本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域中一株降解除草劑普施特的細菌及其用途。

背景技術(shù)：
普施特，又名咪草煙，英文名稱Pursuit(imazethapyr-ammonium)，化學(xué)名稱(RS)-5-乙基-2-(4-異丙基-4-甲基-5-氧代-2-咪唑啉-2-基)煙酸?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)如式1所示：普施特是咪唑啉酮類除草劑，是側(cè)鏈氨基酸合成抑制劑，芽前或芽后均可施用，對大豆和其他豆科植物農(nóng)田的禾本科雜草和某些闊葉雜草如莧菜、蓼、藜、龍葵、蒼耳、稗草、狗尾草、馬唐、黍等有優(yōu)異的防治效果。普施特為長殘效除草劑，優(yōu)點是除草效果好、殺草譜寬、用藥量少、使用方便、用藥成本低，但它們在土壤中殘留時間長，一般可達2－3年，在連作或輪作農(nóng)田中使用極易造成后茬作物藥害、減產(chǎn)、甚至絕產(chǎn)，并嚴重影響了農(nóng)業(yè)種植業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整。長殘效除草劑使后茬作物受藥害減產(chǎn)、絕產(chǎn)事件時有發(fā)生。主要表現(xiàn)為：一是在黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古一些地方把大豆田改為水田，種植水稻受害嚴重，甚至絕產(chǎn)。二是除草劑施后3－4年仍有藥害，導(dǎo)致甜菜種植業(yè)下滑。三是經(jīng)濟作物發(fā)展受影響，白瓜籽、向日葵、馬鈴薯、亞麻和蔬菜等受到傷害，嚴重者基地受毀。內(nèi)蒙古東北部幾年前就想調(diào)整種植業(yè)結(jié)構(gòu)，因小麥、大豆田多年使用長殘效除草劑使種植馬鈴薯、亞麻、白瓜子、蕓豆等經(jīng)濟作物未能實現(xiàn)，嚴重制約了本地經(jīng)濟發(fā)展。四是玉米、高粱、谷子等作物受害，矮化減產(chǎn)或絕產(chǎn)。自然界除草劑殘留的降解主要依靠土壤中微生物來完成，但自然降解十分緩慢。因此，有針對性地篩選高效微生物菌株，研制微生物修復(fù)劑，通過人工接種加速土壤長殘效除草劑的降解、消除農(nóng)田除草劑殘留藥害是一項十分必要的工作和切實可行的途徑。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何降解除草劑普施特。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一株可以降解除草劑普施特的細菌。本發(fā)明提供的細菌是中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31，該菌株已于2014年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.9865。本發(fā)明的另一個目的是提供一種菌劑，該菌劑的活性成分為所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865。上述菌劑可為下述1)或2)所述菌劑：1)用于降解除草劑普施特的菌劑；2)用于修復(fù)土壤除草劑普施特污染的菌劑。所述菌劑還可以包括載體。所述載體可為固體載體或液體載體。所述固體載體可為礦物材料、植物材料或高分子化合物；所述礦物材料可為粘土、滑石、高嶺土、蒙脫石、白碳、沸石、硅石和硅藻土中的至少一種；所述植物材料可為玉米粉、豆粉和淀粉中的至少一種；所述高分子化合物可為聚乙烯醇和/或聚二醇。所述液體載體可為有機溶劑、植物油、礦物油或水；所述有機溶劑可為癸烷和/或十二烷。所述菌劑中，所述活性成分可以以被培養(yǎng)的活細胞、活細胞的發(fā)酵液、細胞培養(yǎng)物的濾液或細胞與濾液的混合物的形式存在。所述組合物的劑型可為多種劑型，如液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、顆粒劑、可濕性粉劑或水分散粒劑。根據(jù)需要，所述菌劑中還可添加表面活性劑(如吐溫20、吐溫80等)、粘合劑、穩(wěn)定劑(如抗氧化劑)、pH調(diào)節(jié)劑等。所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865或以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑在降解除草劑普施特中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865或以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑在修復(fù)土壤除草劑普施特污染中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明的再一個目的是提供一種培養(yǎng)中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的方法。本發(fā)明所提供的培養(yǎng)中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的方法包括將中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865在用于培養(yǎng)中間根瘤菌的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的步驟。本發(fā)明的又一個目的是提供一種以中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865為活性成分的菌劑的制備方法。本發(fā)明所提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：將所述的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865作為活性成分，得到所述菌劑。本發(fā)明是從長期受到除草劑普施特污染的農(nóng)田采集土樣，并從中分離篩選得到的除草劑普施特降解菌中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865。實驗證明，該菌株在無機鹽培養(yǎng)基中7天對100mg/L普施特的降解率達到84.62％。這表明該菌株能降解除草劑普施特，在修復(fù)土壤除草劑普施特污染方面具有廣闊的應(yīng)用前景。保藏說明菌種名稱：中間根瘤菌拉丁名：(Mesorhizobiumsp.)菌株編號：198-R-31保藏機構(gòu)：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏機構(gòu)簡稱：CGMCC地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號保藏日期：2014年10月28日保藏中心登記入冊編號：CGMCCNo.9865具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中所用的培養(yǎng)基如下：無氮液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為蔗糖10g/L，NaCl0.12g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，CaCO31g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無氮固體培養(yǎng)基：向無氮液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為15-20g/L得到的培養(yǎng)基。牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl5g/L、瓊脂15-20g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無機鹽液體培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為NH4Cl1.0g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，MgSO40.2g/L，NaCl0.5g/L；溶劑為蒸餾水；pH7.2。無機鹽固體培養(yǎng)基：向無機鹽液體培養(yǎng)基中加瓊脂至其含量為2％得到的培養(yǎng)基。實施例1、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的分離與鑒定一、普施特降解菌198-R-31的分離1、在100ml無菌水中加入10g土壤樣品(采自中國黑龍江黑河受除草劑污染的農(nóng)田)振蕩培養(yǎng)30min制成混濁液。吸取1ml上述混濁液加入盛有9ml無菌水中的試管中充分混勻(此時稀釋度記為10-1)，然后從此試管中吸取1ml加入到另一盛有9ml無菌水的試管中混合均勻，以此類推制成10-2、10-3、10-4、10-5不同稀釋度的菌懸液。將各稀釋度取0.1ml均勻涂布在無氮固體培養(yǎng)基平板上，28℃恒溫靜置培養(yǎng)2—3天。待菌落形成后，在無氮固體培養(yǎng)基平板上進行菌種純化。2、對除草劑普施特、乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚降解能力的初步篩選采用平板透明圈法。將普施特標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到普施特平板；將乙草胺標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到乙草胺平板；將氯嘧磺隆標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到氯嘧磺隆平板；將雜草焚標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)加入無機鹽固體培養(yǎng)基使其含量為1000mg/L，得到雜草焚平板。將普施特平板、乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板進行分區(qū)，吸取步驟1純化得到的每株菌的菌懸液10μL(各種菌株菌懸液的菌體含量相同)分別點種到四種平板上(每株菌在一個平板上重復(fù)3次)，28℃培養(yǎng)、觀察。篩選到一株在普施特平板上能形成較大透明圈的菌株，將其命名為普施特降解菌198-R-31。普施特降解菌198-R-31在乙草胺平板、氯嘧磺隆平板和雜草焚平板上均不能形成透明圈。說明普施特降解菌198-R-31能降解普施特，不能降解乙草胺、氯嘧磺隆和雜草焚。表1.普施特降解菌198-R-31對四種除草劑降解能力初篩結(jié)果菌株編號普施特乙草胺氯嘧磺隆雜草焚普施特降解菌198-R-31+－－－注：“+”表示形成較大透明圈，“－”表示無透明圈形成。二、普施特降解菌198-R-31的鑒定從以下幾個方面鑒定步驟一分離并純化得到的普施特降解菌198-R-31：1、形態(tài)學(xué)鑒定將處于對數(shù)生長期且菌落大小穩(wěn)定，上述步驟一分離并純化得到的普施特降解菌198-R-31進行單菌落狀態(tài)觀察，主要包括菌落的大小、顏色、透明度、濕潤度、菌落表面狀態(tài)(是否平坦、突起、褶皺、凹陷等)、菌落邊緣狀態(tài)(是否整齊、不規(guī)則、放射狀等)。結(jié)果表明，上述步驟一分離并純化得到的普施特降解菌198-R-31菌落凸起、乳白色、粘稠、邊緣規(guī)則；菌落小，直徑0.4-0.9mm。2、生理生化特征分析參考《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》(東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊.北京:科學(xué)出版社，2011.)和《微生物學(xué)實驗》(沈萍,范秀容,李廣武.微生物學(xué)實驗(第三版).北京:高等教育出版社,1999.)測定上述普施特降解菌198-R-31的生理生化特征。所述普施特降解菌198-R-31的生理生化特征測定結(jié)果如表2所示：表2.普施特降解菌198-R-31的生理生化特征注：“+”表示陽性，“－”表示陰性。3、16SrDNA序列同源性分析常規(guī)方法培養(yǎng)上述步驟一分離純化得到的普施特降解菌198-R-31，提取菌株的總DNA作為基因擴增模板，以細菌16SrDNA通用引物，27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492r：5′-TACCTTGTTACGACTT-3′進行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系采用上海生物工程有限公司PCR擴增試劑盒。反應(yīng)程序為：95℃變性30s、55℃退火1min、72℃延伸2min，共30個循環(huán)。DNA測序由北京三博遠志生物技術(shù)公司完成，序列拼接及相似性分析使用DNAStar軟件完成，基因比對通過美國國家生物技術(shù)信息中心NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)和EzTaxon在線完成。PCR基因擴增得到普施特降解菌198-R-31的16SrDNA基因片段約1.3kb，測定序列后與NCBI和EzTaxon數(shù)據(jù)庫中已公開的16SrDNA序列進行在線同源性比對，結(jié)果顯示普施特降解菌198-R-31與中間根瘤菌屬Mesorhizobiumamorphae(GenBank登錄號AF041442)同源性最高，達到99.85％。普施特降解菌198-R-31的16SrDNA序列詳見序列1。鑒于上述形態(tài)、生理生化特征分析和16SrDNA序列同源性分析結(jié)果，將步驟一分離純化得到的普施特降解菌198-R-31鑒定為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)。該普施特降解菌198-R-31已于2014年10月28日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.9865。普施特降解菌198-R-31的全稱為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865，簡稱為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31。實施例2、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865降解普施特能力定量測定一、普施特測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制準(zhǔn)確稱取普施特標(biāo)準(zhǔn)品(Fluka公司產(chǎn)品)10.0mg于10mL容量瓶中，用少量甲醇溶解，將容量瓶放在超聲波浴槽中振蕩10min，然后用甲醇定容至10mL，搖勻，配成1000mg/L普施特母液。然后繼續(xù)用甲醇稀釋獲得濃度分別為20、40、60、80、100mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。采用高效液相色譜(HPLC)測定不同濃度普施特標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，3次重復(fù)。以普施特濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制普施特標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。檢測條件如下：檢測系統(tǒng)：Agilent1100Series。色譜柱：C18DiamosilTM反相柱，250mm×4.6mm，粒徑5μm。色譜條件：流動相：乙腈：水(冰乙酸調(diào)pH3.0)＝40:60(v/v)；檢測波長，258nm；流速，1.0mL/min；進樣體積，10μL；柱溫30℃所得普施特測定標(biāo)準(zhǔn)曲線：y＝24.482x-6.6979(R2＝0.9998)。其中，y為峰面積，x為普施特濃度。二、中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865降解普施特能力定量測定中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31處理：將中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865接種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24h，挑取1環(huán)接種在5mL牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，180r/min培養(yǎng)12h，離心去掉培養(yǎng)基，用無機鹽液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)到OD600值為1.0。吸取0.2mL菌懸液(1×109cfu/ml)接種到5mL含普施特100mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基(向無機鹽液體培養(yǎng)基中加入普施特(Fluka公司產(chǎn)品)使普施特的濃度為100mg/L得到的培養(yǎng)基)的試管中，28℃，180r/min培養(yǎng)7天，得到降解液。取4mL降解液至50mL離心管中，加入8mL二氯甲烷，振蕩2min，靜置10min，加入少許無水硫酸鈉。準(zhǔn)確吸取800μL有機相轉(zhuǎn)移至1.5mLEP離心管中，在氮吹儀上吹干，加入400μL甲醇(色譜級)，在超聲波清洗儀上溶解10min，用液譜過濾器過濾收集至樣品瓶中，按照上述HPLC法測定普施特?？瞻讓φ仗幚恚和瑫r，以未接種中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865的上述含普施特100mg/L的無機鹽液體培養(yǎng)基作為空白對照，按照上述方法測定普施特的濃度。普施特降解率：X＝(1-A/B)×100％，式中X為降解率(％)，A為中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31處理液中殘留的普施特濃度，B為未接菌空白對照處理液中殘留的普施特濃度。實驗設(shè)3次重復(fù)，每次重復(fù)每個處理接種10個試管。表3.中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.986降解普施特功效結(jié)果顯示，普施特初始濃度為100mg/L，7天后所述中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865對普施特的降解率達到84.62％(如表3所示)，這一結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的中間根瘤菌(Mesorhizobiumsp.)198-R-31CGMCCNo.9865可降解普施特。