一種18F標記Cys-AnnexinV的方法及其應用技術領域本發(fā)明屬于PET顯像領域，具體涉及一種18F標記AnnexinV的方法及其應用。

背景技術：
細胞凋亡(Apoptosis)又稱程序性細胞死亡(ProgrammedCellDeath，PCD)，是不同于壞死和意外死亡的、由基因調控的細胞主動性死亡過程。作為細胞生命周期中的重要組成部分，細胞凋亡的過程中伴隨著一系列的生物分子及細胞形態(tài)學的改變。其中，細胞膜脂質雙層中的磷脂酰絲氨酸(PS)由細胞膜內層翻轉至外層，進而暴露于細胞表面，是細胞凋亡早期事件，發(fā)生在凋亡細胞形態(tài)學的改變之前，也是凋亡級聯(lián)反應的初始事件。PS的外翻作為凋亡細胞被吞噬細胞識別的標志，將會進一步引起胞漿的皺縮、染色質的濃集及核內DNA降解等現(xiàn)象。因此，外翻的PS作為凋亡檢測的靶點，具有較高的時效性，可早期檢測細胞凋亡。目前，在利用檢測外翻的PS來獲知細胞凋亡情況的技術中，正電子斷層顯像(positronemissiontomography，PET)是常用的技術手段之一，其主要是利用11C、13N、15O或18F等放射性核素標記的、可與PS特異性結合的物質作為顯像劑，通過顯像劑在代謝中聚集與分布的呈像，來獲知細胞凋亡的情況，從而達到診斷的目的。在可與PS特異性結合的物質中，以AnnexinV作為PET顯像劑的相關技術具有良好的應用前景。AnnexinV(膜聯(lián)蛋白V，又稱AnnexinA5和AnxA5)是一種人體內源性蛋白，屬于Ca2+依賴性磷脂結合蛋白家族，含有319各氨基酸，包括70-80個氨基酸重復單元，分子量約為35kD。研究表明，AnnexinV與PS特異性結合的親和力高達10-9mol/L，其在被放射性核素標記、進而作為PET顯像劑進行體內細胞凋亡的顯像時，可實時監(jiān)測體內凋亡的發(fā)生并且可實現(xiàn)細胞凋亡的活體無創(chuàng)顯像，因此，已成為監(jiān)測活體細胞凋亡領域的研究熱點。在對AnnexinV進行正電子核素標記的技術中，以18F標記AnnexinV的18F-SFB-AnnexinV最為常見。但是，由于18F-SFB-AnnexinV是通過功能基團(18F-SFB)連接AnnexinV中賴氨酸殘基上的氨基，進而標記上放射性核素的，而一分子的AnnexinV蛋白中含有21個賴氨酸殘基，因此，18F-SFB標記在AnnexinV上的位置是不確定的，甚至標記上的個數(shù)也不確定。另外，AnnexinV中的一些賴氨酸殘基處在AnnexinV與PS結合的活性區(qū)域附近，18F-SFB與該處的賴氨酸殘基連接則會影響AnnexinV與PS的親和性。這些均會導致18F-SFB-AnnexinV在細胞凋亡顯像時特異性較低。為實現(xiàn)對AnnexinV的定位標記，且不影響AnnexinV與PS的親和性，進而提高AnnexinV凋亡顯像的特異性，現(xiàn)有技術中出現(xiàn)了對AnnexinV進行修飾，研究新的AnnexinV蛋白變體的相關技術。例如，2008年Li,Xuehe等用18F-FBABM對N端接一個半胱氨酸的AnnexinV蛋白進行標記，研究結果顯示，AnnexinV經(jīng)上述修飾后不影響其與PS結合的親和力，但是18F-FBABM與蛋白的標記率比較低，僅為37％，無法實現(xiàn)更為高效標記。中國專利文獻CN102690345A中公開了一種在大腸桿菌中克隆、表達并純化得到的新的AnnexinV變體，該變體僅在天然AnnexinV的C-末端添加了1個半胱氨酸(Cys-AnnexinV)，該變體已證實可用于99mTc的標記。

技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的第一個技術問題是現(xiàn)有技術中的18F標記AnnexinV的方法無法實現(xiàn)對AnnexinV進行定位標記、標記率低、無法保證AnnexinV與PS較好的親和性的問題，進而提供一種可實現(xiàn)18F定位標記Cys-AnnexinV的、標記后Cys-AnnexinV與PS保持良好的親和性的高標記率的18F標記Cys-AnnexinV的方法。本發(fā)明解決的第二個技術問題是現(xiàn)有技術中的18F標記AnnexinV的PET顯像劑特異性較低、無法實現(xiàn)良好的顯像效果，進而提供一種特異性高、顯像效果良好的18F標記Cys-AnnexinV的PET顯像劑。本發(fā)明的18F標記Cys-AnnexinV的方法，采用18F-FBEM標記Cys-AnnexinV。具體包括以下步驟：取18F-FBEM與Cys-AnnexinV溶解于溶劑中，混合均勻，形成反應液，在30-40℃下反應至生成標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。進一步的，本領域技術人員可根據(jù)原料的溶解等性質選取溶劑，優(yōu)選的，所述溶劑為乙醇、水、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液中的一種或多種。進一步的，在所述反應液中，所述18F-FBEM的放射性活度為1-1000MBq/mL。所述Cys-AnnexinV的濃度為0.2-20mg/mL。本發(fā)明的18F標記Cys-AnnexinV的方法，還包括采用緩沖液調節(jié)所述反應液的pH值至5-8的步驟。當然，所述緩沖液只要可以實現(xiàn)將反應液的pH值調節(jié)至所需范圍內即可，優(yōu)選的，所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液中的一種或兩者的混合液。根據(jù)上述方法制備得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV，可應用與PET顯像領域。所述的18F-FBEM-Cys-AnnexinV在制備PET顯像劑中的應用。本發(fā)明提供的PET顯像劑，包括18F-FBEM-Cys-AnnexinV。本發(fā)明所述的18F-FBEM，即N-[2-(4-[18F]氟苯甲酰氨基)乙基]馬來酰亞胺，其結構式如下：所述Cys-AnnexinV為AnnexinV的變體蛋白，在天然的AnnexinV的C-末端添加1個半胱氨酸，其結構如下：所述18F-FBEM與Cys-AnnexinV的標記反應過程如下所示：本發(fā)明旨在討論18F標記Cys-AnnexinV的方法，所用的原料18F-FBEM與Cys-AnnexinV可采用本領域技術人員常規(guī)方法得到。例如，所述Cys-AnnexinV可采用中國專利文獻CN102690345A中記載的在大腸桿菌中克隆、表達并純化得到的AnnexinV變體的方法得到。本發(fā)明的上述技術方案，相比現(xiàn)有技術具有以下優(yōu)點：(1)本發(fā)明的18F標記Cys-AnnexinV的方法，采用18F-FBEM標記Cys-AnnexinV。首先，AnnexinV的三維結構顯示，其N-端和C-端都位于分子膜結合點的對面，在重組過程中對AnnexinV的兩端進行修飾并不影響重組蛋白在Escherichiacolli的表達或折疊，也不改變其與膜PS結合的親合性，因此，在AnnexinV的C-末端添加1個半胱氨酸得到的Cys-AnnexinV，其與PS結合的親合性并未受到影響。與此同時，經(jīng)過修飾得到的Cys-AnnexinV可與18F-FBEM基團實現(xiàn)高選擇性的連接。Cys-AnnexinV的C端的游離巰基與18F-FBEM上的雙鍵發(fā)生特異性連接，可較好的保證18F的定位標記，避免了標記位置、標記數(shù)量的不確定帶來的顯像特異性低的問題。(2)本發(fā)明標記方法，步驟簡單易行，且標記結果直觀準確。經(jīng)實驗表明，本發(fā)明的標記方法，標記率可達80％以上，且標記產(chǎn)物與反應中可能出現(xiàn)的雜質(如放射性雜質18F-FBEM等)能夠明顯區(qū)分，易于制備成PET顯像劑。(3)本發(fā)明的PET顯像劑，包括18F-FBEM-Cys-AnnexinV，標記后的18F-FBEM-Cys-AnnexinV與Cys-AnnexinV具有相近似的性能，作為顯像劑應用于檢測時，可直觀反映出細胞的凋亡情況，且顯像結果與原位末端標記法檢測細胞凋亡的結果相一致，結果準確。并且，實現(xiàn)了定位標記的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，其顯像特異性優(yōu)異，可實現(xiàn)良好的顯像效果。附圖說明為了使本發(fā)明的內容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結合附圖，對本發(fā)明作進一步詳細的說明，其中圖1為本發(fā)明標記前體Cys-AnnexinV的HPLC色譜圖；圖2為實施例1中標記蛋白18F-FBEM-Cys-AnnexinV的HPLC色譜圖；圖3為實施例1中純化后18F-FBEM-Cys-AnnexinV的HPLC色譜圖；圖4為實施例1中18F-FBEM的HPLC色譜圖(TSKGEL凝膠柱，tR＝15.9min)；圖5為實施例1中19F-FBEM的HPLC色譜圖(反相C18柱，UV檢測tR＝5.4min)；圖6為實施例1中18F-FBEM的HPLC色譜圖(反相C18柱，同位素檢測tR＝5.5min)；圖7為實施例5中18F-FBEM-Cys-AnnexinV在正常小鼠體內的MicroPET顯像圖及部分臟器的時間活性曲線圖；圖8為實施例6中18F-FBEM-Cys-AnnexinV在正常小鼠體內的血藥清除曲線；圖9為實施例7中大鼠肝臟凋亡模型注射18F-FBEM-Cys-AnnexinV1h后的顯像圖，箭頭所指為肝臟區(qū)域，模型鼠肝臟攝取是對照組的5.18倍；圖10為實施例7中大鼠肝臟凋亡模型注射18F-FBEM-Cys-AnnexinV2h后的顯像圖，箭頭所指為肝臟區(qū)域，模型鼠肝臟攝取是對照組的10.41倍；圖11為實施例8中原位末端標記法檢測大鼠凋亡肝臟細胞的熒光顯微鏡圖。具體實施方式實施例1以18F-FBEM標記Cys-AnnexinV本實施例中，Cys-AnnexinV由江蘇靶標生物醫(yī)藥研究所有限公司提供。采用18F-FBEM對Cys-AnnexinV進行18F標記，具體包括以下步驟：(1)18F-FBEM的制備：以4-三甲胺苯甲酸乙酯三氟磺酸鹽為原料，與18F發(fā)生取代反應后，得到4-三甲胺苯甲酸乙酯三[18F]氟磺酸鹽，向其中加入0.5mL濃度為0.5mol/L的NaOH溶液，使其堿性水解，再加入0.7mL濃度為1mol/L的鹽酸溶液，將其酸化，得到4-[18F]氟苯甲酸；將得到的4-[18F]氟苯甲酸與N-(2-氨基乙基)馬來酰亞胺、氰基膦酸二乙酯以及N,N-二異丙基乙胺混合均勻，反應得到18F-FBEM。(2)18F標記：將步驟(1)中得到的18F-FBEM通過萃取柱轉換成18F-FBEM乙醇溶液，取100μL放射性活度為37MBq的18F-FBEM乙醇溶液加入到1000μL的濃度為1mg/mL的Cys-AnnexinV的磷酸緩沖液中，混合均勻后，得到pH值為8.0的反應液，將所述反應液置于35℃水浴中反應30min，即得到標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。將上述方法得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV采用高效液相色譜(HPLC)法，上TSKGEL凝膠柱(SWG2000swxL)，以濃度為0.05M(即mol/L，下同)、pH值為7.0的磷酸緩沖液為流動相，流動相的流速為0.8mL/min，紫外檢測波長為278nm，同時設置有同位素檢測儀，進行檢測。再以相同的檢測條件檢測未標記的Cys-AnnexinV以及18F-FBEM溶液。如圖1、2、4所示，分別為Cys-AnnexinV、18F-FBEM-Cys-AnnexinV以及18F-FBEM的HPLC色譜圖。通過圖1、圖2與圖4的對比可知，18F-FBEM-Cys-AnnexinV的保留時間(tR)為9.2min，與沒有標記的Cys-AnnexinV的保留時間相一致，而18F-FBEM溶液的保留時間(tR)為15.9min。通過分析圖1，計算得到標記率為83.7％。將得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV經(jīng)PD-10柱純化后，得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV的放化純大于95％，其HPLC色譜圖如圖3所示。為了更進一步的確認18F-FBEM，將HPLC中的TSKGEL凝膠柱換成反相C18柱，以標準品19F-FBEM作對照，以乙腈/水(45/55，v/v)為流動相，流動相的流速為1.0mL/min，紫外檢測波長為254nm，并設置有同位素檢測儀，進行檢測。其HPLC色譜圖其如圖5和圖6所示。上述結果表明，本發(fā)明的18F-FBEM標記Cys-AnnexinV的方法，具有較高的標記率(83.7％)，標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV與18F-FBEM能很好的分離，經(jīng)純化后18F-FBEM-Cys-AnnexinV的放化純大于95％。實施例2以18F-FBEM標記Cys-AnnexinV本實施例中，Cys-AnnexinV為采用中國專利文獻CN102690345A中記載的方法制備得到。采用18F-FBEM對Cys-AnnexinV進行18F標記，具體包括以下步驟：(1)18F-FBEM的制備：采用與實施例1相同的方法制備得到。(2)18F標記：取步驟(1)中得到的18F-FBEM配制為放射性活度為1MBq/mL的乙醇溶液，取100μL的18F-FBEM乙醇溶液加入到1000μL的濃度為0.2mg/mL的Cys-AnnexinV的水溶液中，混合均勻后，得到反應液，將所述反應液置于30℃水浴中反應30min，即得到標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。按照與實施例1相同的方法對得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV進行測定，計算得到標記率為82.0％。實施例3以18F-FBEM標記Cys-AnnexinV本實施例中，Cys-AnnexinV由江蘇靶標生物醫(yī)藥研究所有限公司提供。采用18F-FBEM對Cys-AnnexinV進行18F標記，具體包括以下步驟：(1)18F-FBEM的制備：采用與實施例1相同的方法制備得到。(2)18F標記：取步驟(1)中得到的18F-FBEM配制為放射性活度為1000MBq/mL的乙醇溶液，取100μL18F-FBEM溶液加入到1000μL的濃度為20mg/mL的Cys-AnnexinV的檸檬酸鹽緩沖液中，混合均勻后，調節(jié)pH值至5，得到反應液，將所述反應液置于40℃水浴中反應30min，即得到標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。按照與實施例1相同的方法對得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV進行測定，計算得到標記率為81.7％。實施例4以18F-FBEM標記Cys-AnnexinV本實施例中，Cys-AnnexinV由江蘇靶標生物醫(yī)藥研究所有限公司提供。采用18F-FBEM對Cys-AnnexinV進行18F標記，具體包括以下步驟：(1)18F-FBEM的制備：采用與實施例1相同的方法制備得到。(2)18F標記：取步驟(1)中得到的18F-FBEM配制為放射性活度為500MBq/mL的乙醇溶液，取100μL18F-FBEM乙醇溶液加入到1000μL濃度為10mg/mL的Cys-AnnexinV的磷酸鹽與檸檬酸鹽混合的緩沖液中，混合均勻后，得到反應液，將所述反應液置于40℃水浴中反應30min，即得到標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV。按照與實施例1相同的方法對得到的標記產(chǎn)物18F-FBEM-Cys-AnnexinV進行測定，計算得到標記率為83.2％。實施例518F-FBEM-Cys-AnnexinV在小鼠體內的MicroPET顯像本實施例通過18F-FBEM-Cys-AnnexinV在小鼠體內的生物分布，說明該標記化合物的生物學分布特點符合作為顯像劑的要求。具體操作如下：取ICR小鼠2只，用異氟烷麻醉后，使其平躺在microPET的床上，四肢用膠帶固定，取實施例1中標記得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，配制放射性活度為4.5MBq的生理鹽水溶液，取0.2ml分別經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內，動態(tài)掃描采集60min，圖像重建采用FBP法。選擇感興趣部位(本實施例中為心臟，肝臟和腎臟)，計算時間和放射性劑量之間的曲線，如圖7所示。根據(jù)圖7可知，18F-FBEM-Cys-AnnexinV主要是經(jīng)腎臟代謝，在注射后16分鐘(約1000秒)的時候，腎臟中的放射性攝取達到最大值，隨后慢慢下降，到注射后1小時的時候，腎臟、肝臟和心臟的放射性攝取基本接近。上述結果表明，18F-FBEM-Cys-AnnexinV在腎臟的代謝較快，適合其作為顯像劑的快速降低顯像本底的要求。實施例618F-FBEM-Cys-AnnexinV在小鼠體內的血藥清除實驗取ICR小鼠5只，取實施例1中標記得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，配制放射性活度為3.7MBq的生理鹽水溶液，取0.2ml分別經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內，于注射后5，15，30，45，60,90，120min分別采血10μL，用γ計數(shù)儀測量放射性計數(shù)，計算每克血液百分注射劑量率(％ID/g，每克血液的放射性計數(shù)/注射入大鼠體內總放射性計數(shù)×100％)。用DAS2.0軟件擬合，分析18F-FBEM-Cys-AnnexinV在正常小鼠體內的藥代動力學曲線，如圖8所示，符合二室模型特征，藥代公式為：C＝2.359e-0.062t+3.288e-0.005t，分布相半衰期(T1/2α)為11.261min，清除相半衰期(T1/2β)為134.62min，平均血漿清除率(CL)為0.031L/min/kg，藥-時曲線下面積(AUC0→∞值)為643.123％ID/g×min。上述實驗結果表明：18F-FBEM-Cys-AnnexinV在血液中的清除符合蛋白在血液中清除的一般規(guī)律。實施例7大鼠肝臟凋亡模型的18F-FBEM-Cys-AnnexinV的MicroPET顯像選擇SD大鼠4只(衛(wèi)生部核醫(yī)學重點實驗提供)，體重280-290g，以5mg/kg的放線菌酮劑量制備大鼠肝臟凋亡模型，3只大鼠分別經(jīng)尾靜脈注射放線菌酮溶液，另1只大鼠注射生理鹽水作對照。3小時后，取實施例1中標記得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV，配制放射性活度為7.4MBq的生理鹽水溶液，取0.2ml分別經(jīng)尾靜脈注射入大鼠體內，注射顯像劑后1h和2h分別進行MicroPET顯像，各靜態(tài)采集10min。如圖9-10所示，左側為模型鼠，箭頭處為凋亡肝臟顯像，右側為正常對照鼠，在左側模型鼠的MicroPET顯像圖中可觀察到肝臟部位有明顯的放射性濃聚。經(jīng)計算，在注射后1h和2h顯像時，模型鼠肝臟的放射性攝取(％ID/g)分別是對照組肝臟的5.18倍和10.41倍。上述實驗結果表明：化學藥物誘導的肝凋亡細胞對18F-FBEM-Cys-AnnexinV的攝取明顯高于正常肝細胞，說明18F-FBEM-Cys-AnnexinV具有顯現(xiàn)細胞凋亡的能力。實施例8大鼠凋亡肝臟的原位末端標記法(TUNEL)檢測TUNEL法用于單細胞水平凋亡免疫組化檢驗和量化分析，其原理為標記DNA斷裂位，詳細步驟如下：(1)將實施例7中顯像結束后的大鼠處死，立即取出肝臟，用福爾馬林液固定；將大鼠肝臟樣本經(jīng)福爾馬林液固定24h后，石蠟包埋，切片，每片厚度4-5μm；(2)二甲苯脫蠟30min，梯度乙醇水化后PBS沖洗，每次1min；(3)滴加蛋白酶K，37℃孵育30min后，PBS洗滌3次；(4)滴加TUNEL檢測液(購自碧云天生物技術研究所)，37℃避光孵育1h，PBS洗滌3次；(5)用抗熒光淬滅封片液封片后，100倍熒光顯微鏡下觀察。如圖11所示，左側為模型鼠，右側為對照組，圖中箭頭所指為發(fā)熒光的凋亡小體，模型鼠的肝臟可見較多的發(fā)熒光的凋亡小體，而對照組的肝臟中發(fā)熒光的凋亡小體就很少。這個結果與18F-FBEM-Cys-AnnexinV的大鼠肝臟凋亡顯像的結果相一致，說明18F-FBEM-Cys-AnnexinV標記化合物作為顯像劑能夠顯示大鼠肝臟的凋亡情況。實施例9：18F-FBEM-Cys-AnnexinV與18F-SFB-AnnexinV的對比現(xiàn)有技術中，以18F-SFB為基礎計算18F-SFB-AnnexinV的標記率為20-25％(Jian-ChengZhu,FengWang,WeiFang,etal,18F-annexinVapoptosisimagingfordetectionofmyocardiumischemiaandreperfusioninjuryinaratmodel,JRadioanalNuclChem(2013)298:1733–1738.)。而本發(fā)明中以18F-FBEM為基礎計算18F-FBEM-Cys-AnnexinV的標記率大于80％(如實施例1-4所示),由此可見，本發(fā)明的技術方案，標記率遠遠高于現(xiàn)有技術。現(xiàn)有技術中得到的18F-SFB-AnnexinV，在放線菌酮誘導的大鼠肝臟凋亡模型的顯像中，18F-SFB-AnnexinV注射后2h,模型組肝臟的放射性攝取是對照組的3-9倍(KevinJ.Yagle,JanetF.Eary,JonathanF.Tait,etal,Evaluationof18F-AnnexinVasaPETImagingAgentinanAnimalModelofApoptosis,JOURNALOFNUCLEARMEDICINE,Vol.46,No.4,658-666)。也許正是由于18F-SFB標記位置的不確定，導致上述18F-SFB-AnnexinV凋亡顯像的特異性有所降低，使模型組肝臟的放射性攝取與對照組的比值在3-9的范圍內。而本發(fā)明得到的18F-FBEM-Cys-AnnexinV在放線菌酮誘導的大鼠肝臟凋亡模型的顯像中，注射后2h,模型組肝臟的放射性攝取是對照組的10.41倍(如實施例7所示)，明顯高于現(xiàn)有技術，說明18F-FBEM-Cys-AnnexinV的凋亡顯像的特異性高于現(xiàn)有技術的18F-SFB-AnnexinV。綜上所述，本發(fā)明的18F標記Cys-AnnexinV的方法可實現(xiàn)高標記率，且應用于顯像時放射性攝取高、Cys-AnnexinV與PS的親和性較好，顯像特異性高，作為PET顯像劑可實現(xiàn)較為理想的顯像效果。顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。