生型腫瘤對EZH2抑制較少/不應(yīng)答(圖16H)。EZH2抑制在具有轉(zhuǎn)移潛能的BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞系中消除肺轉(zhuǎn)移(圖16G)，與BAP1/EZH2在轉(zhuǎn)移中的作用一致(Harbour等人，2010)。EZH2抑制在體外減少侵襲并增加E-鈣粘蛋白表達(dá)(圖20C-D)。接下來，評估使用BAP1抑制劑GSK126的EZH2抑制的影響。將BAP1突變型間皮瘤細(xì)胞注射到NOD-SCID小鼠的側(cè)腹中，然后在腫瘤形成后用載體或150mg/kg GSK126開始治療。與載體治療的小鼠相比，EZH2抑制顯著降低腫瘤大小(圖21A和圖4)。GSK126治療在體內(nèi)顯著減少BAP1突變型細(xì)胞中的H3K27me3(圖21B)。病理學(xué)分析顯示EZH2抑制與減少的Ki67染色和增加的TUNEL染色相關(guān)(圖21C)。這些數(shù)據(jù)表明EZH2代表BAP1突變型癌細(xì)胞中的潛在治療靶標(biāo)。

致癌性EZH2突變的鑒定(Morin等人，2010；Morin等人，2011；Pasqualucci等人，2011)已引起突變特異性表觀遺傳治療的發(fā)展。然而，表觀遺傳調(diào)節(jié)子中的大多數(shù)突變導(dǎo)致功能喪失，使得它們無法作為易處理的直接治療靶標(biāo)。最近，EZH2抑制劑已進(jìn)入臨床試驗(McCabe等人，2012)，并且所公開的數(shù)據(jù)表明BAP1缺失導(dǎo)致PRC2中的突變特異性的依賴性，這應(yīng)當(dāng)在臨床前和臨床研究中進(jìn)一步探討。這些數(shù)據(jù)與最近研究引起共鳴，表明PRC2抑制在SWI/SNF突變型橫紋肌樣瘤中的作用(Alimova等人，2013；Knutson等人，2013)并且分析顯示BAP1突變與SWI/SNF突變是互相排斥的(Wilson等人，2010)。這些數(shù)據(jù)表明，表觀遺傳調(diào)節(jié)子突變的詳細(xì)研究可用于預(yù)示治療的發(fā)展，其在不同惡性背景下逆轉(zhuǎn)對表觀遺傳狀態(tài)的突變特異性作用。

7.3討論

BAP1和ASXL1相互作用以形成多梳去泛素化酶復(fù)合物，其可以從組蛋白H2A賴氨酸119中去除單泛素(H2AK119Ub)。然而，BAP1和ASXL1在不同的癌癥類型中突變，與調(diào)節(jié)表觀遺傳狀態(tài)和惡性轉(zhuǎn)化中的獨立作用一致。在該實施例中，證明BAP1缺失導(dǎo)致增加的三甲基化組蛋白H3賴氨酸27(H3K27me3)、升高的Ezh2表達(dá)和增強的多梳抑制復(fù)合物2(Polycomb Repressive Complex 2)(PRC2)靶標(biāo)的抑制。這些發(fā)現(xiàn)與在Asxl1缺失中觀察到的H3K27me3的減少形成對比。條件性Bap1和Ezh2缺失在體內(nèi)消除由單獨的Bap1缺失誘導(dǎo)的髓樣祖細(xì)胞擴張。Bap1的缺失導(dǎo)致H4K20單甲基化(H4K20me1)的顯著降低。與H4K20me1在EZH2轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中的作用一致，H4K20mel甲基轉(zhuǎn)移酶SETD8的表達(dá)減少EZH2表達(dá)和消除BAP1突變型細(xì)胞的增殖。而且，缺乏BAP1的間皮瘤細(xì)胞對EZH2藥理學(xué)抑制敏感，表明BAP1突變型惡性腫瘤的新型治療方法。

8.參考文獻(xiàn)

Abdel-Wahab，O.，Adli，M.，LaFave，L.M.，Gao，J.，Hricik，T.，Shih，A.H.，Pandey，S.，Patel，JP.，Chung，Y.R.，Koche，R.，et al.(2012).ASXL1 mutations promote myeloid transformation through loss of PRC2-mediated gcne repression.Cancer Cell 22，180-193.

Abdel-Wahab，O.，Gao，J.，Adli，M.，Dey，A.，Trimarchi，T.，Chung，Y.R.，Kuscu，C.，Hricik，T.，Ndiaye-Lobry，D.，Lafave，L.M.，etal.(2013).Deletion of Asxll results in myelodysplasia and severe developmental defects in vivo.J Exp Med 210，2641-2659.

Abdel-Wahab，O.，Pardanani，A.，Patel，J.，Wadleigh，M.，Lasho，T.，Heguy，A.，Beran，M.，Gilliland，D.G.，Levine，R.L.，and Tefferi，A.(2011).Concomitant analysis of EZH2and ASXL1mutations in myelofibrosis，chronic myelomonocytic leukemia and blast-phase myeloproliferative neoplasms.Leukemia25，1200-1202.

Alimova，I.，Birks，D.K.，Harris，P.S.，Knipstein，J.A.，Venkataraman，S.，Marquez，V.E.，F(xiàn)oreman，N.K.，and Vibhakar，R.(2013).Inhibition of EZH2suppresses self-renewal and induces radiation sensitivity in atypical rhabdoid teratoid tumor cells.Neuro Oncol15，149-160.

Beguelin，W.，Popovic，R.，Teater，M.，Jiang，Y.，Bunting，K.L.，Rosen，M.，Shen，H.，Yang，S.N.，Wang，L.，Ezponda，T.，et al.(2013).EZH2is required for germinal center formation and somatic EZH2mutations promote lymphoid transformation.Cancer Cell 23，677-692.

Bejar，R.，Stevenson，K.，Abdel-Wahab，O.，Galili，N..Nilsson，B.，Garcia-Manero，G.，Kantarjian，H.，Raza，A.，Levine，R.L.，Neuberg，D.，et al.(2011).Clinical effect ofpoint mutations in myelodysplastic syndromes.The New England journal of medicine 364，2496-2506.

Blum，G.，Ibanez，G.，Rao，X.，Shum，D.，Radu，C.，Djaballah，H.，Rice，J.C..and Luo，M.(2014).Small-molecule inhibitors of SETD8with cellular activity.ACS Chem Biol9，2471-2478.

Bott，M.，Brevet，M.，Taylor，B.S.，Shimizu，S.，Ito，T.，Wang，L.，Creaney，J.，Lake，R.A.，Zakowski，M.F.，Reva，B..et al.(2011).The nuclear deubiquitinase BAP1is commonly inactivated by somatic mutations and 3p21.1losses in malignant pleural mesothelioma.Nature genetics 43，668-672.

Campbell，J.E.，Kuntz，K.W.，Knutson，S.K.，Warholic，N.M.，Keilhack，H.，Wigle，T.J.，Raimondi，A.，Klaus，C.R.，Rioux，N.，Yokoi，A.，et al.(2015).EPZ011989，A Potent，Orally-Available EZH2Inhibitor with Robust in Vivo Activitv.ACS Med Chem Lett 6491-495.

Dey，A.，Seshasayee，D.，Noubade，R.，F(xiàn)rench，D.M.，Liu，J.，Chaurushiya，M.S.，Kirkpatrick，D.S.，Pham，V.C.，Lill，J.R.，Bakalarski，C.E.，et al.(2012).Loss of the tumor suppressor BAP1 causes myeloid transformation.Science337，1541-1546.

Garcia，B.A.，Mollah，S.，Ueberheide，B.M.，Busby，S.A.，Muratore，T.L.，Shabanowitz，J.，and Hunt，D.F.(2007).Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry.Nat Protoc 2，933-938.

Gelsi-Boyer，V.，Trouplin，V.，Adelaide，J.，Bonansea，J.，Cervera，N.，Carbuccia，N.，Lagarde，A.，Prebet，T.，Nezri，M.，Sainty，D.，et al.(2009).Mutations of polycomb-associated gene ASXL1 in myelodysplastic syndromes and chronic myelomonocytic leukaemia.British journal of haematology 145，788-800.

Guo，Y.，Nady，N.，Qi，C.，Allali-Hassani，A.，Zhu，H.，Pan，P.，Adams-Cioaba，M.A.，Amaya，M.F.，Dong，A.，Vedadi，M.，et al.(2009).Methylation-state-specific recognition of histones by the MBT repeat protein L3MBTL2.Nucleic Acids Res 37，2204-2210.

Harbour，J.W.，Onken，M.D.，Roberson，E.D.，Duan，S.，Cao，L.，Worley，L.A.，Council，M.L.，Matatall，K.A.，Helms，C.，and Bowcock，A.M.(2010).Frequent mutation of BAP1in metastasizing uveal melanomas.Science 330，1410-1413.

Knutson，S.K.，Warholic，N.M.，Wigle，T.J.，Klaus，C.R.，Allain，C.J.，Raimondi，A.，Porter Scott，M.，Chesworth，R.，Moyer，M.P.，Copeland，R.A.，et al.(2013).Durable tumor regression in genetically altered malignant rhabdoid tumors by inhibition of methyltransferase EZH2.Proc Natl Acad Sci USA 110，7922-7927.

Krivtsov，A.V.，F(xiàn)eng，Z.，Lemieux，M.E.，F(xiàn)aber，J.，Vempati，S.，Sinha，A.U.，Xia，X.，Jesneck，J.，Bracken，A.P.，Silverman，L.B.，et al.(2008).H3K79methylation profiles define murine and human MLL-AF4leukemias.Cancer Cell 14，355-368.

Lara-Astiaso，D.，et al.Immunogenetics.Chromatin state dynamics during blood formation.Science 345，943-949(2014).

Love，M.I.，Huber，W.，and Anders，S.(2014).Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.Genome biology15，550.

MacLean，B.，Tomazela，D.M.，Shulman，N.，Chambers，M.，F(xiàn)inney，G.L.，F(xiàn)rewen，B.，Kem，R.，Tabb，D.L.，Liebler，D.C.，and MacCoss，M.J.(2010).Skyline：an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.Bioinformatics 26，966-968.

McCabe，M.T.，Ott，H.M.，Ganji，G.，Korenchuk，S.，Thompson，C.，Van Aller，G.S.，Liu，Y.，Graves，A.P.，Della Pietra，A.，3rd，Diaz，E.，et al.(2012).EZH2inhibition as a therapeutic strategy for lymphoma with EZH2-activating mutations.Nature492，108-112.

Morin，R.D.，Johnson，N.A.，Severson，T.M.，Mungall，A.J.，An，J.，Goya，R.，Paul，J.E.，Boyle，M.，Woolcock，B.W.，Kuchenbauer，F(xiàn).，et al.(2010).Somatic mutations altering EZH2(Tyr641)in follicular and diffuse large B-cell lymphomas of germinal-center origin.Nature genetics 42，181-185.

Morin，R.D.，Mendez-Lago，M.，Mungall，A.J.，Goya，R.，Mungall，K.L.，Corbett，R.D.，Johnson，N.A.，Severson，T.M.，Chiu，R.，F(xiàn)ield，M.，et al.(2011).Frequent mutation of histone-modifying genes in non-Hodgkin lymphoma.Nature476，298-303.

Nishioka，K.，Rice，J.C.，Sarma，K.，Erdjument-Bromage，H.，Werner，J.，Wang，Y.，Chuikov，S.，Valenzuela，P.，Tempst，P.，Steward，R.，et al.(2002).PR-Set7is a nucleosome-specific methyltransferase that modifies lysine 20of histone H4and is associated with silent chromatin.Mol Cell9，1201-1213.

O′Geen，H.，Echipare，L.，and Farnham，P.J.(2011).Using ChIP-seqtechnology to generate high-resolution protiles of histone modificatiohs.Methods Mol Biol 791，265-286.

Pasqualucci，L.，Trifonov，V.，F(xiàn)abbri，G.，Ma，J.，Rossi，D.，Chiarenza，A.，Wells，V.A.，Grunn，A.，Messina，M.，Elliot，O.，et al.(2011).Analysis of the coding genome of diffuse large B-cell lymphoma.Nat Genet 43，830-837.

Pena-Llopis，S.，Vega-Rubin-de-Celis，S.，Liao，A.，Leng，N.，Pavia-Jimenez，A.，Wang，S.，Yamasaki，T.，Zhrebker，L.，Sivanand，S.，Spence，P.，et al.(2012).BAP1loss defines a new class of renal cell carcinoma.Nat Genet 44，751-759.

Phung，Y.T.，Barbone，D.，Broaddus，V.C.，and Ho，M.(2011).Rapid generation of in vitro multicellular spheroids for the study of monoclonal antibody therapy.Journal of Cancer 2，507-514.

Qin，J.，Van Buren，D.，H uang，H.S.，Zhong，L.，Mostoslavsky，R.，Akbarian，S.，and Hock，H.(2010).Chromatin protein L3MBTL1 is dispensable for development and tumor suppression in mice.J Biol Chem 285，27767-27775.

Qin，J.，Whyte，W.A.，Anderssen，E.，Apostolou，E.，Chen，H.H.，Akbarian，S.，Bronson，R.T.，Hochedlinger，K.，Ramaswamy，S.，Young，R.A.，et al.(2012).The polycomb group protein L3mbtl2assembles an atypical PRC1-family complex that is essential in pluripotent stem cells and early development.Cell Stem Cell 11，319-332.

Scheuermann，J.C.，de Ayala Alonso，A.G.，Oktaba，K.，Ly-Hartig，N.，McGinty，R.K.，F(xiàn)raterman，S.，Wilm，M.，Muir，T.W.，and Muller，J.(2010).Histone H2A deubiquitinase activity of the Polycomb repressive complex PR-DUB.Nature465，243-247.

Skarnes，W.C.，Rosen，B.，West，A.P.，Koutsourakis，M.，Bushell，W.，Iyer，V.，Mujica，A.O.，Thomas，M.，Harrow，J.，Cox，T.，et al.(2011).A conditional knockout resource for the genome-wide study of mouse gene function.Nature 474，337-342.

Su，I.H.，Basavaraj，A.，Krutchinsky，A.N.，Hobert.O.，Ullrich，A.，Chait，B.T.，and Tarakhovsky，A.(2003).Ezh2controls B cell development through histone H3methylation and Igh rearrangement.Nat Immunol 4，124-131.

Suraokar，M.B.，Nunez，M.I.，Diao，L.，Chow，C.W.，Kim，D.，Behrens，C.，Lin，H.，Lee，S.，Raso，G.，Moran，C.，et al.(2014).Expression profiling stratifies mesothelioma tumors and signifies deregulation of spindle checkpoint pathway and microtubule network with therapeutic implications.Annals of oncology：official journal of the European Society for Medical Oncology/ESMO25，1184-1192.

Trojer，P.，Cao，A.R.，Gao，Z.，Li，Y.，Zhang，J.，Xu，X.，Li，G.，Losson，R.，Erdjument-Bromage，H.，Tempst，P.，et al.(2011).L3MBTL2protein acts in concert with PcG protein-mediated monoubiquitination of H2A to establish a repressive chromatin structure.Mol Cell 42，438-450.

Trojer，P.，Li，G.，Sims，R.J.，3rd，Vaquero，A.，Kalakonda，N.，Boccuni，P.，Lee，D.，Erdjument-Bromage，H.，Tempst，P.，Nimer，S.D.，et al.(2007).L3MBTL1，a histone-methylation-dependent chromatin lock.Cell 129，915-928.

Wilson，B.G.，Wang，X.，Shen，X.，McKenna，E.S.，Lemieux，M.E.，Cho，Y.J.，Koellhoffer，E.C.，Pomeroy，S.L.，Orkin，S.H.，and Roberts，C.W.(2010).Epigenetic antagonism between polycomb and SWI/SNF complexes during oncogenic transformation.Cancer Cell 18，316-328.

本文引用了各種參考文獻(xiàn)，其全部內(nèi)容引入本文以供參考。本文引用了各種核酸和氨基酸序列登錄號，并且由那些登錄號引用的完整序列的全部內(nèi)容引入本文以供參考。