基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的est-ssr標(biāo)記引物與應(yīng)用
【專利說明】
[0001] 本案為申請?zhí)?01410284580. 1的分案申請
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用，特別涉及基 于陸地棉Coker312莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR引物及其應(yīng)用，屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0003] 棉花是重要的經(jīng)濟作物之一，也是最重要的紡織纖維作物。其栽培種有4個，包 括2個二倍體棉種，即草棉（Gossypium. herbaceum)和亞洲棉（G. arboreum)以及2個四 倍體棉種，即陸地棉（G. hirsutum)和海島棉（G. barbadense)。由于陸地棉的產(chǎn)量高，適 應(yīng)性的特點，使之成為栽培種中的重要品種。但目前育成的陸地棉品種多樣性水平降低，遺 傳基礎(chǔ)狹窄，導(dǎo)致在生產(chǎn)上難以區(qū)分和識別，從而制約著產(chǎn)量和品質(zhì)的進一步提高。
[0004] 隨著基因組學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記成為改善這一問題的首選方法。簡單重復(fù)序列 (SSR)是一種高度多態(tài)和共顯性標(biāo)記，因而被廣泛用于分子標(biāo)記遺傳分析。隨著高通量測 序技術(shù)的發(fā)展，許多物種中已開發(fā)出大量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在新標(biāo)記的開發(fā)和應(yīng)用 過程中具有重要意義。蘿卜（Raphanus sativus L.)，辣椒（Capsicum annuum L.)，芝麻 (Sesamum indicum L.)等作物中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的挖掘，為其識別和開發(fā)新的EST-SSR標(biāo)記提 供可靠性。目前利用轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)新的分子標(biāo)記在棉花中已有應(yīng)用，來德勇等利用陸地 棉花發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)掘了 670個新的EST-SSR標(biāo)記；陳浩東等從達爾文氏棉轉(zhuǎn)錄 組序列中開發(fā)了 780對EST-SSR引物，并詳細分析了 EST-SSR位點的特征，引物的多態(tài)性及 可轉(zhuǎn)移性；呂遠大等基于海島棉纖維發(fā)育EST序列開發(fā)出380對SSR引物Jena等在草棉 轉(zhuǎn)錄組99780個Unigene中，查找出12471個SSR位點，分布于8900條EST中。
[0005]目前，棉花中開發(fā)的EST-SSR主要與纖維發(fā)育基因相關(guān)，與棉花早期形態(tài)建成相 關(guān)的基因SSR標(biāo)記開發(fā)尚未見報道。莖端組織與植物葉原基、芽原基的發(fā)生以及植物頂端 生長優(yōu)勢密切相關(guān)，開發(fā)與此相關(guān)的EST-SSR既能增加棉花EST-SSR標(biāo)記的數(shù)量，又能深入 探宄EST-SSR標(biāo)記基因的功能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo) 記引物與應(yīng)用?；陉懙孛耷o尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴增穩(wěn)定、電泳條 帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu) 建、品種純度和真實性鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研宄領(lǐng)域。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0008] 一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物，該引物為一對，核苷酸序 列分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2。
[0009] 上述EST-SSR標(biāo)記SCRC056的引物在遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面 的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC056定位于chr. 16 (D7)上20. 4cM處，位于chr. 16 (D7)上15. 4cM的標(biāo)記 BNL2734與chr. 16 (D7)上24. 4cM的標(biāo)記CGR6280之間，與標(biāo)記BNL2734相距5cM，與標(biāo)記 CGR6280 相距 4cM。
[0010] 一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物，該引物為一對，核苷酸序 列分別為 SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4。
[0011] 上述EST-SSR標(biāo)記SCRC371的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建 方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC371定位于chr. 18(D13)上63. 2cM處，位于chr. 18(D13)上52. 7cM 的標(biāo)記SHIN1403與chr. 18(D13)上78. 4cM的標(biāo)記CGR5021之間，與標(biāo)記SHIN1403相距 10. 5cM〇
[0012] 一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物，該引物為一對，核苷酸序 列分別為 SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6。
[0013] 上述EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu) 建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC878定位于chr. 2 (A2)上42. 5cM處，位于連鎖群末端，與位于 chr. 2 (A2)上35. 5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7. OcM。
[0014] 一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物，該引物為一對，核苷酸序 列分別為 SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8。
[0015] 上述EST-SSR標(biāo)記SCRC1022的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu) 建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC1022定位于chr. 23 (D9)上19. 5cM處，位于chr. 23 (D9)上16. 6cM 的標(biāo)記CGR5392與chr. 23(D9)上24. 4cM的標(biāo)記HAU2017之間，與標(biāo)記CGR5392相距2. 9cM， 與標(biāo)記HAU2017相距4. 9cM。
[0016] 上述的EST-SSR標(biāo)記的引物進行棉花遺傳多樣性分析的方法，步驟如下：
[0017] (l)DNA 提取
[0018] 利用改良的CTAB法提取待測樣品總DNA
[0019] (2)引物擴增及電泳檢測
[0020]以步驟（1)提取的待測樣品為模板，利用上述引物進行PCR擴增；擴增產(chǎn)物采用 8 %非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，銀染顯色。
[0021] PCR 體系（10yL)包括 l.OyL lOXTaq Buffer(含 Mg2+)，0.2yL dNTP， 0? 1 y L(2. 5U) Taq酶，上下游引物各0? 6 y L, 2. 0 y L(20~50ng)DNA模板，加無菌蒸餾水至 10 y L〇
[0022] PCR程序為：94°C預(yù)變性 3min ;94°C 45s，（Tm) °C 45s，72°C 45s，共 32 個循環(huán)；72°C 延伸7min ;25°C保存。
[0023] PCR產(chǎn)物加入2. OyL溴酚藍后點樣，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。 電泳在 Electrophoresis Power Supply_EPS301 (Made in Sweden)核酸電泳系統(tǒng)中進行。 取1. 2 y L樣品，以Takara 20bp DNA Ladder Marker為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，300W恒功率電泳 40min，銀染顯色。
[0024] (3)數(shù)據(jù)統(tǒng)計。采用兩種數(shù)據(jù)統(tǒng)計的方法：①記錄多態(tài)性位點。根據(jù)DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)和引物擴增結(jié)果統(tǒng)計數(shù)據(jù)。同一等位點出現(xiàn)清晰條帶記錄為"1"，無條帶記錄為"0" ； ②差異性條帶記錄。以引物在親本中擴增出的條帶為標(biāo)準(zhǔn)，親本1的帶型記錄為"1"，親本 2的帶型記錄為"2"，出現(xiàn)于親本帶型不一樣的第一種帶型記錄為"3"，以此類推。
[0025] 所述遺傳多樣性分析為：采用上述（3)中①方法統(tǒng)計的數(shù)據(jù)，利用PopGene32計算 引物的多態(tài)性信息含量（PIC)。
[0026] 所述高密度遺傳圖譜的構(gòu)建是采用上述步驟（3)中②記錄的數(shù)據(jù)采用 Jion-Map4. 0軟件構(gòu)建分子遺傳連鎖圖譜（LOD值=6. 5)，以Kosambi函數(shù)作圖；采用 MapChart2. 2繪圖軟件繪制遺傳圖譜。
[0027] 有益效果
[0028] 本發(fā)明所述的EST-SSR引物均來自陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列，與以往的陸地棉纖維 相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組中開發(fā)出的SSR引物存在功能差別，所述的引物在陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組中分布 均勻、多態(tài)性豐富、擴增穩(wěn)定、擴增條帶易于鑒定，并且成功連鎖到高密度遺傳圖譜上，豐富 了陸地棉基于轉(zhuǎn)錄組發(fā)掘SSR引物的數(shù)量，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高 密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實性鑒定。
【附圖說明】
[0029] 圖1為SSR Locator軟件搜索結(jié)果示意圖；
[0030] 圖2為引物SCRC056在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；
[0031] 圖中：M、Marker(20bp DNA Ladder TAKARA)，l、Tm-l，2、Coker 312,3、AcalasJ-5， 4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫 尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；
[0032] 圖3為引物SCRC371在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；
[0033]圖中：M、Marker(20bp DNA Ladder TAKARA)，l、Tm-l，2、Coker 312,3、AcalasJ-5， 4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫 尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；
[0034] 圖4為引物SCRC878在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；
[0035]圖中：M、Marker(20bp DNA Ladder TAKARA)，l、Tm-l，2、Coker 312,3、AcalasJ-5， 4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫 尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；
[0036] 圖5為引物SCRC1022在13份試驗材料中檢測到的多態(tài)性的電泳結(jié)果圖；
[0037]圖中：M、Marker(20bp DNA Ladder TAKARA)，l、Tm-l，2、Coker 312,3、AcalasJ-5， 4、中棉所12號，5、中棉所10號，6、魯棉研22號，7、魯原343,8、3-79,9、海7124,10、阿須莫 尼，11、雷蒙德氏棉，12、阿非利加棉，13、石系亞1號；
[0038] 圖6為5對引物在重組自交系親本中擴增后的電泳結(jié)果圖；
[0039]圖中：M、Marker(20bp DNA Ladder TAKARA)，5 對引物：SCRC056( I )、 SCRC371( II )、SCRC584(III)、SCRC878( IV)、SCR1022C( V ) ;1、親本 1，2、親本 2 ;
[0040]圖7為4對引物在遺傳圖譜上的定位示意圖。
【具體實施方式】
[0041] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步闡述，但本發(fā)明所保護范圍不限于 此。
[0042] 實施例
[0043] 陸地棉Coker312轉(zhuǎn)錄組EST-SSR在棉屬種間及種內(nèi)多態(tài)性分析中的應(yīng)用
[0044] 1.棉花基因組DNA的提取
[0045] ⑴材料
[0046] 從棉花種質(zhì)材料中選取5個棉種共13份材料（見表1)，用于新開發(fā)引物的評價， 包括擴增效果和多態(tài)性分析。
[0047] 表1本發(fā)明中用于引物多態(tài)性分析的材料信息
【主權(quán)項】
1. 一種陸地棉Coker312的EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物，其特征在于，該引物為一對， 核苷酸序列分別為SEQIDNO. 5和SEQIDNO. 6。
2. 權(quán)利要求1所述的EST-SSR標(biāo)記SCRC878的引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度 遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用，標(biāo)記SCRC878定位于chr. 2 (A2)上42. 5cM處，位于連鎖群末端， 與位于chr. 2 (A2)上35. 5cM的標(biāo)記HAU880距離最近，相距7.OcM。
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于陸地棉轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)的EST-SSR標(biāo)記引物與應(yīng)用，EST-SSR標(biāo)記為SCRC878。本發(fā)明還涉及EST-SSR標(biāo)記引物在棉花遺傳多樣性分析和高密度遺傳圖譜構(gòu)建方面的應(yīng)用。本發(fā)明所述的基于陸地棉莖尖轉(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的EST-SSR引物具有擴增穩(wěn)定、電泳條帶清晰、多態(tài)性豐富等優(yōu)點，可有效用于棉花種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、高密度圖譜的構(gòu)建、品種純度和真實性鑒定、分子標(biāo)記輔助育種等研究領(lǐng)域。
【IPC分類】C12Q1-68, C12N15-11
【公開號】CN104694661
【申請?zhí)枴緾N201510149587
【發(fā)明人】張軍, 高陽, 王芙蓉, 劉國棟, 張傳云, 張景霞, 周娟
【申請人】山東棉花研究中心
【公開日】2015年6月10日
【申請日】2014年6月23日