用于疼痛治療的寡核苷酸誘餌的制作方法
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背景
發(fā)明領(lǐng)域
本發(fā)明涉及治療劑，諸如稱為寡核苷酸誘餌的雙鏈核酸，包含其的藥物組合物，以及調(diào)節(jié)感受傷害信號(hào)傳導(dǎo)以例如預(yù)防和/或治療疼痛的相關(guān)方法。
相關(guān)領(lǐng)域的描述
疼痛可被定義為與真實(shí)或潛在組織損傷相關(guān)聯(lián)，或者以這樣損傷的措辭描述的令人不悅的感覺和情感體驗(yàn)。慢性疼痛折磨至少40％的美國人口并且與許多有害的醫(yī)學(xué)病況有關(guān)。持續(xù)性和高度衰弱的慢性疼痛通常伴有虛弱、失眠、缺乏食欲、易怒和抑郁。隨著時(shí)間的推移，生活質(zhì)量受到深刻影響，患者常常無法完成日常生活的簡(jiǎn)單任務(wù)。
目前使用的疼痛治療應(yīng)用三步止痛法(three-step pain ladder)，其推薦如下施用藥物：非阿片樣物質(zhì)(例如，阿司匹林、對(duì)乙酰氨基酚等)，然后，必要時(shí)，溫和阿片樣物質(zhì)(例如，可待因)和最后強(qiáng)阿片樣物質(zhì)(例如，嗎啡)。盡管有這種藥物庫，但超過50％的慢性疼痛患者沒有得到有效治療。
目前的疼痛治療的無效性尤其歸因于現(xiàn)有藥物療法的顯著毒性問題。所有種類的疼痛藥物引起輕度至嚴(yán)重的毒性：非甾體抗炎藥物引起胃腸損傷，昔布類(coxibs)與心力衰竭相關(guān)，且阿片樣物質(zhì)引起許多副作用，包括呼吸抑制、鎮(zhèn)靜、消化功能障礙和成癮。
轉(zhuǎn)錄因子是多種信號(hào)傳導(dǎo)通路中的重要因子，并且經(jīng)?？刂圃S多基因的同時(shí)表達(dá)。許多轉(zhuǎn)錄因子參與牽涉疼痛的基因的表達(dá)調(diào)控，所述基因包括但不限于BDNF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGFB1)、CDKN1A、GFAP、POU因子、上游刺激因子(USF1、USF2)、EGR1、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白/活化轉(zhuǎn)錄因子(CREB/ATF)、活化蛋白1(AP1)、血清應(yīng)答因子(SRF)、啟動(dòng)子選擇性轉(zhuǎn)錄因子(SP1)和runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(CBFA2)。
因此，為了監(jiān)測(cè)牽涉疼痛的基因的表達(dá)，在抑制轉(zhuǎn)錄因子中可能具有顯著的治療潛力。因此，需要的是選擇性的，易于獲得的非毒性轉(zhuǎn)錄因子抑制劑。
概述
本發(fā)明的實(shí)施方案總地來說涉及抑制至少一種Krüppel樣家族(KLF)轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的治療劑(諸如寡核苷酸)、包含此類藥劑的藥物組合物，以及調(diào)節(jié)感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)，例如，以預(yù)防和/或治療有此需要的受試者的疼痛的相關(guān)方法。在一些實(shí)施方案中，治療劑是雙鏈寡核苷酸(例如，寡核苷酸誘餌)，其包含結(jié)合至少一種KLF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
因此，本發(fā)明的實(shí)施方案包括包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸誘餌，其中所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組的轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17中的一個(gè)或多個(gè)的一種或多種轉(zhuǎn)錄因子(1、2、3、4、5種等)。
在具體實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌包含至少兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的組合，其中每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組的轉(zhuǎn)錄因子。在具體實(shí)施方案中，每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合不同的KLF轉(zhuǎn)錄因子。
在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌在長(zhǎng)度上為約15至約35個(gè)堿基對(duì)。
在具體實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌包含第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中所述第一和第二轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)重疊。在某些實(shí)施方案中，所述第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且所述第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF15。在某些實(shí)施方案中，所述第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且所述第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF6。
在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌具有第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和第三轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中所述第一、第二和第三轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)重疊。在具體實(shí)施方案中，所述第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF6，所述第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且所述第三轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF15。
某些實(shí)施方案涉及本文所述的寡核苷酸誘餌的一個(gè)或多個(gè)群體，其中寡核苷酸誘餌的群體在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或小于約0.8或等于或高于約1.0的KLF15/KLF9的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比。
一些實(shí)施方案涉及寡核苷酸誘餌的群體，其中寡核苷酸誘餌的群體在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或高于預(yù)定值例如約0.2OD450的光密度值的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。
在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌(例如，在群體中)包含由式1或式2表示的序列：
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQ ID NO:2)
其中S為G或C；W為A或T；Y為T或C；D為A、G或T；B為C、G或T；K為T或G；M為C或A；H為C、T或A；V為C、G或A；R為A或G；并且N為任意核苷酸，其中小寫字母可以存在或不存在，并且其中下標(biāo)中的數(shù)字表示核苷酸在所述序列中的位置。
在一些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌包含選自由SEQ ID NO：3-35組成的組的序列或其變體。在具體實(shí)施方案中，所述誘餌包含與SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的序列具有至少70％同一性的序列。
某些實(shí)施方案包括包含由式1或式2表示的序列的寡核苷酸誘餌：
a1t2c3c4T5T6Y7G8M9M10T11Y12Y13K14Y15C16N17H18h19n20n21v22n23n24y25m26h27w28b29v30a31w32(式1；SEQ ID NO:1)
t1g2t3k4b5K6K7D8D9V10D11N12S13D14N15B16N17N18d19v20m21b22v23m24h25r26m27a28(式2；SEQ ID NO:2)
其中S是G或C；W是A或T；Y是T或C；D是A、G或T；B是C、G或T；K是T或G；M是C或A；H是C、T或A；V是C、G或A；R是A或G；并且N是任意核苷酸，其中小寫字母可以存在或不存在，并且其中下標(biāo)中的數(shù)字表示核苷酸在序列中的位置。
在一些實(shí)施方案中，所述誘餌包含選自由SEQ ID NO：3-35組成的組的序列或其變體，或由所述序列或其變體組成，或基本上由所述序列或其變體組成。在具體實(shí)施方案中，所述誘餌包含與SEQ ID NO:28(16.6.5)、SEQ ID NO:25(16.6.2)、SEQ ID NO:19(17.5)、SEQ ID NO:34(T16.6-T17.5Fu1)或SEQ ID NO:35(T16.6-T17.5Fu2)的序列具有至少70％同一性的序列。
還包括藥物組合物，其包含本文所述的寡核苷酸誘餌或誘餌群體和藥學(xué)上可接受的載體。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌作為鹽、水合物、溶劑合物或N-氧化物衍生物提供。
一些實(shí)施方案包括一個(gè)或多個(gè)試劑盒，其包含本文所述的寡核苷酸誘餌或誘餌群體，任選地使用寡核苷酸誘餌的說明書。
還包括用于調(diào)節(jié)存在于細(xì)胞中的參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的基因的轉(zhuǎn)錄的方法，其包括向所述細(xì)胞施用有效量的本文所述的寡核苷酸誘餌或藥物組合物。
還包括用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其包括向細(xì)胞施用有效量的本文所述的寡核苷酸誘餌或藥物組合物。
某些實(shí)施方案包括用于預(yù)防和/或治療受試者的疼痛的方法，其包括向受試者施用治療有效量的本文所述的寡核苷酸誘餌或藥物組合物。在一些實(shí)施方案中，疼痛是慢性疼痛。在具體實(shí)施方案中，疼痛是神經(jīng)性疼痛。在一些實(shí)施方案中，疼痛與炎癥相關(guān)。在某些的實(shí)施方案中，疼痛與中樞神經(jīng)系統(tǒng)或內(nèi)臟病癥相關(guān)。在具體實(shí)施方案中，疼痛是與炎癥相關(guān)的神經(jīng)性疼痛。
還包括用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其包括向所述細(xì)胞施用治療有效量的治療劑，其中所述治療劑抑制轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組。
在一些實(shí)施方案中，治療劑在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或小于約0.8或等于或高于約1.0(例如，基于OD450值或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位)的KLF15/KLF9的結(jié)合比。在具體實(shí)施方案中，治療劑在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或高于約0.2OD450的光密度值或使用等同的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位的相當(dāng)?shù)慕Y(jié)合水平的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。
還包括用于治療受試者的疼痛的方法，其包括向受試者施用治療有效量的治療劑，其中所述治療劑抑制轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組。在一些實(shí)施方案中，治療劑在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或小于約0.8或等于或高于約1.0的KLF15/KLF9的結(jié)合比。在某些實(shí)施方案中，治療劑在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定中提供等于或高于約0.2OD450的光密度值的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。在具體實(shí)施方案中，疼痛是神經(jīng)性疼痛、與炎癥相關(guān)的疼痛和/或與炎癥相關(guān)的神經(jīng)性疼痛。
附圖簡(jiǎn)述
圖1顯示了某些寡核苷酸誘餌相對(duì)于對(duì)照KLF誘餌(以灰色突出顯示的)的的KLF結(jié)合特征。與KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合值表示為來自實(shí)施例1中描述的體外ELISA結(jié)合測(cè)定的平均值和SEM OD450值。還列出了相應(yīng)的N。治療神經(jīng)性疼痛和/或神經(jīng)炎性疼痛的功效表示為在相應(yīng)的動(dòng)物研究的測(cè)試期期間(取決于研究，總共～4-8周，治療后～2-4周)相對(duì)于對(duì)照的疼痛減輕的百分比(％)。N/A＝不適用。
圖2A-B顯示某些寡核苷酸誘餌在慢性神經(jīng)性疼痛的保留性神經(jīng)損傷(SNI)模型中的功效。使用重復(fù)的von Frey細(xì)絲將疼痛測(cè)量為機(jī)械超敏性(mechanical hypersensitivity)。在術(shù)后第14天(POD14)，鞘內(nèi)注射寡核苷酸誘餌(200納摩爾)或媒介物一次。將對(duì)von Frey刺激的總反應(yīng)的平均值+SEM值針對(duì)在注射媒介物或誘餌之前于POD14測(cè)量的基線疼痛值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；跨組組合POD14之前的注射前數(shù)據(jù)，給定的時(shí)間點(diǎn)上的對(duì)比媒介物的T檢驗(yàn)：*p≤0.05，誘餌對(duì)比媒介物的治療后數(shù)據(jù)分布(POD 17-POD31)：對(duì)于TFD16、16.6.2、16.6.5、TFD17、17.5，p≤0.001，對(duì)于17.1，p＝0.005，對(duì)于16.9，p＝0.39，以及對(duì)于17.9，p＝0.46；每個(gè)測(cè)試組n＝4只大鼠。X軸顯示術(shù)后天數(shù)(POD)。
圖3A-B顯示某些寡核苷酸誘餌在慢性神經(jīng)炎性疼痛的慢性壓迫性損傷(CCI)模型中的功效。使用重復(fù)的von Frey細(xì)絲將疼痛測(cè)量為機(jī)械超敏性。在術(shù)后第14天(POD14)，鞘內(nèi)注射寡核苷酸誘餌(200納摩爾)或媒介物一次。將對(duì)von Frey刺激的總反應(yīng)的平均值+SEM值針對(duì)在注射媒介物或誘餌之前于POD14測(cè)量的基線疼痛值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；跨組組合POD14之前的注射前數(shù)據(jù)，給定的時(shí)間點(diǎn)上的對(duì)比媒介物的T檢驗(yàn)：*p≤0.1，**p≤0.05，誘餌對(duì)比媒介物的治療后數(shù)據(jù)分布(POD 17-POD31)：對(duì)于TFD16，p＝0.23，對(duì)于16.6.2，p＝0.01，對(duì)于16.6.5，p＝0.03，對(duì)于16.9為0.02，對(duì)于TFD17，p＝0.0004，對(duì)于17.1，p＝0.005，對(duì)于17.5，p＝0.004以及對(duì)于17.9，p＝0.12；每個(gè)測(cè)試組n＝4只大鼠(除17.9外：n＝3，因?yàn)?只大鼠由于在POD14處的基線疼痛值不足而被排除)。X軸顯示術(shù)后天數(shù)(POD)。
圖4A-C顯示與它們的KLF15/KLF9結(jié)合比率相關(guān)的某些寡核苷酸誘餌的功效水平(4A)，治療慢性神經(jīng)性疼痛的功效與對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(4B)，以及與它們的KLF15/KLF9結(jié)合比率(不包括～0.9的比率)相關(guān)的所測(cè)試的誘餌群體的功效水平的線性回歸(4C)。將每種誘餌的功效水平在慢性疼痛的SNI模型中測(cè)量為測(cè)試期間(總共～4-8周，治療后～2-4周，取決于研究)對(duì)比對(duì)照的疼痛緩解的百分比。
圖5A-C顯示與它們的對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的組合結(jié)合相關(guān)的某些寡核苷酸誘餌的功效水平(5A)，治療慢性神經(jīng)炎性疼痛的功效與對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(5B)，以及與它們對(duì)KLF6和KLF9的總結(jié)合能力相關(guān)的所測(cè)試的誘餌群體的功效水平(如通過它們的1/(KLF6+KLF9)結(jié)合比率所指示的)的線性回歸(5C)。在慢性疼痛的CCI模型中將每一種誘餌的功效水平測(cè)量為測(cè)試期間(總共～4-8周，治療后～2-4周，取決于研究)對(duì)比對(duì)照的疼痛減輕的百分比。
圖6顯示某些寡核苷酸誘餌(白色菱形)跨疼痛的補(bǔ)充性病因(從神經(jīng)病變(Y-軸)至包括炎癥組分的疼痛(X-軸))的相對(duì)于來自文獻(xiàn)的對(duì)照KLF誘餌(TFDC1、TFDC2和TFD3，其含有兩個(gè)KLF-共有CACCC-盒結(jié)合位點(diǎn)，黑色菱形)的功效的差異模式。
圖7顯示表2中的本發(fā)明的寡核苷酸誘餌的1/(KLF6+KLF9)結(jié)合比率(菱形)(其指示治療神經(jīng)炎性疼痛的功效(越低，功效越強(qiáng)))和KLF15/KLF9結(jié)合比率(方塊)(其指示治療神經(jīng)性疼痛的功效(越高，功效越強(qiáng))的曲線圖(X軸，KLF誘餌：1＝16.5，2＝16.6.7，3＝17.7，4＝17.1，5＝16.2，6＝16.6.2，7＝17.3，8＝16.6，9＝17.9，10＝17.5，11＝16.8，12＝16.9，13＝17.8，14＝17.4，15＝17.1，16＝16.4，17＝16.1，18＝17.2，19＝16.0，20＝17.5.3，21＝16.6.3，22＝17.5.1，23＝16.3，24＝16.6.5，25＝16.10，26＝17.6，27＝T16.6-T17.5Fu2，28＝17.0，29＝16.6.4，30＝16.6.6，31＝17.5.2，32＝16.7，T16.6-T17.5Fu1由于不適用的值而未列出)。
圖8A-B顯示遞升劑量水平的16.6.5寡核苷酸誘餌在慢性神經(jīng)性疼痛(A)的SNI模型和慢性神經(jīng)炎性疼痛(B)的CCI模型中的作用。使用重復(fù)的von Frey細(xì)絲將疼痛測(cè)量為機(jī)械超敏性。在術(shù)后第14天(POD14)鞘內(nèi)注射16.6.5或媒介物一次。將對(duì)von Frey刺激的總反應(yīng)的平均值+SEM值針對(duì)在注射媒介物或誘餌前于POD14測(cè)量的基線疼痛值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化；跨組組合POD14之前的注射前數(shù)據(jù)，給定時(shí)間點(diǎn)上的對(duì)比媒介物的T檢驗(yàn)：*p≤0.05，16.6.5對(duì)比媒介物的治療后數(shù)據(jù)分布(POD 17-POD31)：在SNI模型中，對(duì)于100、200和300納摩爾劑量水平，p≤0.001，對(duì)于200摩爾，p＝0.02，以及在CCI模型中，對(duì)于300納摩爾劑量水平，p≤0.001；每個(gè)測(cè)試組n＝4只大鼠。X軸顯示術(shù)后天數(shù)(POD)。
詳述
除非另有定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。盡管與本文所述的那些方法和材料相似或等同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)踐或測(cè)試，但描述了優(yōu)選方法和材料。為了本發(fā)明的目的，在下文中定義以下術(shù)語。
定義
冠詞“一個(gè)/一種(a/an)”在本文中用于指一個(gè)或多于一個(gè)(即，指至少一個(gè))該冠詞的語法對(duì)象。作為示例，“一個(gè)元件”是指一個(gè)元件或多于一個(gè)元件。
“約”是指相對(duì)于參照數(shù)量、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長(zhǎng)度變化多達(dá)30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的數(shù)量、水平、值、數(shù)目、頻率、百分比、尺寸、大小、量、重量或長(zhǎng)度。
如在結(jié)合治療劑諸如寡核苷酸誘餌的轉(zhuǎn)錄因子的上下文中所使用的，“結(jié)合”是指轉(zhuǎn)錄因子與寡核苷酸誘餌之間的直接相互作用(例如，轉(zhuǎn)錄因子與寡核苷酸誘餌之間的非共價(jià)鍵合，包括氫鍵合、范德華鍵合等)。因此，不結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子的治療劑諸如寡核苷酸不與所述轉(zhuǎn)錄因子直接相互作用，反之亦然。
在整個(gè)本說明書中，除非上下文另有要求，否則詞語“包含(comprise/comprises/comprising)”將被理解為暗示包含所述步驟或元素或步驟或元件的組，但不排除任何其它步驟或元素或步驟或元素的組。
“由...組成”意指包括并且不限于短語“由...組成”之后的任何內(nèi)容。因此，短語“由...組成”表示所列元素是必需的或強(qiáng)制性的，并且可以不存在其它元素?！盎旧嫌?.....組成”意指包括在短語之后列出的任何元素，并且限于不干擾或促成本公開中針對(duì)所列元素指定的活性或作用的其它元素。因此，短語“基本上由......組成”表示所列元素是所需的或強(qiáng)制性的，但其它元素是任選的，并且可以存在或不存在，這取決于它們是否實(shí)質(zhì)影響所列元素的活性或作用。
“慢性”是指包括數(shù)月(例如，至少兩個(gè)月)或數(shù)年的時(shí)段。
“同源性”是指相同或構(gòu)成保守取代的核苷酸的百分?jǐn)?shù)。同源性可使用序列比較程序諸如EMBOSS逐對(duì)比對(duì)算法(可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)、ClustalW程序(可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)或BLAST程序(((BLAST Manual,Altschul等，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR 25:3389 3402)或GAP(Deveraux等，1984，Nucleic Acids Research 12,387-395)來確定。這樣，可通過將缺口插入比對(duì)中來比較長(zhǎng)度與本文引用的那些序列相似或大體上不同的序列，此類缺口例如通過由GAP所使用的比較算法來確定。
“分離的”意指大體上或基本上不含通常以其天然狀態(tài)伴隨其的組分的材料。例如，如本文中所用，“分離的多核苷酸”或“分離的寡核苷酸”可以指已被從以天然存在的狀態(tài)側(cè)翼連接其的序列純化或去除的多核苷酸，例如被從在基因組中與DNA片段相鄰的序列去除的所述DNA片段。術(shù)語“分離”，當(dāng)其涉及細(xì)胞時(shí)，是指從來源受試者(例如，具有多核苷酸重復(fù)疾病的受試者)純化細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞、淋巴母細(xì)胞)。在mRNA或蛋白質(zhì)的上下文中，“分離”是指從來源(例如，細(xì)胞)中回收mRNA或蛋白質(zhì)。
術(shù)語“調(diào)節(jié)”包括使一個(gè)或多個(gè)可量化參數(shù)“增加”或“減少”任選地確定的和/或統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的量?！霸黾?increase/increasing)”、“促進(jìn)(enhance/enhancing)”或“刺激(stimulate/stimulating)”通常是指一種或多種試劑諸如寡核苷酸誘餌在細(xì)胞或受試者中產(chǎn)生或引起相對(duì)于由無試劑或?qū)φ栈衔镆鸬姆磻?yīng)更大的生理或細(xì)胞反應(yīng)(諸如轉(zhuǎn)錄因子的活性(例如，基因表達(dá)))的能力。相關(guān)的生理或細(xì)胞反應(yīng)(體內(nèi)或體外)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。相對(duì)于由無試劑或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的量或反應(yīng)，“增加”或“增強(qiáng)”的量或反應(yīng)可以是“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”，并且可包括為由無試劑或?qū)φ栈衔锂a(chǎn)生的量或反應(yīng)的1.1倍、1.2倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍、40倍、50或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包括其間并且高于1(例如1.5、1.6、1.7、1.8)的所有整數(shù)和范圍)的增加。術(shù)語“減少”或“抑制”通常可涉及一種或多種試劑諸如寡核苷酸誘餌在細(xì)胞或受試者中“減少”相關(guān)生理或細(xì)胞反應(yīng)的能力，諸如轉(zhuǎn)錄因子的活性(例如，基因表達(dá))、生理過程(例如，感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo))或本文所述的疾病或病況的癥狀(例如，疼痛)。相關(guān)的生理或細(xì)胞反應(yīng)(體內(nèi)或體外)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的，并且可以按照常規(guī)技術(shù)測(cè)量。相較于無藥劑或?qū)φ战M合物產(chǎn)生的反應(yīng)，反應(yīng)的“減少”可以是“統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的”，并且可包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的減少，包括其間的所有整數(shù)和范圍。
“基因表達(dá)水平的調(diào)節(jié)”包括基因表達(dá)水平的任何變化，包括誘導(dǎo)或活化(例如，基因表達(dá)的增加)、抑制或阻遏(例如，基因表達(dá)的減少)或穩(wěn)定化(例如，阻止通常響應(yīng)于刺激諸如疼痛誘導(dǎo)刺激而發(fā)生的基因的上調(diào)或下調(diào))。
“感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)”是指牽涉有害刺激或潛在有害刺激的檢測(cè)的分子和細(xì)胞機(jī)制，其導(dǎo)致疼痛的感知。具體實(shí)例包括神經(jīng)遞質(zhì)合成和釋放、神經(jīng)遞質(zhì)誘導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)、膜去極化，以及相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間信號(hào)傳導(dǎo)事件。
“疼痛”是指與實(shí)際或潛在組織損傷相關(guān)或以此類術(shù)語描述的不愉快的感覺和情感體驗(yàn)。疼痛的所有不同表現(xiàn)和性質(zhì)，包括機(jī)械性疼痛(例如，由機(jī)械刺激或身體運(yùn)動(dòng)引起的)、溫度引起的疼痛(例如，由熱、溫和/或冷的溫度引起的疼痛)以及化學(xué)誘導(dǎo)的疼痛(例如，由化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的疼痛)。在某些實(shí)施方案中，疼痛是慢性、亞慢性、急性或亞急性的。在某些實(shí)施方案中，疼痛特征是痛覺過敏(例如，對(duì)疼痛刺激的敏感性增加)和/或異常性疼痛(例如，對(duì)通常非疼痛刺激的疼痛反應(yīng))。在某些實(shí)施方案中，疼痛預(yù)先存在于患者體內(nèi)。在其它實(shí)施方案中，疼痛是醫(yī)源性的，在患者中誘導(dǎo)的(例如，手術(shù)后疼痛)。
“預(yù)防/防止(preventing/pervention)”包括(1)獲得疾病或病癥(例如，導(dǎo)致疾病的至少一個(gè)臨床癥狀在患者中不發(fā)展，所述患者可能暴露于疾病或?qū)膊∫赘?，但尚未?jīng)歷或顯示疾病的癥狀)的風(fēng)險(xiǎn)的降低，和/或(2)與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的可能嚴(yán)重性的降低(例如，降低患者的疾病的至少一種臨床癥狀，所述患者可能暴露于或傾向于疾病但尚未經(jīng)歷或表現(xiàn)出疾病癥狀)。
如本文中所用，術(shù)語“序列同一性”或例如包含“與……具有50％同一性的序列”，是指序列在比較窗口中在逐個(gè)核苷酸的基礎(chǔ)上相同的程度。因此，可通過在比較窗口上比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列，確定在兩個(gè)序列中存在相同核酸堿基(例如，A、T、C或G)的位置的數(shù)目以產(chǎn)生匹配位置的數(shù)目，將匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中的位置總數(shù)(即，窗口大小)，并將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列同一性的百分?jǐn)?shù)來計(jì)算“序列同一性百分比”。在一些實(shí)施方案中，用于比對(duì)比較窗口的序列的最佳比對(duì)可以通過使用EMBOSS逐對(duì)比對(duì)算法(可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)、ClustalW程序(也可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)或BLAST程序(BLAST Manual,Altschul等，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR 25:3389 3402)來進(jìn)行。在某些實(shí)施方案中，針對(duì)參照序列(例如，來自序列表)的整個(gè)長(zhǎng)度進(jìn)行用于比對(duì)比較窗的序列比對(duì)。在一些實(shí)施方案中，針對(duì)參照序列的一部分進(jìn)行用于比對(duì)比較窗口的序列比對(duì)，所述參照序列的一部分是例如參照序列的約、至少約或不超過約10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)或100個(gè)連續(xù)核苷酸。
“受試者”或“有此需要的受試者”或“患者”包括哺乳動(dòng)物受試者諸如靈長(zhǎng)類動(dòng)物或人受試者。
“亞急性”是指包括數(shù)小時(shí)(例如，1-24小時(shí)，包括其間的所有整數(shù)和范圍)的時(shí)段。
“亞慢性”是指包數(shù)括天或數(shù)月(例如，少于2或3個(gè)月)的時(shí)段。
在一些實(shí)施方案中，任何疾病或病癥的“治療(treating/treatment)”是指改善疾病或病癥(例如，阻止或減少疾病或其至少一種臨床癥狀的發(fā)展)。在一些實(shí)施方案中，“治療”是指改善患者不能辨別的至少一個(gè)物理和/或生物學(xué)參數(shù)。在某些實(shí)施方案中，“治療”是指物理地(例如，可辨別的癥狀的穩(wěn)定化)、生理地(例如，物理參數(shù)的穩(wěn)定化)或在這兩個(gè)方面抑制疾病或病癥。在一些實(shí)施方案中，“治療”是指延遲疾病或病癥的發(fā)作?！爸委煛被颉邦A(yù)防”不一定表示完全根除、治愈或預(yù)防疾病或病況或其相關(guān)癥狀。
“治療有效量”是指當(dāng)向患者施時(shí)足以實(shí)現(xiàn)特定疾病或病癥的此類治療的化合物的量?！爸委熡行Я俊睂⒏鶕?jù)化合物、疾病、疾病的嚴(yán)重性以及待治療的患者的年齡、體重等而變化。
寡核苷酸誘餌和其它治療劑
本發(fā)明的實(shí)施方案總地來說涉及抑制至少一種轉(zhuǎn)錄因子與其(內(nèi)源)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)中的至少一個(gè)的結(jié)合的治療劑。具體實(shí)例包括包含一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸誘餌，其結(jié)合至少一種轉(zhuǎn)錄因子，從而改變轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá)的能力。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子是轉(zhuǎn)錄因子的Krüppel樣家族(KLF)的一個(gè)或多個(gè)成員，其實(shí)例包括KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17。
因此，某些實(shí)施方案包括包含一個(gè)或多個(gè)(例如，1個(gè)、2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)等)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸誘餌，其中所述一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組的轉(zhuǎn)錄因子。
還包括寡核苷酸誘餌，其包含至少兩個(gè)(例如例如，2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)等)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的組合，其中每個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組的轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的組合的具體實(shí)例包括結(jié)合KLF6/KLF9、KLF9/KLF15或KLF6/KLF9/KLF15的那些組合。
術(shù)語“寡核苷酸”包括通常小于約200個(gè)核苷酸(或100個(gè)堿基對(duì))并且包括但不限于DNA、RNA和RNA-DNA雜交體的任何雙鏈或基本上雙鏈的含核酸的聚合物。
在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸的長(zhǎng)度為約、至少約或不超過約10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、100個(gè)、110個(gè)、120個(gè)、130個(gè)、140個(gè)、150個(gè)、160個(gè)、170個(gè)、180個(gè)、190個(gè)或200個(gè)核苷酸(包括其間的所有整數(shù)和范圍)，并且任選地包含約、至少約或不超過約10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)、100個(gè)、110個(gè)、120個(gè)、130個(gè)、140個(gè)、150個(gè)、160個(gè)、170個(gè)、180個(gè)、190個(gè)或200個(gè)堿基配對(duì)的核苷酸(包括其間的所有整數(shù)和范圍)。在具體實(shí)施方案中，所述寡核苷酸誘餌的長(zhǎng)度為約15至約35個(gè)堿基對(duì)。
在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌包含第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，任選地其中所述第一轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)和第二轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)重疊。在具體實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF15。在具體實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF6。
還包括具有第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)、第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和第三轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的寡核苷酸誘餌，任選地其中第一、第二和第三轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)重疊。在具體實(shí)施方案中，第一轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF6，第二轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF9，且第三轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合KLF15。
在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌(例如，誘餌的有義鏈)包含由下表1所示的式1或式2所示的序列(例如，雙鏈序列)或其變體或其互補(bǔ)序列(例如，反義序列)，由所述序列或其變體或其互補(bǔ)序列組成或基本上由所述序列或其變體或其互補(bǔ)序列組成。
在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌(例如，誘餌的有義鏈)包含下表2中的序列或其變體或其互補(bǔ)序列(例如，反義序列)，由所述序列或其變體或其互補(bǔ)序列組成或基本上由所述序列或其變體或其互補(bǔ)序列組成。
在本文所述的式和序列中，“A”是腺嘌呤核苷酸，“C”是胞嘧啶核苷酸，“G”是鳥嘌呤核苷酸，“T”是胸腺嘧啶核苷酸，“N”可以是任意核苷酸，優(yōu)選A、C、G或T。盡管所述式和序列顯示單鏈，但應(yīng)理解，互補(bǔ)反義鏈被包括作為寡核苷酸誘餌的結(jié)構(gòu)的部分。在某些實(shí)施方案中，任何一個(gè)或多個(gè)“T”可以是“U”或尿嘧啶核苷酸。
因此，某些寡核苷酸誘餌包含表1或表2(例如，SEQ ID NO：1-35)中的序列或其變體或連續(xù)或非連續(xù)部分，由所述序列或其變體或連續(xù)或非連續(xù)部分組成或基本上由所述序列或其變體或連續(xù)或非連續(xù)部分組成。例如，某些寡核苷酸誘餌包含表1或表2中的靶向序列(例如，SEQ ID NO：1-35)中的任何靶向序列的約或至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34個(gè)或35個(gè)連續(xù)或非連續(xù)核苷酸，并且其結(jié)合一種或多種的本文所述的KLF轉(zhuǎn)錄因子(例如，KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16、KLF17)。對(duì)于非連續(xù)部分，可刪除間插核苷酸，或用不同的核苷酸取代間插核苷酸，或可添加間插核苷酸。變體的另外的實(shí)例包括與表1或表2中的序列(例如，SEQ ID NOS:1-35)的整個(gè)長(zhǎng)度或連續(xù)部分具有至少或至少約70％序列同一性或同源性(例如，70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性或同源性)的寡核苷酸誘餌，并且所述寡核苷酸誘餌結(jié)合一種或多種本文所述的KLF轉(zhuǎn)錄因子(例如，KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16、KLF17)。在一些實(shí)施方案中，連續(xù)部分為表1或表2中的序列(例如，SEQ ID NO：1-35)的約、至少約或不超過約10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、21個(gè)、22個(gè)、23個(gè)、24個(gè)、25個(gè)、26個(gè)、27個(gè)、28個(gè)、29個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)、60個(gè)、70個(gè)、80個(gè)、90個(gè)或100個(gè)連續(xù)核苷酸。
與另一序列具有一定百分比(例如，65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％)序列同一性的寡核苷酸誘餌意指，當(dāng)比對(duì)時(shí)，該百分比在比較兩個(gè)序列中確定堿基排列的對(duì)應(yīng)性水平。該比對(duì)和百分比同源性或同一性可以使用本領(lǐng)域已知的允許局部比對(duì)的任何合適的軟件程序來測(cè)定。在一些實(shí)施方案中，此類程序包括但不限于EMBOSS逐對(duì)比對(duì)算法(可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)、ClustalW程序(也可從歐洲生物信息學(xué)研究所(EBI)獲得)或BLAST程序(BLAST Manual,Altschul等，Natl Cent.Biotechnol.Inf.,Natl Lib.Med.(NCIB NLM NIH),Bethesda,Md.和Altschul等，(1997)NAR25:3389 3402)。
如上所述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到本發(fā)明包括的序列包括與本文所述的序列完全或部分互補(bǔ)的那些序列，包括在嚴(yán)格雜交條件下與示例序列(例如，表1和2；SEQ ID NO：1-35)雜交的那些序列。當(dāng)核酸的單鏈形式可在適當(dāng)?shù)臏囟群腿芤弘x子強(qiáng)度條件下與另一單鏈核酸退火時(shí)，核酸可與另一核酸雜交。雜交條件是本領(lǐng)域熟知的。在一些實(shí)施方案中，退火可在含鹽溶劑(例如Tris-EDTA緩沖液)中，在從變性溫度(例如，100℃)至室溫的溫度緩慢降低期間發(fā)生。
還包括寡核苷酸誘餌的群體，包括提供與KLF轉(zhuǎn)錄因子的組合(例如，KLF15/KLF9)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率，和/或與一種或多種個(gè)(例如，1種、2種、3種、4種、5種等)KLF轉(zhuǎn)錄因子(例如，KLF6+KLF9)的總轉(zhuǎn)錄結(jié)合能力的那些寡核苷酸誘餌的群體，所述轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率和/或總轉(zhuǎn)錄結(jié)合能力是相對(duì)于預(yù)定量定義的。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率或總轉(zhuǎn)錄結(jié)合能力約等于、小于或高于預(yù)定水平或量。可以使用多種技術(shù)(諸如標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定法(參見實(shí)施例))建立用于定義相對(duì)結(jié)合比率或總結(jié)合能力的“預(yù)定水平”。
例如，在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體提供等于或小于約0.8或等于或高于約1.0(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定(參見實(shí)施例)的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位，例如，熒光))的KLF15/KLF9的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率。在具體實(shí)施方案中，KLF15/KLF9的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率等于或小于約0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、0.01或更小(包括其間的所有范圍和整數(shù))(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定的OD450值)。在一些實(shí)施方案中，KLF15/KLF9的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合比率等于或高于約1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0或10.0或更高(包括其間的所有范圍和整數(shù))(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定法的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位))。
在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體提供等于或高于預(yù)定量的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。在一些情況下，預(yù)定量是如在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定(參見實(shí)施例)中測(cè)量的約0.2OD450或更高的光密度值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位，例如熒光)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)KLF6和KLF9的預(yù)定量或總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力等于或高于約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0或更高(包括其間的所有范圍和整數(shù))(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定法的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位))。
在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體提供等于或小于預(yù)定量的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。在一些實(shí)施方案中，對(duì)KLF6和KLF9的預(yù)定量或總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力表示為1/(KLF6+KLF9)(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定(參見實(shí)施例)的光密度值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位，例如熒光))。例如，在具體實(shí)施方案中，對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力(如由1/(KLF6+KLF9)表示的)為約5或更小(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位)。在一些實(shí)施方案中，對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力(如由1/(KLF6+KLF9)表示的)等于或小于約5、4、3、2、1、0.5、0.1或更小(包括其間的所有范圍和整數(shù))(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位))。
寡核苷酸誘餌的群體可由一種寡核苷酸誘餌，或兩種或更多種(例如2種、3種、4種、5種等)寡核苷酸誘餌的組合組成。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體由具有單個(gè)KLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的一種寡核苷酸誘餌組成。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體由具有至少兩個(gè)(例如2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)等)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的組合的一種寡核苷酸誘餌組成，其結(jié)合相同或不同(例如，兩種或至少兩種不同的)KLF轉(zhuǎn)錄因子。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌的群體包含具有至少3個(gè)(例如，3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)等)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的組合的一種寡核苷酸誘餌，其結(jié)合相同或不同(例如，3種或至少3種不同的)KLF轉(zhuǎn)錄因子。其它組合對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
通常，本文公開的寡核苷酸誘餌可用于結(jié)合調(diào)節(jié)牽涉感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)和/或受試者(例如，患者)的疼痛感覺的基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，例如，從而抑制所述轉(zhuǎn)錄因子。被設(shè)計(jì)來結(jié)合特定轉(zhuǎn)錄因子的寡核苷酸誘餌具有模擬通常被轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的內(nèi)源基因組DNA序列的核酸序列。因此，在一些方面，本文公開的寡核苷酸誘餌抑制基因表達(dá)和調(diào)節(jié)的必要步驟。此外，本文公開的寡核苷酸誘餌可以結(jié)合一種或多種不同的轉(zhuǎn)錄因子。
術(shù)語寡核苷酸涵蓋包括任何已知的DNA和RNA的堿基類似物的序列，所述堿基類似物包括但不限于2,6-二氨基嘌呤、5-羧甲基氨甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基氨甲基尿嘧啶、二氫尿嘧啶、肌苷、尿嘧啶-5-氧基乙酸、N6-異戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、辮苷(queosine)、2-硫代胞嘧啶、5-溴尿嘧啶、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、甲縮醛(ormacetal)、3'-硫代甲縮醛、硝基氧主鏈、砜、氨基磺酸酯、嗎啉代衍生物、鎖核酸(LNA)衍生物和/或肽核酸(PNA)衍生物。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸由退火在一起的兩個(gè)互補(bǔ)單鏈寡核苷酸組成。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸由形成分子內(nèi)堿基對(duì)以產(chǎn)生基本上雙鏈結(jié)構(gòu)的一個(gè)單鏈寡核苷酸組成。
在一些實(shí)施方案中，本文公開的寡核苷酸誘餌通過本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方法(例如，在核苷酸之間摻入硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、碳酸酯、硫醚、硅氧烷、乙酰胺酯或羧甲基酯鍵聯(lián))來修飾，以防止被細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外流體(例如血清、腦脊液)中的核酸酶降解。在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌被設(shè)計(jì)來形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和啞鈴結(jié)構(gòu)，其還可防止或阻礙核酸酶降解。在具體實(shí)施方案中，將寡核苷酸誘餌作為能夠在靶細(xì)胞中附加型維持或組成型復(fù)制的較大質(zhì)粒的一部分插入，以提供對(duì)誘餌序列的更長(zhǎng)期的增強(qiáng)的細(xì)胞內(nèi)暴露和/或減少其降解。因此，本領(lǐng)域已知的增強(qiáng)寡核苷酸穩(wěn)定性的任何化學(xué)修飾或結(jié)構(gòu)改變?cè)诒竟_的范圍內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，可將本文公開的寡核苷酸誘餌例如連接于改善寡核苷酸誘餌的治療效果的聚乙二醇聚合物、肽(例如，蛋白質(zhì)易位結(jié)構(gòu)域)或蛋白質(zhì)。此類修飾的寡核苷酸誘餌可優(yōu)先穿過細(xì)胞膜。
本文所述的寡核苷酸誘餌通?？梢杂米饔坞x酸或游離堿。或者，寡核苷酸誘餌可以以酸或堿加成鹽的形式使用。本發(fā)明的游離氨基化合物的酸加成鹽可以通過本領(lǐng)域熟知的方法制備，并且可以由有機(jī)和無機(jī)酸形成。合適的有機(jī)酸包括馬來酸、富馬酸、苯甲酸、抗壞血酸、琥珀酸、甲磺酸、乙酸、三氟乙酸、草酸、丙酸、酒石酸、水楊酸、檸檬酸、葡糖酸、乳酸、扁桃酸、肉桂酸、天冬氨酸、硬脂酸、棕櫚酸、乙醇酸、谷氨酸和苯磺酸。
合適的無機(jī)酸包括鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸和硝酸。堿加成鹽包括與羧酸鹽陰離子形成的那些鹽，包括與有機(jī)和無機(jī)陽離子，諸如選自堿金屬和堿土金屬(例如，鋰、鈉、鈣、鉀、鎂、鋇和鈣)，以及銨離子及其取代的衍生物(例如，二芐基銨、芐基銨、2-羥基乙基銨等)形成的鹽。因此，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”旨在包括任何和所有可接受的鹽形式。
還包括前藥。前藥是當(dāng)將向患者施用此類前藥時(shí)在體內(nèi)釋放化合物的任何共價(jià)鍵合的載體。前藥通常通過以使得修飾通過常規(guī)操作或在體內(nèi)裂解而產(chǎn)生母體化合物的方式修飾官能團(tuán)來制備。前藥包括例如本發(fā)明的化合物，其中羥基、胺或巰基被鍵合于任何基團(tuán)，當(dāng)向患者施用時(shí)，其裂解以形成羥基、胺或巰基。因此，前藥的代表性實(shí)例包括(但不限于)本文所述的寡核苷酸誘餌的醇和胺官能團(tuán)的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物。此外，在羧酸(-COOH)的情況下，可以使用酯，諸如甲酯、乙酯等。
在某些實(shí)施方案中，將寡核苷酸誘餌作為鹽、水合物、溶劑合物或N-氧化物衍生物提供。在某些實(shí)施方案中，在溶液(例如，具有生理pH的鹽溶液)中或以凍干形式中提供寡核苷酸誘餌。在一些實(shí)施方案中，在脂質(zhì)體中提供寡核苷酸誘餌。
本文所述的寡核苷酸誘餌可通過本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法制備，因此完全在本領(lǐng)域技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。寡核苷酸誘餌及其變體的活性可按照本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)(參見實(shí)施例)來測(cè)定。在具體實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌是合成寡核苷酸(即，化學(xué)合成的、非天然存在的寡核苷酸)。
還包括非基于寡核苷酸的治療劑，包括例如通過特異性結(jié)合KLF轉(zhuǎn)錄因子，或通過特異性結(jié)合其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(例如，通過模擬KLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))來抑制轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的那些治療劑。治療劑的實(shí)例包括結(jié)合劑諸如抗體、例如抗體、小分子、肽、adnectin、anticalin、錨蛋白重復(fù)蛋白(Darpin)、anaphone和適體，所述結(jié)合劑表現(xiàn)出對(duì)KLF轉(zhuǎn)錄因子例如KLF因子轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域的結(jié)合特異性，或表現(xiàn)出對(duì)內(nèi)源KLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合特異性。
如果結(jié)合劑以可檢測(cè)的水平(在例如ELISA測(cè)定中)與多肽或核酸反應(yīng)，并且在相似條件下不以顯著(例如，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的)方式與無關(guān)結(jié)構(gòu)可檢測(cè)地反應(yīng)，則結(jié)合劑被認(rèn)為對(duì)KLF多肽(例如，其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或內(nèi)源性KLF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(例如，雙鏈DNA序列)表現(xiàn)出“結(jié)合特異性”、“特異性結(jié)合”。
術(shù)語“抗體”涉及免疫球蛋白(無論是天然的還是部分或全部合成產(chǎn)生的)。該術(shù)語還涵蓋具有為抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或與抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽或蛋白質(zhì)。該術(shù)語也涵蓋CDR移植抗體。術(shù)語“抗體的抗原結(jié)合部分”、“抗原結(jié)合片段”、“抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域”、“抗體片段”或“抗體的功能片段”在本發(fā)明中可互換使用，以包括一個(gè)或多個(gè)保留特異性結(jié)合抗原的能力的抗體的片段(參見例如Holliger等，Nature Biotech.23(9):1126-1129(2005))。
抗體可通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的多種技術(shù)中的任一種制備。參見，例如Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,1988。可使用Kohler和Milstein,Eur.J.Immunol.6:511-519,1976中的技術(shù)及其改進(jìn)來制備對(duì)于目標(biāo)多肽是特異的單克隆抗體。還包括利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物諸如小鼠來表達(dá)人抗體的方法。參見，例如，Neuberger等，Nature Biotechnology 14:826,1996；Lonberg等，Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101,1994；和Lonberg等，Internal Review of Immunology 13:65-93,1995。具體實(shí)例包括由產(chǎn)生的平臺(tái)(參見，例如，美國專利第6,596,541號(hào))。還可通過使用噬菌體展示或酵母展示文庫產(chǎn)生或鑒定抗體(參見，例如，美國專利第7,244,592號(hào)；Chao等，Nature Protocols.1:755-768,2006)。
如上所述，抑制KLF轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的“肽”被包括作為結(jié)合劑。術(shù)語肽通常是指氨基酸殘基的聚合物及其變體和合成類似物。在某些實(shí)施方案中，術(shù)語“肽”是指相對(duì)短的多肽，包括由約3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)、8個(gè)、9個(gè)、10個(gè)、11個(gè)、12個(gè)、13個(gè)、14個(gè)、15個(gè)、16個(gè)、17個(gè)、18個(gè)、19個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、31個(gè)、32個(gè)、33個(gè)、34個(gè)、35個(gè)、36個(gè)、37個(gè)、38個(gè)、39個(gè)、40個(gè)、41個(gè)、42個(gè)、43個(gè)、44個(gè)、45個(gè)、46個(gè)、47個(gè)、48個(gè)、49個(gè)、50個(gè)或更多個(gè)(包括其間的所有整數(shù)和范圍(例如，5-10個(gè)、8-12個(gè)、10-15個(gè)、15-20個(gè)、20-25個(gè)、25-30個(gè)、30-40個(gè)、40-50個(gè)))氨基酸組成，以及例如結(jié)合KLF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域，例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或通過結(jié)合其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)來模擬KLF轉(zhuǎn)錄因子的肽。肽可以由天然存在的氨基酸和/或非天然存在的氨基酸組成。
如上所述，本發(fā)明包括抑制KLF轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的小分子。“小分子”是指合成或生物來源，但通常不是聚合物的有機(jī)或無機(jī)化合物。有機(jī)化合物包括其分子含有碳的一大類化合物，通常不包括僅包含碳酸鹽、簡(jiǎn)單的碳氧化物或氰化物的那些化合物?！熬酆衔铩蓖ǔＪ侵赣芍貜?fù)結(jié)構(gòu)單元組成的大分子或高分子，其通常通過共價(jià)化學(xué)鍵連接。在某些實(shí)施方案中，小分子具有小于1000-2000道爾頓，通常在約300與700道爾頓之間，并且包括約50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、500、650、600、750、700、850、800、950、1000或2000道爾頓的分子量。
還包括抑制KLF轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的適體作為結(jié)合劑(參見，例如，Ellington等，Nature.346,818-22,1990；和Tuerk等，Science.249,505-10,1990)。適體的實(shí)例包括核酸適體(例如，DNA適體、RNA適體)和肽適體。核酸適體通常是指具有二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)以結(jié)合各種分子靶諸如小分子、蛋白質(zhì)、核酸和甚至細(xì)胞、組織和生物體的核酸種類，其已通過重復(fù)輪的體外選擇或等效方法諸如SELEX(通過指數(shù)富集的配體的系統(tǒng)演化)進(jìn)行了工程化。參見例如美國專利第6,376,190號(hào)和第6,387,620號(hào)。因此，包括結(jié)合KLF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或結(jié)合其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)的核酸適體。
肽適體通常包括在兩個(gè)末端端附接于蛋白質(zhì)支架的可變肽環(huán)、雙重結(jié)構(gòu)約束(其通常將肽適體的結(jié)合親和力提高至與抗體的結(jié)合親和力相當(dāng)?shù)乃?例如，在納摩爾范圍內(nèi)))。在某些實(shí)施方案中，可變環(huán)長(zhǎng)度可由約10-20個(gè)氨基酸(包括其間的所有整數(shù))組成，并且支架可包括具有良好的溶解度和致密度性質(zhì)的任何蛋白質(zhì)。某些示例性實(shí)施方案可利用細(xì)菌蛋白硫氧還蛋白-A作為支架蛋白，可變環(huán)被插入在還原活性位點(diǎn)(野生蛋白中的-Cys-Gly-Pro-Cys-環(huán))內(nèi)，其中兩個(gè)半胱氨酸側(cè)鏈為能夠形成二硫鍵。用于鑒定肽適體的方法描述于例如美國申請(qǐng)第2003/0108532號(hào)中。因此，包括結(jié)合KLF轉(zhuǎn)錄因子的一個(gè)或多個(gè)區(qū)域(例如，轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域)或結(jié)合其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)的肽適體。肽適體選擇可使用本領(lǐng)域已知的不同系統(tǒng)(包括酵母雙雜交系統(tǒng))來進(jìn)行。
還包括特異性結(jié)合KLF轉(zhuǎn)錄因子的ADNECTINSTM、AVIMERSTM和ANTICALINS。ADNECTINSTM是指一類源自人纖連蛋白的靶向生物制劑，所述纖連蛋白是與其它蛋白質(zhì)天然結(jié)合的豐富的細(xì)胞外蛋白質(zhì)。參見，例如美國申請(qǐng)第2007/0082365號(hào)；第2008/0139791號(hào)和第2008/0220049號(hào)。ADNECTINSTM通常由天然纖連蛋白主鏈，以及人纖連蛋白的特定部分的多個(gè)靶向結(jié)構(gòu)域組成?？梢怨こ袒邢蚪Y(jié)構(gòu)域以使得AdnectinTM能夠特異性識(shí)別目標(biāo)治療靶標(biāo)，諸如KLF轉(zhuǎn)錄因子多肽或其片段，例如轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域，或其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)。
AVIMERSTM是指使用體外外顯子改組和噬菌體展示工程化的多聚體結(jié)合蛋白或肽。連接多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而導(dǎo)致與單表位免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域相比更大的親和力和特異性。參見，例如，Silverman等，Nature Biotechnology.23:1556-1561,2005；美國專利第7,166,697號(hào)；和美國申請(qǐng)第2004/0175756號(hào)、第2005/0048512號(hào)、第2005/0053973號(hào)、第2005/0089932號(hào)和第2005/0221384號(hào)。
還包括設(shè)計(jì)的錨蛋白重復(fù)蛋白(DARPin)，其包括一類非免疫球蛋白蛋白，所述非免疫球蛋白蛋白可在藥物發(fā)現(xiàn)和藥物開發(fā)中提供優(yōu)于抗體的靶結(jié)合的優(yōu)點(diǎn)。在其它用途中，DARPin由于其有利的分子性質(zhì)，包括小尺寸和高穩(wěn)定性，理想地適合于體內(nèi)成像或毒素或其它治療有效載荷的遞送。在細(xì)菌中的低成本生產(chǎn)和許多靶特異性DARPin的快速產(chǎn)生使得DARPin法可用于藥物發(fā)現(xiàn)。另外，DARPin可以容易地以多特異性形式產(chǎn)生，提供將效應(yīng)子DARPin靶向特定器官或用一個(gè)由幾個(gè)DARPin組成的分子靶向多個(gè)多肽/核酸的潛力。參見，例如，Stumpp等，Curr Opin Drug Discov Devel.10:153-159,2007；美國申請(qǐng)第2009/0082274號(hào)；和PCT/EP2001/10454。
某些實(shí)施方案包括“單體”，其通常利用人纖連蛋白(FNfn10)的第10纖連蛋白III型結(jié)構(gòu)域作為支架來展示用于靶結(jié)合的多個(gè)表面環(huán)。FNfn10是具有類似于免疫球蛋白折疊的β-夾心結(jié)構(gòu)的小(94個(gè)殘基)蛋白質(zhì)。其是高度穩(wěn)定的，無二硫鍵或金屬離子，其可在細(xì)菌中以正確折疊形式高水平表達(dá)。FNfn10支架與實(shí)際上任何展示技術(shù)兼容。參見，例如，Batori等，Protein Eng.15:1015-20,2002；和Wojcik等，Nat Struct Mol Biol.,2010和美國專利第6,673,901號(hào)。
Anticalin是指一類抗體模擬物，其通常由人脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(具有由結(jié)構(gòu)上剛性的框架支持的高變環(huán)區(qū)域的結(jié)合蛋白的家族)合成。參見，例如，美國申請(qǐng)第2006/0058510號(hào)。Anticalin通常具有約20kDa的大小。Anticalin可通過由八個(gè)反向平行的β-鏈(穩(wěn)定的β-桶支架)形成的桶結(jié)構(gòu)來表征，所述反向平行的β-鏈由四個(gè)肽環(huán)和附接的α-螺旋成對(duì)連接。在某些方面，在高變環(huán)區(qū)域中產(chǎn)生實(shí)現(xiàn)特異性結(jié)合的構(gòu)象偏差。參見，例如，Skerra，F(xiàn)EBS J.275：2677-83,2008，通過引用并入本文。
治療劑，例如本文所述的抑制KLF轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合的結(jié)合劑可用于本文所述的任何方法和組合物。
使用方法
本發(fā)明的實(shí)施方案包括使用本文所述的治療劑(例如寡核苷酸誘餌、結(jié)合劑)和相關(guān)組合物調(diào)節(jié)一種或多種KLF轉(zhuǎn)錄因子的活性的方法，所述治療劑抑制或以其它方式減少一種或多種KLF轉(zhuǎn)錄因子與其內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合。在具體實(shí)施方案中，所述一種或多種轉(zhuǎn)錄因子選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組。
所述方法可用于例如治療受試者的疼痛，以調(diào)節(jié)存在于細(xì)胞中的參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)存在于細(xì)胞中的參與受試者疼痛的感知的基因的轉(zhuǎn)錄，和/或調(diào)節(jié)例如受試者的細(xì)胞中的感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)。此類方法可以在體外實(shí)施，例如通過將細(xì)胞與治療劑(例如，寡核苷酸誘餌)或相關(guān)組合物接觸，或在體內(nèi)實(shí)施，例如通過向有此需要的受試者施用治療劑(例如，寡核苷酸誘餌)或相關(guān)組合物。在具體實(shí)施方案中，治療劑是如本文所述的寡核苷酸誘餌或寡核苷酸誘餌的群體。
因此，某些實(shí)施方案包括用于治療受試者的疼痛的方法，包括向受試者施用治療有效量的治療劑，其中所述治療劑抑制轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，并且其中所述轉(zhuǎn)錄因子來自由KLF1，KLF2，KLF3，KLF4，KLF5，KLF6，KLF8，KLF9，KLF10，KLF11，KLF12，KLF13，KLF14，KLF15，KLF16和KLF17組成的組。還包括治療有此需要的受試者的疼痛的方法，其包括向受試者施用治療有效量的本文所述的一種或多種寡核苷酸誘餌。在一些實(shí)施方案中，提供了預(yù)防受試者的疼痛的方法，例如治療或控制疼痛的預(yù)防性方法。此類方法包括向有此需要的受試者(例如，可能發(fā)展疼痛，例如手術(shù)后疼痛的患者)施用治療有效量的本文所述的寡核苷酸誘餌。
因此，在某些實(shí)施方案中，向遭受疼痛或預(yù)期遭受疼痛的有此需要的受試者(例如，諸如動(dòng)物(例如，鳥、哺乳動(dòng)物、靈長(zhǎng)類動(dòng)物、人患者)施用寡核苷酸誘餌和/或包含其的藥物組合物。疼痛的具體實(shí)例包括但不限于機(jī)械性疼痛(例如，機(jī)械痛覺過敏和/或異常性疼痛)、化學(xué)疼痛、溫度疼痛、慢性疼痛、亞慢性疼痛、急性疼痛、亞急性疼痛、炎性疼痛、神經(jīng)性疼痛、肌肉疼痛、骨骼疼痛、手術(shù)后疼痛、神經(jīng)根疼痛、背痛、關(guān)節(jié)炎疼痛和/或糖尿病疼痛。在某些實(shí)施方案中，向患者諸如動(dòng)物施用寡核苷酸誘餌和/或其藥物組合物，作為針對(duì)疼痛的預(yù)防措施，所述疼痛包括但不限于前述疼痛實(shí)例中的任何一種或多種。在一些實(shí)施方案中，疼痛是手術(shù)后疼痛、慢性疼痛、炎性疼痛、神經(jīng)性疼痛、肌肉疼痛和/或骨骼痛。在某些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌和/或其藥物組合物可用于預(yù)防疼痛的一個(gè)方面，同時(shí)治療另一種疼痛癥狀。
在具體實(shí)施方案中，疼痛是慢性疼痛。在一些實(shí)施方案中，疼痛是神經(jīng)性疼痛，例如慢性神經(jīng)性疼痛和/或與炎癥(例如，神經(jīng)炎癥)相關(guān)的(慢性)神經(jīng)性疼痛。在某些實(shí)施方案中，疼痛與炎癥相關(guān)，例如與炎癥相關(guān)的慢性疼痛、與炎癥相關(guān)的慢性神經(jīng)性疼痛。在一些實(shí)施方案中，疼痛與中樞神經(jīng)系統(tǒng)和/或內(nèi)臟病癥相關(guān)。在一些實(shí)施方案中，疼痛是手術(shù)后疼痛。
在一些實(shí)施方案中，被施用來治療、控制和/或預(yù)防疼痛的治療劑(例如，寡核苷酸誘餌、寡核苷酸誘餌的群體、結(jié)合劑)或組合物提供等于或小于約0.8或等于或高于約1.0(基于標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定(參見上文)中的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位))的KLF15/KLF9的結(jié)合比率。在具體實(shí)施方案中，前述治療劑用于治療神經(jīng)性疼痛。
在具體實(shí)施方案中，被施用來治療、控制和/或預(yù)防疼痛的治療劑(例如，寡核苷酸誘餌、寡核苷酸誘餌的群體、結(jié)合劑)或組合物在標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定(參見上文)中提供與預(yù)定量，例如約0.2OD450(或使用等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位的相當(dāng)結(jié)合水平)的光密度值相等或高于其的對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力。在一些實(shí)施方案中，KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力(如由1/(KLF6+KLF9)所指示的)等于或小于約5、4、3、2、1、0.5、0.1或更小(包括其間的所有范圍和整數(shù))(基于來自標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)定的OD450值(或等效的標(biāo)準(zhǔn)ELISA測(cè)量單位，例如，熒光))。在具體實(shí)施方案中，前述治療劑用于治療與炎癥相關(guān)的疼痛或神經(jīng)性疼痛。
還包括用于調(diào)節(jié)存在于細(xì)胞中的參與受試者的感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)和/或疼痛感知的基因的轉(zhuǎn)錄的方法，所述方法包括向所述細(xì)胞施用治療有效量的治療劑，其中所述治療劑抑制轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，其中所述轉(zhuǎn)錄因子選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組。在一些實(shí)施方案中，所述治療劑包括本文所述的一種或多種寡核苷酸誘餌。在某些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括抑制或阻遏基因表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括穩(wěn)定基因表達(dá)。在具體實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)包括活化或誘導(dǎo)基因表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，所述基因參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)。涉及感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的基因包括但不限于編碼膜蛋白(例如，離子通道、膜受體等)、可溶性信號(hào)傳導(dǎo)分子(例如，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子或神經(jīng)遞質(zhì))、合成酶(例如，神經(jīng)遞質(zhì)合成酶)和轉(zhuǎn)錄因子的基因。此類蛋白質(zhì)的具體實(shí)例包括但不限于BDNF(由KLF9調(diào)節(jié))、TGFB1(由KLF6調(diào)節(jié))、CDKN1A、JUN、GFAP(由KLF15調(diào)節(jié))；和其它蛋白質(zhì)諸如BDKRB2、HTR3A、SCN9A、GRM5、NOS1、GCH1、CDK5R1、CACNA1B、P2XR3和PNMT。
一些實(shí)施方案包括用于調(diào)節(jié)細(xì)胞中感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，其包括向所述細(xì)胞施用治療有效量的治療劑，其中治療劑抑制轉(zhuǎn)錄因子與其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合，其中轉(zhuǎn)錄因子選自由KLF1、KLF2、KLF3、KLF4、KLF5、KLF6、KLF8、KLF9、KLF10、KLF11、KLF12、KLF13、KLF14、KLF15、KLF16和KLF17組成的組。在一些實(shí)施方案中，治療劑包括本文所述的一種或多種寡核苷酸誘餌。在某些實(shí)施方案中，感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)包括抑制或阻遏感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)。在一些實(shí)施方案中，感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)包括活化感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的抑制劑。在具體實(shí)施方案中，感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)包括增加參與細(xì)胞中感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)的蛋白水解降解。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)降解的調(diào)節(jié)包括刺激蛋白酶體功能。在某些實(shí)施方案中，蛋白質(zhì)參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)。參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的蛋白質(zhì)包括但不限于膜蛋白(例如，離子通道、膜受體等)、可溶性信號(hào)傳導(dǎo)分子(例如，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)分子或神經(jīng)遞質(zhì))、合成酶(例如，神經(jīng)遞質(zhì)合成酶)和轉(zhuǎn)錄因子。此類蛋白質(zhì)的具體實(shí)例包括但不限于BDNF(由KLF9調(diào)節(jié))、TGFB1(由KLF6調(diào)節(jié))、CDKN1A、JUN、GFAP(由KLF15調(diào)節(jié))；和其它蛋白質(zhì)諸如BDKRB2、HTR3A、SCN9A、GRM5、NOS1、GCH1、CDK5R1、CACNA1B、P2XR3和PNMT。
在某些實(shí)施方案中，在體內(nèi)(例如，在遭受疼痛或可能遭受疼痛的受試者中)提供各種方法的細(xì)胞。體內(nèi)提供的細(xì)胞可位于不同位置，包括但不限于背根神經(jīng)節(jié)和/或脊髓。在其它實(shí)施方案中，在體外(例如，在陪替氏培養(yǎng)皿中)提供各種方法的細(xì)胞。細(xì)胞可以是參與感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的任何細(xì)胞，包括但不限于神經(jīng)元(例如，來自背根神經(jīng)節(jié)和/或脊髓或來自交感神經(jīng)系統(tǒng)的疼痛神經(jīng)元)、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、組織支持性細(xì)胞(例如，成纖維細(xì)胞)、免疫細(xì)胞或來自細(xì)胞系的細(xì)胞(例如，PC12細(xì)胞)。
在一些實(shí)施方案中，寡核苷酸誘餌和/或其藥物組合物用于與至少一種其它治療劑的組合治療。其它治療劑的實(shí)例包括但不限于一種或多種另外的寡核苷酸誘餌。寡核苷酸誘餌和/或其藥物組合物和治療劑可累加地或更優(yōu)選協(xié)同地起作用。在一些實(shí)施方案中，將寡核苷酸誘餌和/或其藥物組合物與另一治療劑(包括另一寡核苷酸誘餌)的施用同時(shí)施用。在其它實(shí)施方案中，在施用另一治療劑(包括另一寡核苷酸誘餌)之前或之后施用寡核苷酸誘餌或其藥物組合物。
對(duì)于向有此需要的受試者施用，可通過任何方便的途徑施用本文所述的寡核苷酸誘餌和/或藥物組合物。具體實(shí)例包括通過輸注或推注注射，通過經(jīng)上皮或粘膜皮膚襯里(例如，口腔粘膜、直腸和腸粘膜等)的吸收以及通過口服施用的施用。施用可以是全身性的或局部的。各種遞送系統(tǒng)是本領(lǐng)域已知的，包括例如包封在脂質(zhì)體、微粒、微膠囊、膠囊等中，其可用于施用化合物和/或其藥物組合物。施用方法包括但不限于真皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)、硬膜外(epidural)/硬膜外(peridural)、口服、舌下、鼻內(nèi)、腦內(nèi)、陰道內(nèi)、經(jīng)皮、經(jīng)直腸、通過吸入或局部(特別地至耳、鼻、眼或皮膚)施用。在某些實(shí)施方案中，神經(jīng)周、硬膜外/硬膜外、鞘內(nèi)或皮內(nèi)施用寡核苷酸誘餌。在某些實(shí)施方案中，向患者施用多于一種寡核苷酸誘餌。優(yōu)選的施用模式由醫(yī)生決定，并且將部分地取決于醫(yī)學(xué)病況的部位。
在具體實(shí)施方案中，可能需要向需要治療的區(qū)域局部施用一種或多種寡核苷酸誘餌。這可以例如但不限于通過在手術(shù)期間局部輸注、局部敷貼(例如，與手術(shù)后的傷口敷料結(jié)合)、通過注射、通過導(dǎo)管、通過栓劑，或通過植入物(所述植入物是多孔、非多孔或凝膠狀材料，包括膜，諸如硅橡膠膜或纖維)來實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，施用可以是通過在疼痛部位(例如，先前、現(xiàn)在或預(yù)期的部位)直接注射。
在某些實(shí)施方案中，可能需要通過任何合適的途徑(包括但不限于腦室內(nèi)、鞘內(nèi)、神經(jīng)周和/或硬膜外/硬膜外注射)將一種或多種寡核苷酸誘餌導(dǎo)入神經(jīng)系統(tǒng)。腦室內(nèi)注射可以通過腦室內(nèi)導(dǎo)管(例如，附接于儲(chǔ)器諸如Ommaya儲(chǔ)器的)來促進(jìn)。
也可以使用肺施用，例如通過使用吸入器或霧化器，以及具有霧化劑的制劑，或通過在碳氟化合物或合成肺表面活性劑中的灌注。
在治療或預(yù)防患者疼痛中將是有效的寡核苷酸誘餌的量將取決于病況的具體性質(zhì)，并且可通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)來確定。另外，可任選地使用體外或體內(nèi)測(cè)定來幫助鑒定最佳劑量范圍。所施用的寡核苷酸誘餌的量當(dāng)然將取決于受治療的受試者、受試者的體重、痛苦的嚴(yán)重程度、施用方式和處方醫(yī)師的判斷等因素。在某些實(shí)施方案中，單劑量的寡核苷酸誘餌包含約5μg至約15mg、約50μg至約7.5mg、約100μg至約1mg、約250μg至約750μg，或約500μg的寡核苷酸誘餌/千克(kg)體重。
在一些實(shí)施方案中，劑型適于不超過每日兩次，更優(yōu)選每日僅一次向患者施用。給藥可以單獨(dú)提供或與其它藥物組合提供，并且可持續(xù)長(zhǎng)至有效治療或預(yù)防疼痛所需的時(shí)間。
組合物和試劑盒
某些實(shí)施方案包括組合物，例如藥物或治療組合物，其包含任選與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體(例如，藥物級(jí)載體)組合的本文所述的一種或多種治療劑(例如，寡核苷酸誘餌、結(jié)合劑)。
本文公開的藥物組合物包含治療有效量的一種或多種治療劑(例如，寡核苷酸誘餌)，優(yōu)選以純化形式與合適量的藥學(xué)上可接受的載體一起，以提供用于向患者的適當(dāng)施用的形式。當(dāng)向患者施用時(shí)，治療劑諸如寡核苷酸誘餌和藥學(xué)上可接受的載體優(yōu)選是無菌的。藥學(xué)上可接受的載體的實(shí)例包括但不限于鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、tris緩沖液、水、含水乙醇、乳液諸如油/水乳液或甘油三酯乳液、片劑和膠囊。當(dāng)靜脈內(nèi)施用寡核苷酸誘餌時(shí)，水是優(yōu)選的媒介物。鹽水溶液和葡萄糖水溶液以及甘油溶液也可用作液體媒介物，特別是用于可注射溶液。合適的藥學(xué)上可接受的載體還包括賦形劑諸如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明膠、麥芽、大米、面粉、白堊、硅膠、硬脂酸鈉、單硬脂酸甘油酯、滑石、氯化鈉、干脫脂乳、甘油、丙烯、乙醇、水、乙醇等。如果需要，藥物組合物還可含有少量的潤(rùn)濕劑或乳化劑或pH緩沖劑。另外，可使用助劑、穩(wěn)定劑、增稠劑、潤(rùn)滑劑和著色劑。
藥物組合物可通過常規(guī)混合、溶解、制粒、糖衣丸制造、研磨、乳化、包封、包埋或凍干方法制備?？梢砸猿Ｒ?guī)方式使用一種或多種生理學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、賦形劑或助劑配制藥物組合物，其有利于將本文公開的化合物加工成可在藥學(xué)上使用的制劑。適當(dāng)?shù)闹苿┤Q于所選擇的施用途徑。
藥物組合物可采取溶液、混懸劑、乳液、片劑、丸劑、丹劑、膠囊、含有液體的膠囊、粉劑、持續(xù)釋放制劑、栓劑、氣霧劑、噴霧劑、混懸劑或適合使用的任何其它形式的形式。合適的藥物媒介物的其它實(shí)例已經(jīng)在本領(lǐng)域中進(jìn)行了描述(參見Remington’s Pharmaceutical Sciences,Philadelphia College of Pharmacy and Science，第19版，1995)。
用于口服遞送的藥物組合物可呈片劑、錠劑、水性或油性混懸劑、顆粒劑、粉劑、乳劑、膠囊劑、糖漿劑或酏劑形式。口服施用的組合物可含有一種或多種任選的試劑，例如甜味劑諸如果糖、阿斯帕坦或糖精、調(diào)味劑諸如薄荷、冬青油或櫻桃著色劑和防腐劑，以提供藥學(xué)上可口的制劑。此外，當(dāng)呈片劑或丸劑形式時(shí)，可包被組合物以延遲在胃腸道中的崩解和吸收，從而在延長(zhǎng)的時(shí)段內(nèi)提供持續(xù)的作用。口服組合物可包括標(biāo)準(zhǔn)媒介物諸如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。此類媒介物優(yōu)選是藥物級(jí)的。
對(duì)于口服液體制劑諸如例如混懸劑、酏劑和溶液劑，合適的載體、賦形劑或稀釋劑包括水、鹽水、亞烷基二醇(例如，丙二醇)、聚亞烷基二醇(例如，聚乙二醇)、油、醇、pH 4與pH 6之間的微酸性緩沖液(例如，在約5mM至約50mM之間的乙酸鹽、檸檬酸鹽或抗壞血酸鹽)等。另外，可以加入調(diào)味劑、防腐劑、著色劑、膽汁鹽、酰基肉堿等。
對(duì)于頰部施用，組合物可采取以常規(guī)方式配制的片劑、錠劑等形式。適合與噴霧器和液體噴霧裝置和EHD氣溶膠裝置一起使用的液體藥物制劑通常包括化合物與藥學(xué)上可接受的媒介物。在一些方面，藥學(xué)上可接受的媒介物是液體，諸如醇、水、聚乙二醇或全氟化碳。任選地，可添加另一種材料以改變化合物的溶液或混懸劑的氣溶膠性質(zhì)。在一些方面，所述材料是液體諸如醇、二醇、聚乙二醇或脂肪酸。配制適用于氣溶膠裝置的液體藥物溶液或混懸劑的其它方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(參見，例如Biesalski，美國專利第5,112,598號(hào)；Biesalski，美國專利第5,556,611號(hào))。還可將化合物配制成直腸或陰道組合物，諸如例如含常規(guī)栓劑基質(zhì)諸如可可脂或其它甘油酯的栓劑或保留灌腸劑。除了先前描述的制劑以外，還可將化合物配制為貯庫型制劑(depot preparation)。此類長(zhǎng)效制劑可以通過植入(例如，皮下或肌內(nèi))或通過肌內(nèi)注射進(jìn)行施用。因此，例如，化合物可用合適的聚合物或疏水材料(例如，作為在可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂配制，或配制為微溶衍生物，例如配制為微溶鹽。
可將寡核苷酸誘餌作為藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物包含在任何本文所述的制劑中，或者任何其它合適的制劑中。藥學(xué)上可接受的鹽大體上保留母體化合物的活性，并且可通過與適當(dāng)?shù)膲A或酸反應(yīng)來制備，并且傾向于比相應(yīng)的母體形式更易溶于水性和其它質(zhì)子溶劑中。
在一些情況下，可將脂質(zhì)體用于促進(jìn)寡核苷酸誘餌至細(xì)胞中的攝取，例如在體外或在受試者中(參見，例如，Williams,S.A.,Leukemia10(12):1980-1989,1996；Lappalainen等，Antiviral Res.23:119,1994；Uhlmann等，Chemical Reviews，第90卷，No.4,25，第544-584頁，1990；Gregoriadis,G.，第14章，Liposomes,Drug Carriers in Biology and Medicine，第287-341頁，Academic Press,1979)。水凝膠也可以用作用于寡核苷酸誘餌施用的媒介物，例如，如WO 93/01286中所述的?；蛘?，可將寡核苷酸誘餌在微球或微粒中施用。(參見，例如Wu,G.Y.和Wu,C.H.,J.Biol.Chem.262:4429-4432,30 1987)?；蛘?，使用與寡核苷酸誘餌復(fù)合的充氣微泡可增強(qiáng)向靶組織的遞送，如美國專利第6,245,747號(hào)中所述的。也可使用持續(xù)釋放組合物。這些可包括以成型制品形式存在的半透性聚合物基質(zhì)，諸如膜或微膠囊。
可使用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)(例如，轉(zhuǎn)染、電穿孔、融合、脂質(zhì)體、膠體聚合物顆粒和病毒及非病毒載體以及本領(lǐng)域已知的其它方法)將寡核苷酸誘餌引入細(xì)胞。所選擇的遞送方法將至少取決于寡核苷酸化學(xué)、待處理的細(xì)胞和細(xì)胞的位置，并且對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員將是顯而易見的。例如，可以通過在表面上具有導(dǎo)向脂質(zhì)體的特異性標(biāo)志物的脂質(zhì)體、直接注射至含有靶細(xì)胞的組織中、特異性受體介導(dǎo)的攝取等來實(shí)現(xiàn)定位。
如本領(lǐng)域中已知的，寡核苷酸誘餌可使用例如牽涉脂質(zhì)體介導(dǎo)的攝取、脂質(zhì)綴合物、聚賴氨酸介導(dǎo)的攝取、納米顆粒介導(dǎo)的攝取和受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用的方法，以及另外的非內(nèi)吞遞送模式諸如顯微注射、透化(例如，鏈球菌溶血素-O透化作用、陰離子肽透化作用)、電穿孔和本領(lǐng)域已知的各種非侵入性非內(nèi)吞遞送方法(參見，例如，Dokka和Rojanasakul,Advanced Drug Delivery Reviews 44:35-49，通過引用整體并入)來進(jìn)行遞送。
在某些實(shí)施方案中，在試劑盒中提供一種或多種寡核苷酸誘餌。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包括例如用于使用所述一種或多種寡核苷酸誘餌的說明書。在某些實(shí)施方案中，所述說明書描述了本發(fā)明的一種或多種方法，例如用于預(yù)防或治療疼痛的方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞中感受傷害的信號(hào)傳導(dǎo)的方法，調(diào)節(jié)細(xì)胞中的蛋白質(zhì)降解等的方法。在某些實(shí)施方案中，試劑盒中提供的寡核苷酸誘餌以凍干形式提供。在某些相關(guān)實(shí)施方案中，包含一種或多種凍干的寡核苷酸誘餌的試劑盒還包含可用于重懸浮一種或多種寡核苷酸誘餌的溶液(例如，藥學(xué)上可接受的鹽水溶液)。
以下實(shí)施例旨在說明而非限制本發(fā)明。本文提及的每個(gè)專利和非專利參考文獻(xiàn)通過引用整體并入。
實(shí)施例
實(shí)施例1
靶向KLF家族用于治療疼痛
設(shè)計(jì)針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子(KLF)的Krüppel樣家族成員的寡核苷酸誘餌，其特征在于KLF結(jié)合，并在神經(jīng)性疼痛和神經(jīng)炎性疼痛的動(dòng)物模型中對(duì)其測(cè)試。
跨兩個(gè)單獨(dú)的神經(jīng)性和神經(jīng)炎性疼痛模型(如下所述的)的KLF結(jié)合模式、功效幅度和持續(xù)時(shí)間的交叉分析顯示，寡核苷酸誘餌TF D16(GATCCTTTGCCTCCTTCGATCCTTTGCCTCCTTCAAG；SEQ ID NO:37)和TFD17(GGTGTTTGGGAGAGCTTTGGGAGGATACG；SEQ ID NO:38)在兩種模型中均有效，并通過抑制KLF6,9和/或15起作用(數(shù)據(jù)未顯示)。這些數(shù)據(jù)表明，通過KLF9和KLF15的組合抑制，減輕慢性神經(jīng)性疼痛的功效是有效的，通過KLF6和KLF9的組合抑制，減輕慢性神經(jīng)炎性疼痛的功效是有效的。
因此，選擇TFD16和TFD17作為序列矩陣來產(chǎn)生具有互補(bǔ)KLF6、9和15結(jié)合模式的另外的寡核苷酸誘餌序列?；谠摲治觯苽浔?(上文)中的寡核苷酸誘餌，測(cè)試其的KLF結(jié)合，并且如下所述，在疼痛的動(dòng)物模型中進(jìn)一步測(cè)試表E1(下文)中的那些寡核苷酸誘餌。
ELISA測(cè)定。使用定制版本的SP1商業(yè)ELISA試劑盒(SP1ELISA試劑盒，目錄號(hào)EK-1090，Affymetrix)測(cè)量寡核苷酸誘餌的KLF結(jié)合。簡(jiǎn)言之，將生物素-誘餌探針(12.8皮摩爾/孔)與15μg的含有KLF轉(zhuǎn)錄因子的核蛋白提取物一起孵育，所述提取物來自(a)HELA細(xì)胞：用于KLF1-6、8-14和16-17檢測(cè)(目錄#36010，活性基序，CA)，或(b)HEK290：用于KLF15檢測(cè)(目錄#36033，活性基序，CA)。對(duì)于KLF 7檢測(cè)，使用0.5和1μg重組人KLF7蛋白(Novus，CA，目錄號(hào)NBP2-23176)。
根據(jù)ELISA試劑盒供應(yīng)商進(jìn)行誘餌探針-蛋白質(zhì)混合物的加工：將混合物加載在鏈霉抗生物素蛋白包被的96孔板上，并在微量板讀數(shù)器(OD450nm)中用基于抗體的比色檢測(cè)(綴合于HRP的抗-兔第二抗體)測(cè)量捕獲的KLF的量。當(dāng)將遞增濃度的競(jìng)爭(zhēng)性非生物素化誘餌添加至結(jié)合混合反應(yīng)時(shí)，結(jié)合至生物素化探針的轉(zhuǎn)錄因子的減少是結(jié)合特異性的證明。針對(duì)內(nèi)部測(cè)量的每一個(gè)ELISA運(yùn)行的本底信號(hào)對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并根據(jù)試劑盒供應(yīng)商的推薦標(biāo)準(zhǔn)化所有測(cè)試步驟和測(cè)試條件，包括利用檢測(cè)緩沖液的檢測(cè)時(shí)間(即，對(duì)于該測(cè)定，5.2分鐘被測(cè)定為最佳的)，以確保ELISA運(yùn)行之間的強(qiáng)力(brute)OD450結(jié)合值的適當(dāng)比較。
對(duì)于ELISA測(cè)定，每種誘餌的單鏈由Invitrogen(CA)制造，將其重懸于100μM的TE pH 8，NaCl 50μM中的原液中，并如下在4μM工作溶液中退火：(a)誘餌混合物(100μL)：4μL反義鏈(100μM)+4μl反義鏈(100μM)+89.5μl TE pH 8+2.5μl NaCl(1.94M)；(b)退火：在95°下7分鐘，隨后在使用或于-20℃下貯存之前在室溫下緩慢冷卻1小時(shí)。
通過測(cè)量結(jié)合信號(hào)線性、與游離競(jìng)爭(zhēng)劑KLF誘餌的結(jié)合的減少，以及通過缺乏與突變型誘餌結(jié)合的KLF來評(píng)估結(jié)合特異性(參見下表E2)。
兔第一KLF抗體從商購可得來源獲得，并且用于KLF測(cè)定的綴合于HRP的第二抗兔抗體是ELISA試劑盒中提供的抗體(稀釋度1:200)。
體內(nèi)功效研究。下面提供了用于疼痛動(dòng)物模型的材料和方法。
動(dòng)物。Sprague-Dawley大鼠，250-300g，雄性，Harlan Industries(Livermore，CA)。
測(cè)試和對(duì)照用品。對(duì)于動(dòng)物測(cè)試，寡核苷酸誘餌由Trilink Biotechnologies(CA)制造并被配制為10mM或15mM原液(Tris-pH 7.5，CaCl2)。對(duì)于選定的劑量遞送，以適當(dāng)濃度制備用于20μL注射的每種誘餌。以盲法方式和在即用型小瓶中將供寡核苷酸誘餌和媒介物對(duì)照(Tris-10mM，140mM NaCl，pH 7.5)提供至測(cè)試部位。
保留性神經(jīng)損傷(SNI)模型。以2L/分鐘用2％的O2中的異氟烷誘導(dǎo)麻醉，并用0.5％的O2中的異氟烷來維持麻醉。然后剃刮大鼠并且將其無菌地準(zhǔn)備用于手術(shù)?；谟蒁ecosterd等描述的方法(Decosterd和Woolf，2000)進(jìn)行保留性神經(jīng)損傷。簡(jiǎn)言之，切開左大腿的皮膚和筋膜，股二肌(m.biceps femoris)的兩頭擴(kuò)展，暴露坐骨神經(jīng)的3個(gè)末端分支。緊密結(jié)扎脛骨和腓總神經(jīng)，遠(yuǎn)端解剖以結(jié)扎，去除2-3mm的神經(jīng)干。腓腸分支完好無損。以分層方式封閉傷口。
慢性壓迫性損傷(CCI)模型。根據(jù)慢性壓迫性損傷模型(Bennett和Xie，1988)，通過經(jīng)過股二頭肌的鈍性解剖在大腿中部的水平暴露右側(cè)共同坐骨神經(jīng)。在坐骨三叉分枝附近，約12mm的神經(jīng)沒有粘附組織，并且四個(gè)結(jié)扎線以約1mm的間距松弛地圍繞所述神經(jīng)。所受影響的神經(jīng)的長(zhǎng)度為約6-8mm長(zhǎng)。注意綁扎結(jié)扎線，以使得當(dāng)用40倍放大倍數(shù)觀察時(shí)，看到神經(jīng)的直徑恰好幾乎不縊縮。期望的縊縮程度延遲但不阻止通過表面神經(jīng)脈管系統(tǒng)的循環(huán)，并且有時(shí)在暴露的周圍的肌肉中產(chǎn)生小的短暫的顫搐。在層中封閉切口。
機(jī)械超敏性。使用重復(fù)von Frey細(xì)絲測(cè)試將疼痛測(cè)量為機(jī)械超敏性。簡(jiǎn)言之，使用von Frey細(xì)絲(1-4-6-8-10-10-26g)測(cè)試對(duì)后爪機(jī)械刺激的反應(yīng)性。在測(cè)試前1小時(shí)，使動(dòng)物習(xí)慣在網(wǎng)孔地板上，并且每個(gè)細(xì)絲應(yīng)用五次。對(duì)于每個(gè)應(yīng)用，用足以引起輕微彎曲的垂直于爪壓靠毛發(fā)，并保持約1-2秒。如果爪急劇撤回，則注意到陽性反應(yīng)。在除去毛發(fā)后立即退縮也被認(rèn)為是陽性反應(yīng)。按照上述模式連續(xù)提供刺激。在手術(shù)前和注射前后的確定的時(shí)間點(diǎn)在基線測(cè)試動(dòng)物。
盲法和隨機(jī)化。所有實(shí)驗(yàn)都是盲法進(jìn)行的。測(cè)試地點(diǎn)接受盲法小瓶，并且盲測(cè)代碼在測(cè)試完成后破裂。
在基線疼痛測(cè)試后和給藥前在POD14進(jìn)行隨機(jī)化。對(duì)于每個(gè)測(cè)試的組群，將動(dòng)物分布在2至3只大鼠的組中，以使得平均POD14von Frey值盡可能接近測(cè)試組，如果值允許，靶向彼此的15％內(nèi)。一旦動(dòng)物被分成組，針對(duì)組的溶液處理的性質(zhì)是由實(shí)驗(yàn)者自行決定的。
預(yù)定義的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)。從結(jié)果分析排除在第一次注射當(dāng)天(即，POD14)具有≤5的von Frey值的動(dòng)物。為5的von Frey值基于跨多個(gè)測(cè)試部位的內(nèi)部歷史數(shù)據(jù)，其中大鼠可在基礎(chǔ)條件下，手術(shù)前達(dá)到該值，因此是模型誘導(dǎo)的超敏反應(yīng)的不存在/存在的閾值。如果在注射后的第一周期間，媒介物處理的機(jī)超敏性值的平均值減小50％或更多，則基于疼痛模型沒有適當(dāng)?shù)貓?zhí)行的理由排除該組群。
鞘內(nèi)遞送。鞘內(nèi)遞送寡核苷酸誘餌。將Sprague-Dawley大鼠用2％異氟烷麻醉，將其背部剃毛并用聚維酮碘(Betadine)來制備。然后將大鼠放在瓶上以保持背部拱起。將17G 1/2針沿著L6椎骨水平橫突的左側(cè)向嘴側(cè)滑動(dòng)，直至其達(dá)到L5椎骨水平。然后將針插入L5與L6之間，直至達(dá)到鞘內(nèi)空間，如通過尾部顫搐所指示的。然后鞘內(nèi)(IT)注射20μL的誘餌或媒介物。取決于研究，大鼠在手術(shù)后于POD14，或在POD14和在POD17接受單次IT注射一次。
統(tǒng)計(jì)分析。使用非參數(shù)學(xué)生T檢驗(yàn)，隨后通過不均勻方差校正的T-Welsh分析來分析個(gè)體時(shí)間點(diǎn)和實(shí)驗(yàn)條件之間的數(shù)據(jù)分布比較。
來自KLF結(jié)合ELISA分析以及利用單一劑量水平的誘餌的疼痛的CCI和SNI動(dòng)物模型的結(jié)果示于圖1-3B中。圖1顯示來自表2和E1的寡核苷酸誘餌相對(duì)于獨(dú)立對(duì)照KLF誘餌(以灰色突出顯示；參見，例如Shields和Yang，1998；Matsumuto等，1998)的KLF結(jié)合特征。針對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合值表示為來自實(shí)施例1中描述的體外ELISA結(jié)合測(cè)定的平均值和SEM OD450值。還列出了相應(yīng)的N。治療神經(jīng)性疼痛和/或神經(jīng)炎性疼痛的功效表示為在相應(yīng)動(dòng)物研究的測(cè)試期間相對(duì)于對(duì)照的疼痛減輕的百分比(％)。
圖2A-B顯示了測(cè)試的寡核苷酸誘餌在慢性神經(jīng)性疼痛的SNI模型中的功效，圖3A-B顯示了測(cè)試的寡核苷酸誘餌在慢性神經(jīng)炎性疼痛的CCI模型中的功效。
進(jìn)行體內(nèi)測(cè)試的所有寡核苷酸誘餌的組合體內(nèi)功效和體外結(jié)合結(jié)果的詳細(xì)薈萃分析，以表征KLF結(jié)合模式與寡核苷酸誘餌的功效之間的關(guān)系。圖4A-C顯示與它們的KLF15/KLF9結(jié)合比率相關(guān)的用于治療慢性神經(jīng)性疼痛的寡核苷酸誘餌的功效水平(4A)，用于治療慢性神經(jīng)性疼痛的功效與對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(4B)，以及與KLF15/KLF9結(jié)合比率相關(guān)的功效水平的線性回歸(4C)。
類似地，圖5A-C顯示與它們的對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的組合結(jié)合相關(guān)的用于治療慢性神經(jīng)炎性疼痛的寡核苷酸誘餌的功效水平(5A)，治療慢性神經(jīng)炎性疼痛的功效與對(duì)KLF6、KLF9和KLF15的結(jié)合參數(shù)之間的線性相關(guān)系數(shù)(5B)，和與對(duì)KLF6和KLF9的總轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合能力相關(guān)的功效水平(如通過1/(KLF6+KLF9)結(jié)合比率指示的)的線性回歸(5C)。
圖6顯示跨補(bǔ)充性病原性疼痛(從神經(jīng)性疼痛(Y-軸)至包括炎性組分的疼痛(X-軸))的來自本發(fā)明的誘餌相對(duì)于來自文獻(xiàn)的對(duì)照KLF共有誘餌(TFDC1、TFDC2和TFD3)的功效的差異和優(yōu)異模式。
圖7顯示表2中的寡核苷酸誘餌的1/(KLF6+KLF9)結(jié)合比率(其表示治療神經(jīng)炎性疼痛的功效)(越低，則功效越強(qiáng))和KLF15/KLF9結(jié)合比率(其指示治療神經(jīng)性疼痛的功效)(越高，則功效越強(qiáng)))的曲線圖。X軸中的每個(gè)數(shù)字對(duì)應(yīng)于個(gè)體誘餌。
為了進(jìn)一步表征16.6.5寡核苷酸誘餌的治療特征，在SNI和CCI動(dòng)物模型中進(jìn)行劑量反應(yīng)研究。圖8A-B顯示了在這兩種疼痛動(dòng)物模型中從50至300納摩爾的遞增劑量水平的穩(wěn)固和持久的功效。
總之，這些研究不僅鑒定將KLF轉(zhuǎn)錄因子的家族鑒定為用于治療疼痛的治療相關(guān)性靶標(biāo)，而且還相對(duì)于先前描述的KLF序列鑒定了一組寡核苷酸序列，所述寡核苷酸序列對(duì)KLF轉(zhuǎn)錄因子具有獨(dú)特的結(jié)合特征，所述結(jié)合特征與用于治療跨多個(gè)病因的體內(nèi)疼痛的獨(dú)特和強(qiáng)勁的潛力相關(guān)。
序列表
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<222> (17)..(17)
<223> n為a, c, g或t
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<221> misc_feature
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<220>
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atccttygmm tyykycnhhn nvnnymhwbv aw 32
<210> 2
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<213> 人工序列
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<223> KLF誘餌寡核苷酸
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<221> misc_feature
<222> (1)..(5)
<223> 核苷酸1-5可以存在或可以不存在
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<222> (12)..(12)
<223> n為a, c, g或t
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<223> n為a, c, g或t
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<223> n為a, c, g或t
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<222> (19)..(28)
<223> 核苷酸19-28可以存在或可以不存在
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ctatttcgaa acgatctaca ttggcataac 30
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