本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于環(huán)狀RNA表達(dá)的DNA序列和相應(yīng)的表達(dá)載體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：
環(huán)狀RNA（ciucularRNA，circRNA）是區(qū)別于傳統(tǒng)線性RNA的RNA家族新成員，不具有5'末端帽子和3'末端poly(A)尾巴、并以共價(jià)鍵形成環(huán)形結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子。研究表明環(huán)狀RNA主要通過非典型可變剪切加工產(chǎn)生，廣泛存在于各種生物細(xì)胞中，具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，難以被RNA酶降解、表達(dá)豐度高、物種間保守性好，表達(dá)具有組織及時(shí)空特異性等特征。已有研究顯示環(huán)狀RNA跟神經(jīng)發(fā)育、動脈粥樣硬化、強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良、癌癥等疾病相關(guān)。此外，最新研究在在人唾液和血液中檢測到環(huán)狀RNA的存在，提示環(huán)狀RNA可以在血液，尿液，腹水等臨床標(biāo)本中穩(wěn)定存在，這些特點(diǎn)使得環(huán)狀RNA在新型疾病診斷與治療方法的開發(fā)應(yīng)用上具有廣闊的前景。但是目前對circRNA的功能及其調(diào)控機(jī)制知之甚少。研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可以作為“sponge”海綿吸附miRNA，阻斷miRNA對其靶基因的抑制作用；circRNA可以通過堿基互補(bǔ)配對直接調(diào)控其他RNA水平；此外，circRNA還可能具有與蛋白質(zhì)結(jié)合，調(diào)控蛋白的活性等功能。要研究circRNA的功能和調(diào)控機(jī)制一個(gè)必不可少的手段就是在細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)感興趣的circRNA，觀察其對細(xì)胞功能的影響。那么，要提高circRNA在細(xì)胞中的表達(dá)效率進(jìn)而研究其功能和調(diào)控機(jī)制，需要高效、穩(wěn)定的過表達(dá)基因研究的工具。目前文獻(xiàn)報(bào)道circRNA過表達(dá)一般采取常見的商業(yè)化過表達(dá)載體如pcDNA3.1等，但是按照常方法將circRNA序列插入到載體中表達(dá)出來的是相應(yīng)的線性mRNA，無法有效表達(dá)出circRNA。需要采取特殊的策略，以基因組DNA為模板，擴(kuò)增circRNA序列及其上游1000bp和下游200bp的序列，然后將上游800bp序列通過反向互補(bǔ)插入到下游，這樣得到的序列才能表達(dá)circRNA。2014年Liang對一個(gè)表達(dá)豐度極高的circRNA（hsa_circ_0001727）的兩側(cè)內(nèi)含子序列進(jìn)行研究，并構(gòu)建了一個(gè)circRNA表達(dá)載體，但是該載體有局限性，僅個(gè)別circRNA用該載體能表達(dá)成功，成功率低[20]?，F(xiàn)有方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)難度大，實(shí)驗(yàn)周期長，成功率低，給廣大學(xué)者研究circRNA帶來了極大的不變，限制了circRNA分子作為新型標(biāo)志物及疾病治療靶標(biāo)的研究和開發(fā)。因此有必要從circRNA的形成機(jī)制及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)出發(fā)，開發(fā)出一種簡單易行，穩(wěn)定高效的circRNA過表達(dá)DNA模序及相應(yīng)的載體。circRNA是通過RNA可變剪接產(chǎn)生的。真核生物基因的剪接為GT-AG法則，即前體RNA中參與內(nèi)含子剪接的兩個(gè)特殊位點(diǎn)，即在內(nèi)含子和外顯子交界處有兩個(gè)相當(dāng)短的保守序列：5’端為GT，3’端為AG，成為GT-AG法則。典型的剪接位置一致順序組成為：5'-AGˉGUAAGU--------------YNYURAY--Y10-20--YAGˉG-3'。其中Y為U或C，N為任何核苷酸，箭頭所指為外顯子與內(nèi)含子的交界。5’端剪接位稱供體位（donorsite），3’端剪接位稱受體位（acceptorsite）。內(nèi)含子中還有另一段識別剪接邊界必不可少的序列稱為分枝點(diǎn)，位于3‘-端剪接位的上游，具有特征性組成：-YNCURAY-，Y表示嘧啶（U或C），R表示嘌呤（A或G），A是剪接時(shí)參與形成分枝的特別位點(diǎn)。緊接在分枝點(diǎn)的下游有一段多嘧啶序列，也是參與剪接事件蛋白接合的位置。GT-AG保守剪接供體和受體的存在有利于提高可變剪接發(fā)生效率，大大提高RNA環(huán)化概率。Jecketal等2013年在人Hs68細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了超過25000個(gè)環(huán)狀RNA，經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，circRNA的一個(gè)顯著特點(diǎn)是兩側(cè)的內(nèi)含子序列較長，是常規(guī)基因的3倍以上，而這些長的內(nèi)含子中富含反向重復(fù)序列，其中最典型的就是Alu重復(fù)序列。Alu重復(fù)序列是人類基因組中一族散布的、長度大約為300bp的中等重復(fù)序列(重復(fù)頻率10～104)。分析circRNA上下游500bp序列，發(fā)現(xiàn)20%的circRNA上下游包含Alu反向重復(fù)序列，含有ALU重復(fù)序列的circRNA表達(dá)水平是對照的6倍以上，因此反向重復(fù)序列有助于提高circRNA的表達(dá)水平。文獻(xiàn)報(bào)道的circRNA過表達(dá)方法需要擴(kuò)增circRNA本身序列及其上下游序列，并將上游序列反向互補(bǔ)插入到下游，構(gòu)建方法操作繁瑣，實(shí)驗(yàn)難度大，實(shí)驗(yàn)周期長，給廣大學(xué)者研究circRNA帶來了極大的不變。2014年Liang對一個(gè)表達(dá)豐度極高的circRNA（hsa_circ_0001727）的兩側(cè)內(nèi)含子序列進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其上下游各有50bp左右的序列對circRNA的產(chǎn)生至關(guān)重要，由此構(gòu)建了一個(gè)circRNA表達(dá)載體，但是該載體有局限性，部分circRNA用該載體能表達(dá)成功，部分則不能，成功率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是在于提供一種適用于circRNA表達(dá)的DNA序列及其載體，該序列普遍適用于各種circRNA的表達(dá)，表達(dá)效率高效、穩(wěn)定；該序列內(nèi)部包含多個(gè)酶切位點(diǎn)，滿足絕大多數(shù)circRNA的表達(dá)需求；且該序列能整合到各種類型的表達(dá)載體，能應(yīng)用于普通真核表達(dá)、慢病毒表達(dá)、腺病毒表達(dá)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)、原核表達(dá)等各種表達(dá)體系中；應(yīng)用含有該序列的載體表達(dá)circRNA操作簡單易行，易于推廣。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：一種用于環(huán)狀RNA表達(dá)DNA序列，其特征在于，核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。序列中的：“CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCG”為上下游反向重復(fù)序列，CACTACTAACTTTCTTCTTTCCTTTCCCAG以及AGGTAAGTAACAACTCTGTG為剪接供體和受體序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN為多克隆位點(diǎn)區(qū)域，N表示任意核酸，序列可以根據(jù)需要擬定。含有上述用于環(huán)狀RNA表達(dá)DNA序列，插入到真核表達(dá)載體或慢病毒載體或腺病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中，形成系列circRNA專用表達(dá)載體。circRNA專用表達(dá)載體如pcDNA-circRNA載體，核苷酸序列為SEQIDNO:2所示；pcDNA-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為：GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCTCGAGTCTAGA，依次是KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、XhoI和XbaI。circRNA專用表達(dá)載體為pLL-circRNA載體，核苷酸序列為SEQIDNO:3所示，pLL-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為：GCTAGCTTAATTAAGGATCCACTAGTGGAATTCTACCGGTGCAGATATCCAGCTCGAG，依次是NheI、PacI、BamHI、EcoRI、AgeI、EcoRV和XhoI。本發(fā)明具體的載體的構(gòu)建方案如下：1.circRNA過表達(dá)DNA模序設(shè)計(jì)：根據(jù)circRNA的形成機(jī)制和真核生物RNA剪接的GT-AG法則，設(shè)計(jì)出適用于circRNA表達(dá)剪接供體和剪接受體序列；根據(jù)circRNA兩次內(nèi)含子序列富含反向重復(fù)序列和真核生物基因組中普遍存在ALU重復(fù)序列的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)circRNA表達(dá)普遍適用的上下游反向重復(fù)序列；根據(jù)商業(yè)化載體pcDNA3.1和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro的序列信息，設(shè)計(jì)合適的多克隆位點(diǎn)，從而得到完整的實(shí)驗(yàn)circRNA過表達(dá)的DNA序列。并將這2個(gè)DNA序列交給核酸合成公司進(jìn)行全基因合成.2.構(gòu)建circRNA專用的表達(dá)載體：將合成的DNA序列2通過NheI和ApaI位點(diǎn)構(gòu)建入pcDNA3.1載體中，得到pcDNA-circRNA質(zhì)粒，測序確認(rèn)質(zhì)粒正確；將合成的DNA序列2通過XbaI和NotI位點(diǎn)構(gòu)建入pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro載體中，得到pLL-circRNA質(zhì)粒，測序確認(rèn)質(zhì)粒正確。3.構(gòu)建多個(gè)circRNA過表達(dá)質(zhì)粒：從CircBase數(shù)據(jù)庫中下載hsa_circ_0001730、hsa_circ_0000268、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001756、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000711等circRNA的序列信息，設(shè)計(jì)引物從人cDNA文庫中調(diào)取這些circRNA的序列；將序列通過KpnI和XbaI位點(diǎn)插入到上述構(gòu)建好的pcDNA-circRNA質(zhì)粒中，測序確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建正確。4.驗(yàn)證pcDNA-circRNA質(zhì)粒的過表達(dá)效果：將系列circRNA表達(dá)質(zhì)粒及空載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48小時(shí)后收集細(xì)胞樣本；提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄后QPCR觀察這些表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)效果。5.構(gòu)建pLL-circRNA慢病毒表達(dá)質(zhì)粒：從CircBase數(shù)據(jù)庫中下載hsa_circ_0001730circRNA的序列信息，設(shè)計(jì)引物從人cDNA文庫中調(diào)取這個(gè)circRNA的序列；將序列通過NheI和XhoI位點(diǎn)插入到上述構(gòu)建好的pLL-circRNA慢病毒質(zhì)粒中，測序確認(rèn)質(zhì)粒構(gòu)建正確。6.驗(yàn)證pLL-circRNA慢病毒系統(tǒng)的過表達(dá)效果：pLL-circRNA質(zhì)粒與PMDG、PMSV、PMOII質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝，48h和72h后收集并純化慢病毒；慢病毒感染HepG2，SMMC7721并用Puromycin進(jìn)行篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，收集細(xì)胞，提取RNA逆轉(zhuǎn)錄后QPCR檢測hsa_circ_0001730的表達(dá)效果。該序列以及載體能整合到各種類型的表達(dá)載體，能應(yīng)用于普通真核表達(dá)、慢病毒表達(dá)、腺病毒表達(dá)、逆轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)、原核表達(dá)等各種表達(dá)體系中。本申請的實(shí)驗(yàn)過程中設(shè)計(jì)了多種DNA序列，經(jīng)過可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)本發(fā)明涉及的DNA序列及其相應(yīng)的表達(dá)載體效果最佳，操作簡便、結(jié)果穩(wěn)定、表達(dá)高效（circRNA表達(dá)水平提高百倍以上）。該序列及相應(yīng)的載體能廣泛應(yīng)用于各種circRNA的表達(dá)，為研究circRNA的功能和機(jī)制提供了一個(gè)有力的研究工具，為進(jìn)一步確定circRNA分子作為新型標(biāo)志物及疾病治療靶標(biāo)的研究和開發(fā)提供理論支持。附圖說明圖1是本發(fā)明的pcDNA-circRNA質(zhì)粒整體結(jié)構(gòu)圖；圖2是本發(fā)明pcDNA-circRNA質(zhì)粒的過表達(dá)效果圖；圖3為本發(fā)明pLL-circRNA慢病毒介導(dǎo)的穩(wěn)定細(xì)胞株的過表達(dá)效果圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。本發(fā)明所涉及的技術(shù)均為分子克隆常規(guī)技術(shù)手段，其中涉及的酶、引物、試劑以及反應(yīng)條件在未作說明的情況下均可根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行合理選擇，其中涉及試劑耗材屬于市售的普通產(chǎn)品，其中涉及的檢測手段以及儀器也均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并熟練掌握。下面通過實(shí)施例和試驗(yàn)例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的說明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。一種用于環(huán)狀RNA表達(dá)DNA序列，其特征在于，核苷酸序列為SEQIDNO:1所示。序列中的：“CGGGCGCGGTGGCTCACGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGCCCG”為上下游反向重復(fù)序列，CACTACTAACTTTCTTCTTTCCTTTCCCAG以及AGGTAAGTAACAACTCTGTG為剪接供體和受體序列，NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN為多克隆位點(diǎn)區(qū)域，N表示任意核酸，序列可以根據(jù)需要擬定。該序列可以插入到任何商業(yè)化表達(dá)載體（如真核表達(dá)載體、慢病毒載體、腺病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體）中，形成系列circRNA專用表達(dá)載體。以商業(yè)化表達(dá)載體（pcDNA3.1和pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro）為例，我們構(gòu)建了過表達(dá)載體pcDNA-circRNA和pLL-circRNA，其中pcDNA-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為：GGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTGGAATTCTGCAGATATCCAGCTCGAGTCTAGA，依次是KpnI、BamHI、EcoRI、EcoRV、XhoI和XbaI，載體結(jié)構(gòu)圖見附圖1。pLL-circRNA載體的多克隆位點(diǎn)區(qū)域序列為：GCTAGCTTAATTAAGGATCCACTAGTGGAATTCTACCGGTGCAGATATCCAGCTCGAG，依次是NheI、PacI、BamHI、EcoRI、AgeI、EcoRV和XhoI。為驗(yàn)證本發(fā)明的DNA序列及其載體對circRNA的表達(dá)效果，我們從CircBase數(shù)據(jù)庫（http://www.circbase.org/）下載了hsa_circ_0001730的線性序列信息，設(shè)計(jì)引物從人cDNA模板中調(diào)取hsa_circ_0001730的線性序列，通過KpnI和XbaI位點(diǎn)將該序列插入到了pcDNA-circRNA載體中，得到pcDNA-circRNA1730過表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后經(jīng)QPCR驗(yàn)證，跟對照空載體相比，轉(zhuǎn)染pcDNA-circRNA1730質(zhì)粒組，hsa_circ_0001730的表達(dá)水平上升300多倍。進(jìn)一步用這個(gè)載體過表達(dá)一系列的circRNA（hsa_circ_0000268、hsa_circ_0001727、hsa_circ_0001756、hsa_circ_0000284、hsa_circ_0000711等），結(jié)果顯示這些circRNA的表達(dá)水平均上調(diào)百倍以上，表明本發(fā)明能穩(wěn)定、高效的表達(dá)circRNA，操作簡單易行，具體結(jié)果見附圖2和附圖3。具體的如下具體實(shí)施例。實(shí)施例一：pcDNA-circRNA1730過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建1、引物設(shè)計(jì)：從CircBase數(shù)據(jù)庫下載hsa_circ_0001730環(huán)狀RNA的線性序列：>hsa_circ_0001730|NM_004444|EPHB4GTACTAAGGTCTACATCGACCCCTTCACTTATGAAGACCCTAATGAGGCTGTGAGGGAATTTGCAAAAGAGATCGATGTCTCCTACGTCAAGATTGAAGAGGTGATTGGTGCAGGTGAGTTTGGCGAGGTGTGCCGGGGGCGGCTCAAGGCCCCAGGGAAGAAGGAGAGCTGTGTGGCAATCAAGACCCTGAAGGGTGGCTACACGGAGCGGCAGCGGCGTGAGTTTCTGAGCGAGGCCTCCATCATGGGCCAGTTCGAGCACCCCAATATCATCCGCCTGGAGGGCGTGGTCACCAACAGCATGCCCGTCATGATTCTCACAGAGTTCATGGAGAACGGCGCCCTGGACTCCTTCCTGCGG用Primer5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)：circRNA1730-F：5'GGGGTACCGTACTAAGGTCTACATCGACCCCTT3'circRNA1730-R：5'GCTCTAGACCGCAGGAAGGAGTCCAG3'引物序列由上海捷瑞公司進(jìn)行合成。2、PCR釣取基因：PCR反應(yīng)體系，總計(jì)50ul：2mMdNTP5ul10×KODbuffer5ulMgSO42ulDMSO2.5ul引物F（10uM）1.5ul引物R（10uM）1.5ulHumancDNA0.5ulKODplus1ulddH2O32ulPCR擴(kuò)增條件：3.PCR產(chǎn)物回收1)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外條件下，手術(shù)刀切取含目的片段的凝膠條帶至干凈1.5mlEP管中，按100mg凝膠對應(yīng)100ul溶液BD的比例向離心管中加入溶液BD。2)55℃水浴10min至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次。3)將溶液轉(zhuǎn)移至DNA純化柱中，靜置2min，室溫12000g離心1min，棄濾液。4)向柱上加入500ul溶液PE，室溫12000g離心1min，棄濾液。5)重復(fù)上一操作一次。6)空柱12000g離心1min以徹底去除純化柱中殘留的液體。7)將柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30μl洗脫液，12000g離心1min以洗脫出DNA。4.PCR回收產(chǎn)物取10ul用KpnI和XbaI雙切：在1個(gè)無菌的1.5mlEP管中分別配制雙酶切體系，總計(jì)50μl：ddH2O28ul10×BSA5ul10×NEBuffer45ulPCR回收產(chǎn)物10ulKpnI酶1ulXbaI酶1ul37℃酶切2h5.酶產(chǎn)物回收（DNA凝膠回收試劑盒）1)PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后，在紫外條件下，手術(shù)刀切取含目的片段的凝膠條帶至干凈1.5mlEP管中，按100mg凝膠對應(yīng)100ul溶液BD的比例向離心管中加入溶液BD。2)55℃水浴10min至凝膠完全溶化，水浴期間振蕩混合3次。3)將溶液轉(zhuǎn)移至DNA純化柱中，靜置2min，室溫12000g離心1min，棄濾液。4)向柱上加入500ul溶液PE，室溫12000g離心1min，棄濾液。5)重復(fù)上一操作一次。6)空柱12000g離心1min以徹底去除純化柱中殘留的液體。7)將柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30μl洗脫液，12000g離心1min以洗脫出DNA。6.雙酶切pcDNA-circRNA載體；1）酶切體系如下在1個(gè)無菌的1.5mlEP管中分別配制雙酶切體系，總計(jì)50μl：ddH2O36ul10×BSA5ul10×NEBuffer45ulpcDNA-circRNA載體2ulKpnI酶1ulXbaI酶1ul37℃酶切2h7.載體酶切產(chǎn)物回收，（DNA凝膠回收試劑盒）1）向酶切管中加入100ul溶液BD；2）將溶液轉(zhuǎn)移至DNA純化柱中，靜置2min，室溫12000g離心1min，棄濾液；3）向柱上加入500ul溶液PE，室溫12000g離心1min，棄濾液；4）重復(fù)上一操作一次；5）空柱12000g離心1min以徹底去除純化柱中殘留的液體；6）將柱子置于新的1.5mlEP管上，向柱中央加入30μl洗脫液，12000g離心1min以洗脫出DNA。8.目的片段與載體連接：向0.2mlEP管中加入以下試劑（T4DNALigase酶購于NEB公司），總計(jì)20μlddH2O4ul酶切回收的PCR產(chǎn)物10ul酶切回收的pcDNA-circRNA載體3ul10×LigaseBuffer2ulT4DNALigase1ul室溫連接1h。同時(shí)做陰性對照，以水代替基因與載體連接；9.連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化1)冰浴中將連接產(chǎn)物分別加入至50μlTran5α感受態(tài)細(xì)胞中。輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min。2)42℃水浴熱休克90s。3)快速將管轉(zhuǎn)移至冰浴中，冰浴2min。4)分別加入500μlLB培養(yǎng)基，混勻，37℃、150g振蕩培養(yǎng)40min。5)將150ul菌液涂布于含氨芐青霉素（Amp）（100μg/ml）的LB平板表面，室溫下放置，至液體吸收。倒置平板，轉(zhuǎn)移入37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。10.菌落PCR鑒定陽性克隆；1)從平板上面各接7個(gè)菌落于20ulddH2O中混勻打散菌落；2)PCR鑒定所挑取菌落；PCR體系如下，總計(jì)20μl：ddH2O12.75ul10×TaqBuffer2ul2mMdNTP2ul引物ADAMTS5-F2（10uM）1ul引物ADAMTS5-R2（10uM）1ulTaq酶0.25ul菌液1ul同時(shí)，以空載體作為模板設(shè)置一組PCR作為陰性對照。PCR條件：PCR產(chǎn)物以含溴化乙錠（EB）的1％瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定。11.對鑒定正確的菌落溶液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，加入含有相應(yīng)抗生素的3mlLB培養(yǎng)液中37℃過夜培養(yǎng)，提取其質(zhì)粒，（高純質(zhì)粒小量提取試劑盒）1)用1.5mlEP管收集1ml菌液，12000g離心1min，去上清。2)加入250μl溶液Ⅰ/RNaseA混合液，重懸菌體。3)加入250μl溶液Ⅱ，溫和反復(fù)顛倒混勻6次，室溫放置2min。4)加入350μl溶液Ⅲ，溫和反復(fù)顛倒混勻6次。5)12000g離心10min，小心吸去上清至DNA純化柱中，靜置2min。6)12000g離心1min，棄濾液。7)加入500ul溶液PB至柱中,12000g離心1min，棄濾液。8)加入500ul溶液W至柱中,12000g離心1min，棄濾液。重復(fù)一次。9)空柱12000g離心3min。10)將柱取出置于新的1.5mlEP管中，加入50μl無菌水（60℃預(yù)熱），靜置2min，12000g離心1min，收集管底質(zhì)粒。將質(zhì)粒送測序公司測序。類似的，用同樣的方法可以構(gòu)建pLL-circRNA1730質(zhì)粒，或者其他pcDNA-circRNA表達(dá)質(zhì)粒。實(shí)施例二：pLL-circRNA1730慢病毒及其穩(wěn)定細(xì)胞系構(gòu)建1.慢病毒包裝1)轉(zhuǎn)染前24h，用胰酶消化對數(shù)生長期的293T細(xì)胞，傳代到10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。24h待細(xì)胞密度達(dá)70%～80%時(shí)即可用于轉(zhuǎn)染。細(xì)胞狀態(tài)對于病毒包裝至關(guān)重要，因此需要保證良好的細(xì)胞狀態(tài)和較少的傳代次數(shù)。2)轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無血清培養(yǎng)基。3)向一滅菌離心管中加入所制備的各DNA溶液(pLL-circRNA1730載體10μg，pGag/Pol載體5μg、pRev載體5μg、pVSV-G載體5μg)，與相應(yīng)體積的Opti-MEM混合均勻，調(diào)整總體積為1.5ml。4)將Lipofectamine2000試劑輕柔搖勻，取60μlLipofectamine2000試劑在另一管中與1.5mlOpti-MEM混合，在室溫下溫育5分鐘。5)把稀釋后的DNA與稀釋后的Lipofectamine2000進(jìn)行混合，輕輕地顛倒混勻，不要振蕩。6)混合后，在室溫下溫育20分鐘，以便形成DNA與Lipofectamine2000稀釋液的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。7)將DNA與Lipofectamine2000混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞的培養(yǎng)液中，混勻，于37℃,5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8)培養(yǎng)6小時(shí)后吸去含有轉(zhuǎn)染混和物的培養(yǎng)基，每瓶細(xì)胞中加入含10%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基10ml，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。2.病毒的收獲及濃縮1)收集轉(zhuǎn)染后48小時(shí)和72小時(shí)（轉(zhuǎn)染即可為0小時(shí)計(jì)起）的293T細(xì)胞上清液。2)于4℃，4000g離心10min，除去細(xì)胞碎片。3)以0.45μm濾器過濾上清液于50ml離心管中。4)把病毒粗提液樣品加入到過濾杯中（最多19ml），蓋上蓋子。將過濾杯插到濾過液收集管中。5)組合好后，做好平衡，放在轉(zhuǎn)頭上。6)在5000×g離心，至需要的病毒濃縮體積。通常需要的時(shí)間為10-15分鐘。7)離心結(jié)束后，過濾杯中的即為病毒濃縮液。8)將病毒濃縮液移出，分裝后保存在病毒管中，可在4℃保存一周，或-80℃長期保存。取其中一支進(jìn)行病毒生物學(xué)滴度測定。3.慢病毒感染細(xì)胞：(1).根據(jù)細(xì)胞的量將細(xì)胞在1.5ml管中離心收集然后用100-200ul的無血清培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞沉淀，以細(xì)胞完全浸沒在培養(yǎng)基中為準(zhǔn)。(2).吸取pLL-circRNA1730病毒液加入細(xì)胞中，將1.5ml管放在37℃度培養(yǎng)箱中孵育30分鐘。另取pLL-circRNA空載體對照病毒感染做對照細(xì)胞系。(3).將管中混合溶液吸出加到培養(yǎng)皿中或孔里。(4).加入足夠量的新鮮培養(yǎng)液。(5).12小時(shí)后換液。(6).48小時(shí)后加入2ug/mlpuromycin進(jìn)行穩(wěn)定細(xì)胞株篩選。實(shí)施例三：QPCR檢測1.RNA提取1)細(xì)胞處理：6孔板每孔加入1mlTrizol，用1ml槍頭反復(fù)吹打10次，收集到EP管內(nèi)；離心15分鐘，12000g，取上清。2)向上清中加入200ul氯仿，上下用力顛倒混勻半分鐘，靜置3分鐘。3)4℃，12000g離心15分鐘，此時(shí)可見裂解液分三層：上層為水相的RNA；中層為DNA,脂類等；下層為細(xì)胞殘?jiān)?，蛋白，多糖等?)取上清500ul到新的EP管內(nèi)，167ul吸三次；加入等體積的異丙醇，混勻，靜置10分鐘后，4℃，12000g離心10分鐘。5)小心去掉上清，注意不要丟失RNA沉淀，加入1ml75%乙醇,上下顛倒，使沉淀塊重懸起。6)4℃，12000g離心10分鐘,小心去掉上清，盡量吸干管壁的液體，注意不要丟失RNA沉淀，若沉淀松動可再次離心。晾干約15分鐘，至管壁無液體。7)加入適量體積（20-30ul）的DEPC水溶解RNA，58℃水浴10分鐘。8)取出2ul定量，測量buffer:10mMTrisCl(pH7.8)，根據(jù)定量結(jié)果進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。（1A260=40μg/ml,A260/A280=1.8~2.1）9)逆轉(zhuǎn)錄2.cDNA逆轉(zhuǎn)錄1）實(shí)驗(yàn)體系M-MLVReverseTranscriptase：RNA2μgPrimerMix1μlRNase-freewater至15μl70℃5min冰上5min5×buffer5μl2mMdNTP6.25μlM-MLV1μlRNase-freewater12.75μl25μl42℃60min3.QPCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)1)實(shí)驗(yàn)體系，總計(jì)20μl：GoTaq?qPCRMasterMix10μlFprimer1μlRprimer1μlcDNA模板1.5μlNuclease-FreeWater6.5μl2)反應(yīng)條件：第一步：95℃2min第二步（40個(gè)循環(huán)）：95℃3秒，60℃30秒第三步60–95°C溶解曲線3)上機(jī)進(jìn)行目標(biāo)基因擴(kuò)增4.qPCR相對定量結(jié)果目標(biāo)基因的相對表達(dá)量計(jì)算公式為：2-△△Ct=2-【（△Ct）Test-（△Ct）Control】。Ct目的為目標(biāo)基因Ct值，Ct管家為管家基因Ct值。△Ct=Ct目的-Ct管家，表示各樣本目的基因相對管家基因的相對Ct值，△△Ct=（△Ct）Test-（△Ct）Control，表示處理組相對對照組進(jìn)行歸一化，2-△△Ct表示處理組相對對照組的相對表達(dá)量，表示目標(biāo)基因相對表達(dá)倍數(shù)。以上所述的實(shí)施例僅僅是對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對本發(fā)明的技術(shù)方案所作的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明權(quán)利要求書確定的保護(hù)范圍之內(nèi)。