本發(fā)明屬于植物提取物分離技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提取純化云南松樹皮原花青素的制備方法。

背景技術(shù)：
我們知道，隨著現(xiàn)代生活水平和質(zhì)量的提高，人們的健康意識也日益增強，具有優(yōu)良生理特性和功能的原花青素成為了人們關(guān)注的熱點。因其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗衰老、抗癌以及對心血管、心臟和視力的保護作用，原花青素作為重要的健康保健用品和治療性藥物，可用于改善血液循環(huán)、治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、減輕水腫和抑制靜脈曲張等。與此同時，原花青素作為飼料添加劑在畜牧業(yè)中也發(fā)揮著重要的作用。既往研究表明，斷奶仔豬腹瀉主要是由于仔豬腸道黏膜屏障功能不全，在斷奶時容易受到外來病原的入侵，引起腸黏膜氧化應(yīng)激損傷進(jìn)而造成氧化應(yīng)激腹瀉。理論上講，如果能夠找到一種高效的抗氧化劑，來緩解氧化應(yīng)激造成的腸道屏障的損傷，將可以顯著降低斷奶應(yīng)激所引起的腹瀉，提高養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)效益。原花青素是有著特殊分子結(jié)構(gòu)的生物類黃酮，它由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素結(jié)合而成，是高效的輔助因子，是國際上公認(rèn)的活性最強的天然抗氧化劑、清除自由基以及其抗衰老作用的物質(zhì)。原花青素作為一種天然抗氧化劑，可以顯著提高血液谷胱甘肽過氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性，谷胱甘肽具有解毒的作用，對提高機體免疫反應(yīng)有重要作用。原花青素有非常強的抗氧化效果，遠(yuǎn)遠(yuǎn)強于維生素C和維生素E，有實驗證明，它的抗自由基的能力是維生素E的50倍，是維生素C的20倍，且現(xiàn)有研究未發(fā)現(xiàn)任何副作用；同時其抗過敏作用已引起科學(xué)界的高度重視，成為國際性的熱門研究課題。原花青素廣泛地存在于植物的根、莖、葉、皮、果實和種子中。而云南松樹皮作為我國林業(yè)重要的富產(chǎn)物，尤其是在西南地區(qū)資源非常豐富，目前主要用于栲膠、粘膠劑和除銹劑等產(chǎn)品價值較低的化工產(chǎn)品，利用率低。云南松樹皮中含有豐富的原花青素類化合物，是提取制備原花青素優(yōu)秀的原料來源，同時因云南松樹皮來源豐富、成本低廉，在顯著降低原花青素的生產(chǎn)成本的同時，充分開發(fā)了云南松樹皮的高附加值。由于原花青素是極性分子，一般易溶于水和乙醇、甲醇、丙酮等有機溶劑中，因此，目前國內(nèi)對原花青素的提取主要采用傳統(tǒng)的有機溶劑浸提法，但該法存在提取時間長、產(chǎn)率低、產(chǎn)品穩(wěn)定性差、有機溶劑用量及排量大、易污染環(huán)境等缺陷?，F(xiàn)代制備過程中還會采用一些輔助的提取方法，如超聲波提取、微波輔助提取和超濾法等。但采用手段比較單一，提取效率還是不足。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的為提供一種云南松樹皮原花青素的制備方法。本發(fā)明提供的制備云南松樹皮原花青素的方法，包括如下步驟：1)將云南松樹皮粉碎后過篩，于溶劑中進(jìn)行酶解輔助浸提，得到酶解液；2)將步驟1)所得酶解液依次進(jìn)行膠磨均質(zhì)和高壓脈沖電場處理，再將所得產(chǎn)物離心，收集上層清液，濃縮，得到原花青素的粗提液；3)將步驟2)所得原花青素的粗提液純化，干燥，得到所述云南松樹皮原花青素。上述方法步驟1)中，所用云南松樹皮為產(chǎn)自中國云南省的松科松屬植物的云南松(學(xué)名為PinusyunnanensisFranch)的樹皮，云南松又名飛松、青松或長毛松；過篩步驟中，篩孔的目數(shù)為20-80目，優(yōu)選40-60目；所述溶劑為水，粉碎后的云南松樹皮與所述溶劑的料液比為1g：5-15mL，具體為1g：5mL、1g：10mL或1g：15mL。酶解輔助浸提步驟中，所用酶選自酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶中的至少一種，優(yōu)選為果膠酶；其中，所述酸性蛋白酶具體為胃蛋白酶，可購于美國Sigma公司，更具體可為美國Sigma公司出售的產(chǎn)品編號為77151的胃蛋白酶；所述酸性蛋白酶的酶活為1200-2400U/mg，具體為1500U/mg；所述酸性蛋白酶的酶活的定義如下：在37℃和pH值3.0的條件下，1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸所需的酶量，即為1個酶活力單位；所述纖維素酶，可購于美國Sigma公司，更具體可為美國Sigma公司出售的產(chǎn)品編號為22178的纖維素酶；所述纖維素酶的酶活為0.3-1.0U/mg，具體為0.8U/mg；所述纖維素酶的酶活的定義如下：在37℃和pH值5.0的條件下，1min分解羧甲基纖維素產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量，即為1個酶活力單位；所述果膠酶，可購于美國Sigma公司，更具體可為美國Sigma公司出售的產(chǎn)品編號為17389的果膠酶；所述果膠酶的酶活為0.5-5.0U/mg，具體為1.0U/mg；所述纖維素酶的酶活的定義如下：在50℃和pH值為4.0條件下，1min分解聚半乳糖醛酸產(chǎn)生1μmol半乳糖醛酸所需的酶量，即為1個酶活力單位。所用酶與粉碎后的云南松樹皮的質(zhì)量比為0.8-1.4：100，具體為1：100。所述步驟1)酶解輔助浸提步驟中，浸提的時間為60min-120min，具體為60min、90min或120min；或，浸提的溫度為45℃-55℃，具體為45℃、50℃或55℃；或，浸提的pH值為3.0-4.0，具體為3.0、3.5或4.0。所述步驟2)膠磨均質(zhì)步驟中，處理時間為15min-30min，具體為20min。所述步驟2)高壓脈沖電場處理步驟中，電場強度為18-24kV/cm，具體為21kV/cm；或，處理脈沖數(shù)為4-14個脈沖，具體為4、6、8、10、12或14個脈沖。所述步驟2)離心步驟中，離心力為4000g-6000g，具體為5000g；或，離心的時間為10min-30min，具體為15min。所述步驟2)濃縮步驟中，濃縮的方式為真空濃縮；所述真空濃縮中，真空度具體為0.1MPa；或，真空濃縮的溫度具體為40℃-60℃，更具體為50℃；或，真空濃縮的時間具體為20min-60min，更具體為30min。所述步驟3)純化步驟中，純化的方式為大孔樹脂吸附；所述大孔樹脂具體選自弱極性或非極性的AB-8、XAD180、X-5、HPD-100、HPD-300或HPD-700型號的大孔樹脂，更具體為AB-8型號的大孔樹脂；或，所述大孔樹脂吸附步驟中，原花青素粗提液的流速具體為30-90mL/h，更具體為60mL/h；或，所用洗脫劑選用質(zhì)量百分濃度為70％-90％的乙醇水溶液，具體為85％的乙醇水溶液；或，洗脫劑的pH值為3.0-4.0，具體為3.5；或，洗脫劑的流速為30-90mL/h，具體為60mL/h。所述步驟3)干燥步驟中，干燥的方式選自噴霧干燥、冷凍干燥、真空干燥和鼓風(fēng)干燥中的至少一種，具體為噴霧干燥。所述方法還包括如下步驟：在所述步驟1)粉碎步驟之前，將所述云南松樹皮進(jìn)行清潔除雜。另外，按照前述制備得到的云南松樹皮花青素及以前述方法制備得到的云南松樹皮花青素為活性成分的產(chǎn)品，也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明提供的原花青素的制備方法，以云南松樹皮為原料，通過酶-高壓脈沖電場輔助提取，再經(jīng)濃縮和純化制備云南松樹皮原花青素，所得云南松樹皮原花青素提取率≥95％，純度≥75％，得率≥1.0％。本發(fā)明的方法具有以下優(yōu)點：1)本發(fā)明提供的原花青素的制備方法工藝簡捷易操作，有利于產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。而且選用的原料為資源豐富、價格低廉的云南松樹皮，降低生產(chǎn)成本的同時，充分開發(fā)了云南松樹皮的高附加值；2)相比于目前商業(yè)化中常用的有機溶劑提取，本方法提取溶劑為水，降低了成本，且明顯降低了乙醇、甲醇等有機溶劑的排放，有效改善了因大量排放有機廢液造成的環(huán)境污染問題；3)本發(fā)明采用了酶-高壓脈沖電場輔助的方法，酶將細(xì)胞壁成分降解，讓胞內(nèi)的原花青素成分迅速滲透擴散出來，再經(jīng)高壓脈沖電場處理進(jìn)一步破壞了云南松樹皮的細(xì)胞膜，增大了細(xì)胞膜的通透性，加速了胞內(nèi)原花青素向胞外的傳質(zhì)過程，大大提高了原花青素的提取率，縮短了提取時間。此外，整個提取過程條件溫和，減少了因高溫加熱導(dǎo)致的原花青素的降解問題。具體實施方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明并不限于以下實施例。所述方法如無特別說明均為常規(guī)方法。所述原料如無特別說明均能從公開商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所述含量如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。下述實施例中，所用云南松樹皮為產(chǎn)自中國云南省的松科松屬植物的云南松(學(xué)名為PinusyunnanensisFranch)的樹皮，云南松又名飛松、青松或長毛松；所用酸性蛋白酶具體為胃蛋白酶，購自美國Sigma公司，產(chǎn)品編號為77151，酶活力為1500U/mg；纖維素酶購自美國Sigma公司，產(chǎn)品編號為22178，酶活為0.8U/mg；果膠酶購自美國Sigma公司，產(chǎn)品編號為17389，酶活為1.0U/mg。原花青素標(biāo)準(zhǔn)品購于武漢市偉琪博星生物科技有限公司，CAS號為4852-22-6，純度為98％。按照如下方法測定下述實施例中所得云南松樹皮原花青素的含量，以及計算原花青素提取率和得率：采用鐵鹽催化法測定原料或樣品中原花青素的含量，具體操作為：準(zhǔn)確量取1.0mL樣液于10mL刻度試管中，加入6.0mL正丁醇-濃鹽酸(95:5v/v)與0.2mL的2％硫酸鐵銨溶液(溶解于2mol/L鹽酸)，混勻后置于沸水浴中加熱40min后，立即取出用冰水快速冷卻至室溫，在550nm處測定吸光值，然后與原花青素標(biāo)準(zhǔn)品制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線對比，計算出所測樣品中原花青素的含量；提取率＝C×V/W得率＝C×V/m式中：C為云南松樹皮原花青素的質(zhì)量濃度(mg/mL)；V為樣液體積(mL)；W為同等質(zhì)量云南松樹皮中原花青素的總質(zhì)量(mg)；m為云南松樹皮原料質(zhì)量(mg)實施例1、不同酶對云南松樹皮原花青素提取率的影響1)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，加入常溫清水作為提取溶劑，粉碎后的云南松樹皮與常溫清水的料液比為1g：10mL，再加入酶，所加酶為酸性蛋白酶(胃蛋白酶)、纖維素酶或果膠酶中的一種，每100g原料(粉碎后的云南松樹皮)中加入1g酶活力為1500U/mg的酸性蛋白酶或1g酶活力為0.8U/mg的纖維素酶或1g酶活力為1.0U/mg的果膠酶。將加入酶后的混合液pH調(diào)至為3.5，并置于水浴恒溫振蕩器中在45℃下進(jìn)行酶解120min，得到酶解液?？瞻讓φ战M不加酶，其他條件不變。2)將步驟1)中酶解后的混合液在離心力為4000g-6000g(具體為5000g)下離心10min-30min(具體為15min)，得到上層清液；再將所得上層清液在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為40℃-60℃(具體為50℃)條件下濃縮20min-60min(具體為30min)，得到原花青素的粗提液。測定粗提液中原花青素的含量，計算提取率，結(jié)果如表1所示。表1不同酶對云南松樹皮原花青素提取率的影響由表1可知，在提取云南松樹皮原花青素過程中，用酶輔助提取，可明顯提高了原花青素的提取率，酸性蛋白酶、纖維素酶和果膠酶對云南松樹皮原花青素提取率的影響差異不明顯，且三種酶的原花青素提取率均較高，達(dá)到78％以上，其中，提取效果更為優(yōu)選的為果膠酶，提取率達(dá)到81％以上。實施例2、酶解條件對云南松樹皮原花青素提取率的影響1)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，加入常溫清水作為提取溶劑，再加入酶，每100g原料(粉碎后的云南松樹皮)中加入1g酶活力為1.0U/mg的果膠酶，在一定條件下進(jìn)行酶解，得到酶解液。根據(jù)筆者研究，選取對原花青素提取率影響較大的料液比、酶解pH、酶解溫度和酶解時間等四因素進(jìn)行L9(34)正交試驗，設(shè)計的四因素三水平編碼見表2，即：粉碎后的云南松樹皮與常溫清水的料液比為1g：5mL、1g：10mL或1g：15mL，酶解pH值為3.0、3.5或4.0，酶解溫度為45℃、50℃或55℃下，酶解時間為60min、90min或120min。2)將步驟1)中酶解后的混合液在離心力為4000g-6000g(具體為5000g)下離心10min-30min(具體為15min)，得到上層清液；再將所得上層清液在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為40℃-60℃(具體為50℃)條件下濃縮20min-60min(具體為30min)，得到原花青素的粗提液。測定粗提液中原花青素的含量，計算提取率，結(jié)果如表3所示。表2、設(shè)計因素水平編碼表表3、酶解條件對云南松樹皮原花青素提取率的影響根據(jù)表3可知，果膠酶輔助提取法在一定范圍條件下，云南松樹皮原花青素提取率均較高，可達(dá)80％及以上。其中，最為優(yōu)選的酶解提取條件是料液比為1g：10mL，酶解pH值為3.5，酶解溫度為55℃，酶解時間為60min，在此條件下，云南松樹皮原花青素的提取率可達(dá)82.5％以上。實施例3、高壓脈沖電場處理脈沖數(shù)對云南松樹皮原花青素提取率的影響1)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，加入常溫清水作為提取溶劑，粉碎后的云南松樹皮與常溫清水的料液比為1g：10mL，再加入酶，每100g原料(粉碎后的云南松樹皮)中加入1g酶活力為1.0U/mg的果膠酶。將加入酶后的混合液pH調(diào)至為3.5，并置于水浴恒溫振蕩器中在55℃下進(jìn)行酶解60min，得到酶解液。2)對步驟1)所得酶解液進(jìn)行膠磨均質(zhì)，處理時間為15min-30min(具體為20min)，將膠磨均質(zhì)后的混合液泵入高壓脈沖電場裝置，在電場強度為18-24kV/cm(具體為21kV/cm)的條件下，改變脈沖數(shù)(4、6、8、10、12或14)進(jìn)行高壓脈沖電場輔助提取原花青素。得到的提取混合液在，離心力為4000g-6000g(具體為5000g)下離心10min-30min(具體為15min)，得到上層清液；再將所得上層清液在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為40℃-60℃(具體為50℃)條件下濃縮20min-60min(具體為30min)，得到原花青素的粗提液。測定粗提液中原花青素的含量，計算提取率，結(jié)果如表4所示。表4脈沖數(shù)對云南松樹皮原花青素提取率的影響根據(jù)表4，結(jié)合表3中實施例2的提取結(jié)果，可知，酶-高壓脈沖電場輔助法較單獨酶法提取顯著提高了云南松樹皮原花青素的提取率，提取率由82％提高至90％以上，尤其是在脈沖數(shù)為8-12的高壓脈沖電場處理條件下，云南松樹皮原花青素的提取率可達(dá)95％及以上，其中，最為優(yōu)選的是脈沖數(shù)為10時，提取率達(dá)96.08％。實施例4、大孔樹脂類型對云南松樹皮原花青素純度的影響1)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，加入常溫清水作為提取溶劑，粉碎后的云南松樹皮與常溫清水的料液比為1g：10mL，再加入酶，每100g原料(粉碎后的云南松樹皮)中加入1g酶活力為1.0U/mg的果膠酶。將加入酶后的混合液pH調(diào)至為3.5，并置于水浴恒溫振蕩器中在55℃下進(jìn)行酶解60min，得到酶解液。2)對步驟1)所得酶解液進(jìn)行膠磨均質(zhì)，處理時間為20min，將膠磨均質(zhì)后的混合液泵入高壓脈沖電場裝置，在電場強度為21kV/cm、脈沖數(shù)為10的條件下，進(jìn)行高壓脈沖電場輔助提取原花青素。得到的提取混合液在，離心力為5000g下離心15min，得到得到上層清液；再將所得上層清液在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為50℃條件下濃縮30min，得到原花青素的粗提液。3)將步驟2)所得原花青素的粗提液用大孔樹脂吸附法進(jìn)行純化，大孔樹脂類型選自弱極性或非極性的AB-8、XAD180、X-5、HPD-100、HPD-300或HPD-700中的一種。具體操作為將步驟3)所得原花青素的粗提液以進(jìn)樣流速為30-90mL/h(具體為60mL/h)過大孔樹脂柱進(jìn)行吸附，待吸附飽和后用水清洗大孔樹脂，除雜，再用pH值為3.0-4.0(具體為3.5)、質(zhì)量百分濃度為70％-90％(具體為85％)的乙醇水溶液作為洗脫劑洗脫，洗脫劑的流速為30-90mL/h(具體為60mL/h)，收集洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。用噴霧干燥的方法干燥產(chǎn)物，得到云南松樹皮原花青素產(chǎn)品。測定產(chǎn)品中原花青素含量(即純度)，并計算所得云南松樹皮原花青素產(chǎn)品得率。結(jié)果見表5所示。表5、大孔樹脂類型對云南松樹皮原花青素產(chǎn)品純度的影響由表5可知，不同大孔樹脂類型純化云南松樹皮原花青素產(chǎn)品的效果差異較大，其中，效果最佳的大孔樹脂類型為AB-8，產(chǎn)品純度為75.64％，得率為1.12％。對比例以實施例4中優(yōu)選組為本發(fā)明處理組；此外，還有傳統(tǒng)有機溶劑提取組和超聲波輔助法提取組，方法如下：傳統(tǒng)有機溶劑提?。?)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，按料液比1g：10mL加入質(zhì)量百分濃度為75％乙醇水溶液，在溫度80℃下動態(tài)浸提二次，每次5h，合并濾液。2)將步驟1)中所得濾液在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為50℃條件下濃縮30min，得到原花青素的粗提液。3)將步驟2)所得原花青素的粗提液以進(jìn)樣流速60mL/h過AB-8大孔樹脂吸附柱進(jìn)行吸附，待吸附飽和后用水清洗大孔樹脂，除雜，再用pH值為3.5、質(zhì)量百分濃度為具體為85％的乙醇水溶液洗脫，洗脫流速為60mL/h，收集洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。用噴霧干燥的方法干燥產(chǎn)物，得到云南松樹皮原花青素產(chǎn)品。測定各產(chǎn)品中原花青素含量(即純度)，并計算提取率和產(chǎn)品得率。結(jié)果見表6所示。超聲波輔助法提?。?)將經(jīng)過清潔除雜后的云南松樹皮粉碎，過60目篩，按料液比1g：10mL加入質(zhì)量百分濃度為60％乙醇水溶液，在55℃下用超聲波處理60min。2)將步驟1)中所得超聲波輔助提取后的混合液在離心力為5000g下離心15min，得到濾液。隨后在真空度為0.1MPa，濃縮溫度為50℃條件下濃縮30min，得到原花青素的粗提液。3)將步驟2)所得原花青素的粗提液以進(jìn)樣流速60mL/h過AB-8大孔樹脂吸附柱進(jìn)行吸附，待吸附飽和后用水清洗大孔樹脂，除雜，再用pH值為3.5、質(zhì)量百分濃度為具體為85％的乙醇水溶液洗脫，洗脫流速為60mL/h，收集洗脫液，將洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇。用噴霧干燥的方法干燥產(chǎn)物，得到云南松樹皮原花青素產(chǎn)品。測定各產(chǎn)品中原花青素含量(即純度)，并計算提取率和產(chǎn)品得率。結(jié)果見表6所示。表6、不同提取方法對云南松樹皮原花青素提取效果的影響由表6可知，本發(fā)明方法制備的云南松樹皮原花青素產(chǎn)品的提取率和得率均顯著高于傳統(tǒng)有機溶劑提取法和超聲波平輔助提取法制備的原花青素產(chǎn)品。與有機溶劑提取法制備云南松樹皮原花青素相比，本發(fā)明提供的制備方法不僅能夠大大提高云南松樹皮原花青素的提取率和產(chǎn)品得率，同時，減少了因大量排放堿性廢液造成嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。與超聲波輔助法提取效果相比，本發(fā)明方法制備的云南松樹皮原花青素的提取率和得率明顯提高，后續(xù)的純化效果也有所改善，這主要是因為超聲波輔助提取法中超聲波的熱效應(yīng)和空化效應(yīng)會導(dǎo)致作用界面溫度急劇上升，有可能會加速原花青素的氧化分解，雜質(zhì)溶出量增加，影響了提取率及后續(xù)的提純工作。結(jié)論本發(fā)明提供的原花青素的制備方法，以資源豐富、價格低廉的云南松樹皮為原料，大大降低生產(chǎn)成本的同時，充分開發(fā)了云南松樹皮的高附加值，且本發(fā)明制備方法工藝簡捷易操作，有利于產(chǎn)業(yè)化的應(yīng)用。通過酶-高壓脈沖電場輔助提取，加速破壞了云南松樹皮的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，加速了胞內(nèi)原花青素向胞外的滲透擴散，大大提高了原花青素的提取率，縮短了提取時間，此外，整個提取過程條件溫和，不存在高溫處理過程，減少了因高溫加熱導(dǎo)致的原花青素的降解問題。所得云南松樹皮原花青素提取率≥95％，純度≥75％，得率≥1.0％。