本發(fā)明屬于病原微生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種雞毒支原體快速培養(yǎng)與鑒別方法。
背景技術(shù)：
雞毒支原體（Mycoplasma Galliscepticum,MG）也稱雞敗血性支原體，在肉雞中，MG與其它致病菌可引起禽慢性呼吸道病CRD，此病可導(dǎo)致死亡率、淘汰率及加工過程中廢棄率上升；在產(chǎn)蛋母雞，MG的暴發(fā)除造成死亡率上升，其真正危害在于造成產(chǎn)蛋量下降5%～10%。在火雞中，MG可引起竇炎、氣囊炎和以高死亡率為特征的傳染性竇炎。該病原廣泛分布與世界各地，給養(yǎng)雞業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失；
支原體是介于細(xì)菌和病毒之間，能營獨立生活的一群微生物。支原體對營養(yǎng)的要求較高，在培養(yǎng)基中需額外加入10～20%人或動物血清、輔酶等生長因子才能生長，兼性厭氧，5～10%CO2可促進其生長，不易分離，這給支原體的檢測工作帶來了困難。針對規(guī)?；B(yǎng)禽業(yè)，如果能通過簡單且快速的方式確定雞毒支原體的存在情況，則在禽病的防疫工作中會產(chǎn)生巨大經(jīng)濟價值；
目前雞毒支原體的檢測存在諸多的問題，即缺乏成體系成套路的檢測方法，常見的檢測方式重質(zhì)控，輕速度，或不重檢測實際效果，樣本檢測成品率低等。由于分離病原體需多次傳代增值培養(yǎng)，并與L型細(xì)菌的鑒別等，以擴增一代至少需要一天來算，檢測確定的時間實在太多，還有用于生產(chǎn)疫苗時，往往用大量的濃肉湯培養(yǎng)，增值快速的同時也會使得許多樣品雜菌產(chǎn)生過多，以至于醋酸鉈都抑制不了，使得許多樣本檢出率大幅降低，給該病的防治帶來很大的隱患。因此研究一種快速準(zhǔn)確檢測雞毒支原體的方法具有重大的現(xiàn)實意義。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明專利要解決的技術(shù)問題是用快速增殖雞毒支原體，以用于雞毒支原體病原的檢測，為該病的確診、雞群的防疫工作提供有效參考。
為了達(dá)到以上目的，本專利采用以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：
一種雞毒支原體檢測方法，其特征在于：
（1）雞毒支原體液體培養(yǎng)基制備：
所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制： 胰酶解酪蛋15～30g、葡萄糖5～15g、大豆木瓜酶消化物3～6g、酵母浸出粉15～30g、1%的醋酸鉈溶液5ml；
全部均勻混合后置入500ml容量瓶，用去離子水定容到500ml，移出，在120℃，1.8個大氣壓下滅菌30min，待冷卻至常溫后，在無菌條件下加入以下成份：經(jīng)過過濾除菌的5%的精氨酸生素溶液 8～12ml、無菌豬血清80～120ml、青霉素80～120萬單位。調(diào)PH值至7.0～7.4，前述百分比均為質(zhì)量百分比。
在反復(fù)選取實驗方案中發(fā)現(xiàn)，增殖中常用的肉湯類增殖劑，無法用于快速測定，尤其是批量樣品的操作測定，因為要使其不出現(xiàn)雜菌，條件非?？量?，這在批量樣品的檢測中幾乎無法實行，批量樣品中大量產(chǎn)生雜菌嚴(yán)重影響檢測結(jié)果。但是僅僅以酵母浸出粉作為培養(yǎng)料也是不夠的，對于雞毒支原體來說，常常需要2～3天才傳一代，通過實驗發(fā)現(xiàn)，利用胰酶解酪蛋白、葡萄糖、大豆木瓜酶消化物、酵母浸出粉，共同進行培養(yǎng)，增殖速度效果較好。經(jīng)過反復(fù)多批次對比，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生雜菌的情況極少，不會影響樣品的正常測定。這一組合方式是發(fā)明人經(jīng)過反復(fù)對比實驗并進行分析，在反復(fù)實驗后得到的，且具備預(yù)料不到的技術(shù)效果；
（2）疑似病料采集：
從選自疑似帶病批次雞鼻竇粘液、喉頭、氣管分泌物之中取至少100個樣品，每樣品來自不同雞只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸鉈的培養(yǎng)液進行清洗，得到待檢樣品；
（3）初檢樣提取：
將步驟（2）的待檢樣品按1:10接種于步驟（1）所述雞毒支原體液體培養(yǎng)基中，在36～37℃培養(yǎng)16～18h，留存該樣品液，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（4）初檢：
將接種到FM-4固體培養(yǎng)基的樣品37℃培養(yǎng)2～4h，先低倍鏡觀察菌落是否呈煎蛋狀，再以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（5）復(fù)檢：
對于步驟（4）確認(rèn)了存在雞毒支原體的樣品，將步驟（3）中對應(yīng)的留存樣品，選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品A，再將傳代1次的樣品選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品B；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體確認(rèn)復(fù)檢樣品A和B是否存在雞毒支原體；并觀察菌落形態(tài)確認(rèn)是否L型細(xì)菌；
（6）PCR擴增檢驗：
設(shè)計引物對MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，對通過了復(fù)檢的樣品，經(jīng)過PCR擴增，選出732bp的片段，通過測序，檢驗其與Genbank中FMG-2雞毒支原體核苷酸序列相似度；
（7）形成報告：
通過初檢、復(fù)檢和PCR擴增檢驗，確認(rèn)具有雞毒支原體的樣本號碼和數(shù)量，生成報告。
前述檢測方法中所利用的FM-4固體培養(yǎng)基，其制備方法為：
以PPLO肉湯制成粗制肉湯液體培養(yǎng)基，加入2.5%～3%的瓊脂制備成固體，滅菌，冷卻至50～60 ℃，按比例每90ml液體中添加10ml馬血清以及1ml10倍濃縮MEM培養(yǎng)液，于2～6 ℃冷卻，制成固體培養(yǎng)基。
本發(fā)明的檢測方法，支原體增殖生長良好，而且實施簡單，不需要高價設(shè)備，成本低，易于操作，適宜在普通的雞毒支原體檢測中推廣應(yīng)用。
具體實施方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明：
實施例1
一種雞毒支原體檢測方法，其特征在于：
（1）雞毒支原體液體培養(yǎng)基制備：
所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制：
胰酶解酪蛋白30g、葡萄糖15g、大豆木瓜酶消化物3g、酵母浸出粉15g、1%的醋酸鉈溶液5ml。全部均勻混合后置入500ml容量瓶，用去離子水定容到500ml，倒出，在120℃，1.5個大氣壓下滅菌30min，待冷卻至常溫后，在無菌條件下加入以下成份：經(jīng)過過濾除菌的5%的精氨酸生素溶液 8ml、無菌豬血清80ml、青霉素80萬單位；
用0.1%氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7.0～7.2，前述百分比均為質(zhì)量百分比；
（2）疑似病料采集：
從選自疑似帶病批次雞鼻竇粘液、喉頭、氣管分泌物之中取至少120個樣品，每樣品來自不同雞只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸鉈的培養(yǎng)液進行清洗，得到待檢樣品；
（3）初檢樣提?。?/p>
將步驟2的待檢樣品按1:10接種于步驟（1）所述雞毒支原體液體培養(yǎng)基中，在36℃培養(yǎng)16h，留存該樣品液，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（4）初檢：
將接種到FM-4固體培養(yǎng)基的樣品37℃培養(yǎng)2h，先低倍鏡觀察菌落是否呈煎蛋狀，再以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（5）復(fù)檢：
對于步驟（4）確認(rèn)了存在雞毒支原體的樣品，將步驟（3）中對應(yīng)的留存樣品，選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品A，再將傳代1次的樣品選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品B；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體確認(rèn)復(fù)檢樣品A和B是否存在雞毒支原體；并觀察菌落形態(tài)確認(rèn)是否L型細(xì)菌；
（6）PCR擴增檢驗：
設(shè)計引物對MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，對通過了復(fù)檢的樣品，經(jīng)過PCR擴增，選出732bp的片段，通過測序，檢驗其與Genbank中FMG-2雞毒支原體核苷酸序列相似度；
（7）形成報告：
通過初檢、復(fù)檢和PCR擴增檢驗，確認(rèn)具有雞毒支原體的樣本號碼和數(shù)量，生成報告。
前述檢測方法中所利用的FM-4固體培養(yǎng)基，其制備方法為：
以PPLO肉湯制成粗制肉湯液體培養(yǎng)基，加入2.5%的瓊脂制備成固體，滅菌，冷卻至50℃，按比例每90ml液體中添加10ml馬血清以及1ml10倍濃縮MEM培養(yǎng)液，于2℃冷卻，制成固體培養(yǎng)基。
實施例2
一種雞毒支原體檢測方法，其特征在于：
（1）雞毒支原體液體培養(yǎng)基制備：
所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制：胰酶解酪蛋白20g、葡萄糖10g、大豆木瓜酶消化物5g、酵母浸出粉25g、1%的醋酸鉈溶液5ml。全部均勻混合后置入500ml容量瓶，用去離子水定容到500ml，倒出，在120℃，1.6個大氣壓下滅菌40min，待冷卻至常溫后，在無菌條件下加入以下成份：經(jīng)過過濾除菌的5%的精氨酸生素溶液10ml、無菌豬血清10ml、青霉素100萬單位。用0.1%氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7.3～7.4，前述百分比均為質(zhì)量百分比；
（2）疑似病料采集：
從選自疑似帶病批次雞鼻竇粘液、喉頭、氣管分泌物之中取至少150個樣品，每樣品來自不同雞只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸鉈的培養(yǎng)液進行清洗，得到待檢樣品；
（3）初檢樣提?。?/p>
將步驟（2）的待檢樣品按1:10接種于步驟（1）所述雞毒支原體液體培養(yǎng)基中，在36℃培養(yǎng)17h，留存該樣品液，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（4）初檢：
將接種到FM-4固體培養(yǎng)基的樣品37℃培養(yǎng)3h，先低倍鏡觀察菌落是否呈煎蛋狀，再以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（5）復(fù)檢：
對于步驟（4）確認(rèn)了存在雞毒支原體的樣品，將步驟（3）中對應(yīng)的留存樣品，選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品A，再將傳代1次的樣品選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品B；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體確認(rèn)復(fù)檢樣品A和B是否存在雞毒支原體；并觀察菌落形態(tài)確認(rèn)是否L型細(xì)菌；
（6）PCR擴增檢驗：
設(shè)計引物對MG1、MG2，上游引物MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，引物MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，對通過了復(fù)檢的樣品，經(jīng)過PCR擴增，選出732bp的片段，通過測序，檢驗其與Genbank中FMG-2雞毒支原體核苷酸序列相似度；
（7）形成報告：
通過初檢、復(fù)檢和PCR擴增檢驗，確認(rèn)具有雞毒支原體的樣本號碼和數(shù)量，生成報告。
前述檢測方法中所利用的FM-4固體培養(yǎng)基，其制備方法為：
以PPLO肉湯制成粗制肉湯液體培養(yǎng)基，加入2.7%的瓊脂制備成固體，滅菌，冷卻至55℃，按比例每90ml液體中添加10ml豬血清以及1ml10倍濃縮MEM培養(yǎng)液，于4℃冷卻，制成固體培養(yǎng)基。
實施例3
一種雞毒支原體檢測方法，其特征在于：
（1）雞毒支原體液體培養(yǎng)基制備：
所述雞毒支原體培養(yǎng)基按如下工藝配制：
胰酶解酪蛋白15g、葡萄糖5g、大豆木瓜酶消化物6g、酵母浸出粉30g、1%的醋酸鉈溶液5ml。全部均勻混合后置入500ml容量瓶，用去離子水定容到500ml，倒出，在120℃，2個大氣壓下滅菌50min，待冷卻至常溫后，在無菌條件下加入以下成份：經(jīng)過過濾除菌的5%的精氨酸生素溶液12ml、無菌豬血清120ml、青霉素120萬單位。用0.1%氫氧化鈉溶液調(diào)PH值至7.1～7.3，前述百分比均為質(zhì)量百分比；
（2）疑似病料采集：
從選自疑似帶病批次雞鼻竇粘液、喉頭、氣管分泌物之中取至少160個樣品，每樣品來自不同雞只，用含800iu/ml青霉素和0.2%的醋酸鉈的培養(yǎng)液進行清洗，得到待檢樣品；
（3）初檢樣提?。?/p>
將步驟2的待檢樣品按1:10接種于步驟（1）所述雞毒支原體液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)18h，留存該樣品液，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（4）初檢：
將接種到FM-4固體培養(yǎng)基的樣品37℃培養(yǎng)2-4h，先低倍鏡觀察菌落是否呈煎蛋狀，再以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
（5）復(fù)檢：
對于步驟（4）確認(rèn)了存在雞毒支原體的樣品，將步驟（3）中對應(yīng)的留存樣品，選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟（3）相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品A，再將傳代1次的樣品選取1單位菌液作為待檢樣品，以與步驟3相同的方法再傳代1次，取部分接種到FM-4固體培養(yǎng)基，稱為復(fù)檢樣品B；所述FM-4固體培養(yǎng)基不含青霉素和醋酸鉈；
以高倍顯微鏡確認(rèn)雞毒支原體確認(rèn)復(fù)檢樣品A和B是否存在雞毒支原體；并觀察菌落形態(tài)確認(rèn)是否L型細(xì)菌；
（6）PCR擴增檢驗：
設(shè)計引物對MG1、MG2，上游MG1:5’-GGTCCCATCTCGACCACGAGAAAA-3’，下游MG2:5’-CTTTCAATCAGTGAGTAACTGATGA-3’，對通過了復(fù)檢的樣品，經(jīng)過PCR擴增，選出732bp的片段，通過測序，檢驗其與Genbank中FMG-2雞毒支原體核苷酸序列相似度；
（7）形成報告：
通過初檢、復(fù)檢和PCR擴增檢驗，確認(rèn)具有雞毒支原體的樣本號碼和數(shù)量，生成報告。
前述檢測方法中所利用的FM-4固體培養(yǎng)基，其制備方法為：
以PPLO肉湯制成粗制肉湯液體培養(yǎng)基，加入3%的瓊脂制備成固體，滅菌，冷卻至60℃，按比例每90ml液體中添加10ml豬血清以及1ml10倍濃縮MEM培養(yǎng)液，于6℃冷卻，制成固體培養(yǎng)基。
實施例4
本發(fā)明在產(chǎn)生方法之前，對如何選用增殖基料做了廣泛地分析和研究，首先分析的重點是，現(xiàn)存很多用于雞毒支原體疫苗生產(chǎn)中利用的肉湯，但是通過實驗發(fā)現(xiàn)，無論是采用普通肉湯、BGLB肉湯、PPLO肉湯等常用肉湯來培養(yǎng)，每百個樣品在添加少量1%的醋酸鉈溶液后都很難抑制大批量的雜菌生成。該表數(shù)據(jù)是進行了三次實驗的平均值。
由于本發(fā)明需要批量采樣，要求完全無菌采集處理等很難，幾乎不可能完成。由于這里方法的目的是檢測而不是生產(chǎn)疫苗，大幅度提高青霉素等用量是不現(xiàn)實的，由此則肉湯作為輔料在這里很難考慮；
著重考慮其他植物類增殖基料，考慮了酵母浸出物、酵母浸出粉、大豆蛋白胨、去除啤酒花的麥芽汁、胰酶解酪蛋白這些類，通過多次實驗分析其傳代時間，約為：
總的看來，大豆蛋白胨是效果最好的，但是其性能極不穩(wěn)定，批量應(yīng)用有障礙，我們考慮到有大豆木瓜酶消化物的成品粉劑出賣，經(jīng)過實驗發(fā)現(xiàn)性能比較穩(wěn)定，決定用其作為主要基料，又研究了其他各種基料對大豆木瓜酶消化物的效果是否有加成作用：
經(jīng)測試，在大豆木瓜酶消化物中同時使用酵母浸出粉、葡萄糖、胰酶解酪蛋白，實際對傳代時間的縮減效果要大于僅使用酵母浸出粉的10%，最短的傳代時間可以快至12～16h，多數(shù)情況下18h左右可以傳代完畢，由此則本發(fā)明利用此為主要的增殖基料配方。
最后應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對前述實施例所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實施例技術(shù)方案的精神和范圍。