在具自由羥基多糖類(lèi)化合物引入醛基的溫和方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了在具自由羥基的多糖類(lèi)化合物引入醛基的方法，包括將具自由羥基的多糖類(lèi)化合物溶解于水性溶劑中，加入酰胺化反應(yīng)催化劑和1-氨基-3，3二乙氧基丙烷，反應(yīng)；將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，純化、干燥，得到中間產(chǎn)物；將中間產(chǎn)物溶解，醛化，得到帶有醛基的多糖類(lèi)化合物。本發(fā)明方法，反應(yīng)條件溫和，不會(huì)破壞多糖的原始結(jié)構(gòu)，可以高效地在具自由羥基多糖類(lèi)化合物上引入醛基，得到改性多糖類(lèi)化合物，改性多糖類(lèi)化合物可以通過(guò)希夫堿與其他高分子材料在溫和條件下反應(yīng)，共價(jià)交聯(lián)形成水凝膠，具有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。
【專(zhuān)利說(shuō)明】在具自由羥基多糖類(lèi)化合物引入醛基的溫和方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種多糖的修飾方法，特別涉及一種在具有自由羥基的多糖類(lèi)化合物 上引入醛基的溫和方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 老年性關(guān)節(jié)病、關(guān)節(jié)內(nèi)疾病及關(guān)節(jié)損傷常致關(guān)節(jié)軟骨退變或缺損，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)疼 痛及關(guān)節(jié)功能的喪失。由于沒(méi)有血管及神經(jīng)支配，軟骨組織自我修復(fù)功能差。由于軟骨細(xì) 胞的缺乏，軟骨基質(zhì)形成的能力有限，所以軟骨組織再生困難。在沒(méi)有特別處理治療的情況 下，軟骨缺損常常由纖維軟骨組織來(lái)修復(fù)，而這種軟骨的功能與透明軟骨的功能是差別挺 大的。由于組織工程的理念的應(yīng)用，目前合成的生物組織工程材料致力于修復(fù)組織損傷及 缺損，并改善組織功能。近上來(lái)，各種各樣的生物相容性生物材料被用于軟骨缺損修復(fù)，并 且應(yīng)用干細(xì)胞與生物材料相結(jié)合促進(jìn)軟骨生成。當(dāng)把干細(xì)胞種植于3D環(huán)境時(shí)，細(xì)胞活性得 以很好的保持。而當(dāng)細(xì)胞脫離3D環(huán)境時(shí)，它們將快速去分化，喪失細(xì)胞表型及蛋白合成功 能。合成的水凝膠是具有特定的組織化學(xué)特性的組織工程生物學(xué)支架，可以作為一個(gè)研究 干細(xì)胞分化，細(xì)胞間的相互關(guān)系及細(xì)胞與基質(zhì)間關(guān)系的好的模型。
[0003] 在軟骨修復(fù)過(guò)程中，應(yīng)用非侵入性方法將干細(xì)胞及活性分子置入于軟骨缺損是 非常受歡迎的?？勺⑸湫运z，因?yàn)槠淠苄纬筛鞣N不同形狀而適用于各種不規(guī)則軟骨缺 損，可以將各種需要成份移植于需要部位，而不需要開(kāi)放手術(shù)。同時(shí)水凝膠可塑性強(qiáng)，并且 應(yīng)用方便，可以在微創(chuàng)的情況下用于充填不同類(lèi)型的軟骨缺損。水凝膠能維持細(xì)胞原始的 圓形形狀，包裹細(xì)胞，傳遞生物機(jī)械負(fù)荷，他們擁有孔隙結(jié)構(gòu)，有利于營(yíng)養(yǎng)及廢棄物的轉(zhuǎn)運(yùn)。
[0004] 天然多糖的安全性高，通過(guò)對(duì)其改性，將其中的部分羥基轉(zhuǎn)化為醛基，可以與其他 的天然改性材料在體內(nèi)的溫和條件下，發(fā)生化學(xué)交聯(lián)，形成穩(wěn)定性較好的水溶膠。如MA實(shí) 驗(yàn)組發(fā)明了可注射性中空納米纖維星形球狀PLA聚合物作為軟骨細(xì)胞載體用修復(fù)軟骨缺 損，并取得良好效果。MIkos及他的同事應(yīng)用低聚的聚乙二醇延胡索酸鹽作為骨架以提供 一 3D可注射的水凝膠網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)以載荷干細(xì)胞及生長(zhǎng)因子用于軟骨重建修復(fù)。Tan等應(yīng) 用希夫堿結(jié)構(gòu)于氧化透明質(zhì)酸的醛基上及N-琥珀酰殼聚糖的氨基上以構(gòu)建原位水凝膠， 并在體外檢測(cè)了軟骨細(xì)胞在水凝膠內(nèi)的情況。
[0005] 然而現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)多糖的改性過(guò)程中需要將其羥基端氧化以形成醛基，改性過(guò) 程中需要使用強(qiáng)氧化劑，如高碘酸等。強(qiáng)氧化劑的使用，會(huì)破壞多糖的原始結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致多糖 的活性發(fā)生變化，生成不需要的雜質(zhì)，這限制了其應(yīng)用。
[0006] 開(kāi)發(fā)出一種不破壞多糖原始結(jié)構(gòu)的改性方面，在多糖中引入醛基具有非常實(shí)際的 意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種在具有自由羥基多糖中引入醛基的方法。
[0008] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 在具自由羥基的多糖類(lèi)化合物引入醛基的方法，包括如下步驟： 1) 將具自由羥基的多糖類(lèi)化合物溶解于水性溶劑中，加入酰胺化反應(yīng)催化劑和1-氨 基-3,3二乙氧基丙烷，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH，攪拌使其反應(yīng)完全； 2) 將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，純化、干燥，得到中間產(chǎn)物； 3) 將中間產(chǎn)物溶解，調(diào)節(jié)其pH至5?7. 4,醛化，得到帶有醛基的多糖類(lèi)化合物。
[0009] 優(yōu)選的，上述方法中，步驟1)中調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為4?7. 4。
[0010] 優(yōu)選的，上述方法中，步驟1)中使用的水性溶劑選自水性pH緩沖液。
[0011] 優(yōu)選的，上述方法中，1-氨基_3,3二乙氧基丙烷與多糖類(lèi)化合物中的-COOH 或-coo_的摩爾比為0.1?10:1。
[0012] 優(yōu)選的，上述方法中，酰胺化反應(yīng)催化劑為EDC和NHS的混合物。
[0013] 優(yōu)選的，上述方法中，EDC和NHS摩爾比為0. 1?10 :1。
[0014] 優(yōu)選的，上述方法中，使用水性pH緩沖液將中間產(chǎn)物溶解。
[0015] 優(yōu)選的，上述方法中，步驟1)中使用的水性pH緩沖液選自D-PBS溶液、Tris-HCl 緩沖液或者有機(jī)鹽緩沖液。
[0016] 優(yōu)選的，上述方法中，步驟3)中使用的水性pH緩沖液選自PBS溶液、Tris-HCl緩 沖液、有機(jī)鹽緩沖液。
[0017] 優(yōu)選的，上述方法中，具自由羥基的多糖類(lèi)化合物選自海藻酸鹽。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明方法，反應(yīng)條件溫和，不會(huì)破壞多糖的原始結(jié)構(gòu)，可以高效地在具自由羥基多糖 類(lèi)化合物上引入醛基，得到改性多糖類(lèi)化合物，改性多糖類(lèi)化合物可以通過(guò)希夫堿與其他 高分子材料在溫和條件下反應(yīng)，共價(jià)交聯(lián)形成水凝膠，具有非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是AALG-CS水凝膠的形成前后的照片； 圖2是AALG-CS水凝膠的SEM照片； 圖3是不同化合物的紅外光譜圖； 圖4是AALG-CS水凝膠的流變學(xué)特性圖； 圖5是細(xì)胞在水凝膠上的活性檢測(cè)結(jié)果圖； 圖6是軟骨相關(guān)基因表達(dá)情況； 圖7是不同處理組實(shí)驗(yàn)兔的軟骨再生情況； 圖8是軟骨的肉眼ICRS評(píng)分情況圖； 圖9是不同處理組軟骨的HE染色圖； 圖10是不同處理組軟骨的阿利氏藍(lán)染色圖； 圖11是不同處理組軟骨的甲苯胺藍(lán)染色圖； 圖12是不同處理組軟骨的Masson染色圖； 圖13是不同處理組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)12周后的軟骨相關(guān)基因表達(dá)情況； 圖14是不同處理組動(dòng)物實(shí)驗(yàn)12周后的GAGs定量檢測(cè)情況。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 在本發(fā)明中，具有自由羥基的多糖類(lèi)化合物指糖鏈上具有羧基或-COCT基團(tuán)的多 糖或其衍生物，如海藻酸鈉及其衍生的酯類(lèi)及氨類(lèi)化合物等。
[0021] EDC為1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的簡(jiǎn)稱(chēng)寫(xiě)；NHS為羥基琥 珀酰亞胺的簡(jiǎn)稱(chēng)；ADEP為1-氨基-3, 3二乙氧基丙烷的簡(jiǎn)稱(chēng)。
[0022] 在具自由羥基的多糖類(lèi)化合物引入醛基的方法，包括如下步驟： 1) 將具自由羥基的多糖類(lèi)化合物溶解于水性溶劑中，加入酰胺化反應(yīng)催化劑和1-氨 基-3, 3二乙氧基丙烷，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH，攪拌使其反應(yīng)完全； 2) 將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，純化、干燥，得到中間產(chǎn)物； 3) 將中間產(chǎn)物溶解，調(diào)節(jié)其pH至5?7. 4,醛化，得到帶有醛基的多糖類(lèi)化合物。
[0023] 在具有自由羥基的多糖類(lèi)化合物引入醛基的反應(yīng)原理如下：

【權(quán)利要求】
1. 在具自由羥基的多糖類(lèi)化合物引入醛基的方法，包括如下步驟： 1) 將具自由羥基的多糖類(lèi)化合物溶解于水性溶劑中，加入酰胺化反應(yīng)催化劑和1-氨 基-3, 3二乙氧基丙烷，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH，攪拌使其反應(yīng)完全； 2) 將反應(yīng)產(chǎn)物沉淀，純化、干燥，得到中間產(chǎn)物； 3) 將中間產(chǎn)物溶解，調(diào)節(jié)其pH至5?7. 4,醛化，得到帶有醛基的多糖類(lèi)化合物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH為4?7. 4。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟1)中使用的水性溶劑選自水性pH緩 沖液。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：1-氨基_3, 3二乙氧基丙烷與多糖類(lèi)化合 物中的-COOH或-C00_的摩爾比為0? 1?10 :1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：酰胺化反應(yīng)催化劑為EDC和NHS的混合 物。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于：EDC和NHS摩爾比為0. 1?10 :1。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：使用水性pH緩沖液將中間產(chǎn)物溶解。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：步驟1)中使用的水性pH緩沖液選自 D-PBS溶液、Tris-HCl緩沖液或者有機(jī)鹽緩沖液。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于：步驟3)中使用的水性pH緩沖液選自PBS 溶液、Tris-HCl緩沖液、有機(jī)鹽緩沖液。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：具自由羥基的多糖類(lèi)化合物選自海藻酸 鹽。
【文檔編號(hào)】C08B37/04GK104327194SQ201410459142
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月10日
【發(fā)明者】李慶濤, 歐陽(yáng)鈞, 邢孟秋, 萬(wàn)文兵, 鐘世鎮(zhèn) 申請(qǐng)人:南方醫(yī)科大學(xué)