本發(fā)明涉及微生物產(chǎn)電領(lǐng)域，特別涉及含有該混合菌群的微生物產(chǎn)電體系和微生物燃料電池。

背景技術(shù)：

微生物燃料電池(Microbial Fuel Cell，MFC)是一種利用微生物將有機物中的化學能直接轉(zhuǎn)化成電能的裝置。其基本工作原理是：在陽極室厭氧環(huán)境下，有機物在微生物作用下分解并釋放出電子和質(zhì)子，電子依靠合適的電子傳遞介體和產(chǎn)電菌特殊的細胞膜上電子傳遞機制在生物組分和陽極電極之間進行有效傳遞，并通過外電路傳遞到陰極形成電流，而質(zhì)子通過質(zhì)子交換膜傳遞到陰極，氧化劑在陰極得到電子被還原與質(zhì)子結(jié)合成水。

與現(xiàn)有的其它利用有機物產(chǎn)能的技術(shù)相比，微生物燃料電池具有操作上和功能上的優(yōu)勢：首先，它將底物直接轉(zhuǎn)化為電能，保證了具有高的能量轉(zhuǎn)化效率；其次，不同于現(xiàn)有的所有生物能處理，微生物燃料電池在常溫環(huán)境條件下能夠有效運作；第三，微生物燃料電池不需要進行廢氣處理，因為它所產(chǎn)生的廢氣的主要組分是二氧化碳，一般條件下不具有可再利用的能量；第四，微生物燃料電池不需要輸入較大能量，因為若是單室微生物燃料電池僅需通風就可以被動的補充陰極氣體；第五，在缺乏電力基礎(chǔ)設(shè)施的局部地區(qū)，微生物燃料電池具有廣泛應用的潛力，同時也擴大了用來滿足我們對能源需求的燃料的多樣性。

綜合上述，微生物燃料電池是利用能夠?qū)⒓毎麅?nèi)通過代謝反應產(chǎn)生的電子通過特有的細胞膜蛋白運輸出細胞的產(chǎn)電微生物，將化學能轉(zhuǎn)化成電能的裝置，能夠克服風能、太陽能等再生能源受環(huán)境的限制，在環(huán)境處理和新型能源領(lǐng)域起到重要作用，具有很好的發(fā)展前景。但由于產(chǎn)電菌生長環(huán)境苛刻，產(chǎn)電效率低，電子傳遞過程較慢，至今無法實現(xiàn)工業(yè)化應用。

以希瓦式菌為主的產(chǎn)電菌一直被科學家廣泛研究，人們集中于對產(chǎn)電菌的改造和對電極材料的優(yōu)化，但效果并不顯著。例如：(1)無法利用廣泛、 廉價的底物作為碳源(碳源譜窄)；(2)為維持產(chǎn)電量，需要外添加大量的核黃素，成本較高；(3)經(jīng)基因改造后的產(chǎn)電菌生長更加緩慢，產(chǎn)電活力沒有野生菌好；(4)持續(xù)時間短、產(chǎn)電不穩(wěn)定；(5)產(chǎn)電菌較脆弱，加重其產(chǎn)核黃素的代謝負擔會影響其產(chǎn)電；(6)“發(fā)酵－產(chǎn)電”多任務由單一產(chǎn)電菌完成；(7)培養(yǎng)基中需要加入復雜的礦物質(zhì)溶液和復合維生素溶液，成本較高、配制復雜?，F(xiàn)有的微生物燃料電池在產(chǎn)電過程中需要不斷取樣，檢測體系內(nèi)關(guān)鍵物的含量，如果不夠，需要及時添加來維持菌種活性和體系穩(wěn)定性。體系穩(wěn)定性和重復性差，產(chǎn)電持續(xù)時間短，需外添加數(shù)十種礦物質(zhì)和維生素溶液，成本較高，體系復雜。

因此，提供一種高效、穩(wěn)定的微生物燃料電池具有重要的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種含有該混合菌群的微生物產(chǎn)電體系和微生物燃料電池。本發(fā)明通過構(gòu)建混合菌群，使其分工明確的特點，發(fā)酵菌1為體系提供電子傳遞的載體核黃素，發(fā)酵菌2將最常用、低廉的葡萄糖轉(zhuǎn)化為小分子酸提供給產(chǎn)電菌使用。本發(fā)明選擇大腸桿菌或枯草芽孢桿菌——原核生物模式菌株，通過基因工程改造等手段，構(gòu)建出2種不同用途的3種不同的發(fā)酵菌，拓展了微生物燃料電池的碳源譜，增強了產(chǎn)電菌的電子傳遞效率。同時，從物質(zhì)流、能量流、信息流三個重要角度出發(fā)，構(gòu)建穩(wěn)定、合理、高效的功能性混菌共生體系。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種微生物產(chǎn)電體系，包括混合菌群；所述混合菌群包括發(fā)酵菌和產(chǎn)電菌；

發(fā)酵菌包括高產(chǎn)核黃素的菌；

發(fā)酵菌還包括以五碳糖、六碳糖、纖維二糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的菌。

在本發(fā)明中，小分子酸選自乳酸、甲酸、氨基酸等。本領(lǐng)域的技術(shù)人員公知的任何小分子酸均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。

在本發(fā)明中，產(chǎn)電過程不需要外添加物質(zhì)、以葡萄糖為碳源，底物可延伸為木糖、纖維二糖、甚至是纖維素的處理液均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)，本發(fā)明在此不做限定。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系中所述發(fā)酵菌為大腸桿菌和/或枯草芽孢桿菌；

所述產(chǎn)電菌為希瓦氏菌。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系中所述高產(chǎn)核黃素的菌與所述產(chǎn)電菌的接菌比例不大于1:1；

所述以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的菌與所述產(chǎn)電菌的接菌比例不大于1：20。

在本發(fā)明的另一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系包括的所述以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的菌與所述產(chǎn)電菌的接菌比例1:20。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系中所述混合菌群在所述微生物產(chǎn)電體系中的接菌量為產(chǎn)電菌不超過4OD。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系還包括硝酸鹽，硝酸鹽對于產(chǎn)核黃素的發(fā)酵菌在電池產(chǎn)電的條件下正常生長、代謝具有重要作用。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系中所述硝酸鹽在所述微生物產(chǎn)電體系中的終濃度不大于10mM。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系的pH值為6.2～7.2；所述微生物產(chǎn)電體系的緩沖液為HEPES，優(yōu)選為1×HEPES。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，所述微生物產(chǎn)電體系中碳源的濃度為不超過10g/L。

在本發(fā)明的一些具體實施方案中，500mL所述微生物產(chǎn)電體系中包括磷酸二氫鉀1.5g、十二水合磷酸一氫鉀8.55g，氯化鈉0.25g，氯化銨0.5g，硫酸鎂0.12g，氯化鈣5.5mg。

本發(fā)明還提供了一種微生物燃料電池，包括所述的微生物產(chǎn)電體系。

本發(fā)明通過構(gòu)建混合菌群，使其分工明確的特點，發(fā)酵菌1為體系提供電子傳遞的載體核黃素，發(fā)酵菌2將最常用、低廉的葡萄糖轉(zhuǎn)化為小分子酸提供給產(chǎn)電菌使用。本發(fā)明選擇大腸桿菌或枯草芽孢桿菌，通過基因工程改造等手段，構(gòu)建出2種不同用途的發(fā)酵菌，拓展了微生物燃料電池的碳源譜， 增強了產(chǎn)電菌的電子傳遞效率。同時，從物質(zhì)流、能量流、信息流三個重要角度出發(fā)，構(gòu)建穩(wěn)定、合理、高效的功能性混菌共生體系。

本發(fā)明提供的微生物產(chǎn)電體系和微生物燃料電池解決了如下問題：

(1)微生物燃料電池自身持續(xù)時間短、產(chǎn)電不穩(wěn)定，需要定時外添底物和電子載體等昂貴物質(zhì)來維持較高的產(chǎn)電量；

(2)產(chǎn)電菌希瓦氏菌的底物譜、碳源譜窄，只能利用小分子的乳酸、甲酸、氨基酸等物質(zhì)，不能利用廣泛碳源——五、六碳糖，如葡萄糖、木糖等，不能將纖維素或者廣泛、廉價的葡萄糖轉(zhuǎn)化中豐富的化學能轉(zhuǎn)化為電能；

(3)從“體系自身供給”的角度，開發(fā)一個獨立、穩(wěn)定、高效的微生物燃料電池體系；

(4)混菌燃料電池中不同菌株不能共培養(yǎng)的問題。如何使產(chǎn)電菌和發(fā)酵菌間協(xié)同作用，提高體系的產(chǎn)電量和產(chǎn)電時間的問題；

(5)如何選擇和工程改造發(fā)酵菌，作為重要物質(zhì)的輸入。

本發(fā)明能夠做到，只需在起始時加入一定的葡萄糖，中間不需要外添加任何物質(zhì)，可以實現(xiàn)高效產(chǎn)電超過100小時。

本發(fā)明的微生物產(chǎn)電體系簡單，只需要不超過10種基本、廉價的鹽組成的溶液就可以，體系不需要添加復雜的礦物質(zhì)鹽溶液和復合維生素溶液。

本項專利突破了微生物燃料電池領(lǐng)域傳統(tǒng)的單菌改造思維，使用混合菌群分工明確的優(yōu)勢和特點，構(gòu)建大腸桿菌－大腸桿菌－希瓦氏菌的混合產(chǎn)電體系或大腸桿菌－枯草芽孢桿菌－希瓦氏菌的混合產(chǎn)電體系，相較于其他燃料電池具有電量較高、持續(xù)時間較長、成本很低、中間不需要補料等優(yōu)勢。

在構(gòu)建過程中，使用兩種不同功能的經(jīng)過基因改造的大腸桿菌作為發(fā)酵菌為體系提供關(guān)鍵物質(zhì)，成為為菌間相互交流、互利共生和行駛功能的重要的物質(zhì)、能量和信息驅(qū)動力。

其中一種大腸桿菌利用葡萄糖代謝出小分子酸(乳酸、甲酸、氨基酸等)供產(chǎn)電菌利用，另一種工程化的大腸桿菌生產(chǎn)核黃素，作為電子傳遞的載體，供產(chǎn)電菌提高電子傳遞效率，能夠有效的提高產(chǎn)電量。同時，在產(chǎn)電特殊的條件下，產(chǎn)電菌也能夠促進發(fā)酵菌的代謝速度，使體系電輸出持續(xù)時間更長。此外，混合培養(yǎng)條件和接菌比例等條件控制也對產(chǎn)電效果有重要的影響意義。

經(jīng)大量的條件摸索，如圖1所示：為在葡萄糖為碳源，單獨希瓦氏菌的產(chǎn)電圖，產(chǎn)電量極低，48小時候基本沒電。為兩種菌混合，中間沒有補料，在該條件下產(chǎn)電量遠低于綠線(體系)。是我們構(gòu)建的體系三種菌相互合作，協(xié)同促進產(chǎn)電量的提高。

我們的混菌體系用到了2個種屬或3個種屬、三種菌來實現(xiàn)其共能。

(1)物質(zhì)流、能量和信息流的切入點核黃素和小分子酸分配到2種發(fā)酵菌中。(混菌微生物燃料電池的徹底分工的概念)

(2)選擇大腸桿菌+枯草芽孢桿菌(或大腸桿菌)作為發(fā)酵菌，大腸具有基因操作簡單、繁殖速度快、培養(yǎng)條件很簡單等自身獨特的優(yōu)勢，初級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)和分泌能力較強、是生物化工角度最廣泛使用的工程菌?？莶菅挎邨U菌本身就是核黃素的生產(chǎn)菌(不需要基因改造就能產(chǎn)、但此處用到的是世界上經(jīng)改造的最高產(chǎn)核黃素的枯草)，是革蘭氏陽性菌的模式菌，研究較為廣泛和透徹。

(3)電池的效果：產(chǎn)電量超過350mV、產(chǎn)電時間超過100小時；或者產(chǎn)電量超過520mV、產(chǎn)電時間超過100小時。

(4)產(chǎn)電過程不需要外添加物質(zhì)、以葡萄糖為碳源，底物可延伸為木糖、纖維二糖、甚至是纖維素的處理液。

高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌與高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌相比，(1)從功能上，能提供更多的核黃素；(2)從體系角度：混合菌群的復雜度更高、更難調(diào)控；(3)帶來的效果更好。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示實施例5的產(chǎn)電效果對比圖；其中，示希瓦氏菌；示希瓦氏菌+大腸桿菌；示希瓦氏菌+大腸桿菌+大腸桿菌；

圖2示實施例6的產(chǎn)電效果對比圖；其中，示希瓦氏菌；示希瓦氏菌+枯草芽孢桿菌+大腸桿菌；

圖3示pH值試紙圖；其中圖3(A)指pH試紙對照圖；圖3(B)指實施例7的pH值試紙圖；

圖4示實施例7接菌比例和pH對體系的影響；其中，示希瓦氏菌+小分子酸；示希瓦氏菌+大腸桿菌；示希瓦氏菌+大腸桿菌+大腸桿菌(產(chǎn)點菌比發(fā)酵菌＝20:1)；示希瓦氏菌+大腸桿菌+大腸桿菌(產(chǎn)點菌比發(fā)酵菌＝10:1)；

圖5示燃料電池裝置圖。

具體實施方式

本發(fā)明公開了一種含有該混合菌群的微生物產(chǎn)電體系和微生物燃料電池，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應用已經(jīng)通過較佳實施例進行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應用進行改動或適當變更與組合，來實現(xiàn)和應用本發(fā)明技術(shù)。

本發(fā)明提供的混合菌群及其用途、含有該混合菌群的微生物產(chǎn)電體系和微生物燃料電池中所用的原料及試劑均可由市場購得。

其中，所述以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的菌的構(gòu)建方法為：為了增強厭氧條件下發(fā)酵菌2產(chǎn)生小分子酸的能力，本發(fā)明在大腸桿菌中導入ldhE基因(產(chǎn)乳酸基因，乳酸桿菌來源)，利用λ－Red同源重組技術(shù)敲除了pflB基因；

所述高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌的構(gòu)建方法為：在大腸桿菌中導入ribABDEC基因簇；

所述高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌的構(gòu)建方法為：過表達枯草芽孢桿菌中prs和ywlF基因，下調(diào)了Pur操縱子和PurR調(diào)控基因(glyA,guaC,pbuG,xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。菌種按照文章構(gòu)建：Shi S,Chen T,Zhang Z,et al.Transcriptome analysis guided metabolic engineering of Bacillus subtilis for riboflavin production[J].Metabolic engineering,2009,11(4):243-252.

下面結(jié)合實施例，進一步闡述本發(fā)明：

實施例1混合菌群

構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌：通過基因操作，過表達枯草芽孢桿菌中prs和ywlF基因，下調(diào)了Pur操縱子和PurR調(diào)控基因(glyA,guaC,pbuG,xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。

構(gòu)建以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌：在大腸桿菌中利用λ－Red同源重組技術(shù)敲除了pflB基因，然后導入ldhE基因(產(chǎn)乳酸基因，乳酸桿菌來源，GENWIZE公司合成)，方法是：通過EcoRI和PstI酶切、連接到pSB1C質(zhì)粒上然后將連有l(wèi)dhE基因的質(zhì)粒導入上述敲掉pflB基因的大腸桿菌中，氯霉素抗性進行篩選，篩選出正確的轉(zhuǎn)化子。取構(gòu)建的高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌、構(gòu)建的以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌與希瓦氏菌混合，按照：

高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照不超過1:1的接菌比例混合；

以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照不超過1:20的接菌比例混合。

實施例2混合菌群

構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌：通過基因操作，過表達枯草芽孢桿菌中prs和ywlF基因，下調(diào)了Pur操縱子和PurR調(diào)控基因(glyA,guaC,pbuG,xpt-pbuX,yqhZ-folD,and pbuO)。

構(gòu)建以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌：在大腸桿菌中利用λ－Red同源重組技術(shù)敲除了pflB基因，然后導入ldhE基因(產(chǎn)乳酸基因，乳酸桿菌來源，GENWIZE公司合成)，方法是：通過EcoRI和PstI酶切、連接到pSB1C質(zhì)粒上然后將連有l(wèi)dhE基因的質(zhì)粒導入上述敲掉pflB基因的大腸桿菌中，氯霉素抗性進行篩選，篩選出正確的轉(zhuǎn)化子。

取構(gòu)建的高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌、構(gòu)建的以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌與希瓦氏菌混合，按照：

高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合；

以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照1:200的接菌比例混合。

實施例3混合菌群

構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1：在大腸桿菌中導入ribABDEC基因簇；

構(gòu)建以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2：在大腸桿菌中利用λ－Red同源重組技術(shù)敲除了pflB基因，然后導入ldhE基因(產(chǎn)乳酸基因，乳酸桿菌來源，GENWIZE公司合成)，方法是：通過EcoRI和PstI酶切、連接到pSB1C質(zhì)粒上然后將連有l(wèi)dhE基因的質(zhì)粒導入上述敲掉pflB基因的大腸桿菌中，氯霉素抗性進行篩選，篩選出正確的轉(zhuǎn)化子。

取構(gòu)建的高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1、構(gòu)建的以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2與希瓦氏菌混合，按照：

高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照不超過1:1的接菌比例混合；

以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合。

實施例4混合菌群

構(gòu)建高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1：在大腸桿菌中導入ribABDEC基因簇；

構(gòu)建以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2：在大腸桿菌中利用λ－Red同源重組技術(shù)敲除了pflB基因，然后導入ldhE基因(產(chǎn)乳酸基因，乳酸桿菌來源，GENWIZE公司合成)，方法是：通過EcoRI和PstI酶切、連接到pSB1C質(zhì)粒上然后將連有l(wèi)dhE基因的質(zhì)粒導入上述敲掉pflB基因的大腸桿菌中，氯霉素抗性進行篩選，篩選出正確的轉(zhuǎn)化子。

取構(gòu)建的高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1、構(gòu)建的以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2與希瓦氏菌混合，按照：

高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌1與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照1:20的接菌比例混合；

以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌2與產(chǎn)電菌希瓦氏菌按照不超過1:200的接菌比例混合。

實施例5微生物產(chǎn)電體系

陰極：鐵氰化鉀(sigma公司購買)溶液；

陽極：分別取希瓦氏菌、希瓦氏菌+大腸桿菌2(以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌)、實施例3制備的希瓦氏菌+大腸桿菌2(以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌)+大腸桿菌1(高產(chǎn)核黃素的大腸桿菌)；

兩級中間夾著一層質(zhì)子交換膜(杜邦公司購買)；

中間的導線連著2k電阻，在瓶內(nèi)和導線連著多孔碳布作為電極(陽極為2.5cm x 2.5cm，陰極為2.5cm x 3cm)。

實驗順序：(1)先進行陽極和陰極組裝(中間不加質(zhì)子交換膜)，插入電極，不連電阻，裝好后進行滅菌(121℃15min)烘干，加入配好的陰極液，然后在陽極加入混合好的培養(yǎng)液(在配好的基本培養(yǎng)基中加入HEPES、硝酸鹽、葡萄糖)，計算培養(yǎng)好的菌體濃度，離心，用陽極里面的培養(yǎng)液重懸菌體，將其加入電池中，加入順序為希瓦氏－大腸桿菌－大腸桿菌，最后裝上電阻。放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-15小時拿出，用萬用表測電壓。在摸索條件的過程中，每隔4小時從瓶子中取500uL左右的液體，離掉其中的菌體，過濾，用HPLC(高效液相色譜)檢測其中關(guān)鍵代謝物的含量，同時使用pH試紙檢測體系的pH是否處于中性狀態(tài)。

其中，培養(yǎng)液包括：

結(jié)果：電池接好后，放入30℃培養(yǎng)箱，每隔4或8小時取出，用萬用表紀錄數(shù)據(jù)，紀錄每次通過萬用表紀錄的電壓值，繪制成時間－電壓曲線。

見表1和圖1。

表1數(shù)據(jù)結(jié)果

從圖1可以看出，產(chǎn)電菌不能利用葡萄糖，產(chǎn)電量很低，不超過100mV且48小時后產(chǎn)電基本停止。希瓦氏菌和大腸桿菌兩種菌共培養(yǎng)條件下產(chǎn)電量最高達到250mV，在200mV出穩(wěn)定近100小時，本專利發(fā)明的三種菌(發(fā)酵菌為大腸桿菌，產(chǎn)電菌為希瓦氏菌)的微生物燃料電池在產(chǎn)電量上有很好的提升(超過350mV)，持續(xù)時間超過100小時。

實施例6微生物產(chǎn)電體系

陰極：鐵氰化鉀(sigma公司購買)溶液；

陽極：分別取希瓦氏菌、希瓦氏菌+大腸桿菌(以五碳糖、六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌)、實施例1制備的希瓦氏菌+大腸桿菌(以五碳糖、 六碳糖為碳源生產(chǎn)小分子酸的大腸桿菌)+枯草芽孢桿菌(高產(chǎn)核黃素的枯草芽孢桿菌)；

兩級中間夾著一層質(zhì)子交換膜(杜邦公司購買)；

中間的導線連著2k電阻，在瓶內(nèi)和導線連著多孔碳布(陽極為2.5cm×2.5cm，陰極為2.5cm×3cm)。

實驗順序：(1)先進行陽極和陰極組裝(中間不加質(zhì)子交換膜)，插入電極，不連電阻，裝好后進行滅菌(121℃15min)烘干，加入配好的陰極液，然后在陽極加入混合好的培養(yǎng)液(在配好的基本培養(yǎng)基中加入HEPES、硝酸鹽、葡萄糖)，計算培養(yǎng)好的菌體濃度，離心，用陽極里面的培養(yǎng)液重懸菌體，將其加入電池中，加入順序為希瓦氏－大腸桿菌－枯草芽孢桿菌，最后裝上電阻。放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2-15小時拿出，用萬用表測電壓。在摸索條件的過程中，每隔4小時從瓶子中取500uL左右的液體，離掉其中的菌體，過濾，用HPLC(高效液相色譜)檢測其中關(guān)鍵代謝物的含量，同時使用pH試紙檢測體系的pH是否處于中性狀態(tài)。

其中，培養(yǎng)液包括：

結(jié)果：電池接好后，放入30℃培養(yǎng)箱，每隔4或8小時取出，用萬用表紀錄數(shù)據(jù)，紀錄每次通過萬用表紀錄的電壓值，繪制成時間－電壓曲線。

見表2和圖2。

表2數(shù)據(jù)結(jié)果

如圖2所示，產(chǎn)電菌不能利用葡萄糖，產(chǎn)電量很低，不超過100mV且48小時后產(chǎn)電基本停止。本專利發(fā)明的三種菌(發(fā)酵菌為大腸桿菌和枯草芽孢桿菌，產(chǎn)電菌為希瓦氏菌)的微生物燃料電池在產(chǎn)電量上有很好的提升(最高可以達到520mV)，持續(xù)時間超過100小時。

實施例7燃料電池體系的優(yōu)化

燃料電池為陰陽兩個瓶子(裝置圖詳見圖5)，綠色的陰極鐵氰化鉀(sigma公司購買)溶液，兩個瓶子中間夾著一層質(zhì)子交換膜(杜邦公司購買)，陽極為菌液，中間的導線連著2k電阻，在瓶內(nèi)和導線連著多孔碳布(陽極為2.5cm×2.5cm，陰極為2.5cm×3cm)。實驗順序：(1)先進行瓶子組裝(中間不加質(zhì)子交換膜)，插入電極，不連電阻，裝好后進行滅菌(121℃15min)烘干，加入配好的陰極液，然后在陽極加入混合好的培養(yǎng)液(在配好的基本培養(yǎng)基中加入HEPES、硝酸鹽、葡萄糖)，計算培養(yǎng)好的菌體濃度，離心，用 陽極里面的培養(yǎng)液重懸菌體，將其加入電池中，加入順序為希瓦氏－大腸桿菌－大腸桿菌(或枯草芽孢桿菌)，最后裝上電阻。放入30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔一定時間拿出，用萬用表測電壓。在摸索條件的過程中，每隔4h從瓶子中取500uL左右的液體，離掉其中的菌體，過濾，用HPLC(高效液相色譜)檢測其中關(guān)鍵代謝物的含量，同時使用pH試紙檢測體系的pH是否處于中性狀態(tài)(因為產(chǎn)電菌的耐受范圍為pH：6.2-7，pH一般要控制在6.5～6.8以上)。

其中，培養(yǎng)液包括：

菌液：

1#是希瓦氏菌+小分子酸(外添加乳酸鈉)；

2#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)

3#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)——實施例3制備；

4#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)——實施例1制備；

結(jié)果：紀錄每次通過萬用表紀錄的電壓值，繪制成時間－電壓曲線，結(jié)果見圖4。

測定接菌比例和pH值對燃料電池產(chǎn)電的影響：

測體系pH，如圖3所示：

檢測電池陽極的pH，結(jié)果如圖3所示，1號希瓦氏菌+小分子酸，體系基本維持中性，2號希瓦氏菌+大腸桿菌體系pH和標準pH試紙對照，認為pH低于5.4，3號希瓦氏菌希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)(產(chǎn)電菌：發(fā)酵菌＝(1～10):1)，和標準pH試紙相比，pH接近5.4，偏酸性。4#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)(產(chǎn)電菌：發(fā)酵菌大于20:1)，和標準pH試紙相比，pH接近6.2，仍偏酸性。

結(jié)論：

1#是希瓦氏菌+小分子酸(外添加乳酸鈉)，體系pH為中性；

2#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)，pH較低，影響產(chǎn)電；

3#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)(產(chǎn)電菌：發(fā)酵菌＝(1～10):1)，pH較2#好一些，但仍然偏酸，造成體系開始電量很快上升，但由于發(fā)酵菌產(chǎn)生小分子酸的積累，不是產(chǎn)電菌的生存和產(chǎn)電的環(huán)境，造成產(chǎn)電菌無法產(chǎn)電甚至死亡。

4#是希瓦氏菌+大腸桿菌(發(fā)酵菌1，產(chǎn)小分子酸)+大腸桿菌(發(fā)酵菌2產(chǎn)核黃素)(產(chǎn)電菌：發(fā)酵菌大于20:1)，發(fā)酵菌比例較小，產(chǎn)酸量較少，對體系影響相對于3#要小一些，電量更高。經(jīng)過優(yōu)化，加入了1×HEPES，保證體系的pH在中性范圍左右，適合產(chǎn)電菌的生存，同時降低了體系內(nèi)發(fā)酵菌的比例，避免小分子酸在開始時的過量積累(緩慢產(chǎn)生，緩慢消耗)，延長了產(chǎn)電時間，結(jié)果如圖2所示。

關(guān)于葡萄糖濃度，主要是對產(chǎn)酸的量的影響，產(chǎn)電菌總共需要的小分子酸的量很少，嘗試10g/L的葡萄糖初始濃度，產(chǎn)的小分子酸過多，無法繼續(xù)試驗。逐漸降低到10g/L以下。(中間取樣測葡萄糖的消耗和產(chǎn)乳酸的情況的曲線，基本情況是乳酸一直就有且夠用)，因此減少葡萄糖的量就是為了控制產(chǎn)酸的量，防止產(chǎn)電菌代謝不了過多造成的酸積累影響體系pH。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。