本發(fā)明涉及一種多肽及其抗體制備方法，這種抗體主要用于天然蛋白抗原的檢測(cè)。

2.

背景技術(shù)：

1)GTPBP9功能：GTPBP9是Obg家族GTP水解酶中一種新的NTP水解酶(Koller-Eichhon et al.，J.Biol.Chem.2007 282：19928-19937)。研究顯示GTPBP9能夠更有效地結(jié)合并水解ATP而不是GTP分子。不同種群中的此類(lèi)蛋白也同時(shí)具有ATP和GTP兩種水解酶的功能。通過(guò)X光晶體結(jié)構(gòu)分析，并用AMPPCP，一種不可水解的ATP分子類(lèi)似物做為分析底物，人們發(fā)現(xiàn)造成這類(lèi)NTP水解酶核苷酸結(jié)合特異性改變的一個(gè)原因是所有相關(guān)的Obg家族GTP水解酶中的一個(gè)疏水氨基酸基團(tuán)被谷氨酰胺分子所替代，從而造成這些水解酶與ATP分子的結(jié)合效率高于同GTP分子的結(jié)合。同樣的替代也可以使Ras樣GTP水解酶失活。GTPBP9分子的中心G區(qū)域的兩側(cè)分別被一個(gè)螺旋線圈結(jié)構(gòu)和一個(gè)功能未知的TGS區(qū)域(ThrRS，GTPase，SpoT)所包含。根據(jù)這些結(jié)構(gòu)特征，人們預(yù)測(cè)GTPBP9是一種調(diào)節(jié)蛋白，它與下游的效應(yīng)蛋白相互作用，并通過(guò)它與ADP和ATP結(jié)合產(chǎn)生的構(gòu)象改變行使其調(diào)節(jié)功能。2)GTPBP9抗體產(chǎn)品信息：經(jīng)檢索，除我公司產(chǎn)品外，市場(chǎng)上沒(méi)有其他Anti-GTPBP9多克隆抗體。

3)GTPBP9抗體的應(yīng)用：

一組發(fā)表在美國(guó)國(guó)家科學(xué)院雜志上的研究數(shù)據(jù)顯示GTPBP9具有抑制人體細(xì)胞抗氧化功能的作用。GTPBP9基因敲出可增加人體細(xì)胞對(duì)氧化劑，包括叔丁基過(guò)氧化氫物(tBH)和二酰胺的抵抗能力，并且不影響細(xì)胞的增殖，基礎(chǔ)凋亡和對(duì)其他細(xì)胞毒性因子的敏感性(Zhang et al.，Proc Natl Acad Sci USA.2009 Sep 8；106(36)：15356-61)。相反，過(guò)度表達(dá)GTPBP9可增加細(xì)胞對(duì)tBH和二酰胺等氧化物的敏感性。經(jīng)過(guò)過(guò)氧化物處理后，GTPBP9基因敲除的人體細(xì)胞內(nèi)聚集的活性氧化物水平物明顯低于母細(xì)胞內(nèi)的水平，并且其還原性谷胱甘肽的利用率也顯著降低。該研究小組還發(fā)現(xiàn)GTPBP9是在非轉(zhuǎn)錄水平上產(chǎn)生的對(duì)抗氧化功能的抑制作用。GTPBP9基因敲出后人體細(xì)胞抗氧化功能增強(qiáng)的結(jié)果顯示該靶蛋白在不久的將來(lái)將成為很有潛力的抗氧化治療的藥 物靶點(diǎn)。

3.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種GTPBP9多肽，其序列為：RAFEDDDITHVEGS。用此多肽制備的抗GTPBP9抗體可以在免疫印跡(Western blot)及免疫組化(IHC)分析中特異識(shí)別組織或細(xì)胞中的天然GTPBP9蛋白。

抗GTPBP9抗體是通過(guò)以下步驟獲得的：

步驟一：多肽序列的分析和設(shè)計(jì)：利用DNAstar軟件對(duì)GTPBP9蛋白的氨基酸序列進(jìn)行抗原表位分析，主要評(píng)估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過(guò)去制備抗體的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，最終確定GTPBP9蛋白125-138位14個(gè)氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為RAFEDDDITHVEGS。

步驟二：多肽合成和交聯(lián)：采用ACT396全自動(dòng)多通道多肽合成儀合成目的多肽，并采用質(zhì)譜進(jìn)行鑒定；為增強(qiáng)多肽的抗原性，將GTPBP9多肽與載體蛋白KLH采用Sulfo-SMCC交聯(lián)法進(jìn)行交聯(lián)。

步驟三：多肽免疫和抗血清制備：將交聯(lián)后的GTPBP9-KLH與弗氏佐劑混合乳化，在新西蘭兔背部進(jìn)行皮內(nèi)注射免疫，并反復(fù)加強(qiáng)免疫，至取血檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)時(shí)停止免疫。

步驟四：抗體純化：實(shí)驗(yàn)兔抗體效價(jià)達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)后，采用心臟取血，分離抗血清，采用Protein A純化全抗體后，進(jìn)一步采用肽親和純化，得到目標(biāo)抗體。

抗GTPBP9抗體是通過(guò)以下步驟鑒定的：

步驟一：免疫印跡：將所獲得的GTPBP9抗體作為一抗，采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫印跡方法，確認(rèn)該抗體能夠與變性后的天然GTPBP9蛋白相互作用，可用于免疫印跡試驗(yàn)。

步驟二：免疫組化：將所獲得的GTPBP9抗體作為一抗，采用標(biāo)準(zhǔn)的免疫組化方法，用于檢測(cè)組織芯片(9種人體組織)，確認(rèn)該抗體能夠與具有天然結(jié)構(gòu)的GTPBP9蛋白相互作用，可用于免疫組化試驗(yàn)。

4.附圖說(shuō)明

圖1為免疫印跡圖(Western blot)

圖2為免疫組化(IHC)圖

5.具體實(shí)施方式

1.多肽序列的分析和設(shè)計(jì)

利用DNAstar軟件對(duì)GTPBP9蛋白的氨基酸序列進(jìn)行抗原表位分析，主要評(píng)估親水性，抗原性，表面可能性，柔性區(qū)等指數(shù)，再結(jié)合過(guò)去制備抗體的實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，考慮氨基酸結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度，易氧化程度，合成難度，氨基酸類(lèi)別和分布等，最終確定GTPBP9蛋白125-138位14個(gè)氨基酸作為合成多肽氨基酸序列，序列為RAFEDDDITHVEGS。同時(shí)，為保證后期多肽交聯(lián)載體蛋白以及肽親和純化，在N末端增加一個(gè)半胱氨酸C，最終待合成多肽序列為C-RAFEDDDITHVEGS。

2.多肽合成和交聯(lián)

采用ACT396全自動(dòng)多通道多肽合成儀，按照編制好的程序自動(dòng)合成目的多肽，將合成后的多肽溶于50％乙腈，采用質(zhì)譜儀進(jìn)行鑒定，確認(rèn)所獲得的多肽為目的多肽。采用Sulfo-SMCC作為交聯(lián)劑將載體蛋白KLH與合成多肽進(jìn)行交聯(lián)：取10mg KLH溶于0.5ml超純水中；取3mg sulfo-SMCC溶于0.5ml超純水中，用3M NaOH調(diào)pH值7左右。在混勻情況下，把sulfo-SMCC溶液逐滴緩慢加入KLH溶液中，室溫下旋轉(zhuǎn)混勻反應(yīng)物30min。將反應(yīng)好的sulfo-SMCC/KLH混合液上樣到預(yù)先用平衡緩沖液(0.05M PB，pH6.0)平衡過(guò)30min的Sephadex G25柱中，收集淺灰色洗脫液，即活化的sulfo-SMCC/KLH溶液。用200ul PBS(pH7.3)溶解待2mg交聯(lián)多肽，把0.2體積的sulfo-SMCC/KLH復(fù)合物溶液加入到多肽溶液中，調(diào)pH值到7.3，室溫振搖4小時(shí)，-70冷凍后，用凍干機(jī)凍干24小時(shí)后備用。通過(guò)Ellman法檢測(cè)交聯(lián)前后多肽巰基確定多肽交聯(lián)效率。

3.多肽免疫和抗血清制備

將交聯(lián)好的KLH-多肽400μg溶于400μl磷酸緩沖液(0.01M PBS)中，加入等體積弗氏完全佐劑充分乳化(至在水中不擴(kuò)散為準(zhǔn))。采用兔齡3個(gè)月，體重1.75-2.25Kg的健康新西蘭兔進(jìn)行免疫，進(jìn)行背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射20點(diǎn)以上。首次免疫3周后，將300μg多肽溶于300μl磷酸緩沖液(0.01M PBS)中，與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化后進(jìn)行皮內(nèi)免疫，作為第一次加強(qiáng)免疫，要求背部皮內(nèi)注射免疫，至少要注射15點(diǎn)以上。第二次免疫3周后，進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫，方法和要求同第一次加強(qiáng)免疫。1周后，采用耳緣靜脈微量取血，用未交聯(lián)的合成多肽包被酶標(biāo)板，間接ELISA法檢測(cè)免疫血清效價(jià)。重復(fù)加強(qiáng)免疫和效價(jià)測(cè)定，直至血清效價(jià)達(dá)到1∶60000以上，采用心臟取血，標(biāo)準(zhǔn)方法獲得抗血清。

4.抗體親和純化

(1)、TIgG純化：用移液器將50％的Protein-A Sepharose混懸液10ml加到30ml層析柱中，去掉頂蓋和底帽，液體流出后的柱床體積即為5ml，然后用25ml去離子水沖洗3遍。取出對(duì)應(yīng)的血清10ml，與2ml PBS混合后加入30ml層析柱中，旋轉(zhuǎn)混合器上室溫(20-25℃)混旋1小時(shí)，讓血清樣品流出。再用15ml純化洗液洗層析柱3次，加入10ml洗脫液進(jìn)行洗脫。

(2)、肽親和純化：在層析柱中加入1ml Sulfo-link凝膠懸液(0.5ml凝膠)，待柱內(nèi)液體流干，用4ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱。用1ml偶聯(lián)緩沖液溶解合成的RBPMS多肽，并加入層析柱，再加入1ml偶聯(lián)緩沖液至層析柱中，室溫顛倒混勻1小時(shí)。用6ml偶聯(lián)緩沖液沖洗層析柱，然后加入3ml封閉液，室溫混勻1小時(shí)。沖洗層析柱3次，然后向?qū)游鲋鶅?nèi)加入6ml IgG及3ml PBS，室溫顛倒混勻1小時(shí)。用PBS沖洗層析柱3次，然后用2ml洗脫液洗脫。將所獲得的純化抗體裝入透析袋內(nèi)4℃透析。透析過(guò)夜，然后4000rpm×35min離心除沉淀，收集上清。用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)并用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

抗GTPBP9抗體是通過(guò)以下步驟鑒定的：

1.免疫印跡分析

按照標(biāo)準(zhǔn)方法配制SDS-PAGE凝膠，將5μl蛋白濃度為5mg/ml的細(xì)胞或者組織裂解液依次加樣，恒壓80V約30分鐘，待樣品跑過(guò)濃縮膠基本呈一條直線時(shí)，改換160V電壓，電泳至溴酚藍(lán)指示劑完全跑出分離膠(約60分鐘)時(shí)終止電泳，采用電轉(zhuǎn)膜方法恒壓100V電轉(zhuǎn)80分鐘轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。將所獲得的GTPBP9抗體作為一抗，采用濃度為1μl/ml與上述轉(zhuǎn)膜得到的抗原芯片在室溫下雜交1小時(shí)，然后用HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體在室溫下雜交1小時(shí)，采用ECL顯色法進(jìn)行顯色，在暗室中用X片進(jìn)行顯色和曝光，得到免疫印跡結(jié)果。

2.免疫組織化學(xué)分析

將4％甲醛溶液固定的組織切成1.5mm×1.5mm×2.0-3.0mm的組織塊，乙醇梯度脫水后二甲苯透明30分鐘，62℃石蠟浸蠟2小時(shí)后，在組織包埋機(jī)上將9種組織按照3×3的排列方式用石蠟進(jìn)行包埋。采用標(biāo)準(zhǔn)石蠟切片方法將切好的4-5μm厚的組織芯片蠟片貼附于APES處理過(guò)的載玻片上，在烤片機(jī)60℃烤片1小時(shí)，然后在烤箱中60℃烤片6小時(shí)。采用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法，室溫下用100μl 10％羊血清于濕盒中封閉切片30分鐘，加入 100μl濃度為2-4μg/ml的GTPBP9抗體，濕盒中4℃過(guò)夜，PBS清洗后加入生物素標(biāo)記羊抗兔IgG于濕盒中37℃孵育30分鐘，然后PBS清洗后加入HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素濃縮液，濕盒中37℃孵育30分鐘，洗片后1％DAB顯色，蘇木素復(fù)染，復(fù)藍(lán)，脫水，透明，封片，鏡檢，檢查結(jié)果并拍照。