一種人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗體技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及應(yīng)用化學(xué)合成法合成人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2的抗原肽，并利用該抗原肽免疫新西蘭大白兔，通過制備抗血清、硫酸銨分級(jí)沉淀及親合層析制備了高質(zhì)量的抗體。具體來說涉及一種人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2的抗原肽、利用抗原肽制備的抗體及其抗體的制備方法。

背景技術(shù)：
補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白（C1qandtumornecrosisfactorrelatedprotein，CTRP）是一類在結(jié)構(gòu)和功能上與脂聯(lián)素類似的分泌蛋白。CTRP在多種組織中有著廣泛的表達(dá)，而脂聯(lián)素僅在脂肪組織特異表達(dá)，CTRP由四個(gè)不同結(jié)構(gòu)域組成：一個(gè)N-末端的信號(hào)肽、一個(gè)短的可變結(jié)構(gòu)域、一個(gè)膠原結(jié)構(gòu)域和一個(gè)與補(bǔ)體蛋白C1q同源的C-末端球形結(jié)構(gòu)域。目前，已成功克隆了13種CTRP的cDNA序列。雖然CTRP在結(jié)構(gòu)上具有相似性，但它們分別參與不同的生理過程，如代謝、炎癥反應(yīng)、宿主防御、凋亡、細(xì)胞分化、器官形成、自體免疫和冬眠等。CTRP蛋白都是以三聚體作為分泌的基本結(jié)構(gòu)單元，也可以形成6聚體、12聚體、18聚體以及更高形式的多聚體等；CTRP3、CTRP5、CTRP6和CTRP10的三聚體通過二硫鍵進(jìn)一步聚集成更有序的低聚物。CTRP除了形成同源低聚物，還可以作為異源低聚體分泌（如CTRP1/CTRP6、CTRP2/CTRP7和脂聯(lián)素/CTRP2等）。CTRP2的生物學(xué)功能及結(jié)構(gòu)與脂聯(lián)素最為相似。在C2C12肌管細(xì)胞中，CTRP2能夠快速激活A(yù)MPK、ACC及p44/42MAPK的磷酸化信號(hào)通路。全長CTRP2、CTRP2球狀結(jié)構(gòu)域（gCTRP2）或者原核表達(dá)的脂聯(lián)素刺激C2C12肌管細(xì)胞16h，可以觀察到肝糖原的積累量上升了6-8倍，CTRP2也能夠顯著促進(jìn)脂肪酸的氧化。Wong等認(rèn)為，CTRP2可以作為一種潛在的胰島素增敏劑。CTRP2在人、鼠、大鼠、牛、豬和斑馬魚等物種中都有非常高的保守性。脂聯(lián)素通過與脂聯(lián)素膜受體相互作用并由脂聯(lián)素受體來傳遞相關(guān)信號(hào)的，作為一種較脂聯(lián)素具有更多功能的CTRP蛋白，其作用機(jī)理研究還不清楚。首先對(duì)與脂聯(lián)素結(jié)構(gòu)最為類似的CTRP2作用機(jī)理、表達(dá)分布和生理功能的探索將有助于研究其他CTRP作用機(jī)理和生理功能。然而，由于CTRP蛋白之間存在高度同源性，并且CTRP與其它蛋白如脂聯(lián)素、TNF等蛋白之間也存在同源，找到CTRP2的特異抗原肽片段并制備高度特異性的相應(yīng)抗體為深入開展CTRP2的作用機(jī)理及應(yīng)用研究奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于此，本發(fā)明提供一種人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2的抗原肽、利用抗原肽制備的抗體及其抗體的制備方法，根據(jù)該方法可獲得高質(zhì)量的識(shí)別人CTRP2抗體。解決上述問題的技術(shù)方案如下：（1）抗原肽的合成：經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)和抗原肽分析軟件的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成了hCTRP2的N-端抗原肽59DRGDSGEEGPP69和C-端抗原肽259IYADQDDPNE269各一段，抗原肽分別與KLH和BSA進(jìn)行化學(xué)耦聯(lián)；（2）免疫新西蘭大白兔：將KLH耦聯(lián)的C-端及N-端抗原肽2毫升（0.5-1.0mg/ml）分別與等體積的弗氏完全佐劑混合到完全乳化，采用皮下注射的方式對(duì)新西蘭雄性大白兔進(jìn)行免疫，皮下注射部位主要集中于兔子的頸、脖及背部，共注射15-18個(gè)點(diǎn)左右（每個(gè)點(diǎn)注射100-200μl乳化抗原）。每只兔子于免疫前從耳靜脈取1-2毫升血液，37°C培養(yǎng)箱中溫育30min，再置4°C冰箱內(nèi)過夜，3000g離心15min，取血清并加入終濃度為0.02%疊氮鈉，置4°C冰箱中保存?zhèn)溆?。初次免疫后的?周，對(duì)各免疫的兔子進(jìn)行再次免疫，再次免疫采用不完全弗氏佐與抗原肽充分完全乳化（每只兔子使用抗原肽0.5mg）；間隔2周后進(jìn)行第2次免疫加強(qiáng)免疫（每只兔子使用抗原肽0.5mg），第2次加強(qiáng)免疫的方法與第一次加強(qiáng)免疫完全相同，于第2次加強(qiáng)免疫的后的第10天，從免疫兔子的耳靜脈采血1-2ml。采血及制備抗血清的方法與免疫前采用的方法完全相同；（3）抗血清效價(jià)的測(cè)定：將10μg/mlBSA耦聯(lián)的抗原肽包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA的方法對(duì)抗血清的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，方法如下：1）包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋白質(zhì)濃度為10μg/mL。每個(gè)反應(yīng)孔中加0.1mL，4℃孵育12h。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液（磷酸鹽緩沖液加0.5%吐溫-20，PBST）洗3次，每次3-5min（簡稱洗滌，下同）；2）封閉：每孔中加0.1mL5%的脫脂奶粉，4℃孵育12h，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）；3）加一抗：加經(jīng)一定比例稀釋的抗體0.1mL于上述已包被抗原的反應(yīng)孔中，置4℃孵育12h。然后用洗滌緩沖液洗3次，每次3-5min（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）；4）加酶標(biāo)二抗：于各反應(yīng)孔中，加入稀釋5,000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG酶標(biāo)二抗0.1mL。37℃孵育1h，洗滌3次，最后一遍用PBS洗滌；5）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入0.1mL新配制的顯色液，放置于30℃恒溫箱中反應(yīng)30min；6）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入4M硫酸50μl終止反應(yīng)；7）結(jié)果判定：在ELISA檢測(cè)儀上，于495nm處，測(cè)定各孔的OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。計(jì)算公式：（待測(cè)樣OD-空白OD）/（陰性對(duì)照OD-空白OD），兩者比值大于2.1可判讀為陽性；（4）抗血清的硫酸銨分級(jí)純化：將血清效價(jià)高和背景值低的C-端抗原肽免疫所得的抗血清分別利用50%和33%的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀和透析處理，對(duì)抗血清按下述方法進(jìn)行初步的分離純化。純化的方法：取效價(jià)最高的兔抗血清，加等體積的生理鹽水，攪拌并逐滴加入與稀釋血清等體積的飽和硫酸銨至終濃度為50%飽和度，4°C靜置4h，3000g離心30min，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫酸銨至飽和度為33%，4°C靜置4h。3000g離心30min，棄上清，沉淀溶于生理鹽水中。重復(fù)用33%飽和度的硫酸銨鹽析分級(jí)純化處理一次，將最后離心所得沉淀以20mMPBS（磷酸鹽緩沖液液，pH7.4)溶解并于10kD的透析袋中于20mMPBS中透析去除硫酸銨；（5）抗體的親合純化：將經(jīng)溴化氰活化的樹脂與耦聯(lián)有BSA的hCTRP2的C-端抗原肽進(jìn)行耦聯(lián)并制備親合純化柱，利用10倍柱體積的20mMPBS（pH7.4)緩沖液對(duì)親合純化柱進(jìn)行平衡處理。將經(jīng)透析去除硫酸銨的抗血清加入到親合純化柱中，20倍柱床體積的20mMPBS（pH7.4)洗除非特異吸附在樹脂上的抗體后，加入3倍親合樹脂柱體積的0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.4)，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1MNaHCO3中和。用20倍柱床體積的20mMPBS（pH7.4)緩沖液對(duì)純化柱再平衡，加入3倍親合樹脂體積的0．05M二乙胺(pH11)緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1MNaHCO3中和。將上述分別利用酸、堿洗脫下來的含純化抗體的溶液合并，于10kDa的透析袋中于100倍體積的20mMPBS中透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換透析液一次。透析后的抗體利用截留分子量為10kDa的50ml超濾管濃縮10倍。純化前后的抗體用10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分析；（6）hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白的表達(dá)載體構(gòu)建：利用擴(kuò)增hCTRP2全長基因的引物對(duì)5’-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’和5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’，擴(kuò)增出hCTRP2的全長基因片段，利用擴(kuò)增hCTRP2球狀區(qū)基因引物對(duì)5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和5’-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAAG-3’擴(kuò)增出C-端球狀區(qū)基因片段；（7）hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白的表達(dá)：挑取數(shù)個(gè)BL21陽性克隆轉(zhuǎn)化子，劃線接種至含70mg/LAmp（氨芐青霉素）的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，再挑取單菌落接種至20mL含70mg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，搖床振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為1mM，將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)至200rpm，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h，取1mL菌液于1.5mLEP管中，10,000g，離心3min，得菌體，PBS充分重懸菌體，10,000g，離心3min，得菌體，加入80μl裂解緩沖溶液，裂解菌體，再加入20μlSDS-PAGE5×上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水中加熱裂解變性10min，14,000g，4℃離心10min，取上層液，利用12%SDS-PAGE對(duì)菌體總蛋白進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后利用考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色（具體步驟參照精編分子生物學(xué)指南），確定hCTRP2全長及球狀功能區(qū)蛋白的表達(dá)情況；（8）抗體特異性分析：將制備好的hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白表達(dá)菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的菌體總蛋白樣品點(diǎn)樣到12%的SDS-PAGE膠中，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，在電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上輕輕剝離并轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡40-60min；按轉(zhuǎn)移凝膠的大小裁剪好濾紙和聚偏氟乙烯(PVDF)膜，濾紙各邊應(yīng)比PVDF膜長2mm，PVDF膜的各邊應(yīng)比PAGE膠的各邊長2mm；將PVDF膜用100%甲醇浸泡30s，將PVDF膜及濾紙一并浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡15min；將膠、濾紙及PVDF膜取出，盡量避免污染濾紙和膜，按從下到上：濾紙-膜-膠-濾紙的順序?qū)⑵湟来畏藕?，盡量避免膠與膜之間產(chǎn)生氣泡；打開半干轉(zhuǎn)移儀，將濾紙-膜-膠-濾紙放入轉(zhuǎn)移盤中，蓋好電源蓋子；接通電源，83mm×75mm大小的膜設(shè)定電流100mA，電壓15V；實(shí)際設(shè)定中電壓15V不變，按60mm2設(shè)1mA的初始電流，設(shè)定轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1h；轉(zhuǎn)移完畢后，將PVDF轉(zhuǎn)移至含5%牛血清白蛋白的TBST中，4℃，封閉12h；封閉結(jié)束后，加入稀釋2萬倍的抗體到PVDF膜中，4℃，孵育12h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜轉(zhuǎn)至含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG中，4℃，孵育12h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜置于一小盒中，加入適量的ECL發(fā)光液，反應(yīng)2分鐘，將膜置于暗盒中并于暗室下將X-光片壓在膜上；將X-光片利用顯影液進(jìn)行顯影和定影處理后，于空氣中干燥并拍照分析。在其中一些實(shí)施例中，步驟（1）所述的抗原肽序列為：hCTRP2的N-端抗原肽是59DRGDSGEEGPP69hCTRP2的C-端抗原肽是259IYADQDDPNE269。根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（5）所述的擴(kuò)增hCTRP2全長及C-端球狀區(qū)的引物分別如下：擴(kuò)增hCTRP2全長基因的引物對(duì)是：上游引物5’-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’和下游引物5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’；擴(kuò)增hCTRP2球狀區(qū)基因的引物對(duì)是：上游引物5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’和下游引物5’-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAAG-3’。根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，步驟（6）所述的表達(dá)菌株為大腸桿菌BL21。根據(jù)權(quán)利要求1所述的生產(chǎn)方法，其特征在于，以IPTG誘導(dǎo)可以表達(dá)hCTRP2全長和C-端球狀區(qū)蛋白的大腸桿菌表達(dá)菌的菌體總蛋白為檢測(cè)對(duì)象，利用Westernblot對(duì)純化的抗體的特異性進(jìn)行分析，Westernblot結(jié)果表明，通過上述方法制備的抗體具有很高的靈敏度和特異性。根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的生產(chǎn)方法制得的抗原肽、抗體、hCTRP2的全長及球狀區(qū)蛋白。本方法制備的抗體具有靈敏度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，抗體在經(jīng)2萬倍的釋稀后仍能高效地檢測(cè)到目標(biāo)蛋白，但沒有檢測(cè)到目標(biāo)蛋白外的非特異蛋白條帶。利用本方法制備的hCTRP2的抗體完全能夠滿足檢測(cè)hCTRP2蛋白的要求。附圖說明圖1是抗血清效價(jià)的測(cè)定圖；圖2是抗體純化結(jié)果的SDS-PAGE分析圖；圖3是載體構(gòu)建示意圖；圖4是hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果分析圖；圖5是純化抗體的Westernblot檢測(cè)結(jié)果，此圖也是抗體特異性驗(yàn)證的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1本發(fā)明選用的大腸桿菌表達(dá)菌株BL21、載體擴(kuò)增菌株TOP10和表達(dá)載體pET32均購自于美國Invritrogen公司。所用培養(yǎng)基及主要試劑的配方如下：1）LB液體培養(yǎng)基：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，高壓滅菌，室溫保存；2）LB/Amp平板：NaCl10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g，蒸餾水1L，瓊脂粉15g，高壓滅菌后，冷卻至70℃以下，加入0.7mL濃度為100mg/ml的氨芐青霉素（Ampicillin），充分混均后倒板，4℃避光保存；3）50×TAE瓊脂糖凝膠電泳緩沖液：Tris堿121g，冰乙酸28.6mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0)50mL，加蒸餾水定容至500mL，室溫保存；4）100mg/mL氨芐青霉素保存液：氨芐青霉素1g，加蒸餾水溶解并定容至10mL，分裝后于-20℃保存；5）5×SDS-PAGE上樣緩沖液：1MTris-HCl（pH6.8)1.25mL，SDS0.5g，BPB25mg，甘油2.5mL，加去離子水溶解后定容至5mL，分裝（約500μL每份）后于室溫保存，使用每份加入25μLβ-巰基乙醇混勻；6）5×SDS-PAGE電泳緩沖液：Tris15.1g，甘氨酸94g，SDS5.0g，加入約800mL去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙夂蠖ㄈ葜?L，室溫保存；7）考馬斯亮藍(lán)R-250染色液：考馬斯亮藍(lán)R-2500.25g，加入225mL甲醇、46mL的冰乙酸、225mL去離子水并攪拌均勻，濾紙去除顆粒物質(zhì)后，室溫保存；8）考馬斯亮藍(lán)脫色液：冰乙酸50mL，甲醇150mL，去離子水300mL，充分混合后，室溫保存；9）PBS的配制：在800mL蒸餾水中溶解8gNaCL，0.2gKCL，1.44g磷酸氫二鈉和0.24g磷酸二氫鉀，用鹽酸調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水定容至1L。本實(shí)施例所述的一種人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗體的制備方法，主要包括以下步驟：（1）抗原肽的合成：經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)和抗原肽分析軟件的分析結(jié)果，設(shè)計(jì)并合成了hCTRP2的N-端和C-端抗原肽各一段，合成的抗原肽序列如下：SEQIDNO:5：hCTRP2的N-端抗原肽是59DRGDSGEEGPP69；SEQIDNO:6：hCTRP2的C-端抗原肽是259IYADQDDPNE269。合成的抗原肽分別與KLH和BSA進(jìn)行化學(xué)耦聯(lián)；（2）免疫新西蘭大白兔：將KLH耦聯(lián)的C-端及N－端抗原肽分別與弗氏完全佐劑混合到完全乳化，采用皮下注射的方式對(duì)新西蘭雄性大白兔進(jìn)行初次免疫，初次免疫使用的抗原肽質(zhì)量在0.5-1.0mg之間，皮下注射部位主要集中于兔子的勁、脖及背部，共注射15-18個(gè)點(diǎn)左右，于注射前從耳靜脈取1-2毫升血液，37°C培養(yǎng)箱中溫育30min，再置4冰箱內(nèi)過夜，3000g離心15min，取血清并加入終濃度為0.02%疊氮鈉，置4冰箱中保存?zhèn)溆?。初次免疫后的?周，對(duì)各免疫的兔子進(jìn)行加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫采用不完全弗氏佐與抗原充分完全乳化（每只兔子使用抗原0.5mg）；間隔2周后進(jìn)行第2次加強(qiáng)免疫（每只兔子使用抗原肽0.5mg），第2次加強(qiáng)免疫的方法與第一次加強(qiáng)免疫完全相同，于第2次加強(qiáng)免疫的后的第10天，從耳靜脈采血1-2ml。采血及制備抗血清的方法與免疫前采用的采血及抗血清制備的方法完全相同；（3）抗血清效價(jià)的測(cè)定：將10μg/mlBSA耦聯(lián)的抗原肽包被96孔酶標(biāo)板，采用間接ELISA對(duì)抗血清的效價(jià)進(jìn)行測(cè)定，方法如下：1）包被：用0.05MpH9.6碳酸鹽包被緩沖液將抗原稀釋至蛋白質(zhì)濃度為10μg/mL。每個(gè)反應(yīng)孔中加0.1mL，4℃孵育12h。棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液（PBST）洗3次，每次3-5min（簡稱洗滌，下同）；2）封閉：每孔中加0.1mL5%的脫脂奶粉，4℃孵育12h，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3min。（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）；3）加一抗：加經(jīng)一定比例稀釋的抗體0.1mL于上述已包被抗原的反應(yīng)孔中，置4℃孵育12h。然后用洗滌緩沖液洗3次，每次3-5min（同時(shí)做空白孔，陰性對(duì)照孔及陽性對(duì)照孔）；4）加酶標(biāo)二抗：于各反應(yīng)孔中，加入稀釋5,000倍的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG酶標(biāo)二抗0.1mL。37℃孵育1h，洗滌3次，最后一遍用PBS洗滌；5）加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入0.1mL新配制的顯色液，放置于30℃恒溫箱中反應(yīng)30min；6）終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入4M硫酸50μl,終止反應(yīng)；7）結(jié)果判定：于495nm處，測(cè)定各孔的OD值，若大于規(guī)定的陰性對(duì)照OD值的2.1倍，即為陽性。計(jì)算公式：（待測(cè)樣OD-空白OD）/（陰性對(duì)照OD-空白OD），兩者比值大于2.1可判讀為陽性。經(jīng)ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，N-端抗原肽免疫兔子所得抗血清的效價(jià)高于320,000倍，但N-端抗原肽在稀釋較低倍數(shù)時(shí)表現(xiàn)出了較高的背景值（如圖1所示）；C-端抗原肽免疫兔子所得的抗血清的效價(jià)都高于1,280,000倍，且C-端抗原肽在稀釋較低倍數(shù)時(shí)背景值也非常低（如圖1所示）；ELISA結(jié)果表明，C-端抗原肽較N-端抗原肽具有更高的特異性和免疫原性，利用C-端抗原肽免疫兔子制備的抗血清具有更高的效價(jià)和特異性；（4）抗血清的初步純化：將血清效價(jià)高和背景值低的C-端抗原肽免疫所得的抗血清分別利用50%和33%的硫酸銨進(jìn)行分級(jí)沉淀和透析處理，對(duì)抗血清進(jìn)行初步的分離純化；純化的方法如下：取效價(jià)最高的兔抗血清，加等量生理鹽水，攪拌并逐滴加入與稀釋血清等量的飽和硫銨至終濃度為50%飽和度，4°C靜置4h，3000g離心30min，棄上清，以生理鹽水溶解沉淀，再逐滴加飽和硫銨至飽和度為33%，4°C靜置4h。3000g離心30min，棄上清，沉淀溶于生理鹽水中。重復(fù)用33%飽和度的硫銨鹽析處理，將最后離心所得沉淀以20mMPBS（pH7.4)溶解并于10kD的透析袋中于20mMPBS中透析去除硫銨；（5）抗體的親合純化：將經(jīng)溴化氰活化的樹脂與耦聯(lián)有BSA的hCTRP2的C-端抗原肽進(jìn)行耦聯(lián)并制備親合純化柱，利用10倍柱體積的20mMPBS（pH7.4)緩沖液對(duì)親合純化柱進(jìn)行平衡處理。將經(jīng)透析去除硫銨的抗血清加入到親合純化柱中，20倍柱床體積的20mMPBS（pH7.4)洗除非特異吸附在樹脂上的抗體后，加入3倍親合樹脂體積的0.1M甘氨酸-HCl緩沖液(pH2.4)，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1MNaHCO3中和。用20倍柱床體積的20mMPBS（pH7.4)緩沖液對(duì)純化柱再平衡，加入3倍親合樹脂體積的0．05M二乙胺(pH11)緩沖液，流速1ml/min，收集解吸附下來的成分，立即以1MNaHCO3中和。將上述分別利用酸、堿洗脫下來的含純化抗體的溶液合并，于10kDa的透析袋中于100倍體積的20mMPBS中透析24小時(shí)，每8小時(shí)更換透析液一次。透析后的抗體利用截留分子量為10kDa50ml超濾管濃縮10倍。SDS-PAGE對(duì)純化前后的抗體進(jìn)行電泳分析，電泳結(jié)果表明，經(jīng)硫銨分級(jí)沉淀后，可以除去抗體中的部分非免疫球蛋白成分，但仍有一些雜蛋白的存在，而在經(jīng)親合層析后，在SDS-PAGE結(jié)果中幾乎檢測(cè)不到分子量在50kDa外的非免疫球蛋白成分（結(jié)果如圖2所示）；（6）hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白的表達(dá)載體的構(gòu)建：利用擴(kuò)增hCTRP2全長基因的引物對(duì)：SEQIDNO:1：5’-GCCTCGAGAAAAGAGACCCACTGCTTGGCGC-3’；和SEQIDNO:2：5’-GCTCTAGATACCTCGTTGGGGTCATC-3’。擴(kuò)增出hCTRP2的全長基因片段利用擴(kuò)增hCTRP2球狀區(qū)基因的引物對(duì)：SEQIDNO:3：5’-GCGGATCCGTGGCAGTGACCAAGAGCTAC-3’；和SEQIDNO:4：5’-GCCTCGAGTCAGATTAGGAAGCCCGTAAAG-3’。擴(kuò)增出C-端球狀區(qū)基因片段；①用BamHI和XhoI雙酶切PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后切膠回收目標(biāo)片段，獲得目的片斷hCTRP2的全長及球狀區(qū)DNA片段，反應(yīng)體系如下（所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司）：PCR產(chǎn)物15μL10×K緩沖液5μLXhoI5UBamH5U無菌水至50μL②用BamHI和XhoI雙酶切pET32，獲得載體片斷，反應(yīng)體系如下（所用內(nèi)切酶及緩沖液均購自大連TAKARA公司）：質(zhì)粒pET3215μL10×K緩沖液5μLXhoI5UBamH5U無菌水至50μL③由①及②步后所得目的片斷和載體片斷，DNA凝膠收回試劑盒回收，該試劑盒購自大連TAKARA公司，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行；表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖見圖3所示。④回收得到的目的片斷和載體用T4DNA連接酶（購自大連TAKARA公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：質(zhì)粒pET32片段1μL目的片段落3μL10×緩沖液1μLT4DNA連接酶0.5μL無菌水至10μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10菌株，涂布LB氨芐平板，挑取平板上生長的轉(zhuǎn)化子，于LB氨芐液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測(cè)序驗(yàn)證，得重組表達(dá)載體pET32/hCTRP2和pET32/ghCTRP2。將重組表達(dá)載體pET32/hCTRP2和pET32/ghCTRP2。分別熱激轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，涂板，37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)，于LBAmp抗性平板篩選得到重組載體的BL21轉(zhuǎn)化子。（7）hCTRP2全長及球狀區(qū)蛋白的表達(dá)：挑取數(shù)個(gè)BL21轉(zhuǎn)化子，劃線接種至含70mg/LAmp的LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，再挑取單菌落接種至20mL含70mg/LAmp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，搖床振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6；加入IPTG至終濃度為1mM，將搖床轉(zhuǎn)速調(diào)至200rpm，37℃誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)6h；取1mL菌液于1.5mLEP管中，10,000g，離心3min，得菌體；PBS充分重懸菌體，加入20μlSDS-PAGE5×上樣緩沖液，振蕩混勻，沸水中加熱裂解變性10min，14,000g，4℃離心10min，取上清液；利用12%SDS-PAGE對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，電泳結(jié)束后，利考馬斯亮藍(lán)對(duì)凝膠進(jìn)行染色（具體步驟參照精編分子生物學(xué)指南），確定hCTRP2全長及球狀功能區(qū)蛋白的表達(dá)；hCTRP2蛋白理論分子量約為30kDa，其N端融合了Trx片段，Trx的理論分子量約為20kDa，hCTRP2與Trx融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物理論分子量大小約50kDa（目標(biāo)蛋白質(zhì)的分子量在45-55kDa之間），SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)，Trx-hCTRP2已經(jīng)大量表達(dá)，當(dāng)誘導(dǎo)表達(dá)的時(shí)間超過2小時(shí)，Trx-hCTRP2蛋白的表達(dá)不再顯著增加（結(jié)果如圖4左側(cè)部分所示）。hCTRP2球狀區(qū)蛋白的理論分子量約為15kDa，其N端融合了Trx片段，Trx的理論分子量約為20kDa，hCTRP2與Trx融合蛋白的表達(dá)產(chǎn)物理論分子量大小約35kDa，SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG誘導(dǎo)1小時(shí)，Trx-ghCTRP2開始大量表達(dá)（結(jié)果如圖4右側(cè)部分所示）。（8）抗體特異性分析：將制備好的hCTRP2及ghCTRP2表達(dá)菌的經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體總蛋白樣品點(diǎn)樣到12%的SDS-PAGE膠中，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分離，在電泳結(jié)束后，將凝膠從玻璃板上輕輕剝離并轉(zhuǎn)至轉(zhuǎn)移緩沖液中，浸泡40-60min；按轉(zhuǎn)移凝膠的大小裁剪好濾紙和PVDF膜，濾紙各邊應(yīng)比PVDF膜長2mm，PVDF膜的各邊應(yīng)比PAGE膠的各邊長2mm；將PVDF膜用100%甲醇浸泡30s，將PVDF膜及濾紙一并浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，平衡15min；將膠、濾紙及PVDF膜取出，盡量避免污染濾紙和膜，按從下到上：濾紙-膜-膠-濾紙的順序?qū)⑵湟来畏藕?，盡量避免膠與膜之間產(chǎn)生氣泡；打開半干轉(zhuǎn)移儀，將濾紙-膜-膠-濾紙放入轉(zhuǎn)移盤中，蓋好電源蓋子；接通電源，83mm×75mm大小的膜設(shè)定電流100mA，電壓15V；實(shí)際設(shè)定中電壓15V不變，按60mm2設(shè)1mA的初始電流，設(shè)定轉(zhuǎn)膜時(shí)間為1h；轉(zhuǎn)移完畢后，將PVDF膜轉(zhuǎn)移至含5%牛血清白蛋白的TBST中，4℃，封閉12h；封閉結(jié)束后，加入稀釋2萬倍的抗體到PVDF膜中，4℃，孵育12h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜轉(zhuǎn)至含有HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG中，4℃，孵育12h，利用TBST洗膜3次，每次15分鐘；將膜置于一小盒中，加入適量的ECL發(fā)光液，反應(yīng)2分鐘，將膜置于暗盒內(nèi)并于暗室中將X-光片壓在膜上；將X-光片進(jìn)行顯影和定影處理，X-光片于空氣中干燥并拍照分析。WB結(jié)果都表明，僅在全長hCTRP2表達(dá)菌的菌體總蛋白的約50kDa和球狀hCTRP2表達(dá)菌的菌體總蛋白的約35kDa處檢測(cè)到了特異條帶，說明制備的抗體具有很高的特異性和靈敏度（結(jié)果如圖5所示）。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。SEQUENCELISTING<110>懷化學(xué)院<120>一種人補(bǔ)體C1q/TNFα相關(guān)蛋白-2（hCTRP2）的抗原肽及其抗體<130>2013<160>6<170>PatentInversion3.3<210>1<211>31<212>DNA<213>人工序列<400>1gcctcgagaaaagagacccactgcttggcgc31<210>2<211>26<212>DNA<213>人工序列<400>2gctctagatacctcgttggggtcatc26<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>3gcggatccgtggcagtgaccaagagctac29<210>4<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>4gcctcgagtcagattaggaagcccgtaaag30<210>5<211>11<212>PRT<213>人工序列<400>5AspArgGlyAspSerGlyGluGluGlyProPro1510<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>6IleTyrAlaAspGlnAspAspProAsnGlu1510