本發(fā)明屬于獸醫(yī)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種豬圓環(huán)病毒cap蛋白嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位的重組病毒及應(yīng)用。

背景技術(shù)：
豬圓環(huán)病毒(PCV)是圓環(huán)病毒科(Circoviridae)圓環(huán)病毒屬(Circovirus)的成員，包括PCV1和PCV2，是目前發(fā)現(xiàn)的世界上最小的脊椎動物病毒。PCV1無致病性，而PCV2有致病性。PCV2在臨床上可感染5-12周齡的豬發(fā)生斷奶豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)，還可引起豬皮炎腎病綜合征(porcinedermatitisandnephropathy，PDNS)，豬呼吸道疾病復(fù)合癥(porcinerespiratorydieasecomplex，PRDC)，增生性壞死性肺炎(proliferativeandnecrotizingpneumonia，PNP)等疾病。目前，國際上為了研究的方便，把這些疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒病(postweaningmultisystemicwastingsyndromeassociateddiease,PCVAD)。PCV的ORF2基因全長702bp(nt1,735-1,034)，其編碼的Cap蛋白由234個氨基酸組成，大小為27.8kDa。Cap是主要的免疫原性蛋白并能誘導(dǎo)特意的PCV2中和抗體(Pogranichnyyetal.,2000)，因此ORF2基因是設(shè)計PCV2新型疫苗的首選目標(biāo)基因。Liu等(2001)通過大腸桿菌表達(dá)ORF2基因，證明其具有很強(qiáng)的免疫原性；在桿狀病毒表達(dá)ORF2基因后可以形成圓環(huán)病毒樣顆粒(Viruslikeparticles，VLP)(Nawagitgul,2000)。Cap蛋白的N段是高度保守且富含精氨酸的序列，N段前41個氨基酸片段是Cap蛋白核定位信號序列(NLS)，研究表明缺失N段核定位序列不影響其組裝成病毒樣顆粒的特性。豬瘟(Classicalswinefever,CSF)是由黃病毒科瘟病毒屬豬瘟病毒(Classicalswinefevervirus,CSFV)引起的一種高度接觸性、出血性和致死性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病。當(dāng)前豬瘟在我國很多豬場流行，臨床上表現(xiàn)為早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及豬生產(chǎn)能力下降等。同時該病與偽狂犬病、圓環(huán)病毒感染相關(guān)疾病等多重感染和混合感染常常發(fā)生。E2蛋白是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要保護(hù)性抗原主要成分，可以抵抗強(qiáng)毒的攻毒保護(hù)實驗(Dongetal.,2006；Chenetal.,2011；LlilianneGangesaetal.,2012)。E2蛋白存在4個相對獨(dú)立的抗原區(qū)：A，B，C和D，而B區(qū)693-716之間的氨基酸序列(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)屬于B細(xì)胞表位，能產(chǎn)生中和抗體并提供完全的保護(hù)率(DongXN,etal.,2006，2007)。近年來，桿狀病毒表達(dá)載體因其具有操作簡單、安全性高，可容納大的目的基因，表達(dá)外源蛋白效率高，有翻譯后修飾的作用，表達(dá)蛋白的免疫原性、生物活性與天然的蛋白相似等優(yōu)點，已經(jīng)在表達(dá)載體上占了主導(dǎo)的地位(Andersonetal.,1995；Wangetal.,2001；Ribeiroetal.,2001)。而近年來發(fā)展起來的病毒樣顆粒疫苗，含有病毒的一個或多個抗原蛋白、具有與病毒粒子相似結(jié)構(gòu)的顆粒，不含有病毒的遺傳物質(zhì)，不能自主復(fù)制、沒有感染性，能以天然構(gòu)象和模式遞呈抗原，有效刺激體液和細(xì)胞免疫，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)。本發(fā)明在PCV2的ORF2基因基礎(chǔ)上，缺失其N段核定位39個氨基酸序列，插入CSFVB細(xì)胞表位或偶聯(lián)T細(xì)胞氨基酸的基因序列，以桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)嵌合B細(xì)胞表位的PCV2的Cap蛋白，研究B細(xì)胞表位的PCV2的病毒樣顆粒疫苗形成的能力。同時利用形成的嵌合病毒樣顆粒制備亞單位二價疫苗，通過動物試驗評價對豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒的免疫原性效果，為臨床上防控豬瘟和豬圓環(huán)病毒病提供理想的候選疫苗株。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個目的是提供了一種人工修飾合成的豬圓環(huán)病毒cap蛋白基因和豬瘟病毒B細(xì)胞表位基因序列嵌合的cDNA基因序列cap-24B，其序列分別為SEQIDNO.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQIDNO.2所示。本發(fā)明的另一個目的是提供一種轉(zhuǎn)移載體pFBD-cap-24B，為含有3個拷貝的嵌合cap-24BcDNA基因序列的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNM1P10eGFP。本發(fā)明的另一個目的就是提供一種表達(dá)豬圓環(huán)病毒cap蛋白和B細(xì)胞表位基因的重組桿狀病毒，該毒株于2014年10月19日送交中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCCNO:V201432，分類命名：重組桿狀病毒RecominantAutographacalifornicamultipleNucleopolyhedrovirusAc-cap-24B，地址：中國武漢武漢大學(xué)。本發(fā)明還有一個目的是提供了重組桿狀病毒Ac-cap-24B在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用，將該嵌合病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒的免疫反應(yīng)，并能產(chǎn)生針對豬瘟和豬圓環(huán)病毒的特異性的抗體反應(yīng)。更詳細(xì)的技術(shù)方案見《具體實施方式》所述。本發(fā)明的有益效果是：1.本發(fā)明根據(jù)桿狀病毒密碼子的偏愛性，首次人工修飾合成了豬圓環(huán)病毒Cap基因N段核定位序列(NLS)替代為豬瘟病毒B細(xì)胞表位的cDNA基因序列的基因序列Cap-24B。2.本發(fā)明是將人工合成目的基因Cap-24B置于桿狀病毒pH啟動子下表達(dá)，提高了外源基因的表達(dá)量。插入到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體上置于桿狀病毒pH啟動子下表達(dá)，因插入是3拷貝形式可提高外源基因的表達(dá)量。3.本發(fā)明的重組桿狀病毒所表達(dá)豬圓環(huán)病毒Cap基因嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位后，同樣能成功形成PCV2樣病毒顆粒，表明豬圓環(huán)病毒Cap基因N段核定位序列(NLS)被替換后不影響其形成病毒樣顆粒的能力，為進(jìn)一步研制嵌合豬圓環(huán)病毒提供可行性依據(jù)。4.本發(fā)明的重組桿狀病毒所表達(dá)嵌合VLP制備亞單位疫苗，免疫小鼠后可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒的特異性免疫反應(yīng)。附圖說明圖1cap-24B基因人工合成和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建的示意圖A：cap-24B基因人工合成的示意圖；B：pFBD-cap-24B桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建示意圖。圖2為桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBD-cap-24B的酶切鑒定圖譜。M：15000bpDNAMarker；1:pFBD-cap-24B/SpeI+NotI酶切圖3重組桿粒rBac-cap-24BPCR鑒定示意圖鑒定正確的桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBD-cap-24B轉(zhuǎn)化DH10Bac，藍(lán)白斑篩選獲得陽性菌落，提取桿粒進(jìn)行PCR鑒定的電泳圖片。M：2000bp；1：利用Cap-24B4F和Cap-R引物擴(kuò)增；2：利用Cap-24B4F和M13R引物擴(kuò)增；3：陰性對照。圖4為一種Westernblot分析重組桿狀病毒Ac-cap-24B蛋白表達(dá)的示意圖M：蛋白marker；1：SF9細(xì)胞對照；2：Ac-cap感染sf9細(xì)胞(陽性對照)；3：Ac-cap-24B感染sf9細(xì)胞；圖5為一種間接免疫熒光分析重組桿狀病毒Ac-cap-24B蛋白表達(dá)的示意圖Anti-Cap：用PCV2cap單抗檢測目的蛋白表達(dá)，觀察紅熒光；EGFP：桿狀病毒攜帶EGFP標(biāo)記，觀察綠熒光；DAPI：觀察細(xì)胞核；Merge：紅熒光與率熒光合在一起的圖片Ac-cap:Ac-cap感染的sf9細(xì)胞；Ac-cap-24B：Ac-cap-24B感染的sf9細(xì)胞圖6為桿狀病毒Ac-cap-24B感染sf9細(xì)胞上清形成病毒樣顆粒的電鏡示意圖重組桿狀病毒Ac-cap-24B接種sf9細(xì)胞，84小時后收集病變細(xì)胞并超聲波裂解和超速離心進(jìn)行電鏡觀察，可見大量大小約為17-20nm的無囊膜病毒，形態(tài)與典型的PCV2相同，表明組裝成病毒樣顆粒VLP。圖7為免疫小鼠免疫后不同時間抗PCV2的間接ELISA抗體和中和抗體示意圖A：小鼠免疫后不同時間點產(chǎn)生針對PCV2cap的ELISA抗體水平；B：小鼠免疫后14天和40天時產(chǎn)生抗PCV2的中和抗體；圖8為免疫小鼠免疫后不同時間抗CSFV抗體示意圖小鼠免疫后不同時間產(chǎn)生針對CSFV的B細(xì)胞表位IgG含量。具體實施方式根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述實際，如未特別說明，均為商業(yè)化或是已公開的試劑材料。實施例1：一種表達(dá)表達(dá)豬圓環(huán)病毒cap蛋白嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位基因的重組桿狀病毒Ac-cap-24B的構(gòu)建(一)重組桿狀病毒Ac-cap-24B的構(gòu)建1、豬圓環(huán)病毒cap嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位的目的基因獲取參照PCV2WH分離株ORF2基因序列(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文：豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分離鑒定及滅活疫苗的研究與應(yīng)用，碩士生：嚴(yán)偉東；導(dǎo)師：何啟蓋；畢業(yè)時間：2009年6月)，將N段核定位信號39個氨基酸的117個核苷酸序列缺失，替代為豬瘟病毒B細(xì)胞表位(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)72個核苷酸序列序列(如圖1所示)，根據(jù)桿狀病毒密碼子的偏愛性人工合成666bp的cap-24B基因序列，其核苷酸序列為SEQIDNO.1所示，其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2所示。這個序列亞克隆入載體pUC中獲得重組質(zhì)粒pUC-cap-24B(由上海生物工程公司成)。2、桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBD-cap-24B的構(gòu)建桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBD-cap-24B的構(gòu)建示意圖如圖1所示。以質(zhì)粒pUC-57cap-24B為模板，利用三對不同的引物(見表1)擴(kuò)增cap-24B基因片段，分別克隆入桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFBDPHmHNM1P10eGFP質(zhì)粒(簡稱pFBD。錢平等，一種表達(dá)人工修飾合成的甲型H1N1流感病毒HA-NA-M1基因的重組桿狀病毒，專利公開號CN101624580A,專利號ZL200910063217.6)。進(jìn)而通過BamHI和EcoRI，SpeI和NotI，SalI和HindIII將cap-24B基因片段分別克隆入pFFBD的相應(yīng)位點，獲得轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBD-cap-24B。pFBD-cap-24B載體通過BamHI和EcoRI雙酶切鑒定，結(jié)果顯示酶切后有1129bp，750bp片段，大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFBD-cap-24B構(gòu)建成功，酶切鑒定結(jié)果如圖2所示。該轉(zhuǎn)移載體含有3個拷貝的嵌合cap-24BcDNA基因序列。表1克隆目的基因所用引物注：黑體是酶切位點序列。3、重組病毒桿狀病毒Ac-cap-24B的構(gòu)建(1)重組桿粒Ac-cap-24B的獲得與鑒定取轉(zhuǎn)移質(zhì)粒1.0μgpFBD-cap-24B加入到100μLDH10Bac大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(GiBCOBRL公司產(chǎn)品)混合，冰浴30min后，于42℃45s水浴進(jìn)行熱激，然后冰浴2min，進(jìn)而加入900μLSOC液體培養(yǎng)基，37℃振搖培養(yǎng)4h，按10-1、10-2、10-3稀釋后，各取100μL涂布于含有卡那霉素、慶大霉素和四環(huán)素的高鹽LB平皿，使用濃度按Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystem操作說明書(Invitrogen公司)，37℃培養(yǎng)24-48h，通過藍(lán)白斑篩選、純化陽性菌落，提取重組桿粒，進(jìn)而進(jìn)行PCR特異引物擴(kuò)增鑒定：vBac-cap-24B桿粒則分別通過Cap-24B1-F和Cap-1R；Cap-24B1-F和M13R兩對引物進(jìn)行鑒定檢測，其預(yù)計擴(kuò)增大小分別為為750bp和1500bp。Cap-24B4-F5’-TTGGATCCGCCACCATGTGCAAGGAAGATTACAGGT-3’；Cap-1R5’-TTGAATTCTTACTTTGGGTTCAGTGGAGGGTCCT-3’；M13R：5’-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’；其PCR擴(kuò)增體系如下：按95℃作用5分鐘；然后94℃作用45秒分鐘，56℃退火30秒，72℃延伸1分鐘，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘的反應(yīng)條件在ABIPCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0％(重量/體積，w/v)的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，結(jié)果表明能夠擴(kuò)增出1500bp和750bp的兩條特異目的條帶，大小與預(yù)期一致，表明目的基因cap-24B片段已成功重組入桿狀病毒基因組中(如圖3所示)。(2)重組桿狀病毒Ac-cap-24B獲得無菌挑取含重組桿粒rBac-cap-24B的陽性菌落于高鹽LB液體培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)16小時后，用0.3mL溶液I(50mmol/L葡萄糖，10mmol/LEDTA,25mmol/LTris-Cl(pH8.0))重懸，加入0.3mL溶液II(0.2mol/LNaOH,1％SDS,現(xiàn)用現(xiàn)配)輕微混勻，室溫靜置5min，緩慢加入0.3mL溶液III(3mol/L的乙酸鉀，pH5.0)混勻，冰浴5-10min，12000r/min離心10min，上清加到0.5mL異丙醇中，混勻冰浴5～10min，室溫12000r/min離心20min，75％乙醇洗滌沉淀，干燥后溶于100μLTE中，分裝于-80℃保存。利用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法(根據(jù)Invitrogen公司Bac-to-BacBaculovirusExpressionSystem操作說明書操作)，將篩選純化后的重組桿粒rBac-cap-24B經(jīng)Reagent轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞(購自武漢大學(xué)中國典型物保藏中心)中，于28℃培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染后72h放置熒光顯微鏡觀察有無綠色熒光出現(xiàn)，收集細(xì)胞上清即獲得重組桿狀病毒Ac-cap-24B，置于-80℃保存。重組桿病毒Ac-cap-24B具有與親本毒株苜蓿銀蚊夜蛾多粒包埋核型多角體病毒(AcMNPV)相同的形態(tài)學(xué)特性和培養(yǎng)特性，但該重組桿狀病毒有綠色熒光標(biāo)記基因eGFP，能在熒光顯微鏡下觀察病毒擴(kuò)增情況。該病毒已于2014年10月19日送至中國典型微生物保藏中心進(jìn)行保藏，分類命名：重組桿狀病毒RecominantAutographacalifornicamultipleNucleopolyhedrovirusAc-cap-24B；保藏編號：CCTCCNO：V201432。地址：中國武漢武漢大學(xué)。(二)、重組桿狀病毒Ac-cap-24B外源基因表達(dá)的檢測1、Westerningblot分析檢測外源基因的表達(dá)將sf9細(xì)胞接種6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞長成80-90％單層時，用1.0m.o.iAc-cap-24B和Ac-cap(陽性對照，碩士論文：彭波；PCV2Cap蛋白在畢赤酵母和桿狀病毒中表達(dá)及亞單位疫苗的制備。導(dǎo)師：錢平)接種sf9細(xì)胞，接毒84小時后收集細(xì)胞并用NP-40裂解液裂解細(xì)胞樣品。SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，以本實驗室何啟蓋教授制備的Cap蛋白單抗為一抗(碩士論文：陳冬煥；表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門氏菌的構(gòu)建及鑒定。導(dǎo)師：何啟蓋)，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Sigma)為二抗進(jìn)行Western-blotting檢測Cap蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示重組病毒Ac-cap和Ac-cap-24B感染的細(xì)胞樣品中分別出現(xiàn)一條27KDa左右大小的特異條帶，大小與預(yù)期一致，而sf9細(xì)胞對照無此特異條帶，證實Cap蛋白獲得表達(dá)，結(jié)果如圖4所示。2、間接免疫熒光鑒定外源基因的表達(dá)在剛長成單層的sf9細(xì)胞上，以1.0m.o.i的劑量接種重組桿狀病毒Ac-cap-24B和Ac-cap，48h后固定細(xì)胞并進(jìn)行間接免疫熒光檢測Cap蛋白的表達(dá)。以本實驗室何啟蓋教授制備的Cap蛋白單抗為一抗(碩士論文：陳冬煥；表達(dá)豬2型圓環(huán)病毒Cap蛋白重組沙門氏菌的構(gòu)建及鑒定。導(dǎo)師：何啟蓋)，二抗為CY3-羊抗鼠IgG(Sigma)進(jìn)行間接免疫熒光，最后置共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明感染Ac-cap-24B的sf9細(xì)胞中有很強(qiáng)的紅色熒光信號，且主要表達(dá)在細(xì)胞核中，而正常sf9細(xì)胞沒有任何紅色熒光信號，表明重組桿狀病毒Ac-cap和Ac-cap-24B都能有效表達(dá)cap蛋白，沒有改變蛋白定位情況。結(jié)果如圖5所示。3、外源基因的插入是否影響PCV2cap蛋白體外組裝成病毒樣顆粒的電鏡觀察將F4代Ac-cap-24B以1.0m.o.i劑量感染懸浮培養(yǎng)的sf9細(xì)胞，感染后在84h收集細(xì)胞，加入裂解液并凍融3次。在4℃條件下8000g離心30min，然后用蔗糖濃縮到原體積的1/10，上清中即含有表達(dá)的VLP顆粒。將上清27,000rpm/min，超速離心3小時，沉淀重懸于2.0ml的PBS中，并用1.0ml的注射器反復(fù)吹打，然后病毒懸液用20-60％蔗糖密度梯度進(jìn)行27,00rpm/min超速離心16小時，收集最上層的蛋白帶進(jìn)行電鏡觀察，結(jié)果顯示在電子顯微鏡(H-7000FA)下cap-24B蛋白能形成病毒液顆粒(Virus-likeparticles，VLPs)，直徑約為大小為17–25nm，其形態(tài)和大小都與PCV2全病毒粒子相似(圖6)。表明我們在PCV2cap蛋白N段缺失NLS序列并替換為CSFV的B表位序列不影響cap蛋白形成VLP的組裝。實施例2：本發(fā)明的重組桿狀病毒Ac-cap-24B在制備亞單位疫苗中的應(yīng)用，過程如下：(一)、重組桿狀病毒Ac-cap-24B嵌合VLPs亞單位疫苗的制備以實施例1獲得的重組桿狀病毒Ac-cap-24B，按照1.0m.o.i的劑量接種懸浮培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞HighFiveTM(購自Invitrogen公司)，84h后收集細(xì)胞及上清，通過細(xì)胞破碎儀處理后離心除去細(xì)胞碎片，通過定量SDS-PAGE配體膠計算出cap-24B的蛋白表達(dá)量為52微克每毫升，進(jìn)而與ISA-206油佐劑(購自SEPPIC公司)乳化制備成亞疫苗，使其每毫升中cap-24B蛋白含量為40微克，存儲于4℃?zhèn)溆茫糜谝韵聦嵤├?1)物理形狀外觀本品為乳白色均勻乳劑。劑型為雙向劑型(水包油包水)，取一清潔吸管吸取少量疫苗滴于冷水中，水面和水內(nèi)都有。粘度用出口內(nèi)徑為1.2mm吸管吸取疫苗1mL在25℃左右的室溫下，令其垂直流出，在8秒鐘內(nèi)流出0.5mL，是合格的。(2)無菌檢驗按照《中國獸藥典》附錄169-171頁進(jìn)行，結(jié)果表明沒有細(xì)菌生長。(二)、本發(fā)明的重組桿狀病毒Ac-cap-24B制備的嵌合VLPs亞單位疫苗的安全性試驗(1)新生仔豬安全性試驗將實驗室制備的嵌合VLPs亞單位疫苗4批，每批隨即取3瓶，混合均勻后，選擇健康1日齡初生仔豬，每批疫苗接種10頭豬，各肌肉注射2倍劑量4mL嵌合VLPs亞單位疫苗，另設(shè)4頭豬為空白對照。所有仔豬在注射疫苗前以及注射疫苗后1周，每天測量2次體溫并觀察豬的生長狀況、精神和食欲，連續(xù)觀察14天。疫苗接種當(dāng)天體溫，精神和食欲正常，無不良反應(yīng)，表明疫苗對新生仔豬是安全的。(2)斷奶仔豬安全性試驗將實驗室制備的嵌合VLPs亞單位疫苗4批，每批隨即取3瓶，混合均勻后，選擇健康30日齡斷奶仔豬，每批疫苗接種10頭豬，各肌肉注射2倍劑量4mL嵌合VLPs亞單位疫苗，另設(shè)4頭豬為空白對照，同上觀察14天。疫苗接種當(dāng)天體溫，精神和食欲正常，無不良反應(yīng)，表明疫苗對斷奶仔豬是安全的。(3)妊娠母豬安全性試驗將實驗室制備的嵌合VLPs亞單位疫苗4批，每批隨即取3瓶，混合均勻后，選擇健康80日齡妊娠母豬，每批疫苗接種10頭豬，各肌肉注射2倍劑量4mL嵌合VLPs亞單位疫苗，另設(shè)2頭豬為空白對照。相同條件下飼養(yǎng)至產(chǎn)仔，觀察疫苗對妊娠母豬繁殖性能產(chǎn)生的影響和新生仔豬發(fā)育情況，疫苗接種后體溫、精神和食欲正常，無流產(chǎn)、死胎、木乃伊等現(xiàn)象，表明疫苗對妊娠母豬是安全的。(三)、重組桿狀病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗在小鼠中的免疫原性實驗為了評價上述制備的嵌合VLPs亞單位疫苗針對豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒的免疫原性，購買6周齡雌性Ba/bc小鼠18只，隨機(jī)分成2組，每組6只。PBS為陰性，Ac-cap-24B組。免疫劑量為Ac-cap-24B組每只小鼠免疫200ul，使cap-24B蛋白量為40微克每只小鼠。免疫途徑為后腿肌肉注射，3周后以同樣劑量加強(qiáng)免疫一次。首免后0，14，28，40天進(jìn)行尾靜脈采血，評價其免疫效果。(1)機(jī)體產(chǎn)生針對PCV2cap蛋白的抗體水平以0.1微克的PCV2cap蛋白原核表達(dá)產(chǎn)物包被酶聯(lián)反應(yīng)板，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清中抗cap的抗體水平。結(jié)果表明重組桿狀病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫小鼠組在一免后14天，均能產(chǎn)生特性的針對PCV2cap蛋白的ELISA抗體。免疫后抗體水平持續(xù)上升，40天時ELISA抗體達(dá)到最高，抗體分別為達(dá)到0.953,0.968，兩組間產(chǎn)生抗cap的ELISA抗體水平?jīng)]有明顯的差異(P<0.05)，而陰性對照組沒有產(chǎn)生特性型的抗PCV2的抗體(如圖7所示)。(2)機(jī)體產(chǎn)生針對CSFV的免疫原性利用CSFV的B細(xì)胞表位多肽(CKEDYRYAISSTNEIGLLGAGGLT)(上海生工公司合成)偶聯(lián)KLH蛋白載體，以2微克蛋白包被酶聯(lián)反應(yīng)板，通過間接ELISA方法檢測小鼠血清中分別抗CSFVB細(xì)胞表位的IgG含量。結(jié)果顯示Ac-cap-24B免疫組小鼠在免疫后14天能檢測到產(chǎn)生針對B細(xì)胞表位的IgG產(chǎn)生，免疫后40天時達(dá)到最高水平；而陰性對照組均檢測不到針對B細(xì)胞表位的IgG產(chǎn)生(如圖8所示)。上述動物試驗結(jié)果表明Ac-cap-24B制備的嵌合VLPs亞單位疫苗能有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生針對PCV2和CSFV免疫應(yīng)答反應(yīng)。(四)、重組桿狀病毒Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗在豬體內(nèi)的免疫效力實驗選擇豬圓環(huán)病毒和豬瘟病毒血清學(xué)陰性3月齡豬，隨機(jī)分4組：PBS陰性組，Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗組，豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗和豬瘟病毒兔化弱毒疫苗組，Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗組以40μg/只蛋白劑量免疫豬頸部肌肉，共免疫2次，間隔4周。豬體免疫后第8周用100RID50豬瘟病毒C株或107TCID50的豬圓環(huán)病毒2型WH株(嚴(yán)偉東，碩士學(xué)位論文，豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)的分離鑒定及滅活疫苗的研究與應(yīng)用)攻毒，每種病毒攻毒5頭豬，進(jìn)而觀察攻毒后豬的臨床癥狀和檢測體溫變化等。各免疫組豬在攻入100個RID50的豬瘟病毒C株后，豬瘟病毒商品疫苗免疫組5頭豬均無明顯體溫變化，Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫組有3頭豬沒有體溫變化，而陰性組組和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫組豬的體溫均升高并呈現(xiàn)定型熱反應(yīng)。以上結(jié)果表明Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗對豬瘟病毒的攻擊有60％的保護(hù)(如表2所示)。表2：豬瘟病毒C株攻毒后的體溫變化豬圓環(huán)病毒2型WH株攻毒后(攻毒劑量為1×107TCID50豬圓環(huán)病毒2型WH株/頭)，PBS陰性組和豬瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫組開始各有1頭豬精神較沉郁，第8天時恢復(fù)正常，均無體溫升高情況。Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫組和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫組在攻毒后這段時間內(nèi)都沒有出現(xiàn)異常情況，采食、精神狀態(tài)以及體溫等都正常。攻毒前和試驗結(jié)束時分別稱重，平均相對日增重結(jié)果顯示Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫組平均相對日增重與豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫組相當(dāng)，均明顯高于陰性對照組和豬瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫組。另外，將所有豬處死后剖檢觀察豬的病變情況，結(jié)果顯示Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫組和豬圓環(huán)病毒2型滅活疫苗免疫組豬的淋巴結(jié)、腎臟和脾臟均較正常；而陰性對照組和豬瘟病毒兔化弱毒疫苗免疫組豬肺部呈現(xiàn)實變、出血點，腹股溝淋巴結(jié)邊緣出血，肺門淋巴結(jié)出血十分嚴(yán)重。表明該Ac-cap-24B嵌合VLP亞單位疫苗免疫組能完全保護(hù)豬圓環(huán)病毒強(qiáng)度的攻擊。盡管本發(fā)明的內(nèi)容是結(jié)合本實施例進(jìn)行說明，但是不能認(rèn)為是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求書限定。另外，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在所附權(quán)利要求書限定的范圍內(nèi)對本發(fā)明進(jìn)行各種改動或修飾，這些改動或修飾形式同樣落在本發(fā)明范圍內(nèi)。SEQUENCELISTING<110>華中農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>一種豬圓環(huán)病毒cap蛋白嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位的重組病毒及應(yīng)用<130>一種豬圓環(huán)病毒cap蛋白嵌合豬瘟病毒B細(xì)胞表位的重組病毒及應(yīng)用<160>2<170>PatentInversion3.1<210>1<211>666<212>DNA<213>人工序列<400>1atgtgcaaggaggactacaggtacgccatctcctccaccaacgagatcggcctgctgggc60gccggcggcctgacctggcgtagaaagaacggtatcttcaacacaagattgtctcgtaca120atcggttacactgtcaagaagaccaccgtcagaaccccatcttggaacgttgacatgatg180agattcaacatcaacgacttcctgccacctggtggtggtagcaacccactcaccgtccct240ttcgagtactacagaatccgtaaggttaaggttgagttctggccatgctctcctatcacc300caaggagacagaggtgtcggtagcactgctgtcatcctggacgacaacttcgttactaag360gccaacgctctgacctacgacccttacgtcaactacagctctagacacaccattactcaa420ccattcagttaccactcccgttacttcaccccaaagcctgtcctggaccgtactattgac480tacttccaaccaaacaacaagcgtaaccagctgtggctgagactgcaaactacaggaaac540gtcgaccacgttggtctgggaaccgccttcgagaactccatctacgaccaggactacaac600atcagaatcacaatgtacgtccagttcagagagttcaacctgaaggaccctccactgaac660ccaaag666<210>2<211>222<212>PRT<213>人工序列<400>2MetCysLysGluAspTyrArgTyrAlaIleSerSerThrAsnGluIle151015GlyLeuLeuGlyAlaGlyGlyLeuThrTrpArgArgLysAsnGlyIle202530PheAsnThrArgLeuSerArgThrIleGlyTyrThrValLysLysThr354045ThrValArgThrProSerTrpAsnValAspMetMetArgPheAsnIle505560AsnAspPheLeuProProGlyGlyGlySerAsnProLeuThrValPro65707580PheGluTyrTyrArgIleArgLysValLysValGluPheTrpProCys859095SerProIleThrGlnGlyAspArgGlyValGlySerThrAlaValIle100105110LeuAspAspAsnPheValThrLysAlaAsnAlaLeuThrTyrAspPro115120125TyrValAsnTyrSerSerArgHisThrIleThrGlnProPheSerTyr130135140HisSerArgTyrPheThrProLysProValLeuAspArgThrIleAsp145150155160TyrPheGlnProAsnAsnLysArgAsnGlnLeuTrpLeuArgLeuGln165170175ThrThrGlyAsnValAspHisValGlyLeuGlyThrAlaPheGluAsn180185190SerIleTyrAspGlnAspTyrAsnIleArgIleThrMetTyrValGln195200205PheArgGluPheAsnLeuLysAspProProLeuAsnProLys210215220