本發(fā)明屬于醫(yī)藥化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類具有吲唑取代結(jié)構(gòu)的表皮生長因子受體抑制劑、含有該抑制劑的藥物組合物，以及所述抑制劑或藥物組合物作為癌癥治療藥物的用途。

背景技術(shù)：

表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)是原癌基因C-erbB-1的表達(dá)產(chǎn)物，為EGFR家族成員之一。EGFR家族包括EGFR(HER-1)、ERBB2(HER-2)、ERBB3(HER-3)和ERBB4(HER-4)四個成員。已表明EGFR過表達(dá)或突變一般會引發(fā)腫瘤。EGFR突變導(dǎo)致EGFR的持續(xù)活化，自分泌環(huán)的作用增強(qiáng)，受體下調(diào)機(jī)制破壞，異常信號傳導(dǎo)通路激活，在腫瘤的演進(jìn)中起著重要作用。

針對EGFR采用EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)治療已經(jīng)成為非小細(xì)胞肺癌治療領(lǐng)域里的金標(biāo)準(zhǔn)。不過，臨床使用發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者會在吉非替尼、厄洛替尼等EGFR-TKI抑制劑治療后6-12個月發(fā)生不同程度的耐藥現(xiàn)象，進(jìn)而導(dǎo)致藥物的療效顯著降低，腫瘤進(jìn)展。研究顯示EGFR-TKI耐藥性的產(chǎn)生與EGFR基因的二次突變有關(guān)，其中最常見的突變是EGFR基因20號外顯子第790位點(diǎn)的突變，即T790M基因突變。由于甲硫氨酸比蘇氨酸空間占位大，因此形成空間位阻，改變了EGFR激酶區(qū)ATP的親和性，使得EGFR-TKI小分子藥物不能有效阻斷EGFR活化信號，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。同時，第一代EGFR抑制劑缺乏野生型EGFR與突變型EGFR的選擇性，普遍存在皮疹、腹瀉等副作用，影響患者依從性。

因此，開發(fā)對因EGFR二次突變產(chǎn)生耐藥的腫瘤患者有效的藥物，特別是開發(fā)能進(jìn)一步提高對野生型EGFR與突變型EGFR選擇性，增強(qiáng)療效，降低副作用的藥物，將具有良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供通式I的具有吲唑取代結(jié)構(gòu)的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，該類化合物表現(xiàn)出良好的EGFR抑制活性，尤其是針對突變的EGFR，

本發(fā)明的另一個目的是提供通式II的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，以所述通式II的化合物為關(guān)鍵中間體制備通式I化合物，反應(yīng)條件溫和，收率和純度較高，

本發(fā)明的第三個目的是提供制備本發(fā)明的通式I和II的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥的方法。

本發(fā)明的第四個目的是提供包含本發(fā)明的通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥和藥學(xué)可接受的載體的藥物組合物以及包含本發(fā)明的通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥和另一種腫瘤抑制劑的藥物組合物。

本發(fā)明的第五個目的是提供本發(fā)明的通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥治療和/或預(yù)防癌癥的方法以及本發(fā)明的通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥治療和/或預(yù)防癌癥的方法及其在制備用于治療和/或預(yù)防癌癥的藥物中的應(yīng)用。

針對上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供通式I所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，

其中

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、氨基烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、羥基烷基、烷氧基烷基、烷基?；?、氨基?；?、單烷基氨基酰基和二烷基氨基?；?；

R₄、R₅和R₆各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、氰基、烷基、烷氧基和環(huán)烷基，所述的烷基、烷氧基和環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、鹵代烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基、氨基烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基或羥基烷基取代；

R_a選自氫、烷基、環(huán)烷基和鹵代烷基；和

R_b選自氫、烷基和環(huán)烷基，所述的烷基和環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基或羥基取代；或者

R_a、R_b及其連接的N一起構(gòu)成含氮雜環(huán)烷基，所述的含氮雜環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、烷基、鹵代烷基、烷氧基、氨基、單烷基氨基、二烷基氨基、羥基、氨基烷基、單烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基或羥基烷基取代。

第二方面，本發(fā)明提供通式II的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，以所述通式II的化合物為關(guān)鍵中間體制備通式I化合物，反應(yīng)條件溫和，收率和純度較高，

其中R₁、R_1a、R₂、R₃、R_a和R_b具有通式I中的定義。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-6烷基、鹵代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、鹵代C_1-6烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-6烷基氨基、二C_1-6烷基氨基、氨基C_1-6烷基、單C_1-6烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-6烷基氨基C_1-6烷基、羥基C_1-6烷基、C_1-6烷氧基C_1-6烷基、C_1-6烷基酰基、氨基?；蜟_1-6烷基氨基?；投﨏_1-6烷基氨基?；?。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、羥基C_1-3烷基、C_1-3烷氧基C_1-3烷基、C_1-3烷基?；?、氨基酰基、單C_1-3烷基氨基?；投﨏_1-3烷基氨基酰基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、碘、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、二氟甲基、二氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、三氟甲基氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、異丙基氨基、二甲氨基、二乙氨基、二丙氨基、二異丙氨基、N-甲基-N-乙基氨基、N-甲基-N-丙基氨基、N-甲基-N-異丙基氨基、N-乙基-N-丙基氨基、N-乙基-N-異丙基氨基、N-丙基-N-異丙基氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二甲氨基乙基、二乙氨基甲基、二乙氨基乙基、羥甲基、羥乙基、甲氧基甲基、乙氧基甲基、丙氧基甲基、甲氧基乙基和乙氧基乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二乙氨基甲基、羥甲基和羥乙基。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a選自氫、C_1-6烷基、C_3-6環(huán)烷基和鹵代C_1-6烷基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a選自氫、C_1-3烷基、C_3-6環(huán)烷基和鹵代C_1-3烷基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a選自氫、甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基和三氟甲基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a為甲基。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_b選自氫、C_1-6烷基和C_3-6環(huán)烷基，所述的C_1-6烷基和C_3-6環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-6烷基、鹵代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、單C_1-6烷基氨基、二C_1-6烷基氨基或羥基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_b選自氫、C_1-3烷基和C_3-6環(huán)烷基，所述的C_1-3烷基和C_3-6環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基或羥基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_b選自氫、C_1-3烷基和C_3-6環(huán)烷基，所述的C_1-3烷基和C_3-6環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、二氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙基氧基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙胺基、二丙氨基、甲基乙基氨基、甲基丙基氨基、乙基丙基氨基或羥基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_b選自甲基、乙基和丙基，所述的甲基、乙基和丙基任選被一個或多個氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙胺基、二丙氨基、甲基乙基氨基、甲基丙基氨基或乙基丙基氨基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a、R_b及其連接的N一起構(gòu)成四至八元氮雜環(huán)烷基，所述的四至八元氮雜環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-6烷基、鹵代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、氨基、單C_1-6烷基氨基、二C_1-6烷基氨基、羥基、氨基C_1-6烷基、單C_1-6烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-6烷基氨基C_1-6烷基或羥基烷基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a、R_b及其連接的N一起構(gòu)成四至八元氮雜環(huán)烷基，所述的四至八元氮雜環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、羥基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基或羥基烷基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I和II的化合物，其中R_a、R_b及其連接的N一起構(gòu)成五或六元氮雜環(huán)烷基，所述的五或六元氮雜環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、氨基、單C_1-3烷 基氨基、二C_1-3烷基氨基、羥基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基或羥基烷基取代。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I的化合物，其中R₄、R₅和R₆各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、氰基、C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、C_3-8環(huán)烷基，所述的C_1-6烷基、C_1-6烷氧基和環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-6烷基、鹵代C_1-6烷基、C_1-6烷氧基、鹵代C_1-6烷氧基、氨基、單C_1-6烷基氨基、二C_1-6烷基氨基、羥基、氨基C_1-6烷基、單C_1-6烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-6烷基氨基C_1-6烷基和羥基C_1-6烷基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I的化合物，其中R₄、R₅和R₆各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、氰基、C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、C_3-6環(huán)烷基，所述的C_1-3烷基、C_1-3烷氧基和C_3-6環(huán)烷基任選被一個或多個鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、羥基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基或羥基C_1-3烷基取代。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I的化合物，其中R₄、R₅和R₆均為氫。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、羥基C_1-3烷基、C_1-3烷氧基C_1-3烷基、C_1-3烷基酰基、氨基酰基、單C_1-3烷基氨基?；投﨏_1-3烷基氨基?；?；

R₄、R₅和R₆均為氫；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二乙氨基甲基、羥甲基和羥乙基；

R₄、R₅和R₆均為氫；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、羥基C_1-3烷基、C_1-3烷氧基C_1-3烷基、C_1-3烷基酰基、氨基?；蜟_1-3烷基氨基?；投﨏_1-3烷基氨基酰基；

R₄、R₅和R₆均為氫；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式I所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二乙氨基甲基、羥甲基和羥乙基；

R₄、R₅和R₆均為氫；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、羥基C_1-3烷基、C_1-3烷氧基C_1-3烷基、C_1-3烷基酰基、氨基酰基、單C_1-3烷基氨基?；投﨏_1-3烷基氨基?；?；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二乙氨基甲基、羥甲基和羥乙基；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C_1-3烷基、鹵代C_1-3烷基、C_1-3烷氧基、鹵代C_1-3烷氧基、硝基、氰基、羥基、氨基、單C_1-3烷基氨基、二C_1-3烷基氨基、氨基C_1-3烷基、單C_1-3烷基氨基C_1-6烷基、二C_1-3烷基氨基C_1-3烷基、羥基C_1-3烷基、C_1-3烷氧基C_1-3烷基、C_1-3烷基酰基、氨基?；蜟_1-3烷基氨基?；投﨏_1-3烷基氨基酰基；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在另一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供通式II所示的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽，其中，

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成

R₁、R_1a、R₂和R₃各自獨(dú)立地選自氫、氟、氯、溴、甲基、乙基、丙基、異丙基、三氟甲基、三氟乙基、甲氧基、乙氧基、羥基、氨基、甲氨基、乙氨基、丙氨基、二甲氨基、二乙氨基、氨基甲基、氨基乙基、氨基丙基、甲氨基甲基、甲氨基乙基、乙氨基甲基、乙氨基乙基、二甲氨基甲基、二乙氨基甲基、羥甲基和羥乙基；

R_a為甲基；

R_b為被二甲氨基取代的乙基。

在一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供以下化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥：

在另一些具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了以下化合物或其藥學(xué)可接受的鹽：

第三方面，本發(fā)明提供本發(fā)明的通式I和II的化合物的制備方法。其中嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成的通式I和II的化合物的制備方法包括如下步驟：

A)式1的原料和式2的原料發(fā)生親核反應(yīng)制得式3的中間體；

B)式3的中間體與式4的原料反應(yīng)制得式5的中間體；

C)式5的中間體經(jīng)過親核反應(yīng)制得式6的中間體；

D)式6的中間體經(jīng)過還原反應(yīng)制得式II的中間體；

E)式II的中間體與式7的原料反應(yīng)制得式I的化合物。

上述R₁、R_1a、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R_a、R_b具有通式I和II中的定義，M表示鹵素。

嘧啶環(huán)與吲唑環(huán)上的N連接構(gòu)成的通式I和II的化合物的制備方法包括如下步驟：

A)式1的原料和式2的原料發(fā)生親核反應(yīng)制得式3’的中間體；

B)式3’的中間體與式4的原料反應(yīng)制得式5’的中間體；

C)式5’的中間體經(jīng)過親核反應(yīng)制得式6’的中間體；

D)式6’的中間體經(jīng)過還原反應(yīng)制得式II的中間體；

E)式II的中間體與式7的原料反應(yīng)制得式I的化合物。

上述R₁、R_1a、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R_a、R_b具有通式I和II中的定義，M表示鹵素。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供制備本發(fā)明的通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥的制備方法，所述方法包括使用本發(fā)明的通式II的化合物。

第三方面，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明通式I的化合物或其藥學(xué)可接受的鹽、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥和藥學(xué)可接受的載體。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供藥物組合物，其包含本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥，還包含選自下列組成的一種或多種化合物：吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼、阿法替尼、凡德他尼、卡奈替尼、阿帕替尼、達(dá)卡替尼(dacomitinib)、培利替尼(pelitinib)、WZ4002、AG-490、AZD8931、AZD9291等。

可以將本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥與藥學(xué)上可接受的載體混合制備成藥物制劑，以適合于經(jīng)口或胃腸外給藥。給藥方法包括，但不限于皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、鼻內(nèi)和經(jīng)口途徑。所述制劑可以通過任何途徑施用，例如通過輸注或推注，通過經(jīng)上皮或皮膚粘膜(例如口腔粘膜或直腸等)吸收的途徑施用。給藥可以是全身的或局部的。經(jīng)口施用制劑的實(shí) 例包括固體或液體劑型，具體而言，包括片劑、丸劑、粒劑、粉劑、膠囊劑、糖漿、乳劑、混懸劑等。所述制劑可通過本領(lǐng)域已知的方法制備，且包含藥物制劑領(lǐng)域常規(guī)使用的載體。

第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物治療和/或預(yù)防腫瘤的方法和在制備治療和/或預(yù)防腫瘤藥物中的應(yīng)用，包括向腫瘤易發(fā)人群或腫瘤患者施用本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或者包含本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥的藥物組合物，以有效降低腫瘤發(fā)生率、延長腫瘤患者生命。

在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物治療具有抗藥性的腫瘤的方法，包括向具有抗藥性的腫瘤患者施用治療有效量的本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或者包含本發(fā)明通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥的藥物組合物。

在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物在制備治療具有抗藥性的腫瘤的藥物中的應(yīng)用。所述具有抗藥性的腫瘤可以是對多種藥物具有抗藥性的腫瘤，優(yōu)選對EGFR抑制劑抗藥的腫瘤，例如對第一、第二、第三代EGFR抑制劑，例如對吉非替尼、厄洛替尼和拉帕替尼具有抗藥性的腫瘤。所述腫瘤包括但不限于實(shí)體瘤，優(yōu)選為肺癌、頭頸部腫瘤、結(jié)直腸癌、膀胱癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔癌、肝癌、卵巢癌。更優(yōu)選地，所述腫瘤為非小細(xì)胞肺癌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥治療具有抗藥性的腫瘤的方法，其中所述腫瘤攜帶EGFR突變基因。在一個實(shí)施方案中，所述腫瘤攜帶的EGFR突變基因是第20號外顯子存在T790M突變。在另一個實(shí)施方案中，所述腫瘤攜帶的EGFR突變基因是第21號外顯子存在L858R突變和/或缺失/插入突變。在另一個實(shí)施方案中，所述腫瘤攜帶的EGFR突變基因是T790M和L858R雙重突變。在另一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于治療腫瘤的本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物，其中治療腫瘤作用表現(xiàn)在突出的療效，高度的選擇性和/或較少的副作用。在再一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物治療腫瘤的方法，所述方法包括給予需要其的患者治療有效量的本發(fā)明的通式I的化合物、異構(gòu)體、溶劑合物、結(jié)晶或前藥或本發(fā)明的藥物組合物，所產(chǎn)生的治療腫瘤方面的作用表現(xiàn)在突出的療效，高度的選擇性和/或較少的副作用。

術(shù)語定義

除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同的含義。

本發(fā)明的“異構(gòu)體”是指順式或反式構(gòu)型的順反異構(gòu)體。

本發(fā)明的“藥學(xué)可接受的鹽”是指本發(fā)明所述的化合物與酸形成的藥學(xué)上可接受的鹽，所述的酸可選自：磷酸、硫酸、鹽酸、氫溴酸、檸檬酸、馬來酸、丙二酸、扁桃酸、琥珀酸、富馬酸、醋酸、乳酸、硝酸、磺酸、對甲苯磺酸、蘋果酸、甲烷磺酸等。

本發(fā)明的“溶劑合物”是指通過與溶劑分子配位形成固態(tài)或液態(tài)的配合物的本發(fā)明化合物的形式。水合物是溶劑合物的特殊形式，其中與水發(fā)生配位。在本發(fā)明范圍內(nèi)，溶劑合物優(yōu)選是水合物。

本發(fā)明的“結(jié)晶”是指本發(fā)明所述的化合物形成的各種固體形態(tài)，包括晶型、無定形。

本發(fā)明的“前藥”是指在生物體的生理?xiàng)l件下，由于與酶、胃酸等反應(yīng)而轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物，即通過酶的氧化、還原、水解等轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物的化合物和/或通過胃酸等的水解反應(yīng)等轉(zhuǎn)化成本發(fā)明的化合物的化合物。

本發(fā)明的“藥物組合物”是指包含任何一種本文所述的化合物，包括異構(gòu)體、前藥、溶劑合物、藥學(xué)上可接受的鹽或其化學(xué)的保護(hù)形式，和一種或多種藥學(xué)上可接受載體的混合物。

本發(fā)明的“在制備用于治療和/或預(yù)防腫瘤的藥物中的應(yīng)用”是指可以抑制或預(yù)防腫瘤的生長、發(fā)展和/或轉(zhuǎn)移，主要向所需要的人或動物給治予治療或預(yù)防有效劑量的本發(fā)明的化合物以抑制、減慢、逆轉(zhuǎn)或預(yù)防受治療者腫瘤的生長、發(fā)展或擴(kuò)撒。

術(shù)語“烷基”是指直鏈或支鏈的飽和烴基，優(yōu)選6個碳原子以下的烴基。烷基的實(shí)例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、異己基、2,2-甲基丁基和2,3-二甲基丁基。術(shù)語“C_1-6烷基”是指含有1-6個碳原子的直鏈或支鏈的飽和烴基。術(shù)語“C_1-3烷基”是指含有1-3個碳原子的直鏈或支鏈的飽和烴基。

本發(fā)明的“環(huán)烷基”是指環(huán)狀的飽和烴基，優(yōu)選12個碳原子以下的環(huán)烷基，進(jìn)一步優(yōu)選8個碳原子以下的環(huán)烷基，更進(jìn)一步優(yōu)選6個碳原子以下的環(huán)烷基。環(huán)烷基的實(shí)例包括環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基。本發(fā)明的“C_3-6烷基”是指含有3-6個碳原子的環(huán)狀的飽和烴基。本發(fā)明中的“烷基”和“環(huán)烷基”包括取代或未取代的烷基和環(huán)烷基，所述烷基或環(huán)烷基可任選被一個或多個選自以下的基團(tuán)取代：烷基、烷氧基、芳氧基、烷氨基、芳基氨基、鹵素、羥基、氨 基、硝基、氰基、烷基酰基、氨基酰基、烷氨基酰基、磺酰基、亞磺酰基、巰基、芳基或雜芳基。

本發(fā)明的“烷氧基”是指-O-烷基。

本發(fā)明的“鹵素”是指氟、氯、溴、碘。

本發(fā)明的“鹵代烷基”是指至少被一個鹵素原子取代的烷基。

本發(fā)明的“鹵代烷氧基”是指至少被一個鹵素取代的烷氧基，優(yōu)選為至少被一個鹵素取代的C_1-6烷氧基，進(jìn)一步優(yōu)選為至少被一個鹵素取代的C_1-3烷氧基，合適的鹵代C_1-3烷氧基為氯甲氧基、氟甲氧基、二氯甲氧基、二氟甲氧基、三氯甲氧基、三氟甲氧基；二氯乙氧基、二氟乙氧基、三氯乙氧基、三氟乙氧基。

本發(fā)明的“單烷基氨基”是指-NH-烷基，優(yōu)選為-NH-C_1-6烷基，進(jìn)一步優(yōu)選為-NH-C_1-3烷基。

本發(fā)明的“二烷基氨基”是指-N-(烷基)(烷基)，優(yōu)選為-N-(C_1-6烷基)(C_1-6烷基)，進(jìn)一步優(yōu)選為-N-(C_1-3烷基)(C_1-3烷基)。

本發(fā)明的“單烷基氨基烷基”是指-烷基-NH-烷基。

本發(fā)明的“二烷基氨基烷基”是指-烷基-N-(烷基)(烷基)。

本發(fā)明的“烷基?；笔侵?C(O)-烷基。

本發(fā)明的“氨基?；笔侵?C(O)-NH₂。

本發(fā)明的“單烷基氨基酰基”是指-C(O)-NH-烷基。

本發(fā)明的“二烷基氨基酰基”是指-C(O)-N-(烷基)(烷基)。

本發(fā)明的“含氮雜環(huán)烷基”是指至少含有一個氮原子的環(huán)狀的飽和烷基，本發(fā)明的“四至八元氮雜環(huán)烷基”是指至少含有一個氮原子的飽和四元環(huán)、五元環(huán)、六元環(huán)、七元環(huán)或八元環(huán)，本發(fā)明的“五或六元氮雜環(huán)烷基”是指至少含有一個氮原子的飽和五元環(huán)或六元環(huán)。合適的實(shí)例包括但不限于氮雜環(huán)丙烷、氮雜環(huán)丁烷、四氫吡咯烷、哌啶環(huán)、哌嗪環(huán)、嗎啉環(huán)。

具體實(shí)施方式

下面代表性的實(shí)施例是為了更好地說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

步驟a 2-氯-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶

在250mL反應(yīng)瓶中，加入2,4-二氯嘧啶(14.9g，100mmol)，50mL DMF溶解后，加入碳酸銫(50g，152mmol)，0-4℃下滴加入30mL溶有吲唑(11.8g，100mmol)的DMF溶液，滴加完畢后，室溫反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，倒入冰水中，抽濾，用50mL水洗滌濾餅，干燥后柱層析純化得到標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:231.1[M+H]。

步驟b N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺的合成

在250mL反應(yīng)瓶中，加入步驟a所得物2-氯-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶(16.3g，70mmol)、4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(13.0g，70mmol)和對甲苯磺酸(12.0g，70mmol)，50mL仲丁醇溶解后，110℃反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾，用30mL仲丁醇洗滌濾餅，干燥得標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:381.2[M+H]。

步驟c N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺的合成

在50mL單口瓶中，依次加入步驟b所得物N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺(16.8g，44mmol)、N,N,N’-三甲基乙二胺(4.5g， 44mmol)、二異丙基乙胺(17.1g，133mmol)和50mL二氧六環(huán)，溶解后110℃回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，濃縮，柱層析純化得標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:463.4[M+H]。

步驟d N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-氨基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺的合成

在50mL單口瓶中，依次加入步驟c所得物N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺(18.9g，41mmol)、10％Pd-C(60mg)和60mL甲醇，在1個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，室溫下，氫氣還原1h，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濃縮得標(biāo)題物，直接用于下一步。

ESI-Ms m/z:433.3[M+H]。

步驟e N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

在150mL單口瓶中，加入步驟d所得物N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-氨基苯基)-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-胺(9.3g，22mmol)、二異丙基乙胺(2.8g，22mmol)、50mL二氯甲烷溶解后，0-5℃滴入10mL溶解有烯丙基酰氯(1.95g，22mmol)的二氯甲烷溶液，反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束后，濃縮，柱層析純化得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:9.59(s,1H),8.89(s,1H),8.56-8.55(d,1H),8.51(s,1H),8.44-8.43(d,1H),8.20(s,1H),7.89-7.87(d,1H),7.46-7.41(m,1H),7.32-7.29(m,2H),7.04(s,1H),6.74-6.65(m,1H),6.29-6.23(d,1H),5.77-5.74(d,1H),3.83(s,3H),3.34-3.31(s,4H),2.83-2.82(m,6H),2.50(s,3H)。

ESI-Ms m/z:486.9[M+H]。

實(shí)施例1B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

步驟a 2-氯-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶的合成

在250mL反應(yīng)瓶中，加入2,4-二氯嘧啶(14.9g，100mmol)，50mL DMF溶解后，加入碳酸銫(50g，152mmol)，0-4℃下滴加入30mL溶有吲唑(11.8g，100mmol)的DMF溶液，滴加完畢后，室溫反應(yīng)1h，反應(yīng)結(jié)束后，倒入冰水中，抽濾，用50mL水洗滌濾餅，干燥后柱層析純化分別得到標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:231.1[M+H]。

步驟b N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺的合成

在250mL反應(yīng)瓶中，加入步驟a所得物2-氯-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶(16.3g，70mmol)、4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺(13.0g，70mmol)和對甲苯磺酸(12.0g，70mmol)，50mL仲丁醇溶解后，110℃反應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，過濾，用30mL仲丁醇洗滌濾餅，干燥得標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:381.2[M+H]。

步驟c N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺的合成

在50mL單口瓶中，依次加入步驟b所得物N-(4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺(16.8g，44mmol)、N,N,N’-三甲基乙二胺(4.5g，44mmol)、二異丙基乙胺(17.1g，133mmol)和50mL二氧六環(huán)，溶解后110℃回流反應(yīng)3h，反應(yīng)結(jié)束后，濃縮，柱層析純化得標(biāo)題物。

ESI-Ms m/z:463.4[M+H]。

步驟d N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-氨基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺的合成

在50mL單口瓶中，依次加入步驟c所得物N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-硝基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺(18.9g，41mmol)、10％Pd-C(60mg)和60mL甲醇，在1個標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下，室溫下，氫氣還原1h，反應(yīng)結(jié)束后，過濾，濃縮得標(biāo)題物，直接用于下一步。

ESI-Ms m/z:433.3[M+H]。

步驟e N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

在150mL單口瓶中，加入步驟d所得物N-(4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-2-甲氧基-5-氨基苯基)-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-胺(9.3g，22mmol)、二異丙基乙胺(2.8g，22mmol)、50mL二氯甲烷溶解后，0-5℃滴入10mL溶解有烯丙基酰氯(1.95g，22mmol)的二氯甲烷溶液，反應(yīng)10min，反應(yīng)結(jié)束后，濃縮，柱層析純化得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:10.08(s,1H),9.44(s,1H),8.77-8.80(d,1H),8.49-8.51(d,1H),8.19(s,1H),7.71-7.74(d,1H),7.40-7.45(m,2H),7.23-7.28(m,2H),6.83(s,1H),6.31-6.40(m,2H),5.64-5.68(m,1H),3.90(s,3H),2.89-2.93(t,2H),2.74(s,3H),2.31-2.35(t,2H),2.29(s,6H)。

ESI-Ms m/z:486.9[M+H]。

實(shí)施例2A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(5-氯-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4,5-三氯嘧啶、吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺 和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1A的方法制得標(biāo)題物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.01(s,1H),9.06(s,1H),8.60(s,1H),8.45(s,1H),8.32(s,1H),8.00(d,1H),7.89(d,1H),7.44-7.26(m,2H),7.00(s,1H),6.53(d,1H),6.24(d,1H),5.79(d,1H),3.80(s,3H),3.04-2.91(m,2H),2.65(s,3H),2.49-2.37(m,2H),2.20(s,6H)。

ESI-Ms m/z:521.2[M+H]。

實(shí)施例2B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(5-氯-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4,5-三氯嘧啶、吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法制得標(biāo)題物。

實(shí)施例3A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(5-甲氧基-1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、5-甲氧基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1化合物1A的方法制得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:10.07(s,1H),8.75(s,1H),8.48-8.36(m,4H),7.29(s,1H),7.23-7.21(d,1H),7.06(s,1H),6.97-6.94(d,1H),6.49-6.40(m,1H),6.20-6.14(d,1H),5.73-5.70(d,1H),3.81(s,3H),3.77(s,3H),2.95(s,2H),2.76(s,3H),2.40(s,2H),2.24(s,6H)。

ESI-Ms m/z:517.3[M+H]。

實(shí)施例3B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(5-甲氧基-1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、5-甲氧基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法制得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:10.00(s,1H),9.24(s,1H),8.23-8.34(m,4H),7.25-7.26(s,1H),7.06(s,1H),6.94-6.97(d,1H),6.52-6.54(d,2H),6.16-6.21(d,1H),5.70-5.74(d,1H),3.80(s,6H),3.01(s,2H),2.71(s,3H),2.46(s,2H),2.23(s,6H)。ESI-Ms m/z:517.3[M+H]。

實(shí)施例4A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(5-甲基-4-(1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、5-甲基-2,4-二氯嘧啶、吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1化合物1A的方法制得標(biāo)題物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.02(s,1H),8.55-8.35(m,4H),8.27(d,1H),7.83(d,1H),7.38-7.20(m,2H),7.02(s,1H),6.47-6.31(m,1H),6.18(d,1H),5.72(d,1H),3.77(s,3H),2.89(t,2H),2.72(s,3H),2.43(s,3H),2.32(t,2H),2.19(s,6H)。

ESI-Ms m/z:501.2[M+H]。

實(shí)施例4B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(5-甲基-4-(1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、5-甲基-2,4-二氯嘧啶、吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺和烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法制得標(biāo)題物。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ10.21(s,1H),9.69(s,1H),9.21(s,1H),8.57(s,1H),8.19(s,1H),7.70-7.77(m,2H),7.32-7.37(t,1H),7.12-7.16(t,1H),7.04(s,1H),6.37-6.51(m,2H),5.82-5.85(t,1H),3.88(s,3H),2.87(t,2H),2.71(s,3H),2.60(s,3H),2.28(t,2H),2.20(s,6H)。

ESI-Ms m/z:501.2[M+H]。

實(shí)施例5A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(5-氟-1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、5-氟-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1A的方法制得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ:10.06(s,1H),9.38(s,1H),8.77(dd,1H),8.49(d,1H),8.15(s,1H),7.44(s,1H),7.39(d,1H),7.34(dd,1H),7.16(td,1H),6.82(s,1H),6.33(s,2H),5.69-5.65(m,1H),3.89(s,3H),2.95-2.90(m,2H),2.74(s,3H),2.48-2.34(m,8H)。

ESI-Ms m/z:505.3[M+H]。

實(shí)施例5B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(5-氟-1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、5-氟-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法制得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ:10.12(s,1H),9.85(s,1H),8.54-8.56(d,1H),7.95(s,1H),7.66-7.71(m,1H),7.60-7.62(d,1H),7.33-7.36(dd,1H),7.26(s,1H),7.10-7.17(td,1H),6.82(s,1H),6.56-6.61(s,1H),6.44(s,1H),5.77-5.81(d,1H),3.91(s,3H),2.92(t,2H),2.74(s,3H),2.31(s,8H)。

ESI-Ms m/z:505.3[M+H]。

實(shí)施例6A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(3-甲基-1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、3-甲基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1A的方法制得標(biāo)題物。

¹H-NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ:10.07(s,1H),8.71(s,1H),8.47(s,1H),8.46-8.43(m,1H),8.38-8.36(d,1H),7.81-7.79(d,1H),7.37-7.26(m,2H),7.20-7.18(d,1H),7.06(s,1H),6.45-6.36(m,1H),6.19-6.14(d,1H),5.73-5.70(d,1H),3.75(s,3H),2.93(s,2H),2.77(s,3H),2.57(s,3H),2.37(s,2H),2.22(s,6H)。

ESI-Ms m/z:501.3[M+H]。

實(shí)施例6B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-(4-(3-甲基-1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯嘧啶、3-甲基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法制得標(biāo)題物。

實(shí)施例7A N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-((5-甲基-4-(3-甲基-1H-吲唑-1-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯-5-甲基嘧啶、3-甲基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1A的方法得標(biāo)題化合物。

1H-NMR(300MHz,DMSO-d6)δ:10.07(s,1H),8.71(s,1H),8.47(s,1H),8.46-8.43(m,1H),8.38-8.36(d,1H),7.81-7.79(d,1H),7.37-7.26(m,2H),7.20-7.18(d,1H),6.45-6.36(m,1H),6.19-6.14(d,1H),5.73-5.70(d,1H),3.75(s,3H),2.93(s,2H),2.77(s,3H),2.57(s,3H),2.37(s,2H),2.34(s,3H),2.22(s,6H)。

ESI-Ms m/z:515.3[M+H]。

實(shí)施例7B N-(2-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基)-4-甲氧基-5-((5-甲基-4-(3-甲 基-1H-吲唑-2-基)嘧啶-2-基)氨基)苯基)烯丙酰胺的合成

以4-氟-2-甲氧基-5-硝基苯胺、2,4-二氯-5-甲基嘧啶、3-甲基-1H-吲唑、N,N,N’-三甲基乙二胺、烯丙基酰氯為原料，按照實(shí)施例1B的方法得標(biāo)題化合物。

實(shí)驗(yàn)例1體外激酶活性評價(jià)

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1酶

EGFR^WT激酶，購于Carna公司；

EGFR^T790M/L858R激酶，購于Invitrogen公司。

1.2試劑

三磷酸腺苷(ATP)，購于Sigma公司；

縮氨酸(Peptide FAM-P22)，購于GL Biochem公司；

乙二胺四乙酸(EDTA)，購于Sigma公司。

1.3儀器

Caliper EZ reader微流控芯片儀器，購于Caliper Life Sciences,Inc.

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1準(zhǔn)備1×激酶基礎(chǔ)緩沖液和終止緩沖液

1×激酶基礎(chǔ)緩沖液(對于EGFR^WT)：50mM HEPES，pH7.5，0.0015％Brij-35，10mM MgCl₂，10mM MnCl₂，2mM DTT；

1×激酶基礎(chǔ)緩沖液(對于EGFR^T790M/L858R)：50mM HEPES，pH7.5，0.0015％Brij-35，10mM MgCl₂，2mM DTT；

終止緩沖液：100mM HEPES，pH7.5，0.0015％Brij-35，0.2％Coating Reagent#3，50mM EDTA。

2.2準(zhǔn)備化合物

用100％DMSO將本發(fā)明的化合物分別溶解至10mM，再用完全培養(yǎng)基稀釋至50μM，然后用含0.1％DMSO的完全培養(yǎng)基稀釋至5μM后，依次3倍稀釋，共10個濃度(對于EGFR^WT)；

用100％DMSO將本發(fā)明的化合物分別溶解至10mM，再用完全培養(yǎng)基稀釋至50μM，然后用含0.1％DMSO的完全培養(yǎng)基稀釋至1μM后，依次3倍稀釋， 共10個濃度(對于EGFR^T790M/L858R)；

在空的孔中加入100μl 100％DMSO用于配制有激酶無化合物對照組和無激酶無化合物對照組；

標(biāo)記以上所用96孔板為來源板。

2.3準(zhǔn)備中間板

從來源板中轉(zhuǎn)移10μl溶液到新的96孔板中，作為中間板，在中間板每孔中加入90μl 1×激酶緩沖液，振蕩混勻10min。

2.4準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)板

從96孔中間板中，每孔轉(zhuǎn)移5μl溶液到384孔板中。

2.5激酶反應(yīng)

2.5.1.準(zhǔn)備2.5×激酶溶液：將EGFR^WT激酶和EGFR^T790M/L858R激酶原液分別加入1×基礎(chǔ)緩沖液中，配制成2.5×激酶溶液；

2.5.2.準(zhǔn)備2.5×縮氨酸溶液：將FAM標(biāo)記的縮氨酸和ATP加到1×基礎(chǔ)緩沖液中，配制成2.5×縮氨酸溶液；

2.5.3.轉(zhuǎn)移10μl 2.5×激酶溶液到384孔實(shí)驗(yàn)板中，室溫孵育10min；

2.5.4.轉(zhuǎn)移10μl 2.5×縮氨酸溶液到384孔實(shí)驗(yàn)板中，在28℃條件下孵育一段時間，加入25μl終止緩沖液終止反應(yīng)。

同時設(shè)置無激酶無化合物對照組(包含DMSO、1×基礎(chǔ)緩沖液和2.5×縮氨酸溶液和有激酶無化合物對照組(包括DMSO、2.5×激酶溶液和2.5×縮氨酸溶液)。

2.5.5.Caliper儀器讀數(shù)、擬合曲線，計(jì)算抑制率

在Caliper儀器上讀取數(shù)據(jù)，并從Caliper程序中獲得conversion數(shù)據(jù)，根據(jù)以下公式計(jì)算抑制率：

抑制率％＝(max-com)/(max-min)×100計(jì)算抑制率，其中“max”代表有激酶無化合物對照組，“com”代表受試化合物組，“min”代表無激酶無化合物對照組。

2.5.6.采用Graphpad 5.0數(shù)據(jù)處理軟件計(jì)算IC₅₀值。結(jié)果見表1。

表1

由以上結(jié)果可以看出，本發(fā)明的化合物對突變型EGFR激酶，例如 EGFR^L858R/T790M具有良好的抑制活性，IC₅₀值小于1nM。由此可見，本發(fā)明的化合物對突變型EGFR激酶抑制作用好，相對于EGFR野生型細(xì)胞，對突變型細(xì)胞具有較好的選擇性，有望成為治療抗藥性腫瘤，尤其是對EGFR突變導(dǎo)致耐藥的腫瘤具有特異療效的藥物。

實(shí)驗(yàn)例2體外細(xì)胞活性評價(jià)

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞

實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞株NCI-H1975(EGFR雙突變細(xì)胞，具有L858R和T790M突變)和A431(EGFR野生型細(xì)胞)，購自于ATCC。

1.2試劑

Cell Titer-Glo luminescent cell viability assay，購自于Promega公司；

RPMI1640medium，購自于Invitrogen公司；

DMEM medium，購自于Invitrogen公司；

胎牛血清，購自于Invitrogen公司；

DMSO，購自于Sigma公司；

NCI-H1975細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活的胎牛血清(GIBCO)的RPMI1640培養(yǎng)基中，含青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL；

A431細(xì)胞培養(yǎng)于含10％滅活的胎牛血清(GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基中，含青霉素100IU/mL和鏈霉素100μg/mL。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1實(shí)驗(yàn)過程(CTG assay)

將對數(shù)生長期的NCI-H1975細(xì)胞和A431細(xì)胞消化后，吹打成單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔培養(yǎng)基100μL，每個細(xì)胞株各種3塊96孔板，其中NCI-H1975細(xì)胞每孔接種3 X 10³個細(xì)胞，A431細(xì)胞每孔接種4 X 10³個細(xì)胞。將接種后的NCI-H1975細(xì)胞和A431細(xì)胞在5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16-24小時，待細(xì)胞貼壁后，按以下濃度要求加入受試化合物(化合物在NCI-H1975細(xì)胞上的最高測試濃度為4μM，3倍稀釋，共9個濃度；在A431細(xì)胞上的最高測試濃度為10μM，3倍稀釋，共9個濃度)，在培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)72小時。同時設(shè)置空白對照組(只有培養(yǎng)基，不加細(xì)胞和DMSO溶液)和DMSO對照組(培養(yǎng)基中加入細(xì)胞和0.5％的DMSO溶液)。加入100μL的CTG溶液，避光振蕩2min，孵育10min。

2.2讀數(shù)，計(jì)算IC₅₀值

將培養(yǎng)板放入多模式微孔板檢測儀讀板，記錄luminescence讀值結(jié)果，并按照以下公式計(jì)算抑制率：

抑制劑(％)＝(1-(RLU_com-RLU_blank)/(RLU_DMSO–RLU_blank))×100％，

其中RLU_com表示受試化合物組的吸光值，RLU_blank表示空白對照組的吸光值，RLU_DMSO表示DMSO對照組的吸光值，

利用XLFit曲線擬合軟件繪制藥效抑制率曲線并計(jì)算IC₅₀值，結(jié)果見表2。

表2

已有研究表明，已上市的EGFR抑制劑的主要副作用之一為皮疹、腹瀉等，這些都與野生型的EGFR被抑制有關(guān)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物對雙突變型細(xì)胞(NCI-H1975)的抑制作用較好，且對EGFR野生型細(xì)胞(A431)的抑制小，選擇性好。有望成為對抗EGFR突變導(dǎo)致耐藥的腫瘤具有特異療效且副作用較小的藥物。

實(shí)驗(yàn)例3血糖影響檢測

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1化合物

將本發(fā)明的化合物用25mM的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)溶解，配制成濃度為1.25mg/mL的澄清溶液，設(shè)為受試化合物組；以25mM的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)設(shè)為溶媒對照組；

1.2動物

雌性BALB/C小鼠，每組各5只，體重18-22g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。受試小鼠實(shí)驗(yàn)前給予2～4天的環(huán)境適應(yīng)期，給藥前禁食8-12h。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠禁食但可自由飲水12小時；

2.2取步驟2.1中的小鼠5只，灌胃(intragastric administration,I.G.)給予本發(fā)明的化合物25mg/kg；

2.3于灌胃后0min，15min，30min，1h，2h眼眶采血，使用羅氏卓越型血糖儀檢測動物血糖值A(chǔ)，根據(jù)公式AUC＝[(A_15min+A₀)×7.5]+[(A_30min+A_15min)×7.5] +[(A_60min+A_30min)×15]+[(A_120min+A_60min)×30]計(jì)算AUC值，并根據(jù)公式AUC增長％＝[(AUC_化合物－AUC_溶媒)/AUC_溶媒]×100％計(jì)算出AUC增長率，其中“A₀”代表灌胃后0min的血糖值，“A_15min”代表灌胃15min后的血糖值，“A_30min”代表灌胃30min后的血糖值，“A_60min”代表灌胃60min后的血糖值，“A_120min”代表灌胃120min后的血糖值，“AUC_化合物”代表受試化合物的AUC值，“AUC_溶媒”代表溶媒對照組的AUC值，結(jié)果見表3。

表3

已有研究表明，CO-1686在臨床上可誘發(fā)高血糖(22％)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明的化合物對血糖影響較小，有望降低此類化合物的高血糖副作用，提高患者依從性。

實(shí)驗(yàn)例4藥物代謝實(shí)驗(yàn)

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1化合物

將本發(fā)明的化合物配制成口服和注射兩種給藥配方。其中，口服藥物配方為25mM的枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)溶解，制成1.25mg/mL澄清溶液；尾靜脈注射藥物配方為枸櫞酸-枸櫞酸鈉緩沖液(pH4.5)與生理鹽水體積比為1：1的混合溶液溶解，制成0.2mg/mL溶液。

1.2動物

雌性BALB/C小鼠，每組各5只，體重18-22g，上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。受試小鼠實(shí)驗(yàn)前給予2～4天的環(huán)境適應(yīng)期，給藥前禁食8-12h，給藥2h后給水，4h后給食。

1.3試劑

甲醇(色譜純)：Spectrum公司生產(chǎn)；

乙腈(色譜純)：Spectrum公司生產(chǎn)；

其余試劑均為市售分析純。

1.4儀器

美國AB公司API 4500型三重四級桿液質(zhì)聯(lián)用儀，配有電噴霧離子源(ESI)，LC-30AD雙泵；SIL-30AC自動進(jìn)樣器；CTO-30AC柱溫箱；DGU-20A3R脫氣機(jī)；Analyst QS A01.01色譜工作站；Milli-Q超純水器(Millipore Inc)；Qilinbeier Vortex-5振蕩器；HITACHI CF16R Ⅹ Ⅱ臺式高速冷凍離心機(jī)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1小鼠禁食但可自由飲水12小時后，采取0時刻空白血漿；

2.2取步驟2.1中的小鼠5只，灌胃(intragastric administration,I.G.)給予本發(fā)明化合物25mg/kg；

取步驟2.1中的小鼠5只，尾靜脈(Intravenous administration,I.V.)給予本發(fā)明的化合物2mg/kg；

2.3于灌胃后5min，15min，30min，1h，2h，4h，10h，24h，從眼底靜脈叢連續(xù)取血置于分布有肝素的EP管中，8000rpm/min離心5min后取上層血漿，-20℃凍存，待LC-MS/MS分析；

于尾靜脈注射給藥后5min，15min，30min，1h，2h，4h，10h，24h，從眼底靜脈叢連續(xù)取血置于分布有肝素的EP管中，8000rpm/min離心5min后取上層血漿，-20℃凍存，待LC-MS/MS分析；

2.4根據(jù)步驟2.3所得的血藥濃度-時間數(shù)據(jù)，采用WinNonlin軟件求算藥代動力學(xué)參數(shù)，見表4；

表4

從上表4可以看出，本發(fā)明的化合物具有較好的藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)，具有較好的臨床應(yīng)用前景。

盡管以上已經(jīng)對本發(fā)明作了詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員理解，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的前提下可以對本發(fā)明進(jìn)行各種修改和改變。本發(fā)明的權(quán)利范圍并不限于上文所作的詳細(xì)描述，而應(yīng)歸屬于權(quán)利要求書。