本發(fā)明提供一種靈芝多糖體的用途，特別是一種靈芝多糖體作為抑制肥胖的用途。
背景技術(shù)：
：長(zhǎng)期以來，肥胖被定義為與大多數(shù)的健康問題以及與減少壽命有關(guān)的疾病病癥。越來越多臨床數(shù)據(jù)顯示，肥胖與慢性發(fā)炎癥狀密切相關(guān)，且會(huì)導(dǎo)致胰島素抗性、第二型糖尿病、脂肪肝、心血管疾病、阻塞性呼吸暫停以及癌癥。然而，肥胖的發(fā)生機(jī)率很高，目前已經(jīng)成為威脅大眾健康的主要病癥之一，全球約有5億的肥胖者及14億的超重者。因此，預(yù)防肥胖已成為現(xiàn)今社會(huì)大眾的一大挑戰(zhàn)。對(duì)于肥胖及與其相關(guān)的代謝異常，目前使用了包括有抗生素與益菌素用于其治療。對(duì)缺乏瘦素基因的小鼠(ob/ob)或以高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠給予抗生素治療，可以改變腸道菌群、降低血液內(nèi)毒素血癥以及改善葡萄糖耐受性。此外，由于益菌素屬于不可消化但可被微生物利用的寡糖、多糖與膳食纖維，因此可藉由其促進(jìn)腸道中特定有益細(xì)菌的生長(zhǎng)，達(dá)成減少體重及發(fā)揮抗發(fā)炎的效果。益菌素不僅改變腸道菌群還能改善腸道緊密連接完整性，并降低脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)引起的血液內(nèi)毒素血癥。然而，基于人類肥胖發(fā)生率有越來越高的趨勢(shì)，以及肥胖在治療及預(yù)防上的困難，有需要以替代方法來預(yù)防、治療或控制此病癥。新的方法可引入至飲食中，不需要在生活方式有太大的改變且不會(huì)引起毒素或?qū)】涤胁涣嫉挠绊?。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明的一目的是提供一種靈芝多糖體制備抑制肥胖的藥物的用途，其中該靈芝多糖體的分子量是大于135kDa；且其中該靈芝 多糖體至少包含甘露糖(mannose)、葡萄糖(glucose)及半乳糖(galactose)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該靈芝多糖體進(jìn)一步包含巖藻糖(fucose)、鼠李糖(rhamnose)、阿拉伯糖(arabinose)及葡萄糖胺(glucosamine)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該靈芝多糖體中巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖以及甘露糖的質(zhì)量百分比的比例是為2:2:2:1:16:26:47至3:3:3:1:17:27:48。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該靈芝多糖體的重量平均分子量為846kDa，以及范圍是介于135kDa至5,364kDa之間，分子量分布指數(shù)(Mw/Mn)是6.25。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該靈芝多糖體的有效劑量為0.001至1,000mg/kg。本發(fā)明的另一目的是提供一種所述的靈芝多糖體的制備方法，包含：是由靈芝菌絲以水萃取，并續(xù)以醇類沉淀，再經(jīng)離心分離與濾膜過濾而得，其中(a)將靈芝菌絲與水混合并以低轉(zhuǎn)速萃取一預(yù)定時(shí)間，取上清液并將該上清液濃縮，以獲得靈芝水萃取濃縮物；(b)將該靈芝水萃取濃縮物加入醇類靜置一段時(shí)間以沉淀出靈芝多糖體粗萃取物；以及(c)將該靈芝多糖體粗萃取物離心后獲得沉淀物；以切向流過濾系統(tǒng)(tangentialflowfiltration,TFF)過濾該沉淀物，以獲得靈芝多糖體。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中該步驟(a)進(jìn)一步包含將該萃取液進(jìn)行高溫萃取步驟，該高溫萃取步驟是于高溫?cái)嚢枋椒磻?yīng)器萃取一預(yù)定時(shí)間，且該萃取上清液是以蒸發(fā)方式濃縮，以及該萃取液靈芝菌絲與水混合的比值為5％(w/v)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中步驟(b)該醇類是95％酒精，且該靈芝萃取濃縮液的濃度比值為20％(w/v)，且該20％(w/v)濃度比值的靈芝萃取濃縮液與95％酒精混合的體積比例為1:5，使該混合液最終酒精濃度比值為80％，以及該一段混合靜置時(shí)間是至少十六小時(shí)。在本發(fā)明的一實(shí)施例中，其中步驟(c)切向流過濾系統(tǒng)由0.2μm中空纖維膜過濾及300kDa超限濾膜(50cm2)TFF的組合進(jìn)行劃分過濾。給予一個(gè)體本發(fā)明的靈芝多糖體可減少體重、附睪脂肪及皮下脂肪 的蓄積；亦能達(dá)到預(yù)防、治療肥胖及抑制脂肪堆積的功效。因此，本發(fā)明的靈芝多糖體為一種預(yù)防、治療肥胖的新策略。以下將配合圖式進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)施方式，以下所列舉的實(shí)施例是用以闡明本發(fā)明，并非用以限定本發(fā)明的范圍，任何熟習(xí)此技藝者，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，當(dāng)可做些許更動(dòng)與潤(rùn)飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍當(dāng)視后附的申請(qǐng)專利范圍所界定者為準(zhǔn)。附圖說明圖1是本發(fā)明的靈芝多糖體的萃取流程圖。圖2是本發(fā)明利用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈沖式安培檢測(cè)器(highperformanceanionexchangechromatography-pulsedamperometricdetection，HPAEC-PAD)分析靈芝多糖體分餾液(G1)中的單糖組成。移動(dòng)相為16mMNaOH，流速為1毫升/分鐘。滯留時(shí)間(分鐘)單糖5.038巖藻糖(Fuc)9.031鼠李糖(Rha)9.966阿拉伯糖(Ara)11.638葡萄糖胺(GlcN)12.639半乳糖(Gal)13.937葡萄糖(Glc)15.851甘露糖(Man)圖3是本發(fā)明的靈芝多糖體分餾液(G1)的凝膠滲透圖譜(gelpermeationchromatogram)。圖4是本發(fā)明的靈芝多糖體分餾液(G1)的分子量取對(duì)數(shù)(Logmolecularweight)對(duì)重量分布/微分分子量取對(duì)數(shù)(weightfraction/dLogMW)的曲線圖。圖5是本發(fā)明的靈芝多糖體分餾液(G1)的分子量取對(duì)數(shù)(Logmolecularweight)對(duì)累積重量分布(cumulativeweightfraction)的曲線圖。圖6A至D是本發(fā)明的靈芝多糖體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)成肥胖小鼠(high-fatdiet，HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積的數(shù)據(jù)圖；A為體重、B為體重增加、C為附睪脂肪(epididymalfat)及D為皮下脂肪(subcutaneousfat)。在數(shù)值統(tǒng)計(jì)分 析應(yīng)用上使用Student’sttest(**P<0.01,***P<0.001)。具體實(shí)施方式定義本文所述的有效劑量表示能減少動(dòng)物及人類體重及脂肪堆積的靈芝多糖體劑量，適當(dāng)?shù)挠行┝靠梢乐委熒矬w或個(gè)體的不同而有不同，但可以劑量遞增的各種實(shí)驗(yàn)技術(shù)決定有效劑量。如于本文中所使用數(shù)值為近似值，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)皆表示在20％的范圍內(nèi)，較佳為在10％的范圍內(nèi)，最佳為在5％的范圍內(nèi)。本發(fā)明提供一種有效減少動(dòng)物及人類體重及脂肪堆積的靈芝多糖體，經(jīng)由實(shí)驗(yàn)顯示本發(fā)明的靈芝多糖體能有效減少小鼠體重及脂肪堆積。一般而言，每日給予哺乳動(dòng)物或人類本發(fā)明的多糖體0.001至1,000mg/kg劑量可有效減少體重及脂肪堆積，詳細(xì)說明如下。實(shí)施例1本發(fā)明的靈芝多糖體的制備方法本發(fā)明的靈芝多糖體具有大于135kDa的分子量能有效用于預(yù)防、治療肥胖、減少脂肪蓄積以及體重管理。本發(fā)明的靈芝多糖體可引入至飲食中，其可為一飲品、日常補(bǔ)充品或食物，不需要在生活方式有太大的改變，且不會(huì)引起毒素或?qū)】涤胁涣嫉挠绊憽?.1本發(fā)明的靈芝萃取濃縮液的制備如圖1所示，首先，由長(zhǎng)庚生物科技股份有限公司(臺(tái)北，臺(tái)灣)取得的干燥液態(tài)發(fā)酵的靈芝菌絲(500g)混合10L蒸餾水形成混合液(50g/L)，其中固體與液體比值為5％(w/v)，以20公升攪拌式反應(yīng)器、121℃高溫以及150RPM轉(zhuǎn)速(revolutionperminute)條件下萃取三十分鐘。接著，離心該萃取后混合液以去除固體物質(zhì)以獲得一靈芝水萃取物，并以蒸發(fā)方式濃縮該靈芝水萃取物至2.5公升，并分裝至20mL暗色玻璃安瓶，接著經(jīng)高壓高溫滅菌處理二十分鐘，以獲得一固體與液體比值為20％(w/v)的一靈芝水萃取濃縮物，保存于4℃?zhèn)溆谩?.2本發(fā)明的靈芝多糖體粗萃取物的制備如圖1所示，取120mL、20％(w/v)的靈芝水萃取濃縮物(代號(hào)為W1，含有總水溶性碳水化合物6.03g；詳見表一)，加入600mL(五倍靈芝水萃取濃縮 物體積)、95％酒精混合均勻，在4℃靜置十六小時(shí)以沉淀出靈芝多糖體酒精粗萃取物，接著續(xù)以離心去除上清液，并以120mL、70％冰酒精清洗及離心沉淀靈芝多糖體酒精粗萃取物三次，將三次的上清液混合為酒精沉淀上清液，體積為1,050mL(代號(hào)為G4，含有總水溶性碳水化合物2.82g；詳見表一)。取1,000mL蒸餾水復(fù)溶酒精沉淀靈芝多糖體粗萃取物，再經(jīng)濃縮至700mL以去除殘留酒精，接著加入蒸餾水定量此靈芝多糖體粗萃取物至2,400mL(代號(hào)為W2，含有總水溶性粗多糖3.21g；詳見表一與表二)。1.3本發(fā)明的靈芝多糖體粗萃取物的分離純化取2,400ml靈芝多糖體粗萃取物至50℃水浴槽，接著以切向流超限過濾系統(tǒng)TFF(Spectrum公司，KrosFlo型號(hào))組合0.2μm中空纖維膜(1,500cm2，polyethersulfone)并將過膜壓力(transmembranepressure，TMP)控制在15至16psi進(jìn)行劃分過濾。當(dāng)回流液體積剩余800至1000ml時(shí)補(bǔ)入蒸餾水600mL，繼續(xù)操作過濾。重復(fù)操作補(bǔ)入蒸餾水600mL三次，共計(jì)補(bǔ)入蒸餾水1,800mL。得到650mL的G1-1分餾液(總水溶性粗多糖1.26g)及3,600mL過濾液。取前步驟3,600mL、0.2μm中空纖維膜過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統(tǒng)組合300kDa超限濾膜(50cm2)進(jìn)行劃分過濾，將過膜壓力控制在16至18psi。當(dāng)回流液體積剩余1,000至1,200mL時(shí)補(bǔ)入蒸餾水600mL，繼續(xù)操作過濾。得到950mL的G1-2分餾液(總水溶性粗多糖0.60g)以及3,600mL過濾液。合并G1-1分餾液與G1-2分餾液得到1,600mL的G1分餾液(代號(hào)為G1，總水溶性粗多糖1.86g；詳見表二)。另取前步驟3,600mL過濾液至50℃水浴槽，接著以切向流過濾系統(tǒng)組合10kDa超限濾膜(50cm2)進(jìn)行劃分過濾，將過膜壓力控制在16至18psi。當(dāng)回流液體積剩余1,000至1,200mL時(shí)補(bǔ)入蒸餾水600mL，繼續(xù)操作過濾。得到970mL的10kDa至300kDa的G2分餾液(總水溶性粗多糖1.01g；詳見表二)，3,600mL的10kDa過濾液，該10kDa過濾液即為小于10kDa的G3分餾液(總水溶性粗多糖0.34g；詳見表二)。將劃分收集到的四個(gè)G1-G4分餾液，進(jìn)行濃縮至少量體積并復(fù)溶蒸餾水至體積110mL。每一分餾液分裝至五瓶20mL暗色玻璃安瓶，接著經(jīng)高壓高溫中滅菌斧滅菌二十分鐘，保存于4℃?zhèn)溆谩?.4本發(fā)明的靈芝多糖體的總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多糖含量分析本發(fā)明利用酚-硫酸法分析20％(w/v)的靈芝水萃取濃縮物(代號(hào)為W1,120mL)、靈芝多糖體粗萃取物(代號(hào)為W2,2,400mL)、G1分餾液(1,600mL)、G2分餾液(970mL)、G3分餾液(3,600mL)與G4分餾液(1,050mL)的總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多糖含量。配制0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.16、0.18與0.20mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。每一濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液分別取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL5％苯酚并均勻混合。接著加入1mL硫酸并均勻混合。待靜置二十分鐘，以分光亮度計(jì)(spectrophotometer)在波長(zhǎng)490nm下測(cè)定其讀值，并以此讀值建立檢量線，檢量線的R2>0.99。待測(cè)樣品經(jīng)適當(dāng)稀釋后，取200μL至1.5mL微量離心管，再加入200μL5％苯酚均勻混合均勻。接著加入1mL硫酸均勻混合。待靜置二十分鐘，以分光亮度計(jì)在波長(zhǎng)490nm下測(cè)定其讀值，將讀值帶入檢量線可以計(jì)算獲得總水溶性碳水化合物或總水溶性粗多糖的濃度。靈芝多糖體粗萃取物的總水溶性碳水化合物與總水溶性粗多糖含量分析結(jié)果如表一及表二所示，其中在表二的20％(w/v)靈芝萃取濃縮液的總水溶性粗多糖含量分布分析中，靈芝多糖體粗萃取物(W2)的總水溶性粗多糖中含有1.86克截留分子量大于300kDa的本發(fā)明的靈芝多糖體(G1)，其占總靈芝多糖體萃取物(W2)的57.9％。表一、靈芝多糖體粗萃取物的總水溶性碳水化合物與總水溶性粗多糖含量分析表二20％(w/v)靈芝萃取濃縮液的總水溶性粗多糖含量分布分析1.5本發(fā)明的靈芝多糖體的單糖組成分析本發(fā)明使用高效能陰離子交換色層分析儀裝配脈沖式安培檢測(cè)器(HPAEC-PAD；廠牌：ThermoScientific；型號(hào)：DionexICS-5000System)分析各靈芝萃取物中的單糖組成。巖藻糖(L-fucose)、鼠李糖(L-rhamnose)、半乳糖胺(D-galactosamine)、阿拉伯糖(D-arabinose)、葡萄糖胺(D-glucosamine)、半乳糖(D-galactose)、葡萄糖(D-glucose)與甘露糖(D-mannose)的標(biāo)準(zhǔn)混合溶液濃度為0.1、0.5、1、2與5mg/L。分析條件在注射體積為25μL、分析管柱為CarboPacPA1(4×250mm)、移動(dòng)相為純水(92％)與200mM氫氧化鈉水溶液(8％)經(jīng)混合后組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1mL/min以及管柱烘箱溫度為30℃。注射入單糖標(biāo)準(zhǔn)品，經(jīng)過三十分鐘的分析時(shí)間，可獲得單糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.1、0.5、1、2與5mg/L的峰形積分面積，以此積分面積建立各別單糖的檢量線，檢量線的R2>0.99。取0.21mL的分餾液(G1)(總水溶性粗多糖3mg)加入2.79mL蒸餾水以及1.33mL三氟醋酸(trifluoroaceticacid)，在112℃下加熱十二小時(shí)進(jìn)行酸水解。接著將此混合物濃縮并反復(fù)復(fù)溶蒸餾水以除酸，最后復(fù)溶蒸餾水至1mg/mL。此水解產(chǎn)物經(jīng)稀釋4倍(0.25mg/mL)后取25μL，利用高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈沖式安培檢測(cè)器與分析管柱分析，移動(dòng)相為純水(92％)與200mM氫氧化鈉水溶液(8％)經(jīng)混合后組成比例為16mM氫氧化鈉水溶液、流速為1mL/min以及管柱烘箱溫度為30℃。經(jīng)過三十分鐘的分析時(shí)間，將樣品分析所得峰形的滯留時(shí)間與積分面積與8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品相比對(duì)，可經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)品檢量線計(jì)算 出分餾液(G1)的各別單糖濃度，進(jìn)而獲得單糖組成的百分比。分餾液(G1)經(jīng)高效能陰離子交換色層分析儀搭配脈沖式安培檢測(cè)器分析單糖組成比例，巖藻糖占2.8％、鼠李糖占2.5％、阿拉伯糖占2.9％、葡萄糖胺占1.1％、半乳糖占16.9％、葡萄糖占26.3％以及甘露糖占47.5％(詳見圖2、表三與表四)。表三、高效能陰離子交換色層分析儀-脈沖式安培檢測(cè)器分析300kDa分餾液(G1)的單糖組成比例表四、300kDa分餾液(G1)的單糖組成摩爾比率(molarratio)分析1.6本發(fā)明的靈芝多糖體的分子量分布的分析本發(fā)明使用分子篩滲透層析法(size-exclusionchromatography,SEC)搭配折射(refractiveindex,RI)、微差黏度(differentialviscosity,DV)以及光散射(lightscattering,LS)三合一偵測(cè)器的高效液相色譜分析儀(highperformanceliquidchromatography，配有Waters2410折射率檢測(cè)器indexdetector，Viscotek270雙檢測(cè)器)分析分餾液(G1)中的多糖分子量分布。制備分子量濃度1.5mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖(Dextran670)進(jìn)行系統(tǒng)校正。分析條件為注射體積100μL、分析管柱為串接2組GPC管柱TSKgelG5000PW×L(7.8×300mm)與TSKgelG6000PW×L(7.8×300mm)、移動(dòng)相為純水添加0.02％NaNO3、流速為0.8mL/min以及管柱分析溫度為22℃。取分餾液(G1)(總水溶性粗多糖7.5mg/mL)以上述條件以O(shè)mniSEC軟件(Viscotek公司，美國(guó))進(jìn)行分析，其計(jì)算方式如下表示：Mn：數(shù)目平均分子量Mn=ΣNiMiΣNi]]>Mw：重量平均分子量Mw=ΣNiMi2ΣNiMi]]>Mz:較高平均分子量Mz=ΣNiMi3ΣNiMi2]]>Mp：最高波鋒分子量，為分子量分布最高重量分布點(diǎn)的分子量Mi：?jiǎn)捂湻肿恿?molecularweightofachain)Ni：?jiǎn)捂湹臄?shù)目(numberofchainsofthatmolecularweight)將分餾液(G1)分析所得的RI-DV-LS數(shù)據(jù)(圖3)經(jīng)OmniSEC軟件進(jìn)行分析計(jì)算的后，所得多糖體分子量分布圖如圖4所示，其中Mn(數(shù)目平均分子量) 為135,395Da、Mw(重量平均分子量)為846,622Da、Mz(z-平均分子量)為5,364,000Da，與峰值分子量Mp(最高波鋒分子量)為309,436Da。多糖體分子重量累積圖(圖5)，Mn與Mw的累積重量分布(cumulativeweightfraction)為0.79與0.18，換算多糖體分子量介于Mn135,395Da至Mw846,622Da之間約占總多糖重量的61％。因此，本發(fā)明的分餾液(G1)雖為截留分子量300kDa超限濾膜所截留，但是由于多糖類的生物高分子特性在一般的情況下會(huì)產(chǎn)生團(tuán)聚現(xiàn)象，因此多糖實(shí)際分子量會(huì)有小于濾膜截留分子量現(xiàn)象，如圖4所示G1分子量分布，證實(shí)本發(fā)明的分餾液(G1)的分子量是大于135kDa的靈芝多糖體。實(shí)施例2本發(fā)明的靈芝多糖體對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)成肥胖小鼠(High-FatDiet，HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積的功效本發(fā)明以標(biāo)準(zhǔn)飼料飼養(yǎng)(來自脂肪能量13.5％)的C57BL/6NCrlBltw作為對(duì)照組(Chow)，以及高脂飲食誘導(dǎo)(來自脂肪能量60％)成肥胖小鼠作為實(shí)驗(yàn)組(HFD)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組再分為每日灌胃給予0.001至1,000mg/kg的G1分餾液、G2分餾液、G3分餾液、G4分餾液或蒸餾水的小組并持續(xù)兩個(gè)月(每小組n＝5)，分別為HFD+G1、HFD+G2、HFD+G3、HFD+G4、HFD、Chow+G1、Chow+G2、Chow+G3、Chow+G4及Chow小組。如圖6A至D顯示靈芝多糖對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)成肥胖小鼠(HFD)在減輕體重及減少脂肪堆積的功效。在體重方面如圖6A所示，相較于其他HFD組，HFD+G1體重較輕，顯示出不同分子量的靈芝多糖體對(duì)減輕體重的效果不同；且大于135kDa分子量靈芝多糖體體重減輕效果最佳。在減少體重增加方面如圖6B所示，HFD+G1比其他HFD組減少體重增加效果最佳，顯示出不同分子量的靈芝多糖體對(duì)減少體重增加的效果不同，且以大于135kDa分子量減少體重增加效果最佳。在附睪脂肪(epididymaLfat)方面如圖6C所示，HFD+G1比其他HFD組附睪脂肪少，顯示出不同分子量的靈芝多糖體對(duì)附睪脂肪減少的效果不同，且以135kDa分子量靈芝多糖體附睪脂肪減少最多，以小于10kDa分子量靈芝多糖體附睪脂肪減少最少。在皮下脂肪(subcutaneousfat)方面如圖6D所示，HFD+G1比其他HFD組皮下脂肪少，顯示出不同分子量的靈芝多糖體對(duì)皮下脂肪減少的效果不同，且以135kDa分子量靈芝多糖體皮下脂 肪減少最多，以小于10kDa分子量靈芝多糖體皮下脂肪減少最少。因此，本發(fā)明的大于135kDa分子量靈芝多糖體具有良好的減輕體重、減少體重增加以及減少脂肪推積的效果。本發(fā)明提供一種靈芝多糖體作為抑制肥胖的用途及其制備方法，經(jīng)由本發(fā)明的特殊制備方法所萃取的靈芝多糖體能有效降低哺乳動(dòng)物體重及脂肪堆積。因此，本發(fā)明對(duì)于體重管理及減少體脂肪堆積提供一種新策略，該策略可有效應(yīng)用于商業(yè)上體重控制及管理需求的目標(biāo)族群，達(dá)到增進(jìn)人類健康福祉的目的。當(dāng)前第1頁1 2 3