本發(fā)明涉及一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

泰拉霉素(Tulathromycin)是半合成大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，于2004年在美國(guó)和歐盟上市。該藥主要用于牛和豬由敏感菌引起的呼吸系統(tǒng)感染性疾病及由牛莫拉氏菌引起牛傳染性角膜結(jié)膜炎的防治，藥效強(qiáng)于市場(chǎng)上廣泛使用的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素泰樂(lè)菌素和替米考星，在畜禽生產(chǎn)中的使用前景廣闊。

泰拉霉素是由異構(gòu)體A、B(分子式C₄₁H₇₉N₃O₁₂，分子量806.09)按9:1組成的十五元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，兩種異構(gòu)體可通過(guò)C11和C13之間內(nèi)酯鍵的形成和斷裂進(jìn)行轉(zhuǎn)換。泰拉霉素結(jié)構(gòu)中含有三個(gè)極性氨基基團(tuán)，PKa值在8.6～9.6之間，屬于三胺類大環(huán)內(nèi)酯抗生素，不同于氮雜環(huán)內(nèi)酯和酮內(nèi)酯類抗生素。

為了確保動(dòng)物源性食品的安全，須對(duì)動(dòng)物專用藥物質(zhì)量進(jìn)行嚴(yán)格控制，藥物含量測(cè)定、未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定和雜質(zhì)限量是藥物質(zhì)量控制的有效方法，雜質(zhì)分析是藥物質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的重要內(nèi)容。泰拉霉素由半合成過(guò)程生產(chǎn)，與合成藥物相比可控性更低，因此雜質(zhì)譜更為復(fù)雜且難以預(yù)測(cè)?，F(xiàn)行歐洲藥典(EP)和美國(guó)藥典(USP)均將獸藥收錄其中，并對(duì)有關(guān)物質(zhì)限量提出要求，歐洲藥典還要求對(duì)特定雜質(zhì)進(jìn)行控制(英國(guó)藥典按慣例收錄了歐洲藥典的全部專論，內(nèi)容一般不作修改)。VICH(獸用藥物注冊(cè)技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)會(huì))指導(dǎo)原則要求獸醫(yī)專用原料藥的雜質(zhì)報(bào)告限度為0.10％，鑒定限度為0.20％，控制限度為0.50％(該指導(dǎo)不包括半合成抗生素)；EMA(歐洲藥品管理局)要求半合成獸用藥物的雜質(zhì)限度應(yīng)符合VICH指導(dǎo)原則的要求。

目前，國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)采用LC-MS法分離檢測(cè)泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的報(bào)道。因此，亟需降解泰拉霉素以制備降解的有關(guān)物質(zhì)，建立泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的 LC-MS分離、檢測(cè)方法，并對(duì)泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行鑒定。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的問(wèn)題是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中缺乏泰拉霉素在合成及降解過(guò)程中產(chǎn)生的有關(guān)物質(zhì)的分離、檢測(cè)方法，且不能對(duì)之進(jìn)行合成、鑒定、確證結(jié)構(gòu)等缺陷，而提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)、其制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)是對(duì)泰拉霉素進(jìn)行質(zhì)量控制的必需品；本發(fā)明的制備方法能夠制得并有效分離泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2，從而控制泰拉霉素的藥品質(zhì)量，為泰拉霉素未知雜質(zhì)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

本發(fā)明提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的分離方法，其包括下述步驟：采用高效液相色譜法，將待測(cè)物在色譜柱中進(jìn)行洗脫，即可；所述的待測(cè)物為泰拉霉素原料藥或泰拉霉素降解物；所述的色譜柱為C18分析柱或C18制備柱；所述的洗脫的流動(dòng)相A為用氨水調(diào)節(jié)pH值為7～8的、體積分?jǐn)?shù)為0.1％～0.4％甲酸水溶液，所述的洗脫的流動(dòng)相B為甲醇與乙腈的體積比為(1.5～2.0):1的混合溶劑；

當(dāng)所述的色譜柱為C18分析柱時(shí)，所述的洗脫的參數(shù)如下：0min→15min，A:B＝(60～70):(40～30)，15min→40min，A:B＝(60～70):(40～30)→(25～35):(75～65)，40→55min，A:B＝(25～35):(75～65)；所述的A:B指所述的流動(dòng)相A與所述的流動(dòng)相B的體積比；

當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，所述的洗脫的參數(shù)如下：所述的流動(dòng)相A與所述的流動(dòng)相B的體積比為(75～85):(25～15)。

在所述的分離方法中，所述的泰拉霉素原料藥可為本領(lǐng)域常規(guī)的泰拉霉素原料藥，較佳地為江蘇凌云藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的泰拉霉素原料藥。

在所述的分離方法中，所述的泰拉霉素降解物為泰拉霉素經(jīng)降解反應(yīng)得到的物質(zhì)；所述的降解反應(yīng)可為本領(lǐng)域常規(guī)的降解反應(yīng)，較佳地為酸降解反應(yīng)、堿降解反應(yīng)、高溫降解反應(yīng)、高濕降解反應(yīng)、氧化降解反應(yīng)或光照降解反應(yīng)；

所述的氧化降解反應(yīng)可包括下述步驟：在乙腈中，將泰拉霉素與雙氧水水溶液進(jìn)行氧化降解反應(yīng)，得到即可；

所述的堿降解反應(yīng)可包括下述步驟：在乙腈中，將泰拉霉素與氫氧化鈉水溶液進(jìn)行堿降解反應(yīng)，得到即可。

在所述的分離方法中，所述的待測(cè)物可采用本領(lǐng)域常規(guī)的方法進(jìn)樣，較佳地以待測(cè)物的乙腈溶液的形式進(jìn)樣；當(dāng)所述的待測(cè)物為泰拉霉素經(jīng)氧化降解反應(yīng)得到的物質(zhì)時(shí)，較佳地，所述的氧化降解反應(yīng)的反應(yīng)液經(jīng)乙腈稀釋后形成所述的待測(cè)物的乙腈溶液；當(dāng)所述的待測(cè)物為泰拉霉素經(jīng)堿降解反應(yīng)得到的物質(zhì)時(shí)，較佳地，所述的堿降解反應(yīng)的反應(yīng)液經(jīng)酸中和、并用乙腈稀釋后形成所述的待測(cè)物的乙腈溶液；當(dāng)所述的待測(cè)物為泰拉霉素經(jīng)酸降解反應(yīng)得到的物質(zhì)時(shí)，較佳地，所述的酸降解反應(yīng)的反應(yīng)液經(jīng)堿中和、并用乙腈稀釋后形成所述的待測(cè)物的乙腈溶液；

所述的酸中和的酸可為本領(lǐng)域常規(guī)的酸，較佳地為鹽酸水溶液，更佳地為0.1mol/L的鹽酸水溶液；所述的堿中和的堿可為本領(lǐng)域常規(guī)的堿，較佳地為NaOH水溶液，更佳地為0.1mol/L的NaOH水溶液；

所述的待測(cè)物的乙腈溶液的濃度可為本領(lǐng)域常規(guī)的濃度，較佳地為3g/L～50g/L，更佳地為5g/L～20g/L；

所述的待測(cè)物的乙腈溶液的進(jìn)樣量可為本領(lǐng)域常規(guī)的進(jìn)樣量，當(dāng)所述的 色譜柱為C18分析柱時(shí)，所述的進(jìn)樣量較佳地為5μL～100μL，更佳地為20μL～50μL；當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，所述的進(jìn)樣量較佳地為50μL～500μL，更佳地為50μL～300μL。

在所述的分離方法中，所述的C18分析柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的C18分析柱，較佳地為Xbridge^TM C₁₈(250×4.6mm，5μm)分析柱；所述的C18制備柱可為本領(lǐng)域常規(guī)的C18制備柱，較佳地為Xbridge^TM C₁₈(19*50mm，5μm)制備柱。

在所述的分離方法中，所述的流動(dòng)相B中甲醇與乙腈的體積比較佳地為45:25；當(dāng)所述的色譜柱為C18分析柱時(shí)，所述的流動(dòng)相A的pH值較佳地為7.6～7.99(例如7.66)，所述的流動(dòng)相A的甲酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)較佳地為0.3％～0.35％，更佳地，為用氨水調(diào)節(jié)pH值為7.6的、體積分?jǐn)?shù)為0.35％的甲酸水溶液；當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，所述的流動(dòng)相A的pH值較佳地為7.6～7.8，所述的流動(dòng)相A的甲酸水溶液的體積分?jǐn)?shù)較佳地為0.3％～0.35％。

在所述的分離方法中，當(dāng)所述的色譜柱為C18分析柱時(shí)，所述的洗脫的參數(shù)較佳地如下：0min→15min，A:B＝65:35，15min→40min，A:B＝65:35→30:70，40→55min，A:B＝30:70；當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，所述的洗脫的參數(shù)較佳地如下：所述的流動(dòng)相A與所述的流動(dòng)相B的體積比為80:20。

在所述的分離方法中，所述的氨水為本領(lǐng)域常規(guī)的氨水，較佳地為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25％～28％的氨水。

在所述的分離方法中，可采用本領(lǐng)域常規(guī)的高效液相色譜，當(dāng)所述的色譜柱為C18分析柱時(shí)，較佳地采用Waters公司的Alliance 2695/ZQ液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀；當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，較佳地采用Waters公司的2767型自動(dòng)純化儀。

在所述的分離方法中，所述的分離方法的流速可為本領(lǐng)域常規(guī)的流速；當(dāng)所述的色譜柱為C18分析柱時(shí)，所述的流速較佳地為 0.7ml/min～1.3ml/min，0.8ml/min～1.2ml/min，例如1.0ml/min；當(dāng)所述的色譜柱為C18制備柱時(shí)，所述的流速較佳地為10ml/min～25ml/min，更佳地為15ml/min～20ml/min，例如17ml/min。

在所述的分離方法中，所述的流動(dòng)相A和所述的流動(dòng)相B可采用本領(lǐng)域常規(guī)的處理方法進(jìn)行預(yù)處理，較佳地經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，并超聲10min。

在所述的分離方法中，所述的分離方法的柱溫可為本領(lǐng)域常規(guī)的柱溫，較佳地為20℃～40℃，更佳地為25℃～35℃，例如30℃。

在所述的分離方法中，所述的分離方法檢測(cè)時(shí)的紫外吸收波長(zhǎng)可為本領(lǐng)域常規(guī)的紫外吸收波長(zhǎng)，較佳地為200～215nm，更佳地為205～210nm；經(jīng)過(guò)紫外檢測(cè)器后的流份的1/5～1/3進(jìn)入質(zhì)譜儀檢測(cè)。

本發(fā)明還提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)1或其鹽，

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)1的富集制備方法，其如上述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的分離方法，收集所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)1即可。

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)1或其鹽在泰拉霉素質(zhì)量控制中作為雜質(zhì)鑒定的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2或其鹽，

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2的制備方法，其包括下述步驟：在乙腈中，將泰拉霉素與雙氧水水溶液進(jìn)行氧化降解反應(yīng)，得到所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2即可。

在所述的氧化降解反應(yīng)中，所述的泰拉霉素與所述的乙腈的質(zhì)量體積比可為本領(lǐng)域中氧化降解反應(yīng)的常規(guī)質(zhì)量體積比，較佳地為3g/L～50g/L，更佳地為5g/L～20g/L。

在所述的氧化降解反應(yīng)中，所述的雙氧水水溶液可為本領(lǐng)域常規(guī)的雙氧水水溶液，較佳地為質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1％～30％的雙氧水水溶液，更佳地為0.15％～0.5％的雙氧水水溶液。

在所述的氧化降解反應(yīng)中，所述的泰拉霉素與所述的雙氧水水溶液的質(zhì)量體積比可為本領(lǐng)域中氧化降解反應(yīng)的常規(guī)質(zhì)量體積比，較佳地為40g/L～90g/L，更佳地為50g/L～75g/L。

在所述的氧化降解反應(yīng)中，所述的氧化降解反應(yīng)的溫度可為本領(lǐng)域中氧化降解反應(yīng)的常規(guī)溫度，較佳地為20℃～50℃，更佳地為20℃～30℃。

在所述的氧化降解反應(yīng)中，所述的氧化降解反應(yīng)的進(jìn)程可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)監(jiān)測(cè)方法(例如LC-MS)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述的降解反應(yīng)的時(shí)間較佳地為1min～30min，更佳地為5min～20min。

所述的氧化降解反應(yīng)較佳地還包括后處理；所述的后處理可為本領(lǐng)域中氧化降解反應(yīng)的常規(guī)后處理，較佳地，所述的氧化降解反應(yīng)的反應(yīng)液按照上述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的分離方法進(jìn)行后處理。

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2或其鹽在泰拉霉素質(zhì)量控制中作為雜質(zhì)鑒定的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)3或其鹽，

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)3的富集制備方法，其如上述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的分離方法，收集所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)3即可。

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)3或其鹽在泰拉霉素質(zhì)量控制中作為雜質(zhì)鑒定的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了一種泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)4或其鹽，

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)4的制備方法，其包括下述步驟：在乙腈中，將泰拉霉素與氫氧化鈉水溶液進(jìn)行堿降解反應(yīng)，得到所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)4即可。

在所述的堿降解反應(yīng)中，所述的泰拉霉素與所述的乙腈的質(zhì)量體積比可為本領(lǐng)域中堿降解反應(yīng)的常規(guī)質(zhì)量體積比，較佳地為3g/L～50g/L，更佳地為5g/L～20g/L。

在所述的堿降解反應(yīng)中，所述的氫氧化鈉水溶液可為本領(lǐng)域常規(guī)的氫氧化鈉水溶液，較佳地為0.1mol/L～10mol/L的氫氧化鈉水溶液，更佳地為1mol/L～5mol/L的氫氧化鈉水溶液。

在所述的堿降解反應(yīng)中，所述的泰拉霉素與所述的氫氧化鈉水溶液的質(zhì)量體積比可為本領(lǐng)域中堿降解反應(yīng)的常規(guī)質(zhì)量體積比，較佳地為 40g/L～90g/L，更佳地為50g/L～75g/L。

在所述的堿降解反應(yīng)中，所述的堿降解反應(yīng)的溫度可為本領(lǐng)域中堿降解反應(yīng)的常規(guī)溫度，較佳地為50℃～90℃，更佳地為55℃～70℃，例如60℃。

在所述的堿降解反應(yīng)中，所述的堿降解反應(yīng)的進(jìn)程可采用本領(lǐng)域中的常規(guī)監(jiān)測(cè)方法(例如TLC、HPLC或LC-MS)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所述的堿降解反應(yīng)的時(shí)間較佳地為15min～50min，更佳地為20min～40min，例如25min。

所述的堿降解反應(yīng)較佳地還包括后處理；所述的后處理可為本領(lǐng)域中堿降解反應(yīng)的常規(guī)后處理，較佳地，所述的堿降解反應(yīng)的反應(yīng)液按照上述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)的分離方法進(jìn)行后處理。

本發(fā)明還提供了所述的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)4或其鹽在泰拉霉素質(zhì)量控制中作為雜質(zhì)鑒定的應(yīng)用。

在不違背本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí)例。

本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。

本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：本發(fā)明的泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)是對(duì)泰拉霉素進(jìn)行質(zhì)量控制的必需品；本發(fā)明的制備方法能夠制得并有效分離泰拉霉素有關(guān)物質(zhì)2，從而控制泰拉霉素的藥品質(zhì)量，為泰拉霉素未知雜質(zhì)的研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖2為有關(guān)物質(zhì)1的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖3為有關(guān)物質(zhì)1的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖4為有關(guān)物質(zhì)3的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖5為有關(guān)物質(zhì)3的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖6為實(shí)施例2得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖7為實(shí)施例3得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖8為實(shí)施例4得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖9為實(shí)施例5得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖10為實(shí)施例6得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖11為實(shí)施例7得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖12為實(shí)施例8得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖13為實(shí)施例9得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖14為實(shí)施例10得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖15為泰拉霉素原料藥氧化降解反應(yīng)后，經(jīng)分析柱的質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖16為泰拉霉素原料藥氧化降解反應(yīng)后，經(jīng)制備柱的質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖17為有關(guān)物質(zhì)2的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖18為有關(guān)物質(zhì)2的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖19為泰拉霉素原料藥堿降解反應(yīng)后，經(jīng)分析柱的質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖20為有關(guān)物質(zhì)4的一級(jí)質(zhì)譜圖。

圖21為有關(guān)物質(zhì)4的二級(jí)質(zhì)譜圖。

圖22為泰拉霉素原料藥酸降解反應(yīng)后，經(jīng)分析柱的質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖23為對(duì)比例1得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖24為對(duì)比例2得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

圖25為對(duì)比例3得到的泰拉霉素原料藥質(zhì)譜總離子流色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí)施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說(shuō)明書選擇。

本發(fā)明所使用試劑如下：

乙腈、甲醇為色譜純(Thermo Fisher Scientific公司)；甲酸(98％)、氨水(25wt％～28wt％)、30wt％過(guò)氧化氫、鹽酸為分析純，氫氧化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)制劑有限公司)；水為娃哈哈純凈水(過(guò)0.22μm水膜)；泰拉霉素原料藥由江蘇凌云藥業(yè)有限公司提供。

本發(fā)明所使用儀器如下：

(1)2695型高效液相色譜儀；2487型紫外檢測(cè)器；Micromass ZQ質(zhì)譜儀；Q-Tof micro質(zhì)譜儀；Masslynx色譜工作站(Waters公司)

(2)Q-Exactive四級(jí)桿軌道阱高分辨質(zhì)譜(Thermo公司)

(3)2767型自動(dòng)純化儀

本發(fā)明所使用的質(zhì)譜方法如下：

Micromass ZQ:檢測(cè)模式ESI(+)；噴霧電壓3kV；錐孔電壓30V；源溫100℃；脫溶劑溫度250℃；全掃描范圍m/z100～1500。

Q-Exactive四級(jí)桿軌道阱高分辨質(zhì)譜參數(shù)：HESI噴霧電壓:+3.0KV/-2.7KV(正負(fù)切換同時(shí)掃描)；鞘氣壓力:35arb；輔助氣壓力:10arb；毛細(xì)管溫度:300℃；加熱溫度：300℃；掃描模式：Full MS(分辨率7000)和dd-MS2(分辨率17500)

實(shí)施例1

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.66)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖1所示，各雜質(zhì)如表1所示。流動(dòng)相鹽濃度為0.35％時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形良好。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。從圖中可以看出，本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)泰拉霉素及其雜質(zhì)，該方法可應(yīng)用于泰拉霉素原料藥合成工藝監(jiān)控及質(zhì)量控 制。

表1圖1中的各雜質(zhì)

注：Aera％為面積歸一化法測(cè)得百分含量。

表1中的4即本發(fā)明的有關(guān)物質(zhì)1，高分辨測(cè)得分子式為C₄₀H₇₇N₃O₁₂([M+H]⁺＝792.55829)，MS²碎片為689.45898(C₃₅H₆₃NO₁₂)、563.39099(C₂₈H₅₅N₂O₉)、420.29337(C₂₁H₄₂NO₇)、230.17519(C₁₂H₂₄NO₃)。其一級(jí)質(zhì)譜圖如圖2所示，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖3所示，質(zhì)譜裂解途徑如下所示：

表1中的13即本發(fā)明的有關(guān)物質(zhì)3，高分辨測(cè)得分子式為C₃₉H₇₂N₂O₁₂([M+H]⁺＝761.51624)，MS²碎片為532.34827(C₂₇H₅₀NO₉)、230.17520(C₁₂H₂₄NO₃)。其一級(jí)質(zhì)譜圖如圖4所示，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖5所示，質(zhì)譜裂解途徑如下所示：

實(shí)施例2

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.3％甲 酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.66)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖6所示。流動(dòng)相鹽濃度為0.3％時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形良好。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例3

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.4％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.66)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖7所示。流動(dòng)相鹽濃度為0.4％時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形良好。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例4

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.1％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.99)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖8所示。流動(dòng)相鹽濃度為0.1％時(shí)，pH值為7.99時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例5

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲 酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.6)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝1.5:1，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖9所示。流動(dòng)相B中甲醇:乙腈＝1.5:1時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例6

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.6)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→35:65；40→55min，A:B＝35:65，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖10所示。流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65:35→35:65；40→55min，A:B＝35:65時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例7

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.6)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝70:30；15→40min，A:B＝70:30→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖11所示。流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?→15min，A:B＝70:30；15→40min，A:B＝70:30→30:70；40→55min，A:B＝30:70時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例8

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.6)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝2:1，梯度洗脫0→15min，A:B＝70:30；15→40min，A:B＝70:30→30:70；40→55min，A:B＝30:70，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.2ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖12所示。流動(dòng)相B為甲醇:乙腈＝2:1，流速1.2ml/min時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例9

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值7.0)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝70:30；15→40min，A:B＝70:30→35:65；40→55min，A:B＝35:65，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖13所示。流動(dòng)相A的pH值7.0，梯度為0→15min，A:B＝70:30；15→40min，A:B＝70:30→35:65；40→55min，A:B＝35:65時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例10

5mg泰拉霉素原料藥溶于1mL乙腈，進(jìn)樣量20μL。

色譜參數(shù)：Xbridge^TM C₁₈(250*4.6mm，5μm)柱，流動(dòng)相A：0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值8.0)，流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25，梯度洗脫0→15min，A:B＝60:40；15→40min，A:B＝60:40→25:75；40→55min，A:B＝25:75，紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min，HPLC流份經(jīng)UV檢測(cè)器后以3:1分流進(jìn)入MS檢測(cè)。質(zhì)譜總離子流如圖14所示。流動(dòng)相A的pH值8.0，梯度為0→15min，A:B＝60:40；15→40min，A:B＝60:40→25:75；40→55min，A:B＝25:75時(shí)，主峰保留時(shí)間合適，峰形對(duì)稱。有關(guān)物 質(zhì)與主峰能良好分離。

實(shí)施例11氧化降解反應(yīng)

取約50mg泰拉霉素原料藥于10ml量瓶中，加0.15％H₂O₂溶液1ml，加1ml乙腈助溶，室溫(20℃)放置5min，乙腈定容，0.22μm濾膜過(guò)濾，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，進(jìn)樣20μl。質(zhì)譜總離子流圖如圖15所示。

反應(yīng)液還可按照下述色譜條件富集：XBridge C18(19*50mm，5μm)制備柱；進(jìn)樣500μL；流動(dòng)相A:0.35％甲酸水溶液(氨水調(diào)節(jié)pH值為7.8)；流動(dòng)相B：甲醇:乙腈＝45:25；A:B＝80:20；紫外吸收波長(zhǎng)：205nm；流速：17ml/min，質(zhì)譜總離子流圖如圖16所示。

圖15中23.32min處的化合物即本發(fā)明的有關(guān)物質(zhì)2，高分辨測(cè)得分子式為C₄₁H₇₉N₃O₁₃([M+H]⁺＝822.56921)，比泰拉霉素分子式中多了一個(gè)O。MS²碎片761.35416(C₃₉H₇₃N₂O₁₂⁺)、593.40082(C₂₉H₅₇N₂O₁₀)、532.34883(C₂₇H₅₀NO₉⁺)、230.17529(C₁₂H₂₄NO₃⁺)。其一級(jí)質(zhì)譜圖如圖17所示，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖18所示，質(zhì)譜裂解途徑如下所示：

實(shí)施例12堿降解反應(yīng)

取約50mg泰拉霉素原料藥于10ml量瓶中，加1M NaOH溶液1ml，加1ml乙腈助溶，60℃水浴加熱25min，0.1M HCl溶液中和，乙腈定容，0.22μm濾膜過(guò)濾，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，進(jìn)樣20μl。質(zhì)譜總離子流圖如圖 19所示。

圖19中的7.80min處的化合物即本發(fā)明的有關(guān)物質(zhì)4，高分辨測(cè)得分子式為C₄₁H₈₁N₃O₁₃([M+H]⁺＝824.58527)，MS²碎片為595.41656(C₂₉H₅₉N₂O₁₀)、550.38651(C₂₇H₅₂NO₁₀⁺)、420.29623(C₂₁H₄₂NO₇)、402.28582(C₂₁H₄₀NO₆)、158.11700(C₈H₁₆NO₂⁺)、230.17590(C₁₂H₂₄NO₃⁺)。其一級(jí)質(zhì)譜圖如圖20所示，二級(jí)質(zhì)譜圖如圖21所示，質(zhì)譜裂解途徑如下所示：

實(shí)施例13酸降解反應(yīng)

取約50mg泰拉霉素樣品于10ml量瓶中，加1M HCL溶液1ml，室溫(20℃)放置4h，1M NaOH溶液中和，乙腈定容，0.22μm濾膜過(guò)濾，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，進(jìn)樣20μl。質(zhì)譜總離子流圖如圖22所示。

實(shí)施例14高溫降解反應(yīng)

條件1取泰拉霉素原料藥適量，置于105℃烘箱中24h，放冷，取5mg溶于1ml乙腈中，0.22μm濾膜過(guò)濾后，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，進(jìn)樣20μL。

條件2取約50mg泰拉霉素樣品于10ml量瓶中，乙腈定容，置沸水浴中12h，放冷，0.22μm濾膜過(guò)濾，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，進(jìn)樣20μl。

高溫破壞分析：泰拉霉素固體樣品高溫破壞與原料藥相比，未見(jiàn)新的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，樣品在說(shuō)明該樣品在高溫下較穩(wěn)定。

實(shí)施例15光照降解反應(yīng)

取泰拉霉素適量，置于光照箱(照度45Lx±500Lx)光照10天，分別于第5天和第10天取樣，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，結(jié)果與未光照處理的樣品對(duì)比發(fā)現(xiàn)樣品光照5天后分子量為818(即表1中的11)的雜質(zhì)含量增大，光照10天后此雜質(zhì)含量增大。

實(shí)施例16高濕降解反應(yīng)

在密閉容器下部放置KNO₃飽和溶液(25℃，濕度92.5％),取泰拉霉素適量，在該容器中放置10天，于第5天和第10天取樣，按實(shí)施例1的色譜參數(shù)測(cè)定，結(jié)果與未高濕處理的樣品比較，未見(jiàn)新的雜質(zhì)峰出現(xiàn)，說(shuō)明樣品受濕度影響不大。

泰拉霉素在高溫、高濕、光照、酸降解反應(yīng)中未發(fā)現(xiàn)新的有關(guān)物質(zhì)。

對(duì)比例1流動(dòng)相A為醋酸銨

色譜條件：Xbridge^TM C18(250*4.6mm，5μm)柱；流動(dòng)相A：15mM醋酸銨，氨水調(diào)節(jié)pH值為7.8；流動(dòng)相B：甲醇：乙腈＝45：25；梯度洗脫0→15min，A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65：35→30:70；40→55min，A：B＝30:70；紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min；除上述參數(shù)外，其余參數(shù)均同實(shí)施例1，質(zhì)譜總離子流圖如圖23所示，其保留時(shí)間長(zhǎng)，雜質(zhì)分離差。

對(duì)比例2流動(dòng)相B為乙腈

色譜條件：XbridgeTM C18(250*4.6mm，5μm)柱；流動(dòng)相A：0.35％甲酸(氨水調(diào)節(jié)pH值7.66)；流動(dòng)相B：乙腈；梯度洗脫0→15min,A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65：35→30:70；40→55min，A：B＝30:70；紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min；除上述參數(shù)外，其余參數(shù)均同實(shí)施例1，質(zhì)譜總離子流圖如圖24所示，其保留時(shí)間太短，雜質(zhì)分離差。

對(duì)比例3流動(dòng)相B為甲醇：乙腈＝1:1

色譜條件：Xbridge^TM C18(250*4.6mm，5μm)柱；流動(dòng)相A：0.35％甲酸(氨水調(diào)節(jié)pH值7.66)；流動(dòng)相B：甲醇：乙腈＝1:1；梯度洗脫0→15min,A:B＝65:35；15→40min，A:B＝65：35→30:70；40→55min，A： B＝30:70；紫外吸收波長(zhǎng)205nm，柱溫35℃，流速1.0ml/min；除上述參數(shù)外，其余參數(shù)均同實(shí)施例1，質(zhì)譜總離子流圖如圖25所示，其雜質(zhì)分離差。