本發(fā)明涉及自動化處理混合樣本，特別是血液樣本的新方法。此外，本發(fā)明涉及進(jìn)行所述方法的設(shè)備以及相應(yīng)的用途。具體地，所述方法和相應(yīng)的設(shè)備可被用于實(shí)施核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)，以測試捐獻(xiàn)的血液和血液制品。發(fā)明背景在醫(yī)學(xué)上，人血液很有價(jià)值且迄今為止是不可或缺的原料，其現(xiàn)在被用于提取或制備大量的組分和制品。在20世紀(jì)90年代早期的所謂的AIDS丑聞突然引起了公眾和專業(yè)人員對血液和血液制品的病毒安全性的注意。核酸擴(kuò)增技術(shù)(NAT)降低了輸血期間感染的風(fēng)險(xiǎn)。在過去的幾年里，由于改善的捐獻(xiàn)血液的分析方法，在輸血期間被病毒病原體如HIV1/2、HCV、HBV或HAV感染的風(fēng)險(xiǎn)顯著降低。已記載，NAT的引入顯著增加了檢測感染的血液儲備的可能性。在施用于患者之前，必須對供體血液進(jìn)行病原體篩查。在引入NAT之前，主要用抗體檢測來鑒定血液儲備中諸如HIV和肝炎病毒的病原體。由于在針對實(shí)際感染的應(yīng)答中，免疫系統(tǒng)需要一定的時(shí)間形成此類抗體，因此使這些控制經(jīng)受開放的時(shí)間窗(診斷窗)。在感染早期階段檢測相應(yīng)的捐獻(xiàn)血液中的病原體是不可能的，這意味著感染的血液能夠進(jìn)入醫(yī)療護(hù)理。對于治療性的新鮮血漿，僅可以通過要求所有供血者二次捐獻(xiàn)使輸注感染的血液制品的風(fēng)險(xiǎn)最小化，所述二次捐獻(xiàn)在2-3個(gè)月的最小間隔后進(jìn)行。這允許檢測到感染情況下的過渡時(shí)期已在供體體內(nèi)形成的抗體。最初捐獻(xiàn)的血漿被冷凍，并且不能被用于醫(yī)學(xué)治療，直至二次捐獻(xiàn)測試為抗體陰性。對于具有僅數(shù)天的保存期較短的血液制品，如紅細(xì)胞或血小板，該方法不可行。在這些情況下，一旦被測試為陰性，制品在捐獻(xiàn)后必須立即釋放。這意味著測試應(yīng)當(dāng)盡早顯示陽性結(jié)果，以在血液供體感染的情況下使診斷窗最小化。這通過引入NAT作為捐獻(xiàn)血液中病毒污染的靈敏的直接檢測的篩查測試來完成。自從20世紀(jì)90年代中期，基于病毒核酸檢測病毒的方法的發(fā)展取得了成功進(jìn)展。在血漿處理工業(yè)的建議(其對保護(hù)其血漿制品如凝血因子VIII或IX的生產(chǎn)池以防高病毒負(fù)載感興趣)下，在20世紀(jì)90年代中期引入了NAT，用于將輸血相關(guān)病毒HIV-1/2、HCV和HBV，以及后來將細(xì)小病毒B19(PB19)和HAV作為質(zhì)量控制度量。在1999年，疫苗及血清研究所(PaulEhrlichInstitute(PEI))使得對血漿和血液細(xì)胞組分強(qiáng)制進(jìn)行HCVNAT測試。從1997年開始，一些早在1997年，德國紅十字會(DRK)和巴伐利亞紅十字會(BRK)的獻(xiàn)血服務(wù)開始使用NAT對所有捐獻(xiàn)血液的輸血相關(guān)病毒HCV、HIV和HBV進(jìn)行了測試。在2000年，他們也首次將NAT測試擴(kuò)展至細(xì)小病毒PB19和HAV，其現(xiàn)在是所有DRK獻(xiàn)血服務(wù)的標(biāo)準(zhǔn)。在2004年5月，PEI也將HIV-1NAT強(qiáng)制化。因此，在中歐，在1997年至2002年的研究中，用NAT對360萬捐獻(xiàn)的血液樣本進(jìn)行HCV和HIV-1(Roth,WK等人Transfusion2002；42:862-868)以及HBV(Roth,WK等人Transfusion2002；42:869-875)測試。這使得鑒定出6個(gè)HCV和2個(gè)HIV-1PCR確認(rèn)的陽性、抗體陰性的捐獻(xiàn)(得率，分別為1/60萬或1/180萬)以及6個(gè)最終為HBsAg陰性的HBVPCR確認(rèn)的陽性捐獻(xiàn)。由于不同度量，如供體選擇、ELISA測試和NAT測試，篩查的輸血相關(guān)病毒的剩余的病毒風(fēng)險(xiǎn)降低至先前未知的不可估量的低水平。因此，在德國，引入PCR之后，三種輸血相關(guān)病毒HCV、HIV和HBV的剩余風(fēng)險(xiǎn)低至對于HCV，小于1:20百萬，對于HIV-1，小于1:4百萬，以及對于HBV，小于1:1百萬，以使人們甚至可以基本不再提及確切剩余的病毒風(fēng)險(xiǎn)。通常，復(fù)雜和昂貴的NAT的引入導(dǎo)致獻(xiàn)血服務(wù)的額外財(cái)政負(fù)擔(dān)。降低費(fèi)用的一種方式是通過形成所謂的迷你池(mini-pool)將許多個(gè)體供體樣本合并為單一樣本(參見Roth,WK和Seifried,E,TransfusionMedicine2002；12:255-258)。該方法使每天有2,000至4,000例捐獻(xiàn)的大規(guī)模DRK獻(xiàn)血服務(wù)特別受益。以單個(gè)測試的形式，對如此大量的供體樣本進(jìn)行目前的6種病毒測試將需要每天實(shí)施多達(dá)24,000次單個(gè)NAT測試。對于在8小時(shí)工作制中進(jìn)行如此大量的單個(gè)NAT測試仍存在不能克服的技術(shù)限制，因?yàn)榧扔械臒嵫h(huán)儀/分析儀和方法均不允許達(dá)到此種通量?；旌蠈y試次數(shù)降低至技術(shù)上和財(cái)政上可行的程度。將多達(dá)96個(gè)供體血液樣本合并為池，這使得在少量測試中獲得高樣本通量(Roth,WK等人，TheLancet1999；Roth,WK等人，VoxSang2000；78(suppl2):257-259)。然而，即使是用于捐獻(xiàn)血液測試的混合的NAT，其仍是部分手動操作程序，所述混合的NAT將潛在的大樣本數(shù)的巨大花費(fèi)降低至可接受的水平，但是仍未使包含混合和后續(xù)步驟的整個(gè)過程自動化。那將是關(guān)于過程安全性的主要且重要的一步。將供體樣本合并至較大的迷你池對于具有小量至中等量供體數(shù)的獻(xiàn)血服務(wù)以及對于具有高病毒流行率的國家可能獲益較少。如果病毒流行率升高超過特定的水平，則包含太多陽性的迷你池或者所有迷你池(在最壞的情況下)必須分散，并分為陽性單樣本。這導(dǎo)致這些陽性池中的所有樣本(包括陰性樣本)的初步封閉。因此，池中代表的血液制品可用于應(yīng)用之前，需要1-3天。因此，用多達(dá)96個(gè)供體血液樣本創(chuàng)建迷你池的概念僅對于在供體集合體中具有高流行率的國家中進(jìn)行的NAT測試具有有限適用性。DE10258258A1教導(dǎo)了實(shí)現(xiàn)十分高的通量以滿足大型獻(xiàn)血服務(wù)的需求的NAT程序的用途。然而，它仍需要人工干預(yù)。將與來自單個(gè)樣本或混合樣本的核酸結(jié)合的磁性顆粒合并通常是有益的。該過程理論上可以無限繼續(xù)下去，但實(shí)際上，在3至4步之后，如此多的珠子聚集使得核酸的洗脫需要越來越大的緩沖液體積，這意味著對于個(gè)體來源的樣本，必需接受不利的稀釋效應(yīng)。因此，本發(fā)明的目標(biāo)是研發(fā)用于具有高流行率的國家，也用于實(shí)現(xiàn)十分高的通量以滿足大型獻(xiàn)血服務(wù)的需求的允許更快且性能改善的核酸擴(kuò)增技術(shù)的方法。此外，對于個(gè)體捐獻(xiàn)，混合不再默認(rèn)地影響測試靈敏度，但是必需與單個(gè)樣本測試等同。這將消除過去提出的關(guān)于混合的主要問題。本發(fā)明通過提供處理混合或單個(gè)樣本(優(yōu)選自動地)的方法實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。所述方法包括下述步驟：a)在容器中提供待分析的樣本，所述容器各自帶有機(jī)器可讀的標(biāo)記，b)如果適用，則將來自a)的樣本合并(混合)至容器中的至少一個(gè)樣本池中，所述容器各自也帶有機(jī)器可讀的標(biāo)記，c)向來自a)或b)的樣本中添加適用于細(xì)胞裂解的溶液以及適用于結(jié)合核酸的磁珠，d)使樣本中的核酸與所述磁珠結(jié)合，e)使樣本中的磁珠與磁體結(jié)合，f)通過將來自至少兩個(gè)樣本的磁性顆粒轉(zhuǎn)移至新的共有容器中來混合來自e)的珠子，g)用至少另一組待分析的樣本重復(fù)步驟a)至f)，h)使來自步驟f)和g)的樣本池的珠子混合至來自至少4個(gè)樣本池的共有的珠子池中，i)用至少另一組待分析的樣本重復(fù)步驟a)至h)，j)將來自步驟h)和i)的樣本池的珠子轉(zhuǎn)移至至少8倍的珠子池中，k)用洗脫緩沖液洗脫來自j)的池，以及l(fā))將來自步驟k)的洗脫的核酸轉(zhuǎn)移至一種或數(shù)種其它檢測方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括一個(gè)或數(shù)個(gè)使用洗滌緩沖液和磁體的洗滌步驟。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法允許在步驟b)中，每個(gè)樣本池合并2至15個(gè)，以及甚至30個(gè)樣本，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個(gè)樣本。除了混合的樣本，向珠子混合物中添加單個(gè)樣本也是可行的，其實(shí)現(xiàn)了針對單個(gè)樣本的典型的較高靈敏度，并具有較高通量。本發(fā)明通過提供自動化處理混合的或單個(gè)樣本以及通過利用珠子混合合并兩個(gè)或者更多個(gè)單個(gè)樣本或樣本池的方法實(shí)現(xiàn)了該目標(biāo)。根據(jù)本發(fā)明的方法導(dǎo)致在具有高流行率的國家中的增加的樣本通量，降低了樣本制備和處理所需的時(shí)間和/或增強(qiáng)了樣本制備和處理的可靠性。本發(fā)明的方法避免了對于來源樣本的靈敏度的損失，因?yàn)榭梢允褂么蟮膩碓大w積，例如在單個(gè)捐獻(xiàn)的情況下。通過使其上結(jié)合有核酸的珠子合并為2個(gè)、4個(gè)、8個(gè)等的池，仍實(shí)現(xiàn)了混合效應(yīng)。在洗脫步驟期間，核酸從珠子上脫離，并且被轉(zhuǎn)移至檢測反應(yīng)。因此，2、4、8、...n倍的更多的珠子到達(dá)洗脫緩沖液。如果關(guān)于單個(gè)樣本，核酸濃度不改變，則洗脫緩沖液的量(體積)必需保持恒定，并且可能不會相應(yīng)地增加(2倍、4倍、8倍等)。這將增加洗脫緩沖液中珠子的濃度，而可用的洗脫緩沖液的量將降低，因?yàn)橹樽又g的中間空間也成為雙倍、四倍等。這通常被認(rèn)為是不利的。然而，出人意料地發(fā)現(xiàn)這是容許的。在利用2倍的珠子池的比較測試中，發(fā)明人未發(fā)現(xiàn)任何靈敏度損失，并且洗脫體積僅略微增加直至4倍的珠子池。樣本本身能夠再次混合的事實(shí)增加了通量，伴隨著靈敏度降低的已知劣勢，因?yàn)楦鶕?jù)池的尺寸，單個(gè)樣本向該過程貢獻(xiàn)更少材料。當(dāng)前的計(jì)劃推測可以使用向所述過程貢獻(xiàn)1.5mL的樣本體積，也可以使用向所述過程貢獻(xiàn)2.0mL的樣本體積。這允許提取1.5mL單個(gè)樣本體積，或者例如在15個(gè)樣本的池中提取100μL的單個(gè)樣本體積，在10個(gè)樣本的池中提取150μL的單個(gè)樣本體積，在5個(gè)樣本的池中提取300μL的單個(gè)樣本體積。關(guān)于通量，將樣本池乘以珠子池，例如如果15個(gè)樣本的池與4倍的珠子池合并，則通量等于60個(gè)樣本/“池”。連同過程長度和每8小時(shí)的運(yùn)行次數(shù)，這導(dǎo)致每班的最大通量。如果可能，該方法使得用戶能夠并行提取單個(gè)捐獻(xiàn)和/或池，其中新的平臺不僅實(shí)施珠子的混合，而且也自動實(shí)施多達(dá)15個(gè)樣本池的上游樣本混合。先前并未執(zhí)行在提取/PCR平臺自動實(shí)施的樣本混合，并且建立了重要優(yōu)勢。使混合(基于珠子池，多達(dá)8倍)與單個(gè)捐獻(xiàn)測試一樣靈敏，并且具有可在同一平臺實(shí)施高通量的樣本混合的更多優(yōu)勢，其消除了對單獨(dú)的混合設(shè)備的需求(如在現(xiàn)有技術(shù)中)。就單個(gè)捐獻(xiàn)的測試來說，用戶僅裝載單個(gè)供體的初始小瓶，其也僅得到每名供體的一個(gè)結(jié)果，盡管實(shí)施了混合(自動地)。因此，關(guān)于混合，用戶可以“忽略”。在陽性混合結(jié)果的情況下，僅將受影響的單個(gè)小瓶返回至裝置，以鑒定陽性單個(gè)樣本。在優(yōu)選實(shí)施方案中，為步驟a)提供的樣本應(yīng)當(dāng)是液體或者液化樣本。樣本優(yōu)選是血液樣本和其它體液，特別是全血、血漿、血清、血液細(xì)胞組分和/或其它血液制品。血液樣本優(yōu)選為包含血液組分的樣本。優(yōu)選使用存在于且用于獻(xiàn)血和輸血醫(yī)學(xué)的樣本。這也可以包括來自全血或成分捐血(apheresisdonation)的下述血液制備物：–個(gè)體捐獻(xiàn)的制品，如紅細(xì)胞濃縮物(EC)、血小板濃縮物(PC)、干細(xì)胞制備物、來自血漿分離置換法(apheresis)的粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞、冷凍的新鮮血漿(FFP)；-混合的血小板制品，如來自血沉棕黃層的混合PC；-來自血漿池的制品，如含有SD(溶劑/清潔劑)失活的病原體、白蛋白、凝血因子、纖維蛋白膠、抑制劑、免疫球蛋白的FFP。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可以重復(fù)實(shí)施所述方法的步驟c)、d)和e)。在根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，直接在用條形碼標(biāo)記的容器中或者在板孔中實(shí)施血液樣本的混合。本發(fā)明的方法有效地消除了存在于包括用于病毒富集的部分手動步驟的之前方法中的樣本混淆的風(fēng)險(xiǎn)。出于該目的，血液樣本的混合直接發(fā)生于用條形碼標(biāo)記的容器中或者板孔中。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的方法代表不存在人工干預(yù)的單一均勻化過程。優(yōu)選地，在步驟c)中添加的溶液由用于病毒裂解的試劑以及提取試劑組成，所述用于病毒裂解的試劑如裂解緩沖液或使用清潔劑、蛋白酶、離液序列高的鹽、有機(jī)溶劑或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適用于提取核酸的其它溶液和懸液的合并的裂解/結(jié)合緩沖液。緩沖液可以具有堿性、中性或酸性pH值?？上蚓彌_液中添加用于結(jié)合釋放的核酸的固相。固相可以是順磁性的、含鐵的、未涂覆或涂覆的，并且含有官能團(tuán)或者不含官能團(tuán)。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，對樣本，并且特別是血液樣本中核酸的存在進(jìn)行篩查。核酸優(yōu)選是DNA、RNA。此外，核酸應(yīng)當(dāng)優(yōu)選是病毒的核酸。病毒可以選自：人免疫缺陷病毒1和2(HIV-1和HIV-2)以及HIV-1亞群M、N和O，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)，巨細(xì)胞病毒(CMV，HHV5)，甲型肝炎病毒(HAV)，戊型肝炎病毒，細(xì)小病毒B19(PB19)，人T細(xì)胞白血病病毒I/II(HTLVI/II)，西尼羅河病毒(WNV)，SARS冠狀病毒(SARSCoV)，MERS冠狀病毒，登革熱病毒和其它病毒，以及EBV，HHV8，HGV/GBVC，TTV或基孔肯雅熱病毒。該方法還使得可對之前未知病毒的核酸的存在進(jìn)行篩查。在優(yōu)選實(shí)施方案中，該方法包括同時(shí)對來自多種病毒的核酸的存在進(jìn)行篩查。該方法優(yōu)選用于同時(shí)篩查多達(dá)7種病毒，如HCV、WNV、HCMV、HIV-1、HIV-2、HBV、HAV、HEV和PB19。可選實(shí)施方案可以包括對游離核酸，例如在血漿中循環(huán)的游離核酸進(jìn)行篩查。該方法的優(yōu)選實(shí)施方案使用大體積的患者血液組分樣本。使其中包含的核酸經(jīng)受所述方法。優(yōu)選的提取方法是在清潔劑的幫助下進(jìn)行裂解，在酸性條件下使釋放的核酸與磁性顆粒結(jié)合，使用基于離液序列高的鹽(如與膜相連的鹽或者作為固相的磁性顆粒)的提取試劑或者本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它提取方法。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，制備樣本池，用于用戶所選的后續(xù)擴(kuò)增步驟。優(yōu)選地，這包括通過使核酸與固相結(jié)合而對核酸進(jìn)行的純化，一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟，以及純化且濃縮的核酸的洗脫。具體地，對7種病毒的提取和PCR準(zhǔn)備同時(shí)發(fā)生，所述7種病毒如HCV、HIV-1、HIV-2、HBV、HAV、HEV和PB19。根據(jù)本發(fā)明的方法的優(yōu)選實(shí)施方案能夠在8小時(shí)內(nèi)分析3,780個(gè)樣本，其中最大的池大小為n＝15，以及在3次運(yùn)行中最多進(jìn)行4倍(2步)珠子混合。優(yōu)選地，該方法的每個(gè)樣本池合并2至15個(gè)樣本，或者多達(dá)30個(gè)樣本(步驟b)。優(yōu)選地，可將根據(jù)本發(fā)明的方法用于將2、5、10或15個(gè)樣本合并至樣本池中(步驟a)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可將各自為100μL的15個(gè)樣本進(jìn)行合并，將各自為300μL的5個(gè)樣本進(jìn)行合并，或者將各自為750μL的2個(gè)樣本進(jìn)行合并。優(yōu)選的樣本池總體積為1.5mL，任選地2.0mL。根據(jù)本發(fā)明的方法為潛在的擴(kuò)大規(guī)模提供了有利的高適應(yīng)性。因此，如果需要更高的靈敏度，則可以增加樣本的源體積。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用各自為100μL的15個(gè)樣本，各自為300μL的5個(gè)樣本，或者各自為750μL的2個(gè)樣本。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法提供了通過在多達(dá)三個(gè)步驟的純化過程中合并(“珠子池”)至少兩個(gè)樣本池而使樣本通量增加2倍、4倍或8倍的選擇。在該方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，其它檢測程序由核酸擴(kuò)增組成。根據(jù)本發(fā)明的核酸擴(kuò)增可以包括PCR、TaqManPCR、實(shí)時(shí)PCR、TMA、NASBA、SDA或LCR。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，擴(kuò)增之后進(jìn)行擴(kuò)增的核酸的檢測方法。然而，也可對樣本池進(jìn)行無需前期擴(kuò)增的檢測方法。該方法的高度優(yōu)選的實(shí)施方案包括實(shí)時(shí)PCR形式的核酸擴(kuò)增，其使得能夠同時(shí)在線檢測擴(kuò)增的核酸。本發(fā)明的另一方面是設(shè)備，所述設(shè)備的特征在于其適用于實(shí)施根據(jù)本發(fā)明的方法。在優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備適用于產(chǎn)生樣本池、自動核酸提取包括珠子混合、PCR準(zhǔn)備和原始數(shù)據(jù)分析。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備允許樣本池所位于的容器的有利連接，其使用自動化提取方法。根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備包含幾種組件：–至少一個(gè)自動移液工作站，–至少一個(gè)磁性分離器，–至少一個(gè)流體處理臂，和–至少一個(gè)機(jī)械臂，以及如果需要且優(yōu)選地–至少一個(gè)擴(kuò)增單元，和–至少一個(gè)檢測單元相應(yīng)的組件對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言通常是已知的?？蓪⒋判苑蛛x器整合至自動移液工作站中。在向樣本池或單個(gè)樣本添加液體(外加磁性固相)之后發(fā)生混合過程(例如基于上下吹吸)。然后經(jīng)磁性分離器上的液體處理臂將液體轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中。任選地，經(jīng)電磁體或永磁體(“浸漬法”)將磁性固相轉(zhuǎn)移至反應(yīng)器皿中。在該步驟中，可以通過轉(zhuǎn)移分別將兩個(gè)樣本池或者單個(gè)樣本的磁性固相在同一反應(yīng)器皿中合并。在根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的優(yōu)選實(shí)施方案中，所有組件均被設(shè)計(jì)為集成設(shè)備，并且位于外殼內(nèi)。用于根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備的合適的組件為，例如瑞士(Switzerland)的Hamilton公司的裝置。因此，合適的自動化移液裝置可以，例如由HamiltonStar或HamiltonVantage移液器組成，而例如KingFisher類型的裝置可以用作磁性分離器。諸如Tecan、Beckman、Xiril、Sias、ThermoFisher和Qiagen的其它制造商的裝置也是合適的組件。在又一優(yōu)選實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備是軟件可控的。根據(jù)本發(fā)明，可以用軟件控制提取過程。可以利用軟件實(shí)現(xiàn)整個(gè)過程(混合、提取、珠子混合、檢測、評價(jià))的監(jiān)測。軟件監(jiān)測整個(gè)過程。在該背景下，軟件向單個(gè)子步驟的軟件程序提供工作列表，并處理、評價(jià)和存檔，例如錯(cuò)誤信息和子步驟結(jié)果。優(yōu)選地，可以對根據(jù)本發(fā)明的軟件進(jìn)行編程，以整合混合、提取、珠子混合、PCR準(zhǔn)備和實(shí)時(shí)PCR。因此，本發(fā)明的又一方面包括控制和監(jiān)測根據(jù)本發(fā)明的方法的計(jì)算機(jī)程序。在又一特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，用條形碼標(biāo)記追蹤諸如捐獻(xiàn)的血液樣本至最終結(jié)果，并且可通過該條形碼對其進(jìn)行鑒定。在用條形碼標(biāo)記的容器中的直接混合以及自動化的條形碼控制的核酸提取、擴(kuò)增和濃縮過程之后的檢測排除了整個(gè)NAT測試過程期間樣本的任何混淆。因此，根據(jù)本發(fā)明的方法將包括濃縮步驟的方法的高通量和高靈敏度與自動化且完全條形碼控制的過程的高安全性水平進(jìn)行了組合。根據(jù)本發(fā)明的方法有效地消除了存在于包括用于病毒富集的部分手動步驟的之前方法中的樣本混淆的風(fēng)險(xiǎn)。出于該目的，將樣本，特別是血液樣本直接在用條形碼標(biāo)記的容器中混合。然后將這些容器轉(zhuǎn)移至提取程序，所述提取程序由于條形碼監(jiān)測或者固定的物理分配而不允許任何樣本混淆。優(yōu)選地，這是無人工干預(yù)的完全自動化的均勻化過程。提取過程(包括珠子混合)之后進(jìn)行自動化和軟件監(jiān)測的PCR設(shè)置、擴(kuò)增以及軟件輔助檢測和評價(jià)。本發(fā)明的另一方面涉及根據(jù)本發(fā)明的設(shè)備在根據(jù)本發(fā)明的如上所述的自動化處理混合或單個(gè)樣本中的用途。也處理之前混合的樣本的選擇以及在特定的后續(xù)過程中再次將其合并至較大的池的選擇也是可用的，包括在同一自動化設(shè)備中實(shí)施該預(yù)混合的選擇。這也將使得在此種情況下將初始小瓶直接裝載于平臺上而沒有單獨(dú)的混合裝置，以及在同一過程中實(shí)施自動化的預(yù)混合是可行的。在小的血液體積和高流行率的情況下，對單個(gè)樣本進(jìn)行測試是選擇的方法。在較大體積的情況下，優(yōu)選在數(shù)個(gè)后續(xù)步驟的提取過程中，分別合并至少兩個(gè)單個(gè)樣本，或者形成例如10個(gè)或者更少的捐獻(xiàn)血液樣本的較小迷你池。該方法能夠?qū)崿F(xiàn)足夠的通量，即使具有高流行率亦如此。在低流行率的情況下，即使高通量的NAT也是可行的。參考附圖，在下述實(shí)施例中進(jìn)一步解釋了本發(fā)明，但其不限于所述實(shí)施例。附圖圖1：來自實(shí)施例1的選擇1的設(shè)備和流程圖。圖2：來自實(shí)施例2的選擇2的設(shè)備和流程圖。圖3：來自實(shí)施例3的每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。圖4：來自實(shí)施例3的每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。圖5：來自實(shí)施例3的每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。圖6：來自實(shí)施例3的每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。圖7：來自實(shí)施例3的每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。觀察到了板1(未混合的)上和最終4倍混合的板上的各HBV的一次失敗。圖8：來自實(shí)施例3的每種樣本類型的Cp值(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的總結(jié)。對貫穿板的樣本類型(分別為未混合的、2倍或4倍混合的)的所有重復(fù)進(jìn)行總結(jié)。實(shí)施例下述實(shí)施例1和2討論了所述8倍或4倍珠子混合原則的兩種可能的選擇，其中所有三部分均合并至連續(xù)過程的單一測試平臺中?？梢蕴峁┓謩e吹吸或者在同一平臺上吹吸的“預(yù)”混合的樣本代替單個(gè)供體樣本。可以使用樣本池代替單個(gè)樣本。也可以將3個(gè)或者更多個(gè)樣本或樣本池進(jìn)行合并來代替如此處所示的各2個(gè)樣本(樣本板)。實(shí)施例1：處理48個(gè)樣本(持續(xù)大約4h)混合發(fā)生在與提取和PCR設(shè)置相同的自動移液工作站。出于該目的，通過條架(striprack)上的移液機(jī)械臂移動多達(dá)48個(gè)初始條形碼標(biāo)記的小瓶(EDTAVacuette,Greiner,Frickenhausen,Germany)，之前將所述小瓶在5,500xg離心15min(Multifuge,Kendro,Osterode,Germany)，以分離血漿和血液細(xì)胞組分。此外，將多達(dá)48個(gè)條形碼標(biāo)記的池容器(例如小瓶)置于移液機(jī)械臂的工作空間。移液裝置配備有用于自動化核酸分離的磁性分離器。例如，病毒核酸的提取使用如德國專利DE10258258A1中公開的基于磁性顆粒的提取化學(xué)。除了48個(gè)條形碼標(biāo)記的小瓶之外，提取裝置還配備有耗材(一次性吸頭、反應(yīng)器皿)、提取試劑(GFEBlut的autoX提取試劑盒)以及用于HIV、HCV、HBV、HAV和PB19(所謂混合母液(mastermixes))的PCR試劑。在完全自動化的提取過程開始之后，讀取初始小瓶的條形碼。從各初始小瓶提取100μL血漿，并將其置于離心小瓶(混合容器)中。向樣本池中添加800μL結(jié)合緩沖液。然后將這些攪拌10min。然后將分別來自2個(gè)小瓶的裂解物在反應(yīng)器皿中合并。由磁性顆粒分離剩余的裂解物，并且僅對與核酸結(jié)合的磁性顆粒進(jìn)行進(jìn)一步處理。隨后用含有蛋白酶的洗滌緩沖液進(jìn)行兩個(gè)洗滌步驟以及于80℃(磁性分離器的加熱模塊)，在具有低離子強(qiáng)度的緩沖液中進(jìn)行核酸的洗脫。在各種情況下，通過磁性分離器上的磁性分離進(jìn)行液體和核酸結(jié)合基質(zhì)的分離。一旦核酸分離完成，隨后進(jìn)行完全自動化的PCR設(shè)置。正如在核酸提取的情況下，該步驟是完全條形碼控制的，并且遵循由軟件所產(chǎn)生的工作表。出于該目的，將之前置于提取裝置的工作空間的相應(yīng)的病毒特異的PCR混合母液置于各PCR板，并且隨后添加提取物。提取和PCR設(shè)置的總持續(xù)時(shí)間為大約2.5小時(shí)。合適的移液裝置及其組件為，例如德國的TecanofCrailsheim的裝置。因此，合適的自動化移液裝置可以由FreedomEVO組成，而諸如TeMagS類型的裝置可以用作磁性分離器，以及可將諸如IKAKScontrol130類型的裝置用于攪拌。德國MerckofDarmstadt的二氧化硅是合適的磁性顆粒的實(shí)例。條形碼以及提取和PCR設(shè)置的監(jiān)測由軟件控制。最終步驟是PCR板的手動或自動密封，以及其向?qū)崟r(shí)PCR熱循環(huán)儀的轉(zhuǎn)移。如之前所公開的實(shí)施擴(kuò)增；對于HIV-1，參見DrostenC等人(J.Clin.Microbiol.,2001,39:4302-4308)；對于HBV，參見DrostenC.等人(Transfusion,2000,40:718-427)；對于HCV、HBV和HIV-1，參見RothWK等人(Lancet,1999,353:359-363)。優(yōu)選地，這包括含有競爭性內(nèi)部對照的TaqManPCR分析。以上擴(kuò)增和檢測花費(fèi)大約2小時(shí)。RocheDiagnostics的480裝置是合適的熱循環(huán)儀的實(shí)例。結(jié)果：所描述的測試實(shí)現(xiàn)了NAT測試過程的完全條形碼控制。確定排除了樣本的任何混淆。關(guān)于單一捐獻(xiàn)，對于各病毒，以三倍濃度使用由GFEBlut的autoX系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的95％的檢測限(對于HCV，102IU/mL；對于HIV-1，1046IU/mL；對于HBV，91IU/mL；對于HAV，40IU/mL；以及對于PB19，483IU/mL)。未觀察到失敗，得到這樣的結(jié)論：所述方法具有等同靈敏度。實(shí)施例2：處理192個(gè)樣本(持續(xù)大約3小時(shí))手動制備樣本，但是這也可以在移液平臺上實(shí)施。用ThermoFisher的KingFisherFlex實(shí)施提取，并且手動進(jìn)行本實(shí)施例中的PCR設(shè)置(也可在移液平臺上實(shí)施)。出于該目的，通過條架上的移液機(jī)械臂移動多達(dá)192個(gè)原始條形碼標(biāo)記的小瓶(EDTAVacuette,Greiner,Frickenhausen)，之前將所述小瓶在5,500xg離心15min(Multifuge,Kendro,Osterode)，以分離血漿和血液細(xì)胞組分。此外，將多達(dá)2個(gè)條形碼標(biāo)記的池容器(例如，具有96個(gè)孔的板)置于移液機(jī)械臂的工作空間上。為了使核酸分離自動化，使移液裝置配備有磁性分離器(KingFisher)。然而，由于其還未被實(shí)施，因此在單獨(dú)的KingFisher模塊上進(jìn)行提取。例如，病毒核酸的提取使用如德國專利DE10258258A1中所公開的基于磁性顆粒的提取化學(xué)。除了4個(gè)條形碼標(biāo)記的96孔板之外，提取裝置還配備有耗材(一次性吸頭、反應(yīng)器皿、深孔板)，提取試劑(GFEBlut的autoX提取試劑盒)以及用于HIV、HCV、HBV、HAV和PB19的PCR試劑(所謂的混合母液)。在樣本制備過程(也用于混合)開始之后，讀取初始小瓶的條形碼。從各初始小瓶提取100μL血漿，并將其置于96孔板內(nèi)。向各樣本池添加800μL結(jié)合緩沖液，并將其置于KingFisher模塊上。然后將樣本攪拌10min。隨后由磁性顆粒分離剩余的裂解物，并且僅將分別來自2個(gè)板位置的與核酸結(jié)合的磁性顆粒在96孔板的一處位置合并，以用于進(jìn)一步處理。隨后用含有蛋白酶的洗滌緩沖液進(jìn)行兩個(gè)洗滌步驟以及于80℃(磁性分離器的加熱模塊)，在具有低離子強(qiáng)度的緩沖液中進(jìn)行核酸的洗脫。在各種情況下，經(jīng)磁性分離器，通過磁性分離進(jìn)行液體和核酸結(jié)合基質(zhì)的分離(用永磁頭進(jìn)行浸漬處理)。一旦核酸分離完成，則可以開始完全自動化的PCR設(shè)置(這在該實(shí)施例中手動進(jìn)行)。正如在核酸提取的情況下，該步驟是完全條形碼控制的，并且遵循由軟件產(chǎn)生的工作表。出于該目的，將之前位于提取裝置的工作空間上的相應(yīng)的病毒特異性PCR混合母液置于各PCR板內(nèi)，并且隨后添加提取物。提取和PCR設(shè)置的總持續(xù)時(shí)間為大約1小時(shí)。合適的移液裝置及其組件為，例如TecanofCrailsheim的裝置。因此，合適的自動化移液裝置可以由FreedomEVO裝置組成，而諸如KingFisherFlex類型的裝置可以用作磁性分離器。MerckofDarmstadt的二氧化硅是合適的磁性顆粒的實(shí)例。系統(tǒng)軟件控制條形碼，并且控制且監(jiān)測提取和PCR設(shè)置。最終步驟是PCR板的手動或自動化密封，以及其向?qū)崟r(shí)PCR熱循環(huán)儀的轉(zhuǎn)移。如之前公開的實(shí)施擴(kuò)增；對于HIV-1，參見DrostenC.等人(J.Clin.Microbiol.,2001,39:4302-4308)；對于HBV，參見DrostenC.等人(Transfusion,2000,40:718-427)；對于HCV、HBV和HIV-1，參見RothWK等人(Lancet,1999,353:359-363)。優(yōu)選地，這包括含有競爭性內(nèi)部對照的TaqManPCR分析。以上擴(kuò)增和檢測花費(fèi)大約2小時(shí)。RocheDiagnostics的480裝置是合適的熱循環(huán)儀的實(shí)例。結(jié)果：所述測試實(shí)現(xiàn)了NAT測試過程的完全條形碼控制。確定排除了樣本的任何混淆。關(guān)于單一捐獻(xiàn)，對于各病毒，以三倍濃度使用由GFEBlut的autoX系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)的95％的檢測限(對于HCV，997IU/mL；對于HIV-1，1029IU/mL；對于HBV，59IU/mL)，并且在珠子混合的各種情況下，將其與陰性樣本組合。未觀察到失敗，得到這樣的結(jié)論：所述方法具有等同靈敏度。實(shí)施例32倍珠子混合為了提供方法的功能的證據(jù)，在使用提取模塊(EM，用于加熱樣本、磁性分離和磁性顆粒的重懸的裝置)的同時(shí)，實(shí)施2倍珠子混合，即來自兩個(gè)樣本池的磁性顆粒的合并。為此，提供24孔形式的兩個(gè)樣本板，其中樣本池如下：板1：板2：陽性＝分別為100μl的15(分析1)或13(分析2)個(gè)樣本的池，它們中的14個(gè)或12個(gè)是病毒陰性樣本(NHP)并且一個(gè)是與GFEautoX系統(tǒng)的2倍檢測限相對應(yīng)的病毒陽性樣本：陰性＝1.5(分析1)或1.3(分析2)ml陰性人血漿(NHP)IC＝內(nèi)部對照，由重組RNA病毒組成，用于監(jiān)測從病毒裂解至RT-PCR的過程步驟以及控制珠子的轉(zhuǎn)移。在病毒裂解和核酸與磁性顆粒結(jié)合之后，將來自板1和2的磁性顆粒合并：板3：在每個(gè)初始板可用的24個(gè)重復(fù)中，對于分別來自板1或板2的各6個(gè)重復(fù)，不實(shí)施珠子混合。對于另外6個(gè)重復(fù)，將陽性材料與陽性材料混合，其中IC各自僅存在于半行中。這導(dǎo)致具有各自單一量的IC的理論上兩倍的陽性材料。因此，應(yīng)當(dāng)用如未混合樣本中的更早的Cp值來檢測各病毒(理論位移-1)，而IC的檢測不應(yīng)改變。對于剩余的6個(gè)重復(fù)，將陽性材料與陰性材料混合，而IC各自僅存在于半行中。在此，應(yīng)當(dāng)在無任何改變的情況下檢測各病毒和IC，即可與不存在珠子混合的分析相比較，而無Cp位移。使用該板配置，在使用的磁性顆粒的種類和提取方案(分別不使用或者使用乙醇)不同的兩個(gè)獨(dú)立分析中，可以顯示，方法的靈敏度不受2倍珠子混合的影響。分析1：1.5ml血漿，離液序列高的裂解以及與具有二氧化硅表面的磁性顆粒結(jié)合，使用溫和且不含乙醇的洗滌緩沖液。不同的樣本類型包含于24深孔KF板中，每孔如下：陽性+IC：100μlPos+1.4mlNHP+10μlIC成套液(kit)陽性：100μlPos+1.4mlNHP陰性+IC：1.5mlNHP+10μlIC成套液陰性：1.5mlNHP在提取模塊的提取的順序，包括下述手動步驟：-在24深孔板中提供待提取的樣本(參見上述)；-添加975μl蛋白酶K溶液；-添加1.970μl含磁性顆粒的離液序列高的結(jié)合緩沖液；-通過EM裂解(在56℃混合/孵育)，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至500μl洗滌緩沖液1中；-通過EM混合，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至500μl洗滌緩沖液2中；-通過EM混合，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至130μl洗脫緩沖液中，在80℃洗脫；-通過EM收集珠子；-將洗脫物(～80μl)手動轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)中(參見下文)。PCR反應(yīng)：通過向參數(shù)HBV/HCV(bc)、HIV-1(i1)、HIV-2/HAV(i2a)和PB19(b19)的各寡聚混合物(OM)中添加基礎(chǔ)混合物(BM)來制備PCR-混合母液(MM)。bc、i2a：每132μlOM，各858μlBM30μlMM/孔分別添加20μl各洗脫物或PosKo(陽性對照的成套液)或NTC(陰性對照的成套液)；i1、b19：每84μlOM，各546μlBM15μlMM/孔分別添加10μl各洗脫物或PosKo(陽性對照的成套液)或NTC(陰性對照的成套液)；用RocheLightCycler480II系統(tǒng)在96孔板中運(yùn)行定量RT-PCR。結(jié)果：+在無珠子混合的情況下的單一量的陽性材料(分別是板1或板2)++兩個(gè)陽性樣本進(jìn)行珠子混合之后的雙倍量的陽性材料+-在一個(gè)陽性樣本和一個(gè)陰性樣本進(jìn)行珠子混合之后的單一量的陽性材料Cp值的平均值(MW)：圖3顯示了每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。除了HIV-2(在+(板1)一次失敗)以外，未觀察到失敗。結(jié)果顯示珠子混合在未喪失任何靈敏度下起作用。這一方面顯示于IC中，其最終以單一量見于所有樣本中(不存在或者存在珠子混合)，并且對于所有參數(shù)(bc、i1、i2a、b19)，可分別用非常相當(dāng)?shù)腃p值對其進(jìn)行鑒定。另一方面，對于最終單一量的陽性材料(+)的所有樣本(不存在以及存在珠子混合)，所有病毒參數(shù)(HCV、HBV、HIV-1、HIV-2、HAV、PB19)各自顯示出非常相當(dāng)?shù)腃p值。此外，在珠子混合之后，如所期望的，包含雙倍量的陽性材料(++)的所有樣本顯示出略小的Cp值，反映增加量的病毒。總之，符合單一珠子混合的預(yù)期。與未混合的樣本相比，最終增加的珠子的量不會導(dǎo)致洗脫效力的顯著變差。在分析2中，使用不同的磁性顆粒和不同的方案確認(rèn)了對于雙倍珠子混合的該結(jié)果。分析2：1.3ml血漿，離液序列高的裂解以及核酸與磁性顆粒(用官能團(tuán)修飾的表面)的結(jié)合的異丙醇沉淀，用包含乙醇的洗滌緩沖液洗滌。不同的樣本類型如下包含于24深孔KF板的各孔中：陽性+IC：100μlPos+1.2mlNHP+10μlIC成套液陽性：100μlPos+1.2mlNHP陰性+IC：1.3mlNHP+10μlIC成套液陰性：1.3mlNHP在提取模塊(EM)的提取的順序，包括下述手動步驟：-在24深孔板中提供待提取的樣本(參見上述)；-添加325μl蛋白酶K溶液；-添加1.300μl含有磁性顆粒的離液序列高的結(jié)合緩沖液；-通過EM裂解(在56℃混合/孵育)；-添加10μl磁性顆粒；-添加2.050μl異丙醇；-通過EM收集珠子，并轉(zhuǎn)移至700μl洗滌緩沖液1中；-通過EM混合，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至800μl洗滌緩沖液2中；-通過EM混合，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至130μl洗脫緩沖液中，在80℃洗脫；-通過EM收集珠子；-將洗脫物(～80μl)手動轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)中(參見下文)。PCR反應(yīng)：通過向參數(shù)HBV/HCV(bc)、HIV-1(i1)、HIV-2/HAV(i2a)和PB19(b19)的各寡聚混合物(OM)中添加基礎(chǔ)混合物(BM)來制備PCR-混合母液(MM)。bc、i2a：每132μlOM，各858μlBM30μlMM/孔分別添加20μl各洗脫物或PosKo(陽性對照的成套液)或NTC(陰性對照的成套液)；i1、b19：每84μlOM，各546μlBM15μlMM/孔分別添加10μl各洗脫物或PosKo(陽性對照的成套液)或NTC(陰性對照的成套液)；使用RocheLightCycler480II系統(tǒng)，在96孔板中運(yùn)行定量RT-PCR。結(jié)果：+在無珠子混合的情況下的單一量的陽性材料(分別是板1或板2)++兩個(gè)陽性樣本進(jìn)行珠子混合之后的雙倍量的陽性材料+-在一個(gè)陽性樣本和一個(gè)陰性樣本進(jìn)行珠子混合之后的單一量的陽性材料Cp值的平均值(MW)：MWCpHCVHBVHIV-1v3HIV-2v2HAVv2PB19IC(bc)IC(i1)IC(i2av2)IC(b19)+(板1)34.0332.8629.1727.2126.5630.2629.3126.0525.7826.09+(板2)33.7332.3929.4026.9626.3630.1628.9025.7625.6126.04++33.1231.7629.0825.8025.2429.2929.8626.3025.5526.55+-33.5633.0430.0727.3126.3030.4730.0426.5626.0526.48圖4顯示了每種樣本類型Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。未觀察到失敗。結(jié)果確認(rèn)了珠子混合也在不同的實(shí)驗(yàn)設(shè)置中的成功實(shí)踐實(shí)施。這在一方面顯示于IC中，其最終以單一量見于所有樣本中(不存在或存在珠子混合)，并且對于所有參數(shù)(bc、i1、i2a、b19)，可分別用非常相當(dāng)?shù)腃p值對其進(jìn)行鑒定。未能觀察到珠子混合的顯著變差。另一方面，對于最終為單一量的陽性材料(+)的所有樣本(不存在或存在珠子混合)，所有病毒參數(shù)(HCV、HBV、HIV-1、HIV-2、HAV、PB19)各自顯示出非常相當(dāng)?shù)腃p值。此外，在珠子混合之后，如所期望的，包含雙倍量的陽性材料(++)的所有樣本顯示出略小的Cp值，反映增加量的病毒?？傊Y(jié)果符合預(yù)期，與未混合的樣本相比，最終增加的珠子的量不會導(dǎo)致洗脫效力的顯著變差。在分析3中，確認(rèn)了對于4倍珠子混合的該結(jié)果。分析3：為了確認(rèn)方法的功能，使用提取模塊(EM，用于加熱樣本，磁性分離和磁性顆粒重懸的裝置)實(shí)施所謂的4倍珠子混合，即來自4個(gè)樣本池的磁性顆粒的混合。實(shí)驗(yàn)設(shè)置：對于4倍珠子混合，需要2個(gè)EM，每個(gè)同時(shí)裂解兩個(gè)樣本板，即總共處理4個(gè)樣本板。裂解之后，在各EM，在洗滌緩沖液1中合并兩個(gè)樣本板的珠子(→2倍混合)。在下一步驟中，將兩個(gè)WB1板置于EM的外巢上，并且在洗滌緩沖液2(中間巢)中合并兩個(gè)板的珠子(→總共4倍混合)。將實(shí)驗(yàn)計(jì)劃為，可以使用Cp值作為讀出，在定量RT-PCR中最終控制各單個(gè)板的裂解以及2倍和4倍珠子混合。對于此，在提取時(shí)，產(chǎn)生未混合的、2倍混合的以及4倍混合的樣本。每行以交替串聯(lián)向樣本板中添加IC，以在成功進(jìn)行珠子混合之后，在各樣本位置可以檢測到單一量的IC。為了對混合的效力以及混合可能的負(fù)面影響進(jìn)行測試，在另一方面，將“陽性材料與陽性材料”進(jìn)行比較，以及在另一方面，“將陽性材料與陰性材料(NHP)”混合。分析3：4倍混合的“陽性材料與陽性材料”：1.5ml血漿，離液序列高的裂解，以及與具有二氧化硅表面的磁性顆粒結(jié)合，使用溫和且不含乙醇的洗滌緩沖液使24孔形式的四個(gè)初始樣本板載有如下樣本池，其中使用兩個(gè)不同的樣本類型：Pos+IC：100μlPos+1.4mlNHP+10μlIC成套液Pos：100μlPos+1.4mlNHP陽性(Pos)＝各100μl的15個(gè)樣本的池，其包含14個(gè)病毒陰性樣本(NHP)和一個(gè)與GFEautoX系統(tǒng)的2倍檢測限相對應(yīng)的病毒陽性樣本：IC＝內(nèi)部對照，由重組RNA病毒組成，用于監(jiān)測病毒裂解至RT-PCR的處理步驟以及控制珠子的轉(zhuǎn)移。板1(EMv2,巢1)：板2(EMv2,巢3)：123456APosPosPosABBCPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICCDPosPosPosD123456板3(EMv1,巢1)：123456AABPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICBCPosPosPosCDPosPosPosD123456板4(EMv1,巢3)：123456AABPosPosPosBCPosPosPosCDPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICD123456隨后在WB1中的2倍珠子混合：2xPos＝作為2倍珠子混合的結(jié)果的雙倍量的陽性材料。WB1(EMv2)中的板1+2:WB1(EMv1)中的板3+4：隨后在WB2中的4倍珠子混合：4xPos＝作為4倍珠子混合的結(jié)果的4倍量的陽性材料。WB1(EMv1)+WB1(EMv2)＝板1+2+3+4在每個(gè)初始板中呈現(xiàn)的24個(gè)重復(fù)中，對于各板1-4的3個(gè)重復(fù)，未實(shí)施珠子混合(總共12個(gè)重復(fù))。對于兩個(gè)2倍珠子混合制備物中的另外3個(gè)重復(fù)，將陽性材料與陽性材料混合，其中IC僅存在于一行(總共6個(gè)重復(fù))。這導(dǎo)致各單一量的IC的理論上雙倍的陽性材料(2xPos)。因此，應(yīng)當(dāng)用在未混合樣本中的較早的Cp值(理論位移-1)來檢測各病毒，而IC的檢測不應(yīng)改變。對于剩余的6個(gè)重復(fù)，在2個(gè)步驟中，分別將陽性材料與陽性材料合并，其中IC僅存在于一行中。這通過兩個(gè)隨后的珠子混合步驟，導(dǎo)致單一量的IC的理論上四倍的陽性材料(4xPos)。因此，與應(yīng)當(dāng)觀察到理論位移-2的Cp的未混合的樣本相比，應(yīng)當(dāng)用2倍混合樣本中甚至更早的Cp值(理論位移-1)來檢測各病毒。IC的檢測不應(yīng)改變。在提取模塊(EM)的提取的順序，包括下述手動步驟：-在24深孔板中提供待提取的樣本(參見上述)；-添加975μl蛋白酶K溶液；-添加1.970μl含磁性顆粒的離液序列高的結(jié)合緩沖液；-通過EM裂解(在56℃混合/孵育)；收集珠子；-2倍珠子混合：通過EM將珠子從各2個(gè)初始樣本板轉(zhuǎn)移至500μl洗滌緩沖液1中；-混合，收集珠子；-4倍珠子混合：通過EM將2倍混合的轉(zhuǎn)移至500μl洗滌緩沖液2中；-通過EM混合，收集珠子，并轉(zhuǎn)移至150μl洗脫緩沖液中，在80℃洗脫；-通過EM收集珠子；-將洗脫物(～80μl)手動轉(zhuǎn)移至PCR反應(yīng)中(參見下述)。PCR反應(yīng)：與2倍珠子混合的分析類似。結(jié)果：Pos+IC在不存在珠子混合的情況下的單一量的陽性材料，單一量的IC2xPos+IC在兩個(gè)陽性樣本的2倍珠子混合之后的雙倍量的陽性材料，單一量的IC4xPos+IC在四個(gè)陽性樣本的4倍珠子混合之后的四倍量的陽性材料，單一量的IC。圖5顯示了每個(gè)參數(shù)和板的Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。未觀察到失敗。圖6顯示了Cp值的總結(jié)：對貫穿板的樣本類型(分別為未混合的、2倍混合池或4倍混合池)的所有重復(fù)進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果顯示也可以實(shí)施4倍珠子混合，而不存在任何問題。這在一方面顯示于IC中，其最終見于單一量的所有樣本中(分別不存在以及存在2倍或4倍珠子混合)，并且對于所有參數(shù)(bc、i1、i2a、b19)，可分別用非常相當(dāng)?shù)腃p值對其進(jìn)行鑒定。在另一方面，如可從未混合的材料至2倍混合的材料直至4倍混合的材料很好地看出，如所期望的，所有病毒參數(shù)(HCV、HBV、HIV-1、HIV-2、HAV、PB19)各自顯示出Cp值的增加。這反映了增加量的病毒?？傊?，結(jié)果符合預(yù)期，與未混合的樣本相比，最終增加的珠子的量不會導(dǎo)致洗脫效力的顯著變差。分析4：4倍混合的“陽性材料和陰性材料”：1.5ml血漿，離液序列高的裂解以及與具有二氧化硅表面的磁性顆粒結(jié)合，使用溫和且不含乙醇的洗滌緩沖液。使24孔形式的四個(gè)初始樣本板載有如下樣本池，其中使用四個(gè)不同的樣本類型：Pos+IC:100μlPos+1.4mlNHP+10μlIC成套液Pos:100μlPos+1.4mlNHPNeg+IC:1.5mlNHP+10μlIC成套液Neg：1.5mlNHP陽性(Pos)＝各100μl的15個(gè)樣本的池，其包含14個(gè)病毒陰性樣本(NHP)和一個(gè)與GFEautoX系統(tǒng)的2倍檢測限相對應(yīng)的病毒陽性樣本：陰性(Neg)＝各100μl的15個(gè)病毒陰性(NHP)樣本的池。IC＝內(nèi)部對照，由重組RNA病毒組成，其用于病毒裂解至RT-PCR的處理步驟以及控制珠子的轉(zhuǎn)移。板1(EMv1,巢1)：板2(EMv1,巢3):板3(EMv2,巢1)：123456AABPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICBCNegNegNegCDNegNegNegD123456板4(EMv2,巢3)：123456AABNegNegNegBCPosPosPosCDPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICPos+ICD123456隨后在WB1中的2倍珠子混合:在WB1(EMv1)中的板1+2：在WB1(EMv2)中的板3+4：隨后在WB2中的4倍珠子混合：WB1(EMv1)+WB1(EMv2)＝板1+2+3+4在每個(gè)初始板中呈現(xiàn)的24個(gè)重復(fù)中，對于各板1-4的3個(gè)重復(fù)，未實(shí)施珠子混合(總共12個(gè)重復(fù))。對于兩個(gè)2倍珠子混合制備物中的另外3個(gè)重復(fù)，將陽性材料與陽性材料混合，其中IC僅存在于一行(總共6個(gè)重復(fù))。對于剩余的6個(gè)重復(fù)，在2個(gè)步驟中，將陽性材料與三倍陰性材料混合一次成4倍，其中IC僅存在于一行中。因此，實(shí)驗(yàn)理論上導(dǎo)致24個(gè)相同的樣本，其中陽性材料以及IC均以單一量存在(Pos+IC)。因此，這些樣本在PCR中應(yīng)當(dāng)表現(xiàn)類似，并且應(yīng)當(dāng)用類似的Cp值對其進(jìn)行檢測。在該實(shí)施例中，如以上所述，以與其它分析類似地實(shí)施該實(shí)驗(yàn)。圖7顯示了每個(gè)參數(shù)和板的Cp值的平均值(MW)(帶標(biāo)準(zhǔn)差)的圖形描述。觀察到了板1(未混合的)上以及最后的4倍混合板上各HBV的一次失敗。此外，圖8顯示了Cp值的總結(jié)：對貫穿板的樣本類型(分別為未混合的、2倍混合的或4倍混合的)的所有重復(fù)進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果顯示也可以實(shí)施4倍珠子混合，而不存在任何問題。這在一方面顯示于IC以及病毒參數(shù)(HCV、HBV、HIV-1、HIV-2、HAV、PB19)中，其最終見于單一量的所有樣本中(分別不存在以及存在2倍或4倍珠子混合)，并且對于所有參數(shù)，可分別用非常相當(dāng)?shù)腃p值對其進(jìn)行鑒定?？傊?，1個(gè)陽性與3個(gè)陰性池樣本的4倍珠子混合的結(jié)果符合預(yù)期。與未混合的樣本相比，最終增加的珠子的量不會導(dǎo)致洗脫效力的顯著變差。當(dāng)前第1頁1 2 3