本發(fā)明涉及2,4-噻唑烷二酮衍生物作為藥物的新用途，尤其是用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。

發(fā)明背景

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(NS)障礙是腦和脊髓的任何部分的疾病。神經(jīng)系統(tǒng)障礙包括神經(jīng)系統(tǒng)在疾病整個(gè)進(jìn)展期間受到影響的障礙比如神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，退行性共濟(jì)失調(diào)比如Friedrich共濟(jì)失調(diào)，多發(fā)性硬化，多系統(tǒng)萎縮癥和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良)，腦血管病(例如全腦缺血或局部缺血，腦內(nèi)出血，卒中)，癲癇發(fā)作和癲癇，病毒病(例如腦膜炎，腦炎)，腦腫瘤和神經(jīng)炎性疾病。神經(jīng)系統(tǒng)障礙也包括神經(jīng)系統(tǒng)僅在障礙的最晚發(fā)展階段期間受到影響的障礙。這些障礙包含罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

神經(jīng)變性疾病的特征是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)或功能的進(jìn)行性損失，包括神經(jīng)元死亡。這些病況是進(jìn)行性且常常致命的。神經(jīng)變性的過(guò)程并未得到良好理解并且由其起源的疾病仍然無(wú)法治愈，盡管一直在尋求治療。

某些神經(jīng)變性疾病也包括炎性組成部分，比如多發(fā)性硬化，其傳統(tǒng)地視為炎性介導(dǎo)的脫髓鞘疾病但實(shí)際上是神經(jīng)變性疾病，其中軸索損害、神經(jīng)元死亡和中樞神經(jīng)系統(tǒng)萎縮是患者中不可逆神經(jīng)病廢的主要原因。從而，多發(fā)性硬化能夠視為神經(jīng)變性疾病但也是神經(jīng)炎性疾病或自身免疫性疾病。

腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良是一類(lèi)一般神經(jīng)系統(tǒng)障礙，其主要特征是腦中白質(zhì)退化。該類(lèi)的一種障礙是腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(X-關(guān)聯(lián)的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良或X-ALD)。這是罕見(jiàn)的遺傳障礙，其導(dǎo)致腦和其它組織的進(jìn)行性損害和最終死亡。該疾病能夠視為神經(jīng)變性和神經(jīng)炎性?xún)烧摺?/p>

X-ALD展示三種主要表型：(i)成人腎上腺髓周?chē)窠?jīng)病(AMN)，具有脊髓中的軸突病，(ii)大腦腎上腺髓周?chē)窠?jīng)病，具有腦脫髓鞘(cAMN)，和(iii)兒童期變種(cALD)，其特征是嚴(yán)重大腦脫髓鞘。X-ALD是最頻繁地遺傳的腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，其最小發(fā)生率為1/17000，包括半合子男性和攜帶者女性。

腦血管病是一類(lèi)腦功能障礙，其涉及供給腦的血管疾病。存在四種類(lèi)型：卒中，短暫性腦缺血發(fā)作(TIA)，蛛網(wǎng)膜下出血和血管性癡呆。

癲癇是不可預(yù)測(cè)的、嚴(yán)重的且能夠致命的神經(jīng)系統(tǒng)障礙。全世界約5千萬(wàn)人患癲癇。

腦腫瘤通過(guò)異常且不受控的細(xì)胞分裂產(chǎn)生，不僅在腦中(神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞)還在血管、顱神經(jīng)、腦膜、顱骨和垂體或松果腺中。腦腫瘤也包括從定位在其它器官中的原發(fā)癌細(xì)胞擴(kuò)散開(kāi)的那些(轉(zhuǎn)移)。

神經(jīng)系統(tǒng)病毒病由NS中病毒感染引起。這些感染能夠誘導(dǎo)神經(jīng)功能障礙和潛在嚴(yán)重的炎性疾病比如腦炎、腦本身的炎癥，引起腦膜炎癥的腦膜炎或意指脊髓炎癥的脊髓炎?？袢。檎?，腮腺炎，脊髓灰質(zhì)炎，單純性皰疹或水痘-帶狀皰疹是神經(jīng)系統(tǒng)病毒感染的類(lèi)型。

罕見(jiàn)的代謝病(也稱(chēng)為代謝先天錯(cuò)誤)通常是單基因疾病，其中某些代謝途徑被擾亂從而導(dǎo)致功能障礙，在許多情況中是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能障礙。它們是長(zhǎng)期性導(dǎo)致衰弱且威脅聲明的病況。

遺傳性線(xiàn)粒體疾病能夠由mtDNA或nDNA突變引起，其損傷線(xiàn)粒體功能和一般地從初生就引起很?chē)?yán)重的多系統(tǒng)疾病、包括NS上的嚴(yán)重表現(xiàn)。

對(duì)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的新治療存在迫切需要。

各式各樣的氘富集2,4-噻唑烷二酮已描述于US 2014/0275180。該文獻(xiàn)也公開(kāi)它們?cè)谥委煾鞣N不同疾病中的預(yù)測(cè)性用途。然而，該文獻(xiàn)未能提供在這方面或關(guān)于這些化合物穿越血腦屏障(BBB)的能力的任何證據(jù)。

吡格列酮是上市藥物，用于治療糖尿病類(lèi)型2。吡格列酮是過(guò)氧化物酶體增殖子-活化的受體-γ(PPARγ)的有效激動(dòng)劑并且其已被建議用于治療某些神經(jīng)變性疾病包括阿爾茨海默氏，帕金森病，ALS和Friedreich共濟(jì)失調(diào)。US2013/0274295公開(kāi)吡格列酮在治療X-ALD中的效用，基于臨床前數(shù)據(jù)。盡管臨床前模型顯示了有希望的結(jié)果，迄今的臨床試驗(yàn)未能顯示在任何一種這些極嚴(yán)重病況中的臨床益處。

此外，吡格列酮已關(guān)聯(lián)于不希望的副作用，包括心血管效果，流體保留，體重增加和膀胱癌。因此，高劑量吡格列酮是不希望的，原因在于高全身性暴露可能會(huì)引起嚴(yán)重副作用。

吡格列酮是"臟(dirty)"藥，其在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為許多代謝物。在口服給藥之后的吡格列酮代謝途徑已在數(shù)種動(dòng)物種類(lèi)和在人類(lèi)中研究，并且代謝物已描述于文獻(xiàn)中(參見(jiàn)例如Sohda et al,Chem.Pharm.Bull.,1995,43(12),2168-2172)和Maeshiba et al,Arzneim.-Forsch/Drug Res,1997,47(I),29-35)。至少六種代謝物已被鑒定，命名為M-I至M-VI。在這些代謝物中，M-II、M-III和M-IV顯示某些藥理學(xué)活性，但是在糖尿病性臨床前模型中比吡格列酮活性更低。

在向大鼠口服給藥[¹⁴C]-吡格列酮之后,吡格列酮及其代謝物在各種組織中的分布也已有研究(Maeshiba et al,Arzneim.-Forsch/Drug Res,1997,47(I),29-35)。在絕大多數(shù)組織中，吡格列酮和代謝物M-I至M-VI的濃度低于血漿中的濃度，并且最低放射性濃度之一存在于腦中，其中主要僅檢測(cè)到吡格列酮。

發(fā)明概要

令人驚訝地已發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙能夠通過(guò)下述治療：式(1)的5-[4-[2-(5-(1-羥基乙基)-2-吡啶基)乙氧基]芐基]-2,4-噻唑烷二酮，吡格列酮的M-IV代謝物。

或其鹽。

神經(jīng)系統(tǒng)障礙包括但不限于神經(jīng)系統(tǒng)在疾病全部進(jìn)展期間受到影響的障礙比如神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，退行性共濟(jì)失調(diào)，多系統(tǒng)萎縮癥和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良)，腦血管病(例如全腦缺血或局部缺血，腦內(nèi)出血，卒中)，癲癇發(fā)作和癲癇，病毒病(例如腦膜炎，腦炎)，多發(fā)性硬化，腦腫瘤和傷害。神經(jīng)系統(tǒng)障礙也包括神經(jīng)系統(tǒng)僅在病況發(fā)展的最晚階段受到影響的障礙，并且包括罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

本發(fā)明至少部分基于數(shù)據(jù)，其顯示式(1)化合物的出乎意料的越過(guò)血腦屏障的能力。此外，本發(fā)明化合物具有一種或多種希望的藥物特性比如良好的口服生物利用度，低全身性血漿清除率和良好的分布體積。另外，本發(fā)明化合物是合理地"干凈(clean)"藥物，原因在于它在體內(nèi)僅轉(zhuǎn)化為5-(4-(2-(5-乙酰基-2-吡啶基)乙氧基)芐基)-2,4-噻唑烷二酮(吡格列酮M-III代謝物)并且兩者都被排泄。由于不希望代謝物的副作用因此被最小化。

從而，根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或式(1)化合物的混合物，用作藥物尤其是用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或式(1)化合物的混合物用于制備藥物的用途，所述藥物尤其是用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括向有需要的受試者給藥有效量的式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或式(1)化合物的混合物。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供藥物組合物，其包含式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或式(1)化合物的混合物。

根據(jù)又一方面本發(fā)明提供新的化合物(2)至(5)：

(2)(R)-5-(4-(2-(5-((R)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(3)(R)-5-(4-(2-(5-((S)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(4)(S)-5-(4-(2-(5-((R)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(5)(S)-5-(4-(2-(5-((S)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

或其藥學(xué)上可接受的鹽

根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供化合物(2)至(5)中的一種或多種的混合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供化合物(2)至(5)中一種或多種或其藥學(xué)上可接受的鹽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。根據(jù)又一方面，本發(fā)明提供治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的方法，包括向有需要的受試者給藥有效量的化合物(2)至(5)中的一種或多種或其藥學(xué)上可接受的鹽。

在又一方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含式(2)至(5)的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，包括式(2)至(5)化合物的混合物，用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙。

在又一方面，本發(fā)明提供用于通過(guò)給藥式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一種或多種式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽來(lái)治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，所述障礙包括神經(jīng)變性疾病(比如阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，退行性共濟(jì)失調(diào)，多系統(tǒng)萎縮癥，多發(fā)性硬化和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良比如ALD)，腦血管病，癲癇發(fā)作，癲癇，病毒病，腦腫瘤，神經(jīng)炎性疾病，在病況發(fā)展的最晚階段影響神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)系統(tǒng)障礙、包括罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

附圖描述

圖1代表，在單次靜脈內(nèi)給藥1mg/Kg所述化合物之后，式(1)化合物在C57BL/6小鼠血漿中的濃度。

圖2代表，在單次口服給藥4.5mg/Kg所述化合物之后，式(1)化合物在C57BL/6小鼠血漿中的濃度。

圖3代表，在單次口服給藥4.5mg/Kg所述化合物之后(圓圈標(biāo)記的線(xiàn))和在單次靜脈內(nèi)給藥1mg/Kg所述化合物之后(方形標(biāo)記的線(xiàn))，式(1)化合物在C57BL/6小鼠腦組織中的濃度。

圖4代表，在雄性C57BL/6小鼠中、在口服給予單次施用的4.5mg/kg吡格列酮之后，基于血漿和腦中吡格列酮、MIV、MIII和MII水平計(jì)算的腦/血漿比例，所述水平在Cmax(最大濃度)定量。

圖5代表，在雄性C57BL/6小鼠中、在口服給予單次施用4.5mg/kg的吡格列酮或MIV之后，基于血漿和腦濃度-時(shí)間曲線(xiàn)的藥代動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)計(jì)算的腦/血漿比例，計(jì)算吡格列酮的曲線(xiàn)下面積。

圖6代表，在單次口服給藥4.5mg/Kg所述混合物之后，包含化合物(2)和(4)混合物(c)和包含化合物(3)和(5)的混合物(d)在C57BL/6小鼠血漿中的濃度。

圖7代表，式(1)化合物在谷氨酸損傷的原代大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元中的效果。

圖8代表，式(1)化合物在紫杉醇(Taxol)損傷的感覺(jué)神經(jīng)元的初級(jí)培養(yǎng)物中的效果。

圖9代表，式(1)化合物在多個(gè)小鼠模型的實(shí)驗(yàn)自免疫腦脊髓炎(EAE)的體內(nèi)效力研究的病廢得分中的效果。

圖10代表，式(1)化合物在谷氨酸損傷的原代運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中的效果。

優(yōu)選實(shí)施方式的描述

在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)"式(1)"化合物、"M-IV"、"MIV"和"M4"無(wú)差別地指5-[4-[2-(5-(1-羥基乙基)-2-吡啶基)乙氧基]芐基]-2,4-噻唑烷二酮，其具有上文描述的結(jié)構(gòu)。

在一個(gè)方面，給予式(1)化合物或藥學(xué)上可接受的鹽可用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙比如神經(jīng)變性疾病(例如阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，肌萎縮性側(cè)索硬化(ALS)，退行性共濟(jì)失調(diào)，多系統(tǒng)萎縮癥，多發(fā)性硬化(MS)和腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良，比如腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ALD或X-ALD)，腦血管病(例如全腦缺血或局部缺血，腦內(nèi)出血，卒中)，癲癇發(fā)作和癲癇，病毒病(例如腦膜炎，腦炎)，腦腫瘤和神經(jīng)炎性疾病。神經(jīng)系統(tǒng)障礙也包括神經(jīng)系統(tǒng)僅在障礙發(fā)展的最晚階段受到影響的障礙。這些障礙包含罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

術(shù)語(yǔ)"治療"或"醫(yī)療"在本說(shuō)明書(shū)的上下文中意指改善或消除疾病或與所述疾病有關(guān)的一種或多種癥狀。"治療"也涵蓋改善或消除疾病的生理學(xué)后遺癥。

術(shù)語(yǔ)"改善"在本發(fā)明的上下文中理解為意指對(duì)治療患者的情況的任何改善。

術(shù)語(yǔ)"預(yù)防"或"防范"是指降低患上或發(fā)展給定疾病或障礙的風(fēng)險(xiǎn)，或降低或抑制疾病或障礙的復(fù)發(fā)。

式(1)化合物能夠命名為5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮并且具有兩個(gè)手性中心。其中之一是噻唑烷-二酮環(huán)5-位的碳原子，而另一個(gè)不對(duì)稱(chēng)原子位于羥基乙基的1位，如箭頭顯示：

如本文所用術(shù)語(yǔ)"式(1)"化合物用來(lái)指定全部可能立體異構(gòu)體，包括其對(duì)映體和非對(duì)映體，和混合物、包括外消旋混合物。

在又一方面，本發(fā)明提供新的化合物(2)至(5)：

(2)(R)-5-(4-(2-(5-((R)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(3)(R)-5-(4-(2-(5-((S)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(4)(S)-5-(4-(2-(5-((R)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

(5)(S)-5-(4-(2-(5-((S)-1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

盡管化合物(2)至(5)已制備和分離，其絕對(duì)(R/S)構(gòu)型并未確定并且僅其旋光已確定。

優(yōu)選，在本發(fā)明中提及化合物(1)至(5)期望指定化合物(1)至(5)，其具有主要呈其同位素¹H形式的氫原子，也即不超過(guò)1％的氫原子總數(shù)每摩爾化合物呈²H同位素形式(氘)，更優(yōu)選不超過(guò)0.015％(是氘的天然豐度)氫原子總數(shù)每摩爾化合物呈²H同位素形式(氘)。

在特別的實(shí)施方式中，化合物(2)至(5)的下述混合物是優(yōu)選的：

(a)包含化合物(2)和(3)的混合物，優(yōu)選化合物(2)和(3)是混合物中僅存在的式(1)化合物；

(b)包含(4)和(5)的混合物，優(yōu)選化合物(4)和(5)是混合物中僅存在的式(1)化合物；

(c)包含(2)和(4)的混合物，優(yōu)選化合物(2)和(4)是混合物中僅存在的式(1)化合物；和

(d)包含(3)和(5)的混合物，優(yōu)選化合物(3)和(5)是混合物中僅存在的式(1)化合物。

混合物(c)和(d)是特別優(yōu)選的。

在上文提及的混合物(a)至(d)中特別優(yōu)選的是，在各混合物提及的兩種化合物以等摩爾量存在。所述混合物可以也包含次要量的(優(yōu)選小于10wt.％，更優(yōu)選小于3wt％，還更優(yōu)選小于1wt.％和最優(yōu)選小于0.1wt.％的)其它式(1)化合物。

本發(fā)明的又一方面提供化合物(2)至(5)或其藥學(xué)上可接受的鹽或混合物(a)至(d)或其藥學(xué)上可接受的鹽，用作藥物。本發(fā)明化合物能夠用來(lái)治療疾病比如中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙等。

為了用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，在選擇優(yōu)選化合物時(shí)可以考慮數(shù)種因素。顯示高腦-至-血漿暴露的化合物是優(yōu)選的。優(yōu)選化合物顯示有效的PPAR-γ激動(dòng)劑活性，但是具有更低效的PPAR-γ激動(dòng)劑活性的化合物也是有用的。為了選擇優(yōu)選化合物還可以考慮其它因素，包括但不限于藥理學(xué)活性(不同于PPAR-γ)，ADME，藥代動(dòng)力學(xué)特征，毒性，安全性，腦分布特性，組織中的化合物蓄積，化合物代謝和清除率，清除率的基因型變化和物理化學(xué)特性。優(yōu)選化合物具有低中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。優(yōu)選化合物具有低全身性毒性。還可以考慮存在或不存在PPARα活性。在某些情況下希望化合物引起低腦蓄積或無(wú)腦蓄積。這能夠降低中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性的風(fēng)險(xiǎn)和/或允許藥物效果在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中快速反轉(zhuǎn)。在另外的情況下，有限全身性暴露的高腦蓄積可以是優(yōu)選的。這能夠引起對(duì)藥物的更高中樞神經(jīng)系統(tǒng)暴露和較高效力。對(duì)化合物常常有利的是并無(wú)顯著的清除率的基因型變化。這引起更一致的效力。這些活性可以通過(guò)使用適當(dāng)?shù)捏w外和體內(nèi)測(cè)試來(lái)確定。

在又一方面，本發(fā)明提供用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的方法，所述障礙包括神經(jīng)變性疾病，腦血管病，癲癇發(fā)作，癲癇，病毒病，腦腫瘤和神經(jīng)炎性疾病。此方面也包括通過(guò)給藥式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或通過(guò)給藥一種或多種式(2)至(5)化合物的混合物用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)僅在障礙發(fā)展的最晚階段受到影響的中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙、包括罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙的方法。

本發(fā)明的又一方面涉及式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一種或多種式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或混合物(a)至(d)或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙，包括神經(jīng)變性疾病，腦血管病，癲癇發(fā)作，癲癇，病毒病，腦腫瘤和神經(jīng)炎性疾病。此方面也包括式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一種或多種式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或混合物(a)至(d)或其藥學(xué)上可接受的鹽，用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)僅在障礙發(fā)展的最晚階段受到影響的中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙、包括罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

本發(fā)明的又一方面涉及式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一種或多種式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或混合物(a)至(d)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療或預(yù)防中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙包括神經(jīng)變性疾病，腦血管病，癲癇發(fā)作，癲癇，病毒病，腦腫瘤和神經(jīng)炎性疾病。此方面也包括式(1)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或一種或多種式(2)至(5)化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，或混合物(a)至(d)或其藥學(xué)上可接受的鹽，其用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)僅在障礙發(fā)展的最晚階段受到影響的中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙、包括罕見(jiàn)的代謝病比如有機(jī)酸血癥或脂肪酸障礙和遺傳性線(xiàn)粒體障礙。

在上述本發(fā)明上述本發(fā)明方面的特別實(shí)施方式中，障礙選自神經(jīng)變性疾病，腦血管病，癲癇發(fā)作，癲癇，病毒病和腦腫瘤；更優(yōu)選地障礙是神經(jīng)變性疾??；更優(yōu)選地障礙選自阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病，F(xiàn)riedreich共濟(jì)失調(diào)，ALS多發(fā)性硬化和X-ALD；更優(yōu)選地障礙選自阿爾茨海默病，亨廷頓舞蹈病，帕金森病或多發(fā)性硬化；更優(yōu)選地障礙是多發(fā)性硬化；更優(yōu)選地障礙是腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良比如腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良(ALD或X-ALD)。

在上述本發(fā)明方面的其它特別實(shí)施方式中，障礙是腦血管病。

優(yōu)選化合物或化合物的混合物可以選擇用于特別的遞送途徑。某些化合物或化合物的混合物還可以基于其治療特別疾病的用途是優(yōu)選的。

本發(fā)明化合物能夠呈藥學(xué)上可接受的鹽的形式。術(shù)語(yǔ)"藥學(xué)上可接受的鹽"是指制備自藥學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸和有機(jī)酸的鹽。

本發(fā)明化合物的示例性的藥學(xué)上可接受的酸加成鹽能夠制備自下述酸，包括但不限于甲酸，乙酸，丙酸，苯甲酸，乙酸，丙酸，苯甲酸，琥珀酸，羥基乙酸，葡糖酸，乳酸，馬來(lái)酸，蘋(píng)果酸，酒石酸，檸檬酸，硝酸，抗壞血酸，葡糖醛酸，馬來(lái)酸，富馬酸，丙酮酸，天冬氨酸，谷氨酸，苯甲酸，鹽酸，氫溴酸，氫碘酸，異檸檬酸，鄰羥基萘甲酸，酒石酸，三氟乙酸，雙羥萘酸，丙酸，鄰氨基苯甲酸，甲磺酸，萘二磺酸鹽，草乙酸，油酸，硬脂酸，水楊酸，對(duì)-羥基苯甲酸，煙酸，苯基乙酸，杏仁酸，撲酸(雙羥萘酸)，甲磺酸，磷酸，膦酸，乙磺酸，苯磺酸，泛酸，甲苯磺酸，2-羥基乙磺酸，對(duì)氨基苯磺酸，硫酸，水楊酸，環(huán)己基氨基磺酸，藻酸，β-羥基丁酸，粘酸和半乳糖醛酸。示范性藥學(xué)上可接受的鹽包括鹽酸和氫溴酸的鹽。

式(1)化合物包括立體異構(gòu)體(2)至(5)、混合物(a)至(d)及其藥學(xué)上可接受的鹽的效用能夠展示于適當(dāng)?shù)娜鐚?shí)施例所述的體外或體內(nèi)測(cè)試中。

在也向患者給予一種或多種其它治療劑或與其組合給予的情況下，根據(jù)本發(fā)明可以使用本發(fā)明化合物或藥學(xué)上可接受的鹽，所述其它治療劑選自抗炎劑和鎮(zhèn)痛劑，多巴胺激動(dòng)劑(例如左旋多巴)，MAO-B抑制劑，兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)抑制劑，抗膽堿能藥，其它抗帕金森病藥物(例如金剛烷胺)，抗NMDA受體(例如美金剛)，膽堿酯酶抑制劑，ACE抑制劑，谷氨酸拮抗劑(例如利魯唑)，抗氧化劑，免疫調(diào)節(jié)劑(例如芬戈莫德，抗CD52，CD25和CD20單克隆抗體，干擾素-β-1a，那他珠單抗，拉喹莫德，二甲基富馬酸酯)化療藥物，酶替換治療劑，底物減少治療劑，皮質(zhì)類(lèi)固醇，抗增殖藥(例如甲氨蝶呤)，抗驚厥藥，抗凝藥，抗高血壓藥和神經(jīng)保護(hù)藥。在患者進(jìn)行基因療法、骨髓移植、深腦刺激或放射療法的情況下，還可以使用本發(fā)明化合物。

包含化合物(2)至(5)、混合物(a)至(d)或藥學(xué)上可接受的鹽的藥物組合物代表本發(fā)明的又一方面。能夠采用任何適宜給藥途徑。例如，口服，口內(nèi)，局部，表皮，皮下，透皮，肌內(nèi)，腸胃外，眼，直腸，陰道，吸入，頰，舌下和鼻內(nèi)遞送途徑中任何一種可以是適宜的?？诜o藥可以是優(yōu)選的。藥物組合物的口服形式可以是固體或液體。適宜的劑型可以是片劑，膠囊，丸劑，顆粒劑，懸浮液，乳液，糖漿劑或溶液。優(yōu)選，藥物組合物是選自片劑，膠囊，丸劑或顆粒劑的固體形式。特別優(yōu)選的是片劑?？诜芤夯驊腋∫阂彩莾?yōu)選的。在患者有吞咽困難時(shí)(例如作為疾病的結(jié)果或用于老年和兒科用途)這些是有利的。舌下制劑也是有利的。

藥物或藥理學(xué)活性劑的"有效"量或"治療有效量"意指提供希望效果的藥物或試劑的無(wú)毒但是足夠的量。"有效"量在受試者中各不相同，取決于個(gè)體的年齡和一般條件、特別的活性劑或試劑等。從而，并非總是可能指定精確的"有效量"。然而，在任何單獨(dú)情況下本領(lǐng)域普通技術(shù)人員用慣例實(shí)驗(yàn)可以確定適當(dāng)?shù)?有效"量。從而，活性劑的劑量取決于病況的性質(zhì)和程度，患者的年齡和狀況，和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它因素。典型日劑量是0.1至200mg，優(yōu)選20至200mg，例如對(duì)于成人將10-100mg作為單劑量提供而不再進(jìn)一步給藥或者以多劑量提供例如1至3次/天。本文描述的化合物還可以以80至600mg的日劑量給予。

藥物組合物可以含有本領(lǐng)域已知的常規(guī)賦形劑和可以通過(guò)常規(guī)方法制備。

藥物組合物可以還包含一種或多種治療劑。聯(lián)合治療可以通過(guò)相同或不同的途徑同時(shí)、依次或分開(kāi)地給予，或者在外科或干預(yù)程序之前、在外科或干預(yù)程序期間和在外科或干預(yù)程序之后給予。

本發(fā)明化合物可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的任何適宜方法和/或通過(guò)描述如下的過(guò)程制備。也應(yīng)認(rèn)識(shí)到的是，存在于描述的各種化合物中且希望保留的官能團(tuán)比如氨基或羥基可以需要在引發(fā)任何反應(yīng)之前處于被保護(hù)的形式。在這種情況下，除去保護(hù)基團(tuán)可以是特別反應(yīng)中的最終步驟。對(duì)于所述官能團(tuán)的適宜保護(hù)基團(tuán)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)將是明顯的。特定細(xì)節(jié)可參考"Protective Groups in Organic Synthesis",Wiley Interscience,T W Greene,PGM Wuts。獲得的最終產(chǎn)品或中間體的任何混合物能夠基于組分的物理化學(xué)差異以已知方式分離為純的最終產(chǎn)品或中間體，例如通過(guò)色譜法、蒸餾、分步結(jié)晶或者通過(guò)形成鹽(如果在這種情況下適當(dāng)或可能的)來(lái)進(jìn)行。

根據(jù)本發(fā)明的化合物可以通過(guò)下述或相似的過(guò)程制備。

式(1)化合物5-[4-[2-(5-(1-羥基乙基)-2-吡啶基)乙氧基]芐基]-2,4-噻唑烷二酮能夠根據(jù)方案1制備(參見(jiàn)例如J.Med.Chem.1996，39(26),5053)。

方案1

在其它途徑當(dāng)中，本發(fā)明的化合物(2)和(4)的混合物或化合物(3)和(5)的混合物可以如方案1制備，但是使用對(duì)映體純的醇(IIa)和(IIb)作為原料。

式(IIa)和(IIb)中間體能夠從外消旋醇(II)通過(guò)一種或多種下述程序制備為單個(gè)對(duì)映體(方案2)：

a)HPLC手性色譜法分離，采用市場(chǎng)上可獲得的手性柱。

b)酶法拆分用酶比如脂酶處理異構(gòu)混合物，其將異構(gòu)體之一乙?；Ｏ铝硪划悩?gòu)體未反應(yīng)。兩種異構(gòu)體能夠然后容易地分離。

c)通過(guò)用拆分劑處理異構(gòu)混合物并且通過(guò)結(jié)晶或通過(guò)普通柱色譜法分離所得非對(duì)映異構(gòu)體。

方案2

通過(guò)手性合成作為單個(gè)對(duì)映體制備中間體(IIa)和(IIb)的備擇方法，用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適當(dāng)?shù)氖中赃€原劑處理式(I)底物。

制備混合物(c)-包含化合物(2)和(4)-和(d)-包含化合物(3)和(5)–的又一方法(方案3)，包括用已經(jīng)描述的方法(手性HPLC分離，酶法拆分，手性拆分等)拆分外消旋混合物VIII、隨后在各對(duì)映體VIIIa和VIIIb中進(jìn)行雙鍵還原。

方案3

本發(fā)明的混合物(b)(包含式(4)化合物和(5))和混合物(a)(包含式(2)化合物和(3))可以制備如下：在手性配體存在下用例如銠或銥催化劑不對(duì)稱(chēng)氫解式VI化合物，如方案4所示。雙鍵的手性還原還可以用生物催化劑(例如深紅酵母(Rhodotorula rubra)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis))進(jìn)行。

方案4

式(2)、(3)、(4)和(5)化合物可以通過(guò)手性HPLC分離得自混合物(c)和(d)(方案45)。另選地，所希望的對(duì)映體純的化合物能夠通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的手性合成程序(例如：不對(duì)稱(chēng)氫解化合物VI的相應(yīng)單一異構(gòu)體)來(lái)制備。

方案5

縮寫(xiě)：

●ACE：血管緊張素-轉(zhuǎn)化酶

●ADME：吸收，分布，代謝和排泄

●ALS：肌萎縮性側(cè)索硬化

●AMN：腎上腺髓周?chē)窠?jīng)病

●AUC：曲線(xiàn)下面積

●C57BL/6小鼠：C57黑色6小鼠

●cALD：ALD的大腦變種

●cAMN：大腦腎上腺髓周?chē)窠?jīng)病

●CD20：B-淋巴細(xì)胞抗原CD20

●CD25：IL-2受體的α鏈

●CD52：分化抗原簇52

●cDNA：互補(bǔ)的脫氧核糖核酸

●Cmax：給藥后的血漿濃度峰值。

●COMT：兒茶酚O-甲基轉(zhuǎn)移酶

●DEAD：二乙基偶氮二羧酸酯

●EC₅₀：半最大有效濃度

●hERG：人類(lèi)醚-α-go-go-相關(guān)性基因

●HPLC：高效液相色譜

●LLOQ：定量下限

●MAO-B：?jiǎn)伟费趸窧

●mtDNA：線(xiàn)粒體脫氧核糖核酸

●NMDA：N-甲基-D-天冬氨酸

●nDNA：核脫氧核糖核酸

●NS：神經(jīng)系統(tǒng)

●Ph：苯基

●PPARγ：過(guò)氧化物酶體增殖子-活化的受體-γ

●qPCR：定量的聚合酶鏈反應(yīng)

●TIA：短暫性腦缺血發(fā)作

●Tmax：達(dá)到Cmax的時(shí)間

●VSS：穩(wěn)態(tài)的表觀(guān)分布體積

●X-ALD：X-關(guān)聯(lián)的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良

下述實(shí)施例支持本發(fā)明。

實(shí)施例1：藥代動(dòng)力學(xué)特征和腦分布

方案：在單次口服(4.5mg/kg)和靜脈內(nèi)(1mg/kg)劑量給藥至雄性C57BL/6小鼠之后，確定5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(外消旋體或立體異構(gòu)體)的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和腦分布。對(duì)于口服和靜脈內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)，在劑量給藥前和劑量給藥后的不同時(shí)間收集血液樣品和腦樣品。為了分析用乙腈進(jìn)行蛋白質(zhì)沉淀處理全部樣品，并且用適合目的的LC/MS/MS方法分析。在血漿和腦中的5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(1)定量下限(LLOQ)是0.99ng/mL。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)用Phoenix WinNonlin的無(wú)隔室分析工具來(lái)計(jì)算。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖1，圖2和圖3。數(shù)據(jù)清楚地展示5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)-噻唑烷-2,4-二酮(1)展示良好的藥代動(dòng)力學(xué)特征，低全身性的血漿清除率和可接受的分布體積(Vss)，其腦-血漿比率暴露為0.12。

于1mg/kg劑量單次靜脈內(nèi)給藥外消旋5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(圖1)至C57BL/6小鼠之后，化合物展示的低全身性血漿清除率(11.79mL/min/kg，小鼠中的普通肝血液流量＝90mL/min/kg)，其終點(diǎn)消除血漿半衰期是1.79小時(shí)。V_SS是總身體水的普通體積的2倍高(0.7L/kg)。

于4.5mg/kg劑量單次口服給藥外消旋5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(1)至C57BL/6小鼠之后(圖2)，觀(guān)察血漿濃度直至24小時(shí)(1只動(dòng)物)。血漿中的Tmax是0.50小時(shí)?？诜锢枚仁?5％。

圖3顯示的是，對(duì)于靜脈內(nèi)和口服藥代動(dòng)力學(xué)特征觀(guān)察腦濃度直至8小時(shí)。腦中的Tmax是0.50小時(shí)，其腦-與-血漿暴露(AUClast)比率是0.12。

這些結(jié)果指出，5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮具有有利的藥代動(dòng)力學(xué)特征，包括良好的口服生物利用度和0.12的腦-與-血漿暴露比率，從而化合物有意義地越過(guò)血腦屏障。

實(shí)施例2：作用機(jī)理：體外藥理學(xué)

方案：為了確定通過(guò)激動(dòng)PPARγ的作用機(jī)理，細(xì)胞功能測(cè)試用PPRE螢光素酶報(bào)告子共轉(zhuǎn)染的人類(lèi)重組細(xì)胞系，PPAR-.γ.，RXR-α和共活化劑DRIP205進(jìn)行。

轉(zhuǎn)染的細(xì)胞用增加劑量的化合物處理。螢光素酶活性通過(guò)alphascreen技術(shù)檢測(cè)和基于β-半乳糖苷酶活性標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果表示為相對(duì)對(duì)照(羅格列酮10μM)的誘導(dǎo)倍數(shù)。獲得劑量響應(yīng)曲線(xiàn)。結(jié)果計(jì)算為EC₅₀，其是激起50％對(duì)照激動(dòng)劑應(yīng)答的化合物的濃度。

EC₅₀外消旋5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮＝9.3μM

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果指出的是，外消旋5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮及其立體異構(gòu)體具有變化的PPARγ激動(dòng)劑活性，具有一系列EC₅₀。這些數(shù)據(jù)顯示，這些化合物活化PPARγ受體和因而取決于該活化的生物學(xué)功能。

實(shí)施例3

一般實(shí)驗(yàn)條件：

¹H譜圖在400MHz Varian NMR光譜儀上記錄，用適當(dāng)?shù)碾軇?。化合物的色譜分析用如下所示的適當(dāng)方法進(jìn)行。

LCMS方法

柱：Agilent Zorbax 3.5μm，SB-C8(4.6×75mm)；波長(zhǎng)：210nm；流速：1mL/min；運(yùn)行時(shí)間：7分鐘；流動(dòng)相-梯度(t/％B)：0/30，3.5/95，5/95，5.5/30，7/30[A：水(0.1％甲酸)；B：乙腈]；質(zhì)量：Agilent-單四級(jí)桿-多模式-APCI-ESI。

手性HPLC方法

柱：Chiralpak-IA 5μm(4.6mm x 250mm)；波長(zhǎng)：210nm；流速：0.7mL/min；運(yùn)行時(shí)間：30分鐘；流動(dòng)相-等度：65/35(A/B)[A：正-己烷(0.05％三乙胺和0.1％三氟乙酸)，B：異丙醇]。

手性制備型HPLC方法

柱：Chiralpak-IA 5μm(250×20mm)；波長(zhǎng)：254nm；流速：18ml/min；運(yùn)行時(shí)間：60分鐘；流動(dòng)相-等度50/50(A/B)：A：正-己烷，B：EtOH(0.05％三乙胺)。

HPLC方法

柱：Symmetry Shield RP-18，5μm(4.6×250mm)；波長(zhǎng)：210nm；流速：1mL/min；運(yùn)行時(shí)間：28分鐘；流動(dòng)相-梯度：(t/％B)：0/10，8/10，12/60，16/80，20/80，24/10，28/10[A：水(磷酸二氫鉀(pH～3))，B：乙腈]

實(shí)施例4：5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(1)根據(jù)方案6制備。

方案6

1-(6-甲基-吡啶-3-基)-乙醇(II)

在-50℃，將LiHMDS(1.0M，在四氫呋喃中，463ml，0.463mol)滴加至冷卻的6-甲基煙酸甲酯(20g，0.132mol)和乙酸乙酯(82g，0.927mol)的二甲基甲酰胺溶液；逐漸提高溫度至r.t.，在該溫度攪拌。在1小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物冷卻至0℃；緩慢地用20％硫酸稀釋和加熱至回流。在4小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物冷卻至r.t.并進(jìn)一步至0℃，用碳酸鉀堿化。反應(yīng)介質(zhì)用水稀釋?zhuān)谝宜嵋阴ブ休腿?3x50ml)。合并的有機(jī)萃取物在硫酸鈉上干燥和濃縮，提供粗制1-(6-甲基吡啶-3-基)乙-1-酮(化合物I)(20.0g)，將其不加任何純化地用于后續(xù)步驟。

ES-MS[M+1]+：136.1

在30分鐘內(nèi)，在0℃將硼氫化鈉(2.3g，0.06mol)分小批加入化合物I(16.4g，0.121mol)的乙醇(160ml)溶液，在相同溫度攪拌反應(yīng)混合物。在1小時(shí)之后，反應(yīng)混合物用碳酸氫鈉溶液(飽和)稀釋(2x200ml)和用二氯甲烷萃取(2x500ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水硫酸鈉上干燥和濃縮，提供淡黃色油狀物，將其通過(guò)快速柱色譜法(5％甲醇/二氯甲烷)純化，提供化合物II(17.0g；93％2步收率)，是淡黃色油狀物。

ES-MS[M+1]+：138.1

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.35(d，J＝2.0Hz，1H)，7.63(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.12(d，J＝8.0Hz，1H)，4.89(q，J＝6.5Hz，1H)，3.30(br s，1H)，2.50(s，3H)，1.48(d，J＝6.5Hz，3H)

5-(1-甲氧基甲氧基-乙基)-2-甲基-吡啶(III)

將化合物II(15g，0.109mol)滴加冷卻的氫化鈉(6.56g，0.164mol)的四氫呋喃(150ml)懸浮液和在0℃攪拌。在30分鐘之后，在攪拌下滴加氯甲基甲基醚(13.2g，0.164mol)和將內(nèi)部溫度保持在約0℃。在加入完成之后，在相同溫度攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。反應(yīng)用冰冷水(80ml)淬滅，用乙酸乙酯萃取(3x50ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水硫酸鈉上干燥和濃縮，提供橙色油狀物，將其通過(guò)快速柱色譜法(1％甲醇/二氯甲烷)純化，提供化合物III(10.0g；51％收率)，是淡黃色油狀物。

ES-MS[M+1]+：182.2

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.45(d，J＝2.0Hz，1H)，7.56(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.14(d，J＝8.0Hz，1H)，4.75(q，J＝6.4Hz，1H)，4.57(ABq，2H)，3.36(s，3H)，2.53(s，3H)，1.48(d，J＝6.6Hz，3H)

2-[5-(1-甲氧基甲氧基-乙基)-吡啶-2-基]-乙醇(IV)

在密封玻璃管中，將化合物III(7.0g，0.0386mol)和37％甲醛溶液(5.8g，0.077mol)的混合物加熱至160℃持續(xù)5小時(shí)。將反應(yīng)混合物冷卻至r.t.和減壓濃縮，提供粗制化合物，將其通過(guò)快速柱色譜法(1％甲醇/二氯甲烷)純化，提供化合物IV(1.2g；17％收率)，是淡黃色油狀物。

ES-MS[M+1]+：212.1

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)：δ8.42(d，J＝2.0Hz，1H)，7.65(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.25(d，J＝8.0Hz，1H)，4.72(q，J＝6.6Hz，1H)，4.65(t，J＝5.6Hz，1H)，4.52(ABq，2H)，3.73(m，2H)，3.24(s，3H)，2.86(t，J＝7.2Hz，2H)，1.49(d，J＝6.4Hz，3H)。

4-{2-[5-(1-甲氧基甲氧基-乙基)-吡啶-2-基]-乙氧基}-苯甲醛(V)

在0℃，將甲磺酰氯(1.19g，0.01mol)滴加至冷卻的化合物IV(1.7g，0.008mol)和三乙胺(1.79ml，0.013mol)的二氯甲烷(20ml)懸浮液和在相同溫度攪拌1小時(shí)。反應(yīng)混合物用水稀釋(50ml)和用二氯甲烷萃取(3x50ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水硫酸鈉上干燥和濃縮，提供2-(5-(1-(甲氧基甲氧基)乙基)吡啶-2-基)乙基甲磺酸酯(2.04g；88％收率)，是黃色油狀物，將其不加純化地用于后續(xù)步驟。

ES-MS[M+1]+：290

將2-(5-(1-(甲氧基甲氧基)乙基)吡啶-2-基)乙基甲磺酸酯加入(2.3g，0.008mol)攪拌的4-羥基苯甲醛(1.65g，0.0137mol)和碳酸鉀(1.86g，0.0137mol)在甲苯(25ml)和乙醇(25ml)混合物中的懸浮液；在85℃攪拌5小時(shí)。在消耗原料之后，反應(yīng)混合物用水稀釋(30ml)和用乙酸乙酯萃取(2x100ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物用水洗滌；在無(wú)水硫酸鈉上干燥和濃縮，提供粗制深黃色液體。粗制品通過(guò)快速柱色譜法(1％甲醇/二氯甲烷)純化，提供化合物V(1.5g；60％收率)，是淡黃色液體。

ES-MS[M+1]+：316.1

5-(4-{2-[5-(1-甲氧基甲氧基-乙基)-吡啶-2-基]-乙氧基}-亞芐基)-噻唑烷-2,4-二酮(VI)

將哌啶(80mg，0.95mmol)加入化合物V(0.6g，1.9mmol)和噻唑烷-2,4-二酮(0.22g，1.9mmol)的乙醇(15ml)溶液和加熱混合物至回流過(guò)夜。在15小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物冷卻至r.t.和減壓濃縮，提供粗制混合物，將其通過(guò)快速柱色譜法(2％甲醇/二氯甲烷)純化，提供化合物VI(500mg；64％收率)，是黃色固體。

ES-MS[M+1]+：415.1

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.25(br s，1H)，8.47(d，J＝2.0Hz，1H)，7.70(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.54(d，J＝8.8Hz，2H)，7.36(d，J＝8.0Hz，1H)，7.21(d，J＝8.8Hz，2H)，4.73(m，1H)，4.60-4.40(m，4H)，4.22(t，J＝6.2Hz，1H)，3.24(s，3H)，3.20(t，J＝6.8Hz，2H)，1.41(d，J＝6.0Hz，3H)。

5-(4-{2-[5-(1-羥基-乙基)-吡啶-2-基]-乙氧基}-芐基)-噻唑烷-2,4-二酮(1)

在10℃，將硼氫化鈉(115mg，3.017mmol)的0.2N氫氧化鈉(1.2ml)溶液緩慢地加入攪拌的化合物VI(0.5g，1.207mmol)，丁二酮肟(42mg，0.36mmol)和CoCl₂.6H₂O(23mg，0.096mmol)在水(6ml)溶液：四氫呋喃(6ml)和1M氫氧化鈉(1ml)混合物中的溶液，在加入之后于r.t.攪拌反應(yīng)混合物。在1小時(shí)之后，反應(yīng)顏色變亮,加入額外量的硼氫化鈉(46mg，1.207mmol)和CoCl₂.6H₂O(22mg，0.096mmol)和在r.t.繼續(xù)攪拌。在12小時(shí)之后，反應(yīng)用乙酸中和(pH～7)；用水稀釋(10ml)和在乙酸乙酯中萃取(3x50ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水硫酸鈉上干燥和濃縮，提供粗制化合物VII，5-(4-(2-(5-(1-(甲氧基甲氧基)乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(0.4g)，是淡黃色半固體，將其不加純化地用于后續(xù)步驟。

ES-MS[M+1]+：417.5

將2N HCl(2ml)加入化合物VII(0.4g，0.96mmol)的甲醇(20ml)溶液和加熱混合物至回流。在4小時(shí)之后，將反應(yīng)混合物冷卻至r.t.；減壓濃縮，提供殘余物，將其溶于水，溶液用碳酸氫鈉溶液(飽和)中和。過(guò)濾收集所得白色沉淀，提供化合物1(250mg；56％2步收率)，是灰白色固體。

ES-MS[M+1]+：373.4

¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.00(br s，-NH)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H)，7.66(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.30(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝8.4Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，5.25(d，J＝4.4Hz，1H)，4.86(m，1H)，4.75(m，1H)，4.30(t，J＝6.8Hz，2H)，3.30(m，1H)，3.14(t，J＝6.4Hz，2H)，3.04(m，1H)，1.34(d，J＝6.4Hz，3H)。

實(shí)施例5(化合物(2)和(4)的混合物(c))和(化合物(3)和(4)的混合物(c))

化合物(2)和(4)的混合物(混合物(c))和化合物(3)和(5)的混合物(混合物(d))根據(jù)方案7制備。

方案7

將(Z)-5-(4-(2-(5-(1-(甲氧基-甲氧基)乙基)吡啶-2-基)乙氧基)亞芐基)噻唑烷-2,4-二酮(化合物VI)的甲基氯甲基醚基團(tuán)如下除去：用含水HCl處理，產(chǎn)生外消旋醇VIII。

包含于(Z)-5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)亞芐基)噻唑烷-2,4-二酮(VIII)外消旋混合物中的對(duì)映體通過(guò)HPLC手性色譜法分離，產(chǎn)生(R)-VIII和(S)-VIII。

(R)-VIII然后用還原混合物(CoCl₂-6H₂O、丁二酮肟、NaOH、硼氫化鈉)，(修飾的Pfaltz共軛還原方案)處理，產(chǎn)生包含化合物(2)和(4)的混合物(c)。

(S)-VIII然后用還原混合物(CoCl₂-6H₂O、丁二酮肟、NaOH、硼氫化鈉)，(修飾的Pfaltz共軛還原方案)處理，產(chǎn)生包含化合物(3)和(5)的混合物(d)。

實(shí)施例6：制備M-IV的非對(duì)映體混合物D-1和D-2：

方案1：

步驟1：合成化合物VIII：將HCl(48ml，2N)加入化合物VI(10g，0.024mol)的甲醇(200ml)溶液和加熱混合物至回流。在4小時(shí)回流之后，將反應(yīng)混合物冷卻至r.t.和減壓濃縮，提供黃色固體。將固體懸浮于水中(70ml)和用飽和NaHCO₃溶液中和。過(guò)濾收集所得淡黃色沉淀和真空干燥，提供化合物VIII(7.5g；84％收率)。

ES-MS[M+1]⁺：371.0。

步驟2：手性制備型HPLC

將化合物VIII(1.0g)溶于含有等體積乙腈、甲醇和二氯甲烷的混合物；注射(150μl注射)入手性制備型HPLC柱(Chiralpak-IA 250x20mm，5微米)和分離[流動(dòng)相-正-己烷/0.05％Et₃N in EtOH(50:50)；流速：18ml/min；運(yùn)行時(shí)間：60分鐘]。將含有對(duì)映體VIIIa和VIIIb的級(jí)分分開(kāi)地減壓濃縮至最小體積，各自殘余物用EtOAc(100ml)、隨后水(50ml)稀釋。所得有機(jī)相在無(wú)水Na₂SO₄上干燥和濃縮，提供化合物VIIIa和VIIIb，是灰白色固體。對(duì)映體VIIIa和VIIIb得以分離，但各對(duì)映體的絕對(duì)構(gòu)型并未確定。

化合物Ent-1(VIII)：250mg(收率：50％)；t_R(手性HPLC)＝14.8分鐘；ES-MS[M+1]⁺：371.0；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.5(br S，1H)，8.47(s，1H)，7.71(s，1H)，7.67(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.53(d，J＝9.2Hz，2H)，7.31(d，J＝7.6Hz，1H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，5.25(d，J＝4.0Hz，1H)，4.74-4.76(m，1H)，4.43(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，3.18(t，J＝6.4Hz，2H)，1.34(d，J＝6.4Hz，3H)。

化合物Ent-2(VIII)：237mg(收率：47％)；t_R(手性HPLC)＝16.7分鐘；ES-MS[M+1]⁺：371.0；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.5(br S，1H)，8.47(s，1H)，7.71(s，1H)，7.67(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.53(d，J＝8.8Hz，2H)，7.31(d，J＝8.0Hz，1H)，7.08(d，J＝9.2Hz，2H)，5.23(d，J＝3.6Hz，1H)，4.75(m，1H)，4.43(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，3.18(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，1.34(d，J＝6.4Hz，3H)。

合成M-IV的非對(duì)映體混合物

合成D-1MIV

步驟3：在10℃，將NaBH₄(77mg，2.02mmol)的0.1N NaOH(2ml)溶液緩慢地加入攪拌的化合物Ent-1(VIII)(250mg，0.675mmol)，丁二酮肟(32mg，0.27mmol)和CoCl₂.6H₂O(16mg，0.067mmol)在水(10ml)、THF(10ml)和1M NaOH(0.5ml)混合物中的溶液，和在r.t.攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。在反應(yīng)介質(zhì)顏色褪去之后，加入額外量的NaBH₄(26mg，0.675mmol)和CoCl₂.6H₂O(16mg，0.067mmol)，在r.t.繼續(xù)攪拌[于12小時(shí)間隔加入額外量的CoC_l2和NaBH₄直至原料消耗，通過(guò)LCMS監(jiān)測(cè)]。在90-96小時(shí)之后，反應(yīng)混合物用AcOH中和(pH～7)；用水稀釋(10ml)和在EtOAc中萃取(3×50ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水Na₂SO₄上干燥和濃縮，提供粗制化合物，將其通過(guò)快速柱色譜法(SiO₂；4％甲醇/CH₂Cl₂)純化，提供MIV D-1的非對(duì)映體混合物(125mg)，是灰白色固體。

合成D-2MIV

步驟3：在10℃，將NaBH₄(72mg，1.921mmol)的0.1N NaOH(2ml)溶液緩慢地加入攪拌的化合物Ent-2(VIII)(237mg，0.64mmol)、丁二酮肟(30mg，0.256mmol)和CoCl₂.6H₂O(15mg，0.064mmol)在水(10ml)、THF(10ml)和1M NaOH(0.5ml)混合物中的溶液，和在r.t.攪拌反應(yīng)混合物1小時(shí)。在反應(yīng)介質(zhì)顏色褪去之后，加入額外量的NaBH₄(24mg，0.64mmol)和CoCl₂.6H₂O(15mg，0.064mmol)，在r.t.繼續(xù)攪拌[于12小時(shí)間隔加入額外量的CoCl₂.6H₂O和NaBH₄直至原料消耗，通過(guò)LCMS監(jiān)測(cè)]。在96小時(shí)之后，反應(yīng)混合物用AcOH中和(pH～7)；用水稀釋(10ml)和在EtOAc中萃取(3×50ml)。經(jīng)合并的有機(jī)萃取物在無(wú)水Na₂SO₄上干燥和濃縮，提供粗制化合物，將其通過(guò)快速柱色譜法(SiO₂；4％甲醇/CH₂Cl₂)純化，提供MIV D-2的非對(duì)映體混合物(100mg)，是灰白色固體。

MIV D-1：收率：125mg(50％)；t_R(手性HPLC)＝17.8，14.7分鐘；ES-MS[M+1]⁺：373.0，¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.00(br s，NH)，8.46(d，J＝2.0Hz，1H)，7.67(dd，J＝8.0，2.4Hz，1H)，7.30(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝8.8Hz，2H)，6.86(d，J＝8.4Hz，2H)，5.27(d，J＝4.0Hz，1H)，4.88-4.85(m，1H)，4.76-4.74(m，1H)，4.30(t，J＝6.8Hz，2H)，3.30(m，1H)，3.14(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，3.08-3.02(m，1H)，1.34(d，J＝6.4Hz，3H)。

MIV D-2：收率：100mg(42％)；t_R(手性HPLC)＝19.4，16.5分鐘；ES-MS[M+1]⁺：373.0；¹H NMR(400MHz，DMSO-d₆)：δ12.01(br s，-NH)，(d，J＝2.0Hz，1H)，7.67(dd，J＝8.0，2.0Hz，1H)，7.31(d，J＝8.0Hz，1H)，7.13(d，J＝8.8Hz，2H)，6.86(d，J＝8.8Hz，2H)，5.27(d，J＝4.0Hz，1H)，4.88-4.85(m，1H)，4.76-4.74(m，1H)，4.30(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，3.30(m，1H)，3.14(dd，J＝6.8，6.4Hz，2H)，3.08-3.02(m，1H)，1.34(d，J＝6.8Hz，3H)。

MIV的非對(duì)映體混合物D-1和D-2相應(yīng)于上文所述的混合物(c)和(d)，但是存在于各非對(duì)映體混合物中的特定的非對(duì)映體并未加以指定。

實(shí)施例7：體外ADME和毒理學(xué)特征

方案：所進(jìn)行的測(cè)試包括采用不同的同種型的細(xì)胞色素P450抑制，微粒體和肝細(xì)胞穩(wěn)定性，在神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)毒性和hERG安全性測(cè)試，其采用膜片鉗電生理學(xué)測(cè)量(FDA Draft Guidance for Industry.Drug Interaction Studies-Study Design,Data Analysis,Implications for Dosing,and Labelling Recommendations 2012,The European Medicines Agency(EMA)Guideline on the Investigation of Drug Interactions Adopted in 2012,Schroeder K et al.2003J Biomol Screen 8(1)；50-64,Barter ZE et al.2007 Curr Drug Metab 8(1)；33-45,LeCluyse EL and Alexandre E 2010Methods Mol Biol 640；57-82)。結(jié)果指出本發(fā)明化合物的安全且有利的ADME特征。

實(shí)施例8：于4.5mg/kg在雄性C57BL/6小鼠中口服劑量給藥單次施用吡格列酮之后的吡格列酮、MIV、MIII和MII的腦血漿比率。

于4.5mg/kg在雄性C57BL/6小鼠中口服劑量給藥單次施用吡格列酮之后，腦-血漿比率基于血漿和腦中的吡格列酮、MIV、MIII和MII水平計(jì)算，所述水平在C max(最大濃度)定量。

對(duì)于吡格列酮、MII和MIII百分比腦血漿比率分別是9，13，7和1％，如圖4所示。從而，活性代謝物MIII和MII以比吡格列酮顯著更低的程度越過(guò)BBB，正如基于化合物的物理化學(xué)特性所預(yù)測(cè)的(參見(jiàn)表1)。與之相對(duì)，代謝物MIV出乎意料地以比母體化合物吡格列酮更高的百分比越過(guò)BBB。

吡格列酮及其代謝物MII和MIII指標(biāo)(ClogP和QPlogBB)的計(jì)算均示于表1。2種代謝物的兩種指標(biāo)均低于吡格列酮，表示MII和MIII更不利地在CNS中穿透和分布。

表1

實(shí)施例9：于4.5mg/kg在雄性C57BL/6小鼠中口服劑量給藥單次施用吡格列酮或M-IV之后，吡格列酮和MIV的腦血漿比率。

為了確認(rèn)上一個(gè)實(shí)施例顯示的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)行了額外的實(shí)驗(yàn)。于4.5mg/kg在雄性C57BL/6小鼠中口服劑量給藥單次施用吡格列酮或MIV之后，腦-血漿比率基于血漿和腦濃度-時(shí)間特征曲線(xiàn)的藥代動(dòng)力學(xué)曲線(xiàn)計(jì)算，所述特征曲線(xiàn)計(jì)算為吡格列酮的曲線(xiàn)下面積。

對(duì)于吡格列酮和M4百分比腦-血漿比率分別是8％和12％，如圖5所示。與在相同條件下對(duì)吡格列酮觀(guān)察到的那些相比，羥基化的代謝物M-IV的這種50％的腦-血漿比率增加是基于物理化學(xué)特性預(yù)言性計(jì)算完全出乎意料的(參見(jiàn)表1)。

M-IV顯示與期望相反的行為。由于MII，MIV是一羥基化的代謝物，但其并未降低50％的BBB穿透，而是BBB穿透高了50％。

吡格列酮和M-IV的兩種指標(biāo)(ClogP和QPlogBB)的計(jì)算示于表1。對(duì)于兩種指標(biāo)MIV都顯示比吡格列酮更低的值，這意味著M-IV更不利于穿透和在CNS中分布；而實(shí)驗(yàn)觀(guān)察則令人驚訝地恰恰相反。

實(shí)施例10：MIV的兩種非對(duì)映體混合物D-1和D-2在小鼠中體內(nèi)差向異構(gòu)化的表征。

方案：在單次口服(4.5mg/kg)灌胃法劑量給藥至雄性Swiss白化病小鼠之后，確定5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮的非對(duì)映體混合物D-1和D-2的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)?？偣?1只小鼠用于該平行采樣設(shè)計(jì)的研究中(n＝3/時(shí)間點(diǎn))。對(duì)于兩者的口服藥代動(dòng)力學(xué)，在劑量給藥前和劑量給藥后的不同時(shí)間收集血液樣品。

將5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮的非對(duì)映體混合物D-1和D-2用液-液萃取(LLE)方法從Swiss白化病小鼠血漿樣品提取并用液體色譜法串聯(lián)的質(zhì)譜(LC-MS/MS)定量，其采用電噴霧離子化(ESI)和多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。采用手性AGP柱對(duì)所選的血漿和腦樣品進(jìn)行手性分析以鑒定手性互變。采用非手性生物分析方法來(lái)定量血漿和腦樣品中存在的總M-IV。

配制劑樣品適宜地用70％甲醇稀釋?zhuān)⑶覍⒃O(shè)備響應(yīng)與已知的相應(yīng)非對(duì)映體混合物標(biāo)準(zhǔn)比較，采用非手性L(fǎng)C-MS/MS方法。5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮(1)的非對(duì)映體混合物D-1和D-2在血漿中的定量下限(LLOQ)是0.99ng/mL。藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)用Phoenix WinNonlin的無(wú)隔室分析工具計(jì)算。

這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果示于圖6。數(shù)據(jù)清楚地展示在小鼠中非對(duì)映體混合物之間的％轉(zhuǎn)化率差異較高。D-1和D-2均在體內(nèi)互變，盡管從D-1轉(zhuǎn)化為D-2比從D-1轉(zhuǎn)化為D-2遠(yuǎn)為顯著。

實(shí)施例11：作為阿爾茨海默病模型的谷氨酸損傷的皮質(zhì)神經(jīng)元的表征。

谷氨酸損傷的初代皮質(zhì)神經(jīng)元(興奮性中毒)是神經(jīng)變性疾病(J Neurosci；1999 Apr 1；19(7):2455-63；J Neurosci Res.2013 May；91(5):706-16)比如帕金森病、阿爾茨海默病和亨廷頓疾病(Brain Res Bull 2013 Apr；93:27-31.)并且也是其它病理學(xué)狀況比如多發(fā)性硬化(Scand J Immunol 2014；79(3):181-186)的成熟體外模型。

方案：大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元按Singer(J Neurosci.1999 Apr 1；19(7):2455-63)和Callizot(J Neurosci Res.2013May；91(5):706-16)的描述培養(yǎng)。

將胎收集和立即置于冰冷的Leibovitz培養(yǎng)基中。皮質(zhì)用胰蛋白酶-EDTA溶液處理，通過(guò)加入Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和葡萄糖(Pan Biotech)停止解離，其含有DNAse I和10％胎牛血清(FCS)。將細(xì)胞機(jī)械地解離和離心。將藥丸懸浮于定義的培養(yǎng)基中，其含10ng/ml腦衍生的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)。將細(xì)胞接種在預(yù)涂層聚-L-賴(lài)氨酸的96-孔板中和于37°培養(yǎng)。每2天替換培養(yǎng)基。在培養(yǎng)13天之后，用谷氨酸使皮質(zhì)神經(jīng)元中毒。

簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)的第13天，在谷氨酸暴露之前將BDNF和試驗(yàn)化合物與初代皮質(zhì)神經(jīng)元預(yù)溫育1小時(shí)。在BDNF或試驗(yàn)化合物存在下，加入谷氨酸至在對(duì)照培養(yǎng)基中稀釋的40μM最終濃度，持續(xù)20分鐘。

在20分鐘之后，洗除谷氨酸和加入含BDNF或試驗(yàn)化合物的新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)額外48小時(shí)。存活率評(píng)價(jià)通過(guò)MTT測(cè)試完成，其用CellTiter Aqueous One溶液細(xì)胞增殖測(cè)試(Promega)進(jìn)行。

結(jié)果示于圖7。它們顯示的是，在谷氨酸損傷的情況下，MIV(化合物(1))顯示保護(hù)效果(對(duì)3μM達(dá)到顯著性)。有趣地，我們觀(guān)察到MIV的良好鐘狀曲線(xiàn)。在3μM獲得完全的保護(hù)效果，正如用參比化合物(BDNF 50ng/ml)所觀(guān)察。全部值表示為平均值+/-SE。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)單因素ANOVA、隨后Dunnett’s或PLSD Fisher檢驗(yàn)進(jìn)行，p<0.05視為顯著。

實(shí)施例12：作為用于治療帕金森病的有效藥物抑制MAO B(單胺氧化酶)的表征。

選擇性抑制劑MAO-B增加在受帕金森病影響的CNS中的多巴胺水平而不增加其它神經(jīng)遞質(zhì)(腎上腺素、去甲腎上腺素或血清素)的水平，與之相對(duì)的是MAO抑制劑(MAO-A和MAO B)無(wú)選擇性。MAO-B抑制劑也能夠用來(lái)治療抑郁癥。

方案：人類(lèi)重組單胺氧化酶蛋白質(zhì)MAO-A和MAO-B購(gòu)自Sigma Aldrich(分別參考M7316和M7441)。為了監(jiān)測(cè)MAO酶活性及其抑制率，采用基于熒光的測(cè)試。用于測(cè)試的底物犬尿胺是非熒光的，直至通過(guò)MAOs發(fā)生氧化脫胺化引起熒光產(chǎn)物4-羥基喹啉。犬尿胺是MAO-A和MAO-B兩者的底物(非特異性底物)。氯吉蘭和得普尼林(Sigma Aldrich)分別用作MAO-A和MAO-B特異性抑制的對(duì)照。

結(jié)果顯示5-(4-(2-(5-(1-羥基乙基)吡啶-2-基)乙氧基)芐基)噻唑烷-2,4-二酮抑制MAO B，具有70.5nM的IC₅₀。與之相對(duì)，該化合物不抑制MAO A蛋白質(zhì)。

實(shí)施例13：在動(dòng)物模型中的體內(nèi)效力的表征，該模型是作為神經(jīng)炎性疾病模型的實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)。

神經(jīng)炎癥能夠應(yīng)答各種感染、外傷性腦損傷、毒物或CNS中的自身免疫而引發(fā)。

神經(jīng)炎性模型的特征是星形細(xì)胞和小神經(jīng)膠質(zhì)的增殖，伴有神經(jīng)元損失，其是許多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的顯著特征，包括阿爾茨海默病，多發(fā)性硬化，卒中，帕金森氏，外傷性腦損傷，感染和ALD(Human Molecular Genetics,2004,Vol.13,No.23 2997-3006)。

慢性炎癥是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的持續(xù)活化和其它免疫細(xì)胞募集進(jìn)入腦中。其是一般與神經(jīng)變性疾病有關(guān)的慢性炎癥。

EAE模型是經(jīng)典用于多發(fā)性硬化的神經(jīng)炎性模型，其類(lèi)似且包括ALD嚴(yán)重大腦形式的絕大多數(shù)特征、小神經(jīng)膠質(zhì)活化、腦脫髓鞘和軸索退化。盡管該疾病的病因?qū)W不同于ALD和EAE(自體反應(yīng)性CD4+淋巴細(xì)胞觸發(fā)的多發(fā)性硬化模型)，EAE模型是研究ALD和多發(fā)性硬化兩者的治療的有價(jià)值工具(Nature 2007；7:904-912)。

方案：在多發(fā)性硬化及其動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎(EAE)中發(fā)展臨床癥狀牽涉T-細(xì)胞活化和進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的遷移，神經(jīng)膠質(zhì)衍生的炎性分子的產(chǎn)生以及脫髓鞘和軸索損害。按描述用大于98％純的合成髓磷脂少突細(xì)胞糖蛋白肽35-55(MOG35-55，MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK，SEQ ID NO：1)主動(dòng)誘導(dǎo)慢性單相EAE。向雌性C57BL/6小鼠(6-8周齡)注射(在一只后肢中兩次100μL皮下注射)250μg MOG35-55，其乳化于100μL磷酸緩沖溶液和與之混合的100uL弗氏完全佐劑中，其中含有500μg結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)(Difco，Detroit，MI)。小鼠接受百日咳毒素(400ng，在200μL磷酸緩沖溶液中，經(jīng)腹膜內(nèi))注射，2天后進(jìn)行第二次百日咳毒素注射，并且于7天加強(qiáng)注射MOG35-55。臨床病征打分如下：0，無(wú)病征；1.0，尾部無(wú)力/失去翻正；2.0，共濟(jì)失調(diào)伴尾部無(wú)力；3.0，單后肢癱瘓；4.0，雙后肢癱瘓；4.5，瀕死；和5.0，死亡。對(duì)于兩個(gè)模型，記錄得分5并且僅在死亡當(dāng)天計(jì)數(shù)。

在免疫后從第5天開(kāi)始每天給予兩次(bid)化合物，持續(xù)15天，采用3個(gè)不同的增加劑量。

結(jié)果顯示MIV(化合物(1))降低實(shí)驗(yàn)自身免疫腦脊髓炎模型的發(fā)展和嚴(yán)重性。實(shí)驗(yàn)中的平均每日臨床得分示于圖9。臨床癥狀以劑量依賴(lài)性方式降低，最高劑量顯示最大效果。臨床癥狀被MIV降低，意味著PPARγ活化在保護(hù)效果中發(fā)揮作用。在治療有關(guān)的最高劑量無(wú)體重?fù)p失和無(wú)顯著血液學(xué)毒性。

神經(jīng)炎癥是多發(fā)性硬化和ALD兩者的標(biāo)志，從而MIV可以對(duì)兩種疾病有效。實(shí)際上，減少小神經(jīng)膠質(zhì)活化提供分子基礎(chǔ)，其解釋同種異體和自體HSCT有效阻止大腦炎癥的原因，即單核細(xì)胞譜系的替換和功能代謝性恢復(fù)，并且將cALD和AMN表型與共享的病原途徑聯(lián)系起來(lái)(Human Molecular Genetics,2012,Vol.21,No.5 1062-1077)。從而，這些模型可以對(duì)研究PPARγ激動(dòng)劑在ALD中的作用具有重大潛力和相關(guān)性。

實(shí)施例14：X-ALD患者的成纖維細(xì)胞的表征，其是X-關(guān)聯(lián)的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良的模型。

人對(duì)照和X-關(guān)聯(lián)的腎上腺腦白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良成纖維細(xì)胞得自Coriell(Candem，USA)。在37℃、在加濕的95％空氣/5％CO₂中，細(xì)胞生長(zhǎng)在Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基中至80-90％匯合度，所述培養(yǎng)基含有10％胎的牛血清，100U/ml青霉素和100mg鏈霉素。為了實(shí)施實(shí)驗(yàn)，使用Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基，其不含D-葡萄糖、丙酮酸或L-谷氨酰胺。細(xì)胞在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)，培養(yǎng)基中補(bǔ)充有1g/l葡萄糖或1g/l半乳糖和10％胎牛血清，用增加劑量的MIV(3，10和30μM)溫育。

MTT的確定按照Mosmann J.Immunol.Methods 1983，65,55-63和Hansen J.Immunol.Methods 1989；119,203-210進(jìn)行。該方法基于有活力而未死亡的細(xì)胞將四唑鎓鹽(MTT)轉(zhuǎn)化為有色甲的能力。

為了確定ATP水平，將2x10⁴細(xì)胞/孔接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在完全培養(yǎng)基中。在16-18小時(shí)之后，細(xì)胞在20μl裂解緩沖劑中裂解并且用10μl裂解液來(lái)測(cè)量ATP水平，采用ATP測(cè)定試劑盒(Molecular Probes,Invitrogen)。1μl各剩余裂解液用于蛋白質(zhì)測(cè)量。

結(jié)果基于細(xì)胞存活的增加(20％，于3μM vs未處理)顯示MIV(化合物(1))對(duì)ALD成纖維細(xì)胞的保護(hù)效果。

實(shí)施例15：脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的表征，其是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(ALS)的模型

谷氨酸損傷的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元是體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，其適于研究ALS和其它運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病(MNDs)比如進(jìn)行性延髓性麻痹，偽延髓性麻痹，原發(fā)性側(cè)索硬化(PLS)，進(jìn)行性肌肉萎縮，脊髓性肌萎縮(SMA)，后脊髓灰質(zhì)炎綜合征(PPS)和其它罕見(jiàn)疾病比如夏-馬-圖三氏病，格-巴二氏綜合征或AMN(Neuron.1992Apr；8(4):737-44)。

方案：大鼠脊髓(SC)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元按Martinou(Neuron.1992 Apr；8(4)：737-44)和Wang(PLoS Genet.2013；9(9))的描述培養(yǎng)。簡(jiǎn)言之，通過(guò)頸脫位處死妊娠14天的懷孕雌性大鼠、將胎收集和立即置于冰冷的L15 Leibovitz培養(yǎng)基中。在37℃用胰蛋白酶-EDTA將脊髓處理20分鐘。加入Dulbecco修飾的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)和葡萄糖(Pan Biotech)停止解離，所述培養(yǎng)基含有DNAse I和10％胎牛血清(FCS)。將細(xì)胞機(jī)械解離，然后將其離心。將藥丸再懸浮于定義的含10ng/ml腦衍生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種在預(yù)涂層聚-L-賴(lài)氨酸的96-孔板中，并且于37°培養(yǎng)。每2天替換培養(yǎng)基。

簡(jiǎn)言之，在培養(yǎng)第13天，在谷氨酸暴露之前，將BDNF或試驗(yàn)化合物與初代脊髓(SC)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元預(yù)溫育1小時(shí)。在BDNF或試驗(yàn)化合物存在下，加入谷氨酸直至在對(duì)照培養(yǎng)基中稀釋的10μM最終濃度，持續(xù)20分鐘。在20分鐘之后，洗除谷氨酸和加入含BDNF或試驗(yàn)化合物的新鮮培養(yǎng)基，持續(xù)額外48小時(shí)。

存活率評(píng)價(jià)通過(guò)免疫染色完成。在中毒48之后，取出細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并通過(guò)乙醇(95％)和乙酸(5％)的冷溶液固定SC運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元5分鐘且使其可滲透。將細(xì)胞與染色特定神經(jīng)元細(xì)胞體(MAP-2)的單克隆抗體抗微管相關(guān)-蛋白質(zhì)2(MAP-2)溫育2小時(shí)，使得可以進(jìn)行培養(yǎng)物中的神經(jīng)元存活率評(píng)價(jià)研究。該抗體用Alexa Fluor 488山羊抗-小鼠IgG來(lái)顯示。

對(duì)于各個(gè)條件評(píng)價(jià)6個(gè)孔，用ImageXpress(Molecular Device)以20x放大率拍攝30張圖片/孔。全部圖像都用相同條件拍攝。神經(jīng)元總數(shù)分析用Custom模塊編輯器(Molecular Device)自動(dòng)進(jìn)行。

在施用谷氨酸之前，將試驗(yàn)化合物預(yù)溫育1小時(shí)。

結(jié)果(圖10)顯示MIV(化合物(1)，1μM)在SC運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(MN)中對(duì)谷氨酸損傷具有保護(hù)效果，其通過(guò)與含谷氨酸(Glut)的對(duì)照相比統(tǒng)計(jì)學(xué)上不同(p<0.05t Student)細(xì)胞存活率增加來(lái)展示。