發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種提高微生物脂類含量的方法以及脂類含量增加的改良性微生物。
背景技術(shù)：
：用活體生物(如植物和藻類)生產(chǎn)的生物燃料是石油類燃料(如柴油和汽油)的替代燃料。藻類是生產(chǎn)生物燃料的首選，它們可以將陽光和二氧化碳高效轉(zhuǎn)化為生物質(zhì)并合成脂類，可以在惡劣環(huán)境條件下生長(zhǎng)。許多藻類菌株產(chǎn)生甘油三酸酯，后者可轉(zhuǎn)化為生物燃料。增加微生物脂類含量的方法包括限制營養(yǎng)，調(diào)節(jié)酶活性，在產(chǎn)生應(yīng)激的環(huán)境中培育微生物，以及基因工程技術(shù)。雖然這些方法可以增加脂類含量，但缺點(diǎn)在于生長(zhǎng)速度和產(chǎn)生的細(xì)胞量整體減少。眾所周知，光合作用中的大量固定碳用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)合成減少會(huì)導(dǎo)致脂類(用于從微生物尤其是藻類/藍(lán)藻細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料)制造過程中固定碳的利用。可以減少蛋白質(zhì)合成，將碳通量用于生產(chǎn)脂類。因此，本發(fā)明的發(fā)明人設(shè)計(jì)一種減少微生物蛋白質(zhì)合成從而增加脂類含量的方法。本發(fā)明還涉及脂類含量增加的改良性微生物菌株，如藻類和/或藍(lán)藻細(xì)菌。發(fā)明目的本發(fā)明的部分目的(通過改進(jìn)至少一種具體實(shí)施方式實(shí)現(xiàn))如下所述：本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種減少(下降調(diào)節(jié))蛋白質(zhì)合成中的tRNA分子表達(dá)以減少蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而增加微生物脂類含量的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種減少(下降調(diào)節(jié))微生物蛋白質(zhì)合成中的起始過程速率以減少蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而增加微生物脂類含量的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種減少微生物中蛋白質(zhì)合成以增加脂類含量，進(jìn)而提高生物燃料整體產(chǎn)量的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供脂類含量增加的微生物改良菌株。配合附圖閱讀以下說明，本發(fā)明的其他目的和優(yōu)勢(shì)將得以進(jìn)一步明確，但這些描述并不意圖限制本發(fā)明的范圍。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明一方面提供一種增加微生物脂類含量的方法。方法包括以下步驟：獲得用于剔除起始子tRNA基因的剔除基因構(gòu)筑體；在載體中克隆剔除基因構(gòu)筑體；將含有剔除基因構(gòu)筑體的載體引入微生物；在含有選擇劑的介質(zhì)中和誘導(dǎo)條件下培育微生物，獲得脂類含量提高的微生物。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，提供一種脂類含量提高的細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942改良菌株，CCAP加入編號(hào)1479/17。附圖簡(jiǎn)要說明下面將借助附圖說明本發(fā)明的方法，其中：圖1說明一種通過減少(下降調(diào)節(jié))微生物中的蛋白質(zhì)合成，增加微生物脂類含量的示意過程。圖2說明通過刪除起始子tRNAmet2制備的含有剔除基因構(gòu)筑體的tRNA-Met2_deletion載體。圖3說明按照本發(fā)明制備的轉(zhuǎn)錄菌株的PCR確認(rèn)。圖4A是利用尼羅紅測(cè)定(NileRedAssay)方法，在帶和不帶放線菌酮的磷酸三甲酯介質(zhì)中培養(yǎng)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞(第4天)觀察到的熒光圖形表示。圖4B是在沒有放線菌酮條件下培養(yǎng)的尼羅紅染色萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞。圖4C是在有放線菌酮條件下培養(yǎng)的尼羅紅染色萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞。圖5說明細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942(剔除tRNAMet2基因)在含有選擇劑的介質(zhì)上的點(diǎn)配置。圖6是細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942相比野生菌株的脂類含量增加示意圖。詳細(xì)說明光合作用中的大量固定碳用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)。因此，蛋白質(zhì)合成減少會(huì)導(dǎo)致脂類(用于從微生物尤其是藻類/藍(lán)藻細(xì)菌生產(chǎn)生物燃料)制造過程中固定碳的利用?？梢詼p少蛋白質(zhì)合成，將碳通量用于生產(chǎn)脂類。據(jù)觀察，微生物中的起始子tRNA分子或起始因子蛋白質(zhì)/核糖體RNA負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)合成的起始?？梢酝ㄟ^基因改良微生物以減少細(xì)胞起始子tRNA分子數(shù)量，從而減少蛋白質(zhì)合成。因此，減少微生物中蛋白質(zhì)合成起始速率以減少蛋白質(zhì)數(shù)量，可以增加微生物中的脂類含量，從而增加這些微生物的生物燃料產(chǎn)量。因此按照本發(fā)明，設(shè)計(jì)一種減少(下降調(diào)節(jié))微生物(具體為藻類和/或藍(lán)藻細(xì)菌)蛋白質(zhì)合成的方法(如圖1所示)。轉(zhuǎn)錄菌株蛋白質(zhì)合成減少導(dǎo)致固定碳用于脂類合成。在本發(fā)明的一個(gè)方面中，提供一種減少(下降調(diào)節(jié))蛋白質(zhì)合成從而增加微生物脂類含量的方法。利用放線菌酮執(zhí)行蛋白質(zhì)合成的化學(xué)抑制。在各種放線菌酮含量(50μM到500μM)條件下培養(yǎng)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15(ChlamydomonasResourceCenter,USA)，找出蛋白質(zhì)合成對(duì)脂類含量的抑制作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)合成的化學(xué)抑制導(dǎo)致脂類含量增加(圖4A)。在存在50μM放線菌酮的條件下培養(yǎng)萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞時(shí)，觀察到最高脂類含量。使用更多放線菌酮(超過200μM)時(shí)，觀察到脂類含量減少，如圖4A所示。圖4B和4C分別介紹無蛋白質(zhì)抑制劑和存在蛋白質(zhì)抑制劑條件下尼羅紅染色的萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞。如圖4C所示，相比沒有蛋白質(zhì)抑制劑條件下培養(yǎng)的萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞，在存在蛋白質(zhì)抑制劑(放線菌酮)的條件下培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)觀察到熒光增加，這說明萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)CW-15細(xì)胞脂類含量增加。轉(zhuǎn)移RNAMet1和tRNAMet2是藍(lán)藻細(xì)胞中的兩種起始子tRNA基因，兩者都參與蛋白質(zhì)合成調(diào)節(jié)。按照本發(fā)明，tRNAMet2基因被剔除。按照本發(fā)明，取出起始子tRNA基因的1kb側(cè)翼序列并在含有選擇標(biāo)記的載體中克隆，制備剔除基因構(gòu)筑體。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式中，選擇標(biāo)記是從下面的組中選擇的一種抗生素，該組包括但不局限于卡那霉素、氨芐青霉素和氯霉素。按照本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供微生物改良菌株，尤其是脂類含量增加的藻類和/或藍(lán)藻細(xì)菌改良菌株，具體來說，按照本發(fā)明的改良菌株可以是CultureCollectionofAlgaeandProtozoa(CCAP),SAMSLimited,ScottishMarineInstitute,Dunbeg,Oban,Argyll,PA371QA,UK的細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942，CCAP加入編號(hào)1479/17。下面將通過以下實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步說明本發(fā)明，這些實(shí)驗(yàn)僅用于說明，不解釋為以任何方式限制本發(fā)明范圍。實(shí)驗(yàn)1細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942的轉(zhuǎn)錄取出起始子tRNA(tRNAMet2)的1千堿性側(cè)翼序列，然后在含有抗生素(氯霉素)選擇標(biāo)記的載體中克隆。本發(fā)明使用的載體為tRNA-Met2_deletion。然后使用該載體從細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942中剔除蛋氨酸t(yī)RNA(tRNAMet2)。將細(xì)長(zhǎng)聚球藻PCC7942(InstitutPasteur,France)培植在50mlBG-11堿性溶液(HiMedia)中，30℃條件下培養(yǎng)一夜，獲得OD730為1(約108cells/ml)。在4000rpm條件下離心培養(yǎng)菌，將收集獲得的小球進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。用10mlpH值7.5的零度1mM4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)緩沖液沖洗小球三次。每次沖洗時(shí)將小球浸泡在HEPES緩沖液中5分鐘。去掉上清液，小球懸浮在500μl含有6％二甲基亞砜(DMSO)和10％甘油的HEPES緩沖液中，通過渦流正確混合以獲得細(xì)胞混合物。將數(shù)百微升上述細(xì)胞混合物轉(zhuǎn)移到預(yù)先冷卻的電穿孔試管中。將5微克線狀DNA(溶解在水中)加入電穿孔試管中。將一個(gè)沒有DNA的試管作為對(duì)照。試管萬冊(cè)完全干燥，然后放入GenePulser中進(jìn)行電穿孔。下面介紹本發(fā)明使用的電穿孔參數(shù)：i)場(chǎng)強(qiáng)1800V/cmii)電容25μFiii)電阻200Ωiv)指數(shù)衰減波脈沖完成電穿孔后，立刻將試管放入冰塊中5分鐘。細(xì)胞懸浮在1mlBG-11堿性溶液中，然后在含有20mlBG-11堿性溶液的錐形燒瓶中培養(yǎng)。在30℃和白光條件下培養(yǎng)細(xì)胞5天。5天后，通過離心收集細(xì)胞。獲得的小球懸浮在200μlBG-11堿性溶液中。在含有1％瓊膠和氯霉素的BG-11堿性溶液中培養(yǎng)培養(yǎng)菌。20天后觀察培養(yǎng)皿上的菌落(圖-5A)。在含有氯霉素的液體和固體BG-11介質(zhì)中進(jìn)一步繁殖單個(gè)菌落8代以獲得同質(zhì)異源性。使用氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)基因基底，通過PCR確認(rèn)轉(zhuǎn)錄，如圖3所示。使用西格瑪工廠DNA提取工具隔離DNA，將染色體組DNA用作模板。從左到右：第1道表示野生菌株，第6道表示含有pMet2KO質(zhì)粒DNA的陽性對(duì)照組，第7道表示無任何DNA的陰性對(duì)照組，第8道表示1kbplus梯度標(biāo)記(ThermoScientific)。第2、第3、第4和第5道是不同轉(zhuǎn)錄：克隆1、克隆3、克隆4和克隆19分別按照本發(fā)明制備。載體tRNA-Met2_deletion的大小為4775bp。指向第6道色帶(陽性對(duì)照組)的箭頭對(duì)應(yīng)CAT基因660bp。野生菌株染色體組DNA沒有CAT基因，因此PCR后未觀察到任何PCR產(chǎn)物，沒有對(duì)應(yīng)野生菌株(第1道)的色帶，如圖-3所示。在轉(zhuǎn)錄菌株中，tRNAMet2基因被剔除，替換為CAT基因(660bp)。指向第5道(克隆19)、第4道(克隆4)和第3道(克隆3)色帶的箭頭對(duì)應(yīng)CAT基因，確認(rèn)轉(zhuǎn)錄結(jié)果。第2道的第二色帶是PCR條件決定的非特異成型帶。實(shí)驗(yàn)2比較野生菌株和轉(zhuǎn)錄菌株產(chǎn)生的脂類使用10微克干燥野生菌株和轉(zhuǎn)錄菌株執(zhí)行十八酸的GC分析，產(chǎn)生甲酯(C18:0)。圖-6和表-1顯示野生菌株和轉(zhuǎn)錄菌株(克隆3和克隆19)產(chǎn)生的C18:0量(％)。圖-6顯示野生菌株和兩個(gè)轉(zhuǎn)錄菌株(克隆3和克隆19)產(chǎn)生的十八酸甲酯(C18:0)。觀察發(fā)現(xiàn)，克隆19產(chǎn)生的脂類(C18:0)量相比野生菌株增加31％。表-110mg干燥物％C18:0WT11.83克隆-314.47克隆-1915.54從圖-6和表-1很容易看出，轉(zhuǎn)錄菌株(克隆3和克隆19)的脂類含量相比野生菌株增加，這表明下降調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成可導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄菌株脂類含量整體增加。技術(shù)優(yōu)勢(shì)本發(fā)明提供的技術(shù)優(yōu)勢(shì)如下：本發(fā)明提供一種減少(下降調(diào)節(jié))蛋白質(zhì)合成中的不同分子以減少蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而增加微生物脂類含量的方法。本發(fā)明提供一種增加微生物脂類含量以提高生物燃料產(chǎn)量的方法。本發(fā)明提供相比野生菌株脂類含量增加的改良性微生物。通過參照描述中的非限定性具體實(shí)施方式，對(duì)上述具體實(shí)施方式及其各種特征和有利細(xì)節(jié)進(jìn)行了解釋。其中省去了對(duì)已知方面、部件及分子生物技術(shù)的描述，以避免不必要的模糊實(shí)施例。上述具體實(shí)施方式的描述將充分披露本發(fā)明中具體實(shí)施方式的一般性，在沒有脫離一般概念的前提下，其他人可以很容易地運(yùn)用現(xiàn)有知識(shí)修改和/或調(diào)整此類具體實(shí)施方式的各種應(yīng)用。因此，這些調(diào)整和修改應(yīng)被確定為包含在與所披露的具體實(shí)施方式相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)。應(yīng)當(dāng)理解為，本文采用的措辭和術(shù)語是為了描述而非限制的目的。因此，雖然文中的具體實(shí)施方式描述的是首選具體實(shí)施方式，熟知本領(lǐng)域的技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到在所描述的具體實(shí)施方式的精神與范圍內(nèi)，可以對(duì)文中的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改。此外，應(yīng)清楚理解為，上述描述主題僅解釋為對(duì)發(fā)明的介紹，而非限制。在參考所述具體實(shí)施方式介紹并說明本發(fā)明原理后，應(yīng)認(rèn)識(shí)到，可以在不背離此類原理的范圍內(nèi)改動(dòng)所述具體實(shí)施方式的布置和細(xì)節(jié)。雖然本發(fā)明的特點(diǎn)已重點(diǎn)強(qiáng)調(diào)，仍應(yīng)理解為，在不背離本發(fā)明原理的條件下，可以對(duì)首選具體實(shí)施方式進(jìn)行各種修改。本發(fā)明本質(zhì)或首選具體實(shí)施方式的這些和其他修改對(duì)本發(fā)明領(lǐng)域熟練的技術(shù)人員是顯而易見的，應(yīng)清楚理解為，上述描述事項(xiàng)只是本發(fā)明說明的解釋而不作為一種限制。當(dāng)前第1頁1 2 3