本發(fā)明屬于柑橘類植物生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體的，涉及柑橘類植物Cit sh1基因啟動子、分子標記及應(yīng)用，通過該分子標記對柑橘類植物(包括本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚等)進行檢測，得出該柑橘類植物是否誘發(fā)人體上火的結(jié)論。該分子標記可以將上火柑橘品種和不上火柑橘品種有效地區(qū)分開來，并且可為柑橘育種選育不上火品種奠定基礎(chǔ)。

背景技術(shù)：

“上火”(熱量增加)是一個非常流行的中醫(yī)概念，起源于傳統(tǒng)的中醫(yī)理論，在亞洲被人們所熟知?！吧匣稹卑Y狀主要包括嘴唇干裂、口腔灼熱、嘴唇和喉嚨發(fā)癢腫脹、臉變紅、便秘、腹瀉，體溫升高等【13】。兩千年以來，中國和印度人都堅信相對于人的身體來講，食物有“熱性”和“寒性”之分。這個區(qū)分和食物本身的溫度沒有關(guān)系，主要是就它們對食用者產(chǎn)生的影響而言的。人體很多生理、疾病狀態(tài)都和“熱性”、“寒性”相關(guān)，而和自身的體溫無關(guān)【3,13】。傳統(tǒng)上，人們認為荔枝、龍眼、寬皮柑橘、榴蓮、椰子、花生等是“熱性”食物，過量食用(劑量依賴性)會誘導產(chǎn)生“上火”癥狀。很多人都有過“上火”的經(jīng)歷，嚴重影響了他們的生活質(zhì)量。“上火”患者堅信食物不耐受是導致他們產(chǎn)生“上火”癥狀的主要原因，并且飲食上剔除某些“熱性”食物可以有效地緩解他們的癥狀。

柑橘果實富含維生素C、類胡蘿卜素，類黃酮和類檸檬苦素類等多種生物活性功能成分【11】，具有抗氧化、抗癌、預防心腦血管疾病等作用【4,5,12】，是含功能性成分最多的保健水果之一。另外，柑橘是世界上栽培面積最廣泛以及消費最多的水果之一，在很多國家，柑橘以三種主要形式存在于人們的日常飲食中：鮮食、果汁以及罐頭。在中國，柑橘品種繁多，但歷來以寬皮柑橘為主，從產(chǎn)量上看，寬皮柑橘、橙、柚的比例分別為73.1％、13.5％以及12.2％【14】。經(jīng)驗上，溫州蜜柑(寬皮柑橘)被認為是“熱性”食物，容易引起“上火”；甜橙、柚不引起“上火”。因此，過多食用溫州蜜柑果實后，很多食用者會出現(xiàn)“上火”癥狀，從而限制了柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展以及柑橘營養(yǎng)功能的發(fā)揮。

“上火”是中醫(yī)概念，在中國被廣為接受，國際上尚未有報道；“過敏”是國際上報到最多的由水果誘導的疾病。水果過敏最常見的癥狀是口腔反應(yīng)，該癥狀發(fā)病輕微，僅出現(xiàn)在口腔部位，表現(xiàn)為發(fā)癢、腫脹等，稱 為口腔過敏綜合征(oral allergy syndrome,OAS)【8】,與“上火”出現(xiàn)的口腔癥狀非常相似。目前，國際上已分離出三種柑橘過敏原：Cit s 1(orange germin-like glycoprotein)、Cit s 2(profilin)、Cit s 3(lipid transfer protein)。Cit s 1和Cit s 3均可以從甜橙果肉、果皮中分離得到，SDS-PAGE和免疫檢測揭示，它們在果皮和果肉中含量相當；Cit s 2亦存在于甜橙果肉、果皮，其在果肉中的含量遠高于果皮【1,2,7】。桃果實中與上述過敏原相對應(yīng)的蛋白質(zhì)是Pru p 1～Pru p 3，其中，Pru p 1在果皮和果肉中的平均含量分別為0.62ug/g、0.26ug/g鮮重；相應(yīng)的，Pru p 3平均含量分別為132.86ug/g、0.61ug/g鮮重，表明Pru p 3主要存在于果皮中【9】。

盡管上述柑橘過敏原(蛋白質(zhì))在一定程度上揭示了導致柑橘類水果誘發(fā)過敏的原因，能夠在一定程度上對柑橘類水果提前進行過敏篩選，但這些過敏原往往并不是“上火”癥狀的主要誘因，過敏反應(yīng)是機體自身的一種免疫反應(yīng)，與攝入量無關(guān)，而“上火”癥狀既與攝入的水果類別有關(guān)，又與攝入量有關(guān)，并且，這些已發(fā)現(xiàn)的過敏原大部分位于果皮中，而大部分柑橘類水果主要是食用它們的果肉部分，對在實際中過敏篩選的效果并不明顯。此外，由于過敏涉及的過敏原種類較多，且與機體(如人體)自身條件有關(guān)，人體對柑橘類水果過敏的案例較為罕見，而“上火”反應(yīng)在人群中發(fā)生則較為普遍，因此，為減小柑橘類水果誘發(fā)的“上火”反應(yīng)，在柑橘育種選育中對柑橘類植物“上火”性狀的篩選更加必要。

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技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)的以上缺陷或改進需求，本發(fā)明的目的在于提供一種柑橘類植物Cit sh1基因的啟動子、分子標記及應(yīng)用，其中通過對關(guān)鍵的易誘發(fā)人體“上火”反應(yīng)相關(guān)蛋白對應(yīng)的Cit sh1基因啟動子進行克隆，對特異性引物等進行改進，與現(xiàn)有技術(shù)相比能夠有效解決現(xiàn)有的分子標記無法判斷柑橘類植物是否誘發(fā)人體“上火”的問題，并且該分子標記可以將上火柑橘品種和不上火柑橘品種有效地區(qū)分開來，為例如柑橘育種選育不上火品種提供支持。

為實現(xiàn)上述目的，按照本發(fā)明的一個方面，提供了一種柑橘類植物Cit sh1基因的啟動子，其特征在于，該啟動子由SEQ ID:1～SEQ ID:6中任意一條的核苷酸序列組成。

按照本發(fā)明的又一個方面，提供了一種基于柑橘類植物Cit sh 1基因啟動子序列差異的分子標記，其特征在于，該分子標記是通過特異性引物進行PCR擴增得到的，所述特異性引物的正向引物的堿基序列優(yōu)選為ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的堿基序列優(yōu)選為AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

按照本發(fā)明的又一個方面，提供了一種上述分子標記在檢測和區(qū)分柑橘類植物是否引起炎癥中的應(yīng)用。

按照本發(fā)明的又一個方面，提供了一種特異性引物，其特征在于，該特異性引物為第一類引物、第二類引物和第三類引物中的任意一種，其中，

所述第一類引物，其正向引物的堿基序列優(yōu)選為GAGCTGGAACGTATTGGTG，反向引物的堿基序列優(yōu)選為TTCTGTGGTTCTAAGGCTGT；

所述第二類引物，其正向引物的堿基序列優(yōu)選為TCTTCAACTTCCTCAATCGC，反向引物的堿基序列優(yōu)選為ATCTTCTTATATCCGATTCCC；

所述第三類引物，其正向引物的堿基序列優(yōu)選為ATTCTGGGAAATCAGGTGG，反向引物的堿基序列優(yōu)選為AGAGGCTAGAAGCTCAATGTA。

按照本發(fā)明的另一個方面，提供了上述特異性引物作為柑橘類植物Cit sh1基因相關(guān)引物的應(yīng)用，其中，所述第一類引物用于克隆如權(quán)利要求1所述的啟動子，所述第二類引物用于柑橘類植物Cit sh1基因的熒光定量PCR，所述第三類引物用于進行PCR擴增得到如權(quán)利要求2所述基于柑橘類植物Cit sh 1基因啟動子序列差異的分子標記。

通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，能夠取得以下有益效果：

1.本發(fā)明通過對柑橘類植物Cit sh1基因的啟動子進行克隆，得出共6條柑橘類植物Cit sh1基因的啟動子序列(如SEQ ID:1～SEQ ID:6所示)。除了啟動子本身的作用外，還可對這些啟動子特定位點核酸序列進行重組，使重組后的序列中含有上述啟動子或其片段，這樣就可以使位于啟動子下游的目的基因(即Cit sh1基因)在柑橘類植物的組織中特異性表達，作為如分析、開發(fā)、改造柑橘類植物組織特性的研究模型。另外，還可以利用已有的分子生物學操作技術(shù)獲得包含目的片段的重組核酸，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)對Cit sh1基因進行敲除，降低柑橘類植物中上火基因的表達。

2.本發(fā)明中的分子標記針對柑橘類植物(如橘、柑、柚、橙等)，能快速識別該柑橘類植物是否能誘發(fā)人體上火反應(yīng)。通過獲得溫州蜜柑果肉“上火”相關(guān)蛋白，并根據(jù)測序獲得的氨基酸序列搜索甜橙數(shù)據(jù)庫(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)，得到誘發(fā)人體上火反應(yīng)蛋白質(zhì)對應(yīng)的Cit sh1基因序列。本發(fā)明以本地早、國慶1號、紅夏橙和高斑柚果實不同組織(果肉、白皮層和黃皮層)為材料，著重對Cit sh1基因表達模式進行了研究。由于基因的表達模式受啟動子調(diào)控，故本發(fā)明同時以上述四個品種葉片為材料，分離克隆Cit sh1基因啟動子。在基因表達分析和啟動子克隆過程中得到相應(yīng)特異性引物，即第一類引物(其堿基序列包括SEQ ID:8～SEQ ID:9，其中SEQ ID:8對應(yīng)正向引物，SEQ ID:9對應(yīng) 反向引物)、第二類引物(其堿基序列包括SEQ ID:10～SEQ ID:11，其中SEQ ID:10對應(yīng)正向引物，SEQ ID:11對應(yīng)反向引物)、第三類引物(其堿基序列包括SEQ ID:14～SEQ ID:15，其中SEQ ID:14對應(yīng)正向引物，SEQ ID:15對應(yīng)反向引物)和第四類引物(其堿基序列包括SEQ ID:12～SEQ ID:13，其中SEQ ID:12對應(yīng)正向引物，SEQ ID:13對應(yīng)反向引物)；利用上述第三類特異性引物進行PCR擴增最終得到分子標記，該分子標記是針對柑橘類植物Cit sh1基因啟動子，即針對上火柑橘品種與不上火柑橘品種Cit sh1啟動子序列之間的差異，能夠?qū)χ参?尤其是柑橘類植物)是否誘發(fā)人體上火等炎癥進行快速識別。

3.本發(fā)明中的分子標記應(yīng)用在檢測和區(qū)別柑橘類植物是否引起炎癥(即是否誘發(fā)人體上火)時，能夠快速檢測，檢測的準確性高。由于不同的柑橘品種其表現(xiàn)的“上火”性狀差異較大，對于上火型的柑橘品種，人們的上火反應(yīng)往往比較普遍，因此檢測柑橘類植物是否誘發(fā)上火反應(yīng)的分子標記具有良好的實用價值。本發(fā)明中的分子標記是通過特異性引物進行PCR擴增得到的，針對不同的柑橘類植物，本發(fā)明共提供了四類特異性引物，能夠應(yīng)用于絕大部分柑橘類植物中的Cit sh1基因及其啟動子。

附圖說明

圖1是熒光定量PCR檢測本地早、溫州蜜柑(國慶1號)、紅夏橙和高斑柚果肉、白皮層和黃皮層Cit sh1基因表達情況；“*”表示與其它樣品相比具有顯著性差異(P<0.01)；

圖2是熒光定量PCR檢測溫州蜜柑葉片、溫州蜜柑果肉、甜橙果肉、柚子果肉中Cit sh1基因表達情況；“*”表示與其它樣品相比具有顯著性差異(P<0.01)；

圖3是Cit sh1啟動子序列以及小衛(wèi)星相對位置示意圖。A圖是重復單元在Cit sh1R2型啟動子中的相對位置；B圖是R1型(同時存在于上火和不上火柑橘品種中)和R2型(僅存在于上火柑橘品種中)啟動子間的區(qū)別。

圖4是本發(fā)明中的分子標記在本地早(圖中序號為1)、國慶1號(圖中序號為2)、紅夏橙(圖中序號為3)以及高斑柚(圖中序號為4)中的應(yīng)用；

圖5是本發(fā)明中的分子標記在26個柑橘品種中的應(yīng)用。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可 以相互組合。

本發(fā)明中分子標記的設(shè)計遵循以下步驟：

(1)首先，通過分析、篩選、比對等方法獲得柑橘類植物中“上火”相關(guān)蛋白氨基酸序列(得出的具體氨基酸序列可見SEQ ID:16～SEQ ID:18)，搜索甜橙數(shù)據(jù)庫，得到與這些“上火”相關(guān)蛋白氨基酸對應(yīng)的Cit sh1基因序列(現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫尚未對該基因序列的功能進行注釋)，該Cit sh1基因序列如SEQ ID:7所示；

(2)對本地早、國慶1號、紅夏橙、高斑柚果肉、白皮層和黃皮層Cit sh1基因進行熒光定量PCR，檢測該基因在不同柑橘品種和部位的表達情況；

(3)利用同源克隆法克隆本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚中Cit sh1啟動子的核苷酸序列；

(4)對得到的8條啟動子序列進行比對分析；

(5)根據(jù)啟動子序列差異設(shè)計分子標記引物。

為了對該基因的“上火”特性進行研究，上述分子標記的設(shè)計過程中選取了4個不同的柑橘品種(即，本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚)，其中本地早和國慶1號傳統(tǒng)上被認為容易誘導人體產(chǎn)生“上火”；紅夏橙和高斑柚則不易引起“上火”。對上述四個柑橘品種Cit sh1基因的表達情況進行分析，發(fā)現(xiàn)其在果肉中的表達量最高，且在國慶1號的表達量高于其它品種，差異顯著(區(qū)別于背景技術(shù)中過敏原的分布)，由于基因的表達模式受啟動子調(diào)控，故本發(fā)明還以本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚的葉片為材料，分離克隆Cit sh1基因啟動子。

在具體操作過程中發(fā)現(xiàn)，通過基因克隆技術(shù)從4個柑橘品種(即本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚)共分離得到8條Cit sh1基因啟動子序列，這8條序列高度雜合。柑橘在雜交的過程中高度雜合，故在克隆啟動子序列時，1個柑橘品種可能克隆得到2條啟動子序列。比對這8條啟動子序列(其中有2組序列重復，因此只有6條啟動子序列)，發(fā)現(xiàn)存在3種啟動子類型。第1種啟動子類型(如SEQ ID:6所示序列)僅存在于高斑柚中；第2種啟動子類型(如SEQ ID:2～SEQ ID:5所示序列)存在于所有4個柑橘品種中，并且只有為數(shù)不多的差異；第3種啟動子類型(如SEQ ID:1所示序列)只存在于上火柑橘品種中，有100bp片段插入。

另外，上火相關(guān)基因Cit sh1在溫州蜜柑果肉中特異性表達，其表達量顯著高于果實其它部位以及其它柑橘品種，而第3種類型啟動子只存在于上火柑橘品種中(本地早和國慶1號)，故根據(jù)該100bp插入片斷設(shè)計引物，開發(fā)分子標記，用于區(qū)分上火柑橘品種以及不上火柑橘品種。

下面以具體實施例對本發(fā)明進行說明，以下實施例中未注明具體實驗條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，如分子克隆(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd ed.)或植物分子生物學－實驗手冊(Plant Molecular Biology－A Laboratory Manual,Melody S.Clark編，Springer-verlag Berlin Heidelberg,1997)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1 在不同柑橘品種中對Cit sh1基因的表達情況進行分析

通過分析、篩選、比對等方法獲得柑橘類植物中“上火”相關(guān)蛋白氨基酸序列(例如，可利用酚提法提取柑橘類植物果汁中的總蛋白，再利用凝膠色譜柱以及高效液相色譜法對蛋白進行精細提取，可將提取到的精細蛋白進一步處理巨噬細胞RAW 264.7細胞系，通過檢測其中的環(huán)氧合酶-2的轉(zhuǎn)錄水平來判斷各個精細蛋白是否對應(yīng)“上火”相關(guān)蛋白)；

利用已經(jīng)公布的甜橙和克里曼丁(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.htmL)基因組數(shù)據(jù)庫，獲取與“上火”相關(guān)蛋白氨基酸對應(yīng)的Cit sh1基因序列信息，根據(jù)保守序列設(shè)計用于實時定量PCR(Real-time PCR，即熒光定量PCR)分析的引物(見表3，或序列SEQ ID:10～SEQ ID:13)，其中F1和R1是對Cit sh1基因進行相對定量擴增的引物(即第二類引物)，而A-F和A-R是對內(nèi)參基因actin進行擴增的引物(即第四類引物)。

柑橘果肉、果皮總RNA提取可參照劉慶(Liu Q,Xu J,Liu Y,Zhao X,Deng X,Guo L,Gu J.A novel bud mutation that confers abnormal patterns of lycopene accumulation in sweet orange fruit(Citrus sinensis L.Osbeck).J Exp Bot,2007,58(15-16):4161-4171)的方法。

首先進行初提?。孩?向10mL離心管(DEPC水浸泡后滅菌)中加入5mL Trizol抽提液(見表1)；⑵.液氮研磨好樣品后，稱取適量(0.5-1g)樣品加入抽提液中；⑶.上下劇烈振蕩混勻30s，室溫靜置15min；⑷.加入2-3mL氯仿，劇烈振蕩15-30s后，室溫靜置10min；⑸4℃，11000g離心15min，取上清液至另一10mL離心管中；⑹.重復步驟4和5各一次；⑺.加入等體積冷凍異丙醇，混勻后靜置5-10min；⑻.4℃，11000g離心20min，棄上清；⑼.沉淀用預冷的75％乙醇(滅菌DEPC水配制)漂洗，并浸泡30min；(10).10000g離心5min，棄乙醇后，稍風干后進入純化步驟。

純化步驟包括：⑴.加入400μL TESAR(見表1)，充分渦旋溶解上述沉淀物，渦旋時間至少3min；⑵.分別加入400μL Bu/CTAB(見表1)和Aq/CTAB(見表1)，渦旋3min；⑶.將混合液轉(zhuǎn)移至1.5mL的離心管中(DEPC水處理后滅菌)；⑷.室溫下，15000g離心10-15min；⑸.離心后溶液分成兩層，將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一個新的1.5mL離心管中；⑹.再加入350μL的0.2M NaCl溶液，充分混勻，4℃，10000g離心8min；⑺.離 心后溶液分為兩層，將下層溶液轉(zhuǎn)移至另一新的1.5mL離心管中，加入50μL 3M NaAc和1mL預冷無水乙醇，-80℃冰凍1h；4℃15000g離心30min，棄上清，稍風干；⑻.加30-100μL滅菌DEPC水溶解；⑼.電泳檢測(如，120V，15min)總RNA質(zhì)量，NanoDrop1000測定總RNA濃度；RNA于-80℃保存。

表1 RNA提取試劑

反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)步驟：將上述總RNA用DNaseI(Invitrogen,美國)處理30分鐘以去除基因組DNA污染。然后將RNA樣品按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Fermentas,Lithuania)的操作方法反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA：取1-1.5μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板(20μL體系)，反轉(zhuǎn)錄完成后加入80μL滅菌雙蒸水(ddH₂O)稀釋，存于-20℃冰箱備用。

基因的表達：基因的表達分析在ABI7500實時定量PCR儀(Applied Biosystems,CA,USA)上完成?；驍U增體系見表2，擴增的反應(yīng)程序如下：50℃2min，95℃10min，[95℃15s，60℃1min](其中中括號部分共進行40次循環(huán))。每個樣品的cDNA擴增反應(yīng)進行3次獨立重復?；虻谋磉_量采用2^-△△Ct方法計算【6】。之后使用SPSS軟件對各表達量進行顯著性分析(P<0.01)。

表2 實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cit sh1在溫州蜜柑(國慶1號)的果肉中表達量最高，與溫州蜜柑白皮層、黃皮層中Cit sh1表達量存在顯著性差異(P<0.01),并且與紅夏橙、高斑柚汁胞、白皮層以及黃皮層中Cit sh1表達量也存在顯著性差異(P<0.01)(如圖1所示)；Cit sh1在溫州蜜柑的果肉中表達量與其葉片，甜橙(即紐荷爾臍橙)、柚子(即琯溪蜜柚)果肉相比，亦存在顯著性差異(P<0.01)(如圖2所示)，表明Cit sh1是溫州蜜柑果肉特異性表達基因。

實施例2 Cit sh1啟動子的克隆

柑橘基因組DNA提取

DNA buffer的配制：先分別配制0.5M EDTA(pH8.0)，1M Tris-HCl(pH8.0)，5M NaCl，再將上述3種試劑與ddH₂O以1:1:3:5的比例混合，滅菌后于室溫下保存?zhèn)溆?。用時按2％的比例往buffer中加入CTAB，65℃水浴條件下使其充分溶解；在通風櫥里加入1％的巰基乙醇(現(xiàn)配現(xiàn)用)。柑橘基因組DNA采用改良CTAB法(可參見程運江，柑橘體細胞胞質(zhì)遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)研究，華中農(nóng)業(yè)大學博士學位論文)小量提?。?/p>

1)取0.5g葉片，加入適量液氮研碎，轉(zhuǎn)入至預冷的1.5mL離心管中，加入600μL含有CTAB及巰基乙醇的DNA buffer，充分搖勻，于65℃水浴60～90min，中途輕輕搖勻2-3次，避免葉片褐化。

2)加入700μL氯仿:異戊醇(24:1)，上下晃動10min，充分混勻，10000g離心10min。

3)吸取上清液至另一離心管中，依次加入60μL 5M NaCl，1mL預冷無水乙醇，輕輕顛倒混勻，于-20℃冰凍30min沉淀DNA。

4)10000g離心5min，棄上清，加入1mL70％乙醇室溫浸泡沉淀2h或過夜。

5)10000g離心5min，棄上清，稍風干，加入50μL 1×TE充分溶解。每管加2μL 5mg/mL RNase，37℃水浴6h或過夜，以去除RNA污染。

6)分光光度計檢測DNA濃度，瓊脂糖凝膠檢測DNA質(zhì)量。

根據(jù)同源克隆法獲得Cit sh1基因的啟動子。利用已經(jīng)公布的甜橙基因組數(shù)據(jù)庫，獲取Cit sh1基因啟動子序列信息，即Cit sh1基因上游2kb區(qū)域，據(jù)此設(shè)計引物，正向引物MF1和反向引物MR1(見表3)，從本地早、國慶1號、紅夏橙以及高斑柚葉片中分離Cit sh1基因啟動子。啟動子利 用快速酶(TransGen，北京全式金生物)進行擴增，擴增體系：10μL 5×NF Buffer，2.5μL 10μM MF1和MR1引物，1μL FastPfu酶，1μL 10mM dNTP,1μL DNA模板(<500ng)，加滅菌去離子水補至50μl。PCR反應(yīng)程序見表4。表3中的MF1、MR1即對應(yīng)第一類引物，F(xiàn)1、R1即對應(yīng)第二類引物，AaF、AaR即對應(yīng)第三類引物，A-F、A-R即對應(yīng)第四類引物。

表3 本發(fā)明設(shè)計的相關(guān)引物的核苷酸序列

PCR結(jié)束后，利用1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，利用 凝膠回收試劑盒(購自O(shè)mega公司，美國)回收特異DNA條帶，回收步驟參照使用說明書進行。回收純化的DNA溶液與pMD18-T載體(購自TaKaRa公司，中國)進行連接反應(yīng),按說明書操作,連接反應(yīng)總體積是10μL：5μL的solutionⅠ，4μL的回收產(chǎn)物，1μL T載體。4℃連接過夜。取10μL連接產(chǎn)物，采用熱擊法【10】轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，大腸桿菌涂布在含有50mg/L氨芐霉素的LB固體平板上，37℃倒置培養(yǎng)(約14-16h)，挑取轉(zhuǎn)化平板上生長出的單菌落，接種于含50mg/L氨芐霉素的液體LB中，37℃190r/min培養(yǎng)過夜(7-9h)，吸取1μL菌液作為擴增的模板，進行PCR驗證。挑選10個陽性克隆測序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)。

表4 啟動子克隆PCR反應(yīng)條件

實施例3 分子標記的開發(fā)與應(yīng)用

分別對每個品種的10個陽性克隆序列進行比對，挑選測序正確的序列，柑橘的基因組序列高度雜合，故發(fā)現(xiàn)每個品種有2條啟動子序列，4個品種共得到8條啟動子序列。比對這8條啟動子序列發(fā)現(xiàn)，本地早中1條序列和國慶1號中的1條序列一模一樣，另1條序列和紅夏橙中的1條序列一模一樣。綜合可得，從4個柑橘品種中共克隆得到6條啟動子序列。這6條啟動子序列共顯示了3種不同的啟動子類型。第1種啟動子類型(如SEQ ID:6所示序列)僅存在于高斑柚中，其在翻譯起始位點上游650bp左右有一段45bp片段插入；第2種啟動子類型(如SEQ ID:2～SEQ ID:5所示序列)存在于所有4個柑橘品種中，并且只有為數(shù)不多的差異。例如，對比國慶1號和本地早該序列，發(fā)現(xiàn)國慶1號中存在3個堿基缺失，7個堿基置換；第3種啟動子類型(如SEQ ID:1所示序列)只存在于上火柑橘品種中，在翻譯起始位點上游1123bp左右有一段100bp片段插入，該100bp片段中有97bp是一段重復序列，在其原始序列下游3bp處(圖3A)，根據(jù)插入序列片段大小，我們將這段重復序列稱之為小衛(wèi)星，存在于所有4個柑橘品種中的啟動子序列只含有一個重復單元，我們稱之為R1啟動子(如SEQ ID:2～SEQ ID:6所示序列)，而僅存在于上火品種中的啟動子序列含有2個重復單元，我們稱之為R2啟動子(如SEQ ID:1所示序列)(圖3B)；故我們根據(jù)該小衛(wèi)星序列，設(shè)計了引物AaF和AaR,序列如表3所示，對4個柑橘品種啟動子區(qū)域進行PCR擴增，以檢驗AaF,AaR在區(qū)分柑橘上火品種與不上火品種中的有效性，PCR擴增體系：2μL 10×NH₄(SO₄)₂Buffer，1.2μL 25mM MgCl₂，0.5μL 10μM AaF和AaR引物，0.2μL Taq酶，0.4μL 10mM dNTP,1μL DNA模板，加滅菌去離子水補至20μl。PCR擴增程序如表5。結(jié)果如圖4所示，550bp片段代表R2啟動子，僅存在于上火柑橘品種(本地早、國慶1號)中，而450bp片段代表R1啟動子，存在于所有4個柑橘品種中，說明R2啟動子與柑橘上火相關(guān)，該分子標記可以很好地區(qū)分上火柑橘品種和不上火柑橘品種。

表5 分子標記PCR擴增條件

將上述開發(fā)的分子標記應(yīng)用于更多的柑橘品種，用以對柑橘上火性狀進行評價，同時對該分子標記在評價柑橘上火方面的適用性作最后驗證。 以26個柑橘品種DNA為模板，對它們的啟動子區(qū)域進行分子標記PCR擴增，品種名為：1.鄂柑1號；2.黔陽無核；3.本地早；4.南豐蜜橘；5.紅橘；6.皇陵廟橘；7.道縣野橘；8.克里曼?。?.國慶1號；10.國慶2號；11.國慶3號；12.國慶4號；13.錦橙；14.暗柳橙；15.雪柑；16.桃葉橙；17.奧林達夏橙；18.紅夏橙；19.紐荷爾臍橙；20.紅肉臍橙；21.塔羅科血橙；22.沙田柚；23.琯溪蜜柚；24.高斑柚；25.無酸柚；26.馬敘葡萄柚。結(jié)果如圖5所示。R2啟動子存在于所有上火柑橘品種中(僅有R2型啟動子，或同時包含R1和R2型啟動子)，而不上火柑橘品種只包含R1型啟動子。說明該分子標記可以有效地用于對柑橘的上火性狀進行評價，可為育種過程中選育不上火柑橘品種提供技術(shù)支撐。

綜上，本發(fā)明利用設(shè)計的引物對上述4個柑橘品種進行檢驗，發(fā)現(xiàn)該分子標記能夠很好的將上火品種與不上火品種區(qū)分開來。將該分子標記應(yīng)用于26個柑橘品種中，發(fā)現(xiàn)該分子標記能很好的應(yīng)用于柑橘中，可有效地區(qū)分上火品種與不上火品種。

本發(fā)明中的柑橘類植物，主要包括柑橘屬植物(如橘、柑、柚、橙等)，例如本發(fā)明實施例3所例舉的26個柑橘品種。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。