基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用本案為申請(qǐng)?zhí)?01410284580.1的分案申請(qǐng)技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用，特別涉及基于陸地棉Coker312莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR引物及其應(yīng)用，屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，也是最重要的紡織纖維作物。其栽培種有4個(gè),包括2個(gè)二倍體棉種,即草棉(Gossypium.herbaceum)和亞洲棉(G.arboreum)以及2個(gè)四倍體棉種,即陸地棉(G.hirsutum)和海島棉(G.barbadense)。由于陸地棉的產(chǎn)量高,適應(yīng)性的特點(diǎn)，使之成為栽培種中的重要品種。但目前育成的陸地棉品種多樣性水平降低，遺傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致在生產(chǎn)上難以區(qū)分和識(shí)別，從而制約著產(chǎn)量和品質(zhì)的進(jìn)一步提高。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記成為改善這一問題的首選方法。簡單重復(fù)序列(SSR)是一種高度多態(tài)和共顯性標(biāo)記，因而被廣泛用于分子標(biāo)記遺傳分析。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,許多物種中已開發(fā)出大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),這些數(shù)據(jù)在新標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用過程中具有重要意義。蘿卜(RaphanussativusL.),辣椒(CapsicumannuumL.),芝麻(SesamumindicumL.)等作物中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘，為其識(shí)別和開發(fā)新的EST-SSR標(biāo)記提供可靠性。目前利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)新的分子標(biāo)記在棉花中已有應(yīng)用，來德勇等利用陸地棉花發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘了670個(gè)新的EST-SSR標(biāo)記；陳浩東等從達(dá)爾文氏棉轉(zhuǎn)錄組序列中開發(fā)了780對(duì)EST-SSR引物，并詳細(xì)分析了EST-SSR位點(diǎn)的特征，引物的多態(tài)性及可轉(zhuǎn)移性；呂遠(yuǎn)大等基于海島棉纖維發(fā)育EST序列開發(fā)出380對(duì)SSR引物；Jena等在草棉轉(zhuǎn)錄組99780個(gè)Unigene中，查找出12471個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于8900條EST中。目前，棉花中開發(fā)的EST-SSR主要與纖維發(fā)育基因相關(guān)，與棉花早期形態(tài)建成相關(guān)的基因SSR標(biāo)記開發(fā)尚未見報(bào)道。莖端組織與植物葉原基、芽原基的發(fā)生以及植物頂端生長優(yōu)勢(shì)密切相關(guān)，開發(fā)與此相關(guān)的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量，又能深入探究EST-SSR標(biāo)記基因的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用?；陉懙孛耷o尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴(kuò)增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點(diǎn)，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實(shí)性鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域。本發(fā)明的技術(shù)方案如下：一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物，該引物為一對(duì)，核苷酸序列分別為SEQIDNO.1和SEQIDNO.2。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物在遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM處，位于chr.16(D7)上15.4cM的標(biāo)記BNL2734與chr.16(D7)上24.4cM的標(biāo)記CGR6280之間，與標(biāo)記BNL2734相距5cM，與標(biāo)記CGR6280相距4cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物，該引物為一對(duì)，核苷酸序列分別為SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標(biāo)記SHIN1403與chr.18(D13)上78.4cM的標(biāo)記CGR5021之間，與標(biāo)記SHIN1403相距10.5cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物，該引物為一對(duì)，核苷酸序列分別為SEQIDNO.5和SEQIDNO.6。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端,與位于chr.2(A2)上35.5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7.0cM。一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物，該引物為一對(duì)，核苷酸序列分別為SEQIDNO.7和SEQIDNO.8。上述EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM處，位于chr.23(D9)上16.6cM的標(biāo)記CGR5392與chr.23(D9)上24.4cM的標(biāo)記HAU2017之間，與標(biāo)記CGR5392相距2.9cM，與標(biāo)記HAU2017相距4.9cM。上述的EST-SSR標(biāo)記的引物進(jìn)行棉花遺傳多樣性分析的方法，步驟如下：(1)DNA提取利用改良的CTAB法提取待測(cè)樣品總DNA(2)引物擴(kuò)增及電泳檢測(cè)以步驟(1)提取的待測(cè)樣品為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；擴(kuò)增產(chǎn)物采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，銀染顯色。PCR體系(10μL)包括1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μL(20～50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至10μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃45s，(Tm)℃45s,72℃45s,共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；25℃保存。PCR產(chǎn)物加入2.0μL溴酚藍(lán)后點(diǎn)樣，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。電泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸電泳系統(tǒng)中進(jìn)行。取1.2μL樣品，以Takara20bpDNALadderMarker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，300W恒功率電泳40min，銀染顯色。(3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。采用兩種數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)的方法：①記錄多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。同一等位點(diǎn)出現(xiàn)清晰條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“0”；②差異性條帶記錄。以引物在親本中擴(kuò)增出的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，親本1的帶型記錄為“1”，親本2的帶型記錄為“2”，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為“3”，以此類推。所述遺傳多樣性分析為：采用上述(3)中①方法統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)，利用PopGene32計(jì)算引物的多態(tài)性信息含量(PIC)。所述高密度遺傳圖譜的構(gòu)建是采用上述步驟(3)中②記錄的數(shù)據(jù)采用Jion-Map4.0軟件構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜(LOD值＝6.5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用MapChart2.2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。有益效果本發(fā)明所述的EST-SSR引物均來自陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列，與以往的陸地棉纖維相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出的SSR引物存在功能差別，所述的引物在陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組中分布均勻、多態(tài)性豐富、擴(kuò)增穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶易于鑒定，并且成功連鎖到高密度遺傳圖譜上，豐富了陸地棉基于轉(zhuǎn)錄組發(fā)掘SSR引物的數(shù)量，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實(shí)性鑒定。附圖說明圖1為SSRLocator軟件搜索結(jié)果示意圖；圖2為引物SCRC056在13份試驗(yàn)材料中檢測(cè)到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號(hào)，5、中棉所10號(hào)，6、魯棉研22號(hào)，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號(hào)；圖3為引物SCRC371在13份試驗(yàn)材料中檢測(cè)到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號(hào)，5、中棉所10號(hào)，6、魯棉研22號(hào)，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號(hào)；圖4為引物SCRC878在13份試驗(yàn)材料中檢測(cè)到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號(hào)，5、中棉所10號(hào)，6、魯棉研22號(hào)，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號(hào)；圖5為引物SCRC1022在13份試驗(yàn)材料中檢測(cè)到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，1、Tm-1，2、Coker312，3、AcalasJ-5，4、中棉所12號(hào)，5、中棉所10號(hào)，6、魯棉研22號(hào)，7、魯原343，8、3-79，9、海7124，10、阿須莫尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號(hào)；圖6為5對(duì)引物在重組自交系親本中擴(kuò)增后的電泳結(jié)果圖；圖中：M、Marker(20bpDNALadderTAKARA)，5對(duì)引物：SCRC056(Ⅰ)、SCRC371(Ⅱ)、SCRC584(Ⅲ)、SCRC878(Ⅳ)、SCR1022C(Ⅴ)；1、親本1，2、親本2；圖7為4對(duì)引物在遺傳圖譜上的定位示意圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。實(shí)施例陸地棉Coker312轉(zhuǎn)錄組EST-SSR在棉屬種間及種內(nèi)多態(tài)性分析中的應(yīng)用1.棉花基因組DNA的提取(1)材料從棉花種質(zhì)材料中選取5個(gè)棉種共13份材料(見表1)，用于新開發(fā)引物的評(píng)價(jià)，包括擴(kuò)增效果和多態(tài)性分析。表1本發(fā)明中用于引物多態(tài)性分析的材料信息(2)CTAB法提取基因組DNA采用改良的CTAB法提取棉花DNA，具體步驟如下：1)取棉花供試材料的新鮮葉片0.2g，洗凈，擦干，撕碎后放入2mLA離心管中，加入液氮，使用Retsch(MM400)組織研磨儀進(jìn)行研磨。2)向離心管中加入700μL提取緩沖液(4℃保存，成分如表2所示)，渦旋均勻，冰浴10min，7200轉(zhuǎn)/min離心10min，棄去上清液。表2提取緩沖液配方(500mL)3)向沉淀中加入700μL裂解緩沖液(65℃預(yù)熱，成分如表3所示)，用槍頭輕輕攪勻，65℃水浴40min，過程中輕輕翻轉(zhuǎn)幾次。表3裂解緩沖液配方(500mL)4)水浴后，加入氯仿：異戊醇(體積比24:1)700μL，翻轉(zhuǎn)30次以上，15℃10000轉(zhuǎn)/min離心10min。5)將上清液轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，加入0.6倍上清液體積的異丙醇(-20℃預(yù)冷)，翻轉(zhuǎn)直到出現(xiàn)絮狀沉淀，靜置10min，10000轉(zhuǎn)/min離心8min，棄去上清液。6)在沉淀中加入700μL70％乙醇洗滌(此步可以過夜)，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄上清，置通風(fēng)處干燥無酒精氣味為止。7)加入700μLTE緩沖液，65℃水浴30min。8)DNA溶解后，加入700μL氯仿：異戊醇(體積比24:1)，緩慢翻轉(zhuǎn)30次以上，靜置5min后10000轉(zhuǎn)/min離心10min。9)取上清液轉(zhuǎn)入新的1.5mL離心管中，加入0.1倍上清液體積的醋酸鈉，加入等上清液體積的異丙醇(-20℃)翻轉(zhuǎn)30次以上，靜置30min，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液。10)加入700μL70％乙醇洗滌DNA小團(tuán)，10000轉(zhuǎn)/min離心5min，棄去上清液，晾干DNA小團(tuán)。11)加入200μLTE緩沖液，4℃保存。12)利用DNA濃度檢測(cè)儀檢測(cè)DNA濃度，1％(質(zhì)量比體積)的瓊脂糖凝膠電泳和EppendorfBiophotometerDNA濃度儀檢測(cè)DNA質(zhì)量。2.陸地棉Coker312莖尖轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記的開發(fā)(1)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列SSR位點(diǎn)的查找基于陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的73518條unigene序列，利用軟件MISA和SSRLocator查找2～10bp的SSR位點(diǎn)，查找條件分別≥6、5、4、4、4、3、3、3。(2)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組SSR引物的設(shè)計(jì)根據(jù)步驟(1)中所獲得的SSR序列為中心，提取SSR上下游各200bp序列，如果上游或下游序列不足200bp則提取上游或下游的全部序列設(shè)計(jì)引物。以新設(shè)計(jì)的SSR引物為引物，以CMD(http：//www.cottonmarker.org/)的EST序列為模板運(yùn)行ePCR，獲得了無重復(fù)的新EST-SSR引物，命名為SCRCXXX(ShanDongCottonResearchCenter)。設(shè)計(jì)的主要參數(shù)為：引物長度18～21bp，最適長度20bp，PCR產(chǎn)物長度100～395；最適Tm值58℃。引物設(shè)計(jì)成功后由上海生物工程有限公司合成。(3)陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組SSR引物的擴(kuò)增和篩選選擇4份棉花材料，用于檢測(cè)陸地棉轉(zhuǎn)錄組EST-SSR標(biāo)記的擴(kuò)增情況。采用步驟(2)中合成的引物，以4份材料的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增效果篩選可穩(wěn)定擴(kuò)增、帶型清晰的引物650對(duì)。上述650對(duì)擴(kuò)增穩(wěn)定的引物，在本發(fā)明所使用的13份棉花材料中進(jìn)行擴(kuò)增，其中有83對(duì)引物在13份材料中能擴(kuò)出多態(tài)性條帶，選取其中23對(duì)條帶清晰，多態(tài)性信息豐富的條帶，在不同種間及種內(nèi)進(jìn)行多態(tài)性分析。表4基于陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的23對(duì)EST-SSR引物信息PCR體系(10μL)包括：1.0μL10×TaqBuffer(含Mg2+)，0.2μLdNTP，0.1μL(2.5U)Taq酶，上下游引物各0.6μL,2.0μl(20～50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至10μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3min；94℃變性45s，(Tm)℃退火45s，72℃延伸45s，共32個(gè)循環(huán)；72℃延伸7min；25℃保存。PCR產(chǎn)物加入2.0μL溴酚藍(lán)后點(diǎn)樣，采用8％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)。電泳在ElectrophoresisPowerSupply-EPS301(MadeinSweden)核酸電泳系統(tǒng)中進(jìn)行。取1.2μL樣品，以Takara20bpDNALadderMarker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，300W恒功率電泳40min，銀染顯色。(4)數(shù)據(jù)分析1)記錄多態(tài)性位點(diǎn)。根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和引物擴(kuò)增結(jié)果統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。同一等位點(diǎn)出現(xiàn)清晰條帶記錄為“1”，無條帶記錄為“0”；建立供試材料SSR多態(tài)性信息數(shù)據(jù)庫。利用PopGene32軟件計(jì)算，供試材料不同種內(nèi)及種間多態(tài)性信息(PIC)。在13份供試材料中，在總材料之間的PIC變幅：0.121～0.648，平均PIC為0.422，其中五個(gè)棉種間(Tm-1，3-79，阿非利加棉，雷蒙德氏棉，石系亞1號(hào))的平均PIC＝0.424，明顯高于陸地棉與海島棉種間詳情見表5。表523對(duì)陸地棉EST-SSR引物在棉屬種間及種內(nèi)的多態(tài)性分析在上述引物中選擇在本實(shí)驗(yàn)室重組自交系親本中有差異性條帶的引物(見圖6)，分別為：SCRC056，SCRC371，SCRC584，SCRC878，SCRC1022。使用這5對(duì)引物在重組自交系359個(gè)群體中記性擴(kuò)增。上述本實(shí)驗(yàn)室重組自交系的構(gòu)建為采用魯棉研22號(hào)(父本)與魯原343(母本)雜交后，從F2代開始連續(xù)自交至F8代獲得，操作方法均為本領(lǐng)域常規(guī)手段。2)差異性條帶記錄。以引物在親本中擴(kuò)增出的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，親本1的帶型記錄為“1”，親本2的帶型記錄為“2”，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為“3”，以此類推。構(gòu)建遺傳圖譜數(shù)據(jù)庫。利用Jion-Map4.0軟件構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜(LOD值＝6.5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用MapChart2.2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。上述5對(duì)引物中有4對(duì)成功連鎖到前期構(gòu)建的遺傳圖譜上(見圖7)，分別為SCRC056、SCRC371、SCRC878、SCRC1022。其中，標(biāo)記SCRC056定位于chr.16(D7)上20.4cM處，位于chr.16(D7)上15.4cM的標(biāo)記BNL2734與chr.16(D7)上24.4cM的標(biāo)記CGR6280之間，與標(biāo)記BNL2734相距5cM，與標(biāo)記CGR6280相距4cM；標(biāo)記SCRC371定位于chr.18(D13)上63.2cM處，位于chr.18(D13)上52.7cM的標(biāo)記SHIN1403與chr.18(D13)上78.4cM的標(biāo)記CGR5021之間，與標(biāo)記SHIN1403相距10.5cM；標(biāo)記SCRC878定位于chr.2(A2)上42.5cM處，位于連鎖群末端,與位于chr.2(A2)上35.5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7.0cM；標(biāo)記SCRC1022定位于chr.23(D9)上19.5cM處，位于chr.23(D9)上16.6cM的標(biāo)記CGR5392與chr.23(D9)上24.4cM的標(biāo)記HAU2017之間，與標(biāo)記CGR5392相距2.9cM，與標(biāo)記HAU2017相距4.9cM。