多特異性FAB融合蛋白及其使用方法相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本申請(qǐng)要求于2011年5月16日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)第61/486,690號(hào)的優(yōu)先權(quán)，所述申請(qǐng)全部?jī)?nèi)容在此通過引用并入本文。關(guān)于序列表的聲明以文本格式代替紙質(zhì)版提供本申請(qǐng)相關(guān)的序列表，并且在此通過引用并入本說明書。包含所述序列表的文本文件命名為FABN_001_02WO_ST25.txt。該文本文件為188KB，創(chuàng)建于2012年5月16日，并通過EFS-Web以電子方式提交。

背景技術(shù)：
領(lǐng)域本公開總體上涉及多特異性Fab融合蛋白(MSFP)。具體而言，本公開的MSFP包含抗體的Fab片段，其兩個(gè)N端通過可切割或不可切割的接頭與融合部分融合。MSFP的Fab片段與天然的細(xì)胞表面靶標(biāo)抗原以及相同抗原的某些可溶形式特異性地結(jié)合。一種或兩種融合部分與細(xì)胞表面上的靶標(biāo)抗原特異性地結(jié)合。相關(guān)領(lǐng)域的描述常規(guī)的免疫球蛋白G(IgG)為包含兩個(gè)相同的免疫球蛋白重鏈和兩個(gè)相同的免疫球蛋白輕鏈的四聚體分子。IgG重鏈有位于N端的可變區(qū)接著是第一恒定區(qū)(CH1)、鉸鏈區(qū)和兩個(gè)另外的恒定區(qū)(CH2CH3)。IgG輕鏈由兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：N端可變區(qū)和C端恒定區(qū)。重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)相互作用構(gòu)成了最小的抗原結(jié)合區(qū)，F(xiàn)v。抗原結(jié)合區(qū)通過重鏈(CH1)的第一恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)(CL)之間的相互作用并進(jìn)一步通過兩個(gè)恒定區(qū)之間的二硫鍵的形成(形成Fab片段)來穩(wěn)定。CH2CH3結(jié)構(gòu)域的同源二聚化(形成Fc)以及由此形成的鉸鏈二硫鍵穩(wěn)定了IgG的結(jié)構(gòu)。因此，IgG有兩個(gè)抗原結(jié)合性Fab臂，該Fab臂彼此以及與Fc結(jié)構(gòu)域在方向上是相對(duì)靈活的。此外，結(jié)合區(qū)(其與抗原直接相互作用)位于N端而無需其它結(jié)構(gòu)。不難想象，這種結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有利于抗體與抗原以最小的空間位阻干擾來相互作用。這種屬性對(duì)于與細(xì)胞表面抗原的結(jié)合尤其重要，細(xì)胞表面抗原往往與復(fù)雜的細(xì)胞膜位置非常接近。近年來，已成功將全長(zhǎng)單克隆抗體用于治療癌癥、自身免疫性疾病和炎性疾病以及其他的人類疾病(Nelson,Nat.review,DrugDiscovery(2010)9:767-74)。盡管天然存在五種不同類型的免疫球蛋白(IgA、IgD、IgG、IgM和IgE)，由于有利的性質(zhì)(包括高結(jié)合親和力和高結(jié)合特異性、高生物利用度、循環(huán)中較長(zhǎng)的血清半衰期、潛在的效應(yīng)功能和工業(yè)規(guī)模的可生產(chǎn)性)，IgG代表了用于人類治療的最適形式。單克隆抗體(非綴合抗體或裸抗體)目前由全球藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)用于腫瘤學(xué)背景的臨床應(yīng)用，其通常通過以下機(jī)制之一或其組合起作用：1)阻斷細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)、2)阻斷向癌細(xì)胞供應(yīng)血液、3)直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡、4)引發(fā)免疫效應(yīng)功能，諸如抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(ADCP)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒作用(CDC)、以及5)促進(jìn)針對(duì)腫瘤的獲得性免疫。單克隆抗體療法已在臨床上表現(xiàn)出生存益處。但是，在癌癥患者中的總體反應(yīng)率較低，并且與化療相比存活益處較小(數(shù)月)。雖然未完全了解缺少?gòu)?qiáng)大的臨床抗癌活性的根本原因，但研究表明，癌細(xì)胞往往迅速發(fā)展出補(bǔ)償信號(hào)途徑來逃避細(xì)胞死亡。此外，癌癥干細(xì)胞(CSC)，其被認(rèn)為是有效的癌癥起始細(xì)胞，細(xì)胞增殖較不活躍，因此它們傾向于更好地維持生長(zhǎng)信號(hào)的缺乏。近年來，ADCC被證明在抗癌抗體的臨床療效中發(fā)揮重要作用?？贵w的Fc結(jié)合Fcγ受體，其中Fcγ受體有多種形式：FcγRI、FCγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIc、FCγRIIIa和FcγRIIIb。Fc結(jié)構(gòu)域?qū)cγRIIIa有特別高的親和力，所述FcγRIIIa表達(dá)于自然殺傷(NK)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞上。Fc與FcγRIIIa的結(jié)合活化NK細(xì)胞，其隨后破壞附近的癌細(xì)胞。經(jīng)由蛋白改造(涉及CH2區(qū)中的多個(gè)氨基酸突變)或生產(chǎn)宿主細(xì)胞(CHO)系(經(jīng)改造減少或消除Asn297聚糖結(jié)構(gòu)中的巖藻糖化)產(chǎn)生的具有增強(qiáng)的活化FcγR結(jié)合性質(zhì)的遺傳改造的抗體，已在臨床前研究中成功地測(cè)試具有改善的生物活性。包含增強(qiáng)的效應(yīng)功能的IgG抗體目前在臨床試驗(yàn)中，目的在于提高療效。目前可用的臨床數(shù)據(jù)表明這些抗體是非常有前景的。另一種抗癌的治療方法是利用T細(xì)胞。T細(xì)胞通過巡視機(jī)體以尋找新出現(xiàn)的癌細(xì)胞并有效及時(shí)地清除它們而在一生中提供對(duì)癌癥的防御性。在癌癥治療中利用T細(xì)胞免疫的成功的治療方法包括：1)FDA批準(zhǔn)使用的用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性腎癌的Proleukin(重組IL-2)；2)FDA批準(zhǔn)使用的用于無癥狀的轉(zhuǎn)移性激素抵抗性前列腺癌的(Sipuleucel-T)。是一種樹突狀細(xì)胞疫苗，其活化離體前列腺癌特異性的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，接著將該細(xì)胞回輸至患者體內(nèi)；3)FDA批準(zhǔn)使用的用于晚期黑色素瘤的易普利姆瑪(抗CTLA-4抗體以通過抑制T細(xì)胞抑制性信號(hào)通路來活化T細(xì)胞)。由于T細(xì)胞不表達(dá)Fcγ受體(FCγR)，抗腫瘤抗體不能有效地直接活化細(xì)胞毒性T細(xì)胞。許多旨在活化T細(xì)胞用于腫瘤殺傷目的的有前景的方法之一是使用雙特異性抗體(bsAb)，以便直接將T細(xì)胞帶至腫瘤細(xì)胞附近，導(dǎo)致T細(xì)胞的活化并殺傷腫瘤細(xì)胞。CD28和CD137(4-1BB)是用于雙特異性靶向方法中的兩種有效的T細(xì)胞共刺激受體。實(shí)例包括：CD28xNG2(Grosse-Hovestetal.,EurJImmunol33:1334-40,2003)、CD28xCD20(Otzetal.,Leukemia23:71-7,2009)和4-1BBxCD20(Liuetal.,JImmunother33:500-9,2010)。利用雙特異性抗體，能夠觸發(fā)T活化的其他T細(xì)胞表面靶標(biāo)也已被用于將其重靶向腫瘤細(xì)胞。過去已開發(fā)了多種雙特異性抗體形式和多特異性抗體形式并在最近得到仔細(xì)的研究(MullerandKontermann,Biodrugs24:89-98,2010;ChamesandBaty,mAbs1:539-47,2009;DeyevandLebedenko,BioEssays30:904-918,2008)。這些形式落入以下三大類：1)基于Fc異源二聚化或與重鏈或輕鏈共價(jià)融合的IgG樣雙特異性分子，包括四源雜交瘤技術(shù)(Staerzetal.,PNAS83:1453-7,1986)、杵-臼技術(shù)(NatBiotechnol.16:677-81;J.Biol.Chem.285:19637-46,2010)、鏈交換改造結(jié)構(gòu)域“SEED”技術(shù)(Davisetal.,PEDS23:195-202,2010)、與IgG的重鏈或輕鏈的C端融合(ColomaandMorrison,Nat.Biotechnol.15:159-63,1997;Shenetal.,J.Immunol.Methods318:65-74,2007;orcuttetal.,PEDS23:221-8,2010;Dongetal.,J.Biol.Chem.,286:4703-17,2011,Lazaretal.,專利申請(qǐng),US20110054151)、與IgG的重鏈或輕鏈的N端融合(Shen,etal.,J.Biol.Chem.281:10706-17,2006;Wuetal.,Nat.Biotechnol.25:1290-7,2007)；2)Fc融合雙特異性抗體(Mabryetal.,PEDS23:115-127,2010;Milleretal.,PEDS23:549-557,2010)；3)通過融合或非共價(jià)連接的僅含有抗體可變區(qū)的分子，包括雙價(jià)抗體(Db)(Holliggeretal.,PNAS90:6444-8,1993)、二硫鍵連接的雙價(jià)抗體(也被稱作雙親和重靶向或DART)(Johnsonetal.,J.Mol.Biol.399:436-49,2010)、單鏈雙價(jià)抗體(scDb)(Alt,etal.,FEBSLetters454:90-4,1999)、串聯(lián)雙價(jià)抗體(tandAbs)(Kipriyanov,etal.,J.Mol.Biol.293:41-56,1999)、串聯(lián)單鏈Fv(taFv)(Mack,etal.,PNAS92:7021-5,1995)；和4)基于Fab的融合分子，包括雙價(jià)抗體和三價(jià)抗體(Schoonjansetal.,J.Immunol.165:7050-7,2000;BiotecnolSA的網(wǎng)頁(yè),http://www.biotecnol.com)、與單域抗體融合的Fab(專利申請(qǐng)US2010/0239582A1)和Fab’2-融合蛋白(美國(guó)專利US5,959,083)。過去二十年里，在雙特異性抗體領(lǐng)域的努力開始在臨床上取得成果。在2009年，Cantomaxomab(抗-CD3，抗-EpCAM三功能性抗體)被歐洲批準(zhǔn)用于有癥狀的惡性腹水。然而，雖然雙特異性抗體已被證明具有有效的腫瘤細(xì)胞殺傷潛力，嚴(yán)重的副作用，包括全身免疫激活、免疫原性(抗藥物抗體反應(yīng))和這些分子保留的普遍較差的可生產(chǎn)性，已在很大程度上阻礙了此類藥物的廣泛應(yīng)用。近年來被稱為雙特異性T細(xì)胞銜接器(engager)或BiTE的雙特異性抗體的技術(shù)平臺(tái)，應(yīng)用抗CD19scFv-抗CD3scFv融合蛋白(Blinatumomab)，因?yàn)槠湓谂R床前試驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中被證明有出色的效能而吸引了很多的關(guān)注(Bargouetal.,Science(2008)321:974-7)。具體而言，在給予blinatumomab的臨床試驗(yàn)期間，非何杰金氏淋巴瘤患者表現(xiàn)出腫瘤退化，并且在某些情況下表現(xiàn)出完全緩解。然而，blinatumomab造成了嚴(yán)重的副作用，包括表現(xiàn)為語言能力喪失及迷失方向的的中樞神經(jīng)系統(tǒng)副作用。癥狀是短暫的，一旦停止給藥是可逆的。據(jù)推測(cè)，通過該藥物直接結(jié)合CD3(在T細(xì)胞上)導(dǎo)致T細(xì)胞部分活化和細(xì)胞再分布(專利申請(qǐng)，US2010/0150918A1)。一些再分布的T細(xì)胞粘附至大腦微脈管，部分活化內(nèi)皮細(xì)胞并導(dǎo)致大腦中微脈管系統(tǒng)的增強(qiáng)的滲透性。在臨床試驗(yàn)中觀察到，副作用的發(fā)生率在具有較高B細(xì)胞：T細(xì)胞比的患者中比具有較低比的患者要低。還已報(bào)道在猴子中利用不同的CD3結(jié)合抗體片段可減輕或避免T細(xì)胞再分布。這些觀察結(jié)果強(qiáng)烈的表明，抗體與CD3連同CD3上的結(jié)合表位的結(jié)合以及所獲得的T細(xì)胞的部分活化可能是嚴(yán)重的CNS副作用的直接原因。CD19xCD3雙特異性scFv-scFv融合蛋白的另一個(gè)缺點(diǎn)是，由于其半衰期短且不兼容皮下給藥，這種藥物需要每日靜脈輸注(i.v.)給藥。此外，scFv-scFv融合蛋白有聚集的傾向。因此，BiTE分子需要高度復(fù)雜的抗體工程技術(shù)并且使其穩(wěn)定和可生產(chǎn)化是很困難的。結(jié)合表達(dá)FcγR或CD3的免疫細(xì)胞的抗體藥物的抗腫瘤活性表現(xiàn)出理論上的臨床證據(jù)。然而，目前的雙特異性抗體形式的缺點(diǎn)對(duì)于這些藥物以良好的有效性和安全性廣泛應(yīng)用于治療癌癥患者仍然是個(gè)挑戰(zhàn)。因此，仍迫切需要在產(chǎn)品功效、穩(wěn)定性、安全性和可生產(chǎn)性方面具有改善性能的新的雙特異性分子設(shè)計(jì)。其它背景信息的參考文獻(xiàn)包括：ColomaandMorrison,Nat.Biotechnol.15:159-63,1997；Kontermann,ActaPharmacol.Sin.,26,1–9.2005;MarvinandZhu；ActaPharmacol.Sin.,26,649–658.2005；Shenetal.,J.Immunol.Methods,318:65–74,2007;Shenetal.JBC281:10706-10714,2006；Wuetal.,Nat.Biotechnol.,25,1290–1297,2007；OrcuttProtPEDS23:221-8,2010;MabryPEDSvol.23no.3第115–127頁(yè),2010;SchoonjansTheJournalofImmunology,2000,165:7050–7057;Michaelson,mAbs1:2,128-141：2009；Robinsonetal.,BritishJournalofCancer(2008)99,1415–1425。簡(jiǎn)述本公開的一個(gè)方面提供了多特異性Fab融合蛋白，其包含：能結(jié)合靶標(biāo)抗原的Fab片段；與所述Fab片段中VL的N端偶聯(lián)的第一融合部分；和/或與所述Fab片段中VH的N端偶聯(lián)的第二融合部分。在所述多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段與Fab靶標(biāo)抗原的結(jié)合與不存在第一和第二融合部分情況下相同F(xiàn)ab片段與Fab靶標(biāo)的結(jié)合相比，減少了50%-90%。本公開的一個(gè)方面提供了多特異性Fab融合蛋白，其包含：a)能結(jié)合靶標(biāo)抗原的Fab片段，其中所述Fab片段包含，i)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(CL)；和ii)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)1(CH1)；其中所述CL區(qū)和CH1區(qū)任選通過二硫鍵連接；b)融合部分A，其中所述融合部分A的C端與所述VH結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；或c)融合部分B，其中所述融合部分B的C端與所述VL結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；或者b和c兩者；d)任選地，位于所述融合部分A和所述VH結(jié)構(gòu)域之間的第一接頭；和e)任選地，位于所述融合部分B和所述VL結(jié)構(gòu)域之間的第二接頭。在MSFP的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或所述融合部分B包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域。所述融合部分A和融合部分B序列可相同或者可包含不同的序列。在本公開的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域而所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的細(xì)胞表面抗原。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域而所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的細(xì)胞表面抗原。在某些實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域而所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的表位或不同的表位。在本公開的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段能結(jié)合細(xì)胞表面靶標(biāo)抗原。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合部分A包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述Fab片段能與所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合相同的細(xì)胞表面抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分B包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述Fab片段能與所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合相同的細(xì)胞表面抗原。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的某些實(shí)施方案中，所述Fab片段與抗原的結(jié)合被所述融合部分A和融合部分B導(dǎo)致的空間位阻所抑制。在一些實(shí)施方案中，所述空間位阻導(dǎo)致不可檢測(cè)到的所述Fab片段與所述抗原的結(jié)合。在其它實(shí)施方案中，所述Fab片段與其靶標(biāo)的結(jié)合相對(duì)于不存在所述融合部分A和融合部分B情況下相同F(xiàn)ab片段與其靶標(biāo)的結(jié)合，降低了50%-90%。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭和第二接頭是可切割的。在其它實(shí)施方案中，若所述第一接頭被切割，則可檢測(cè)到所述Fab片段與所述抗原的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，若所述第二接頭被切割，則可檢測(cè)到所述Fab片段與所述抗原的結(jié)合。在又一個(gè)實(shí)施方案中，若所述第一接頭和第二接頭兩者均被切割，則可檢測(cè)到所述Fab片段與所述抗原的結(jié)合。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)類型選自α、δ、ε、γ和μ。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈來源于IgG抗體，而在其它實(shí)施方案中，所述IgG抗體的亞型選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白輕鏈VL和CL選自免疫球蛋白κ輕鏈和免疫球蛋白λ輕鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含含有scFv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合蛋白不包含第一接頭或第二接頭。在這方面，在一些實(shí)施方案中，所述融合部分A缺失了1-3個(gè)C端的氨基酸殘基；或者其中所述融合部分B缺失了1-3個(gè)C端的氨基酸殘基；或者其中所述融合部分A和融合部分B兩者均缺失了1-3個(gè)C端的氨基酸殘基。在本文所述的MSFP的其它實(shí)施方案中，其中沒有第一接頭或第二接頭，所述FabVH的N末端可以缺失1-3個(gè)氨基酸殘基；或者所述FabVL的N末端可以缺失1-3個(gè)氨基酸殘基；或者所述VH的N末端和所述VL的N末端兩者均可以缺失1-3個(gè)氨基酸殘基。在本文所述的MSFP的其它實(shí)施方案中，其中沒有第一接頭或第二接頭，所述融合部分A和融合部分B兩者均可以缺失1-3個(gè)C端的氨基酸殘基；并且所述FabVH的N末端和所述FabVL的N末端兩者均可以缺失1-3個(gè)氨基酸殘基。而在其它實(shí)施方案中，本文所述的MSFP包含接頭和缺失的任何組合。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白或其同源二聚體的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭包含蛋白酶不可切割的序列和/或所述第二接頭包含蛋白酶可切割的序列。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白或包含相同多特異性Fab融合蛋白的同源二聚體的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭包含蛋白酶可切割的序列和/或所述第二接頭包含不可切割的序列。在某些實(shí)施方案中，所述第一接頭和第二接頭包含可被相同的蛋白酶切割的蛋白酶可切割的序列。在其它實(shí)施方案中，所述第一接頭和第二接頭包含可被不同蛋白酶切割的蛋白酶可切割的序列。在相關(guān)的實(shí)施方案中，所述蛋白酶可切割的序列包含絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可切割的序列。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白酶可切割序列為MMP可切割的序列。在這方面，所述基質(zhì)金屬蛋白酶可切割序列可為基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)或基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)可切割的序列。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭的長(zhǎng)度為1-10個(gè)氨基酸或1-20個(gè)氨基酸。在一些實(shí)施方案中，所述第二接頭包含蛋白酶不可切割的序列或包含蛋白酶可切割的序列。在這方面，所述蛋白酶可切割的序列可為絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶或基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)可切割的序列。在某些實(shí)施方案中，所述蛋白酶可切割序列為MMP可切割的序列，并且在這方面，可為選自以下的MMP可切割的序列：基質(zhì)金屬蛋白酶-1(MMP-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)或基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)可切割的序列。在某些實(shí)施方案中，所述第二接頭的長(zhǎng)度為1-10個(gè)氨基酸或1-20個(gè)氨基酸。在本公開的另一個(gè)方面，所述多特異性Fab融合蛋白包含a)能結(jié)合靶標(biāo)抗原的Fab片段，其中所述Fab片段包含，i)免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(CL)；和ii)免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)1(CH1)；其中所述CL區(qū)和CH1區(qū)任選通過二硫鍵連接；b)融合部分A，其中所述融合部分A的C端與所述VH結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；c)融合部分B，其中所述融合部分B的C端與所述VL結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；d)任選地，位于所述融合部分A和所述VH結(jié)構(gòu)域之間的第一接頭；和e)任選地，位于所述融合部分B和所述VL結(jié)構(gòu)域之間的第二接頭；其中所述融合部分A包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或所述融合部分B包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且進(jìn)一步地，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任一個(gè)或兩個(gè)能結(jié)合細(xì)胞表面抗原。在某些實(shí)施方案中，所述結(jié)合結(jié)構(gòu)域(例如融合部分A或融合部分B的結(jié)合結(jié)構(gòu)域)之一能結(jié)合人血清白蛋白。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab能結(jié)合選自以下的靶標(biāo)抗原：FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、NKG2D、CD3、CD25、CD28、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、EGFR、Her2/neu、ErbB3、CD25和CD28。在具體的實(shí)施方案中，所述Fab能結(jié)合CD3。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab能結(jié)合T細(xì)胞受體。所述Fab可為人源化的。在某些實(shí)施方案中，所述人源化的Fab來源于OKT3、UCHT-1或SP34。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab來源于全人抗體，在一些實(shí)施方案中，其產(chǎn)生自噬菌體展示、酵母展示或人抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的細(xì)胞表面抗原，并且其中所述第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合選自以下的靶標(biāo)：FcγRIIb、CD28、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、CD28、CEA、PSMA、BCMA、CAIX、cMet、EGFR1、Her2/neu、ErbB3、EpCAM、葉酸受體、Ephrine受體、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的細(xì)胞表面抗原，并且其中所述第一和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的靶標(biāo)，所述靶標(biāo)選自：FcγRIIb、CD28、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、CD28、CEA、PSMA、BCMA、CAIX、cMet、EGFR1、Her2/neu、ErbB3、EpCAM、葉酸受體、Ephrine受體、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性Fab融合蛋白的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w的抗原結(jié)合片段。在這方面，所述抗原結(jié)合片段可以選自：scFv、CDR、Fv、免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域、Fab、駱駝科動(dòng)物抗體VHH(camelidVHH)、dAb(結(jié)構(gòu)域抗體)。在某些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是人源化的，并且在其它實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段來源于小鼠、大鼠或兔的單克隆抗體。在一些實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段來源于全人抗體，其可產(chǎn)生自噬菌體展示、酵母展示或人抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在其它實(shí)施方案中，本文所述的MSFP的第一和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自：纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域(Fn3)、錨蛋白重復(fù)序列和Adnectin。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭和/或第二接頭包含SEQIDNO:133.所示的氨基酸序列(PLGLAG)。本公開的一個(gè)方面提供了編碼本文所述的多特異性Fab融合蛋白的分離的多核苷酸、包含所述分離的多核苷酸的表達(dá)載體以及包含此類載體的分離的宿主細(xì)胞。本公開的另一個(gè)方面提供了表達(dá)多特異性Fab融合蛋白的方法，其包括在編碼本文所述的多特異性Fab融合蛋白的分離的多核苷酸表達(dá)所編碼的多特異性Fab融合蛋白的條件下，培養(yǎng)包含所述分離的多核苷酸的宿主細(xì)胞。本公開的另一個(gè)方面提供了包含本文所述的一種或多種多特異性Fab融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本公開的另一個(gè)方面提供了治療病癥的方法，其包括向有此需要的受試對(duì)象給予有效量的包含本文所述的一種或多種多特異性Fab融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述病癥與所述多特異性Fab融合蛋白可結(jié)合的抗原相關(guān)。在本文所述的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A和融合部分B并不二聚化。本公開的另一個(gè)方面提供了包含以下的多特異性Fab融合蛋白：能與CD3ε的N端結(jié)合的Fab片段；與所述Fab片段中VL的N端連接的融合部分A；或與所述Fab片段中VH的N端連接的融合部分B；或與所述Fab片段中VL的N端連接的融合部分A和與所述Fab片段中VH的N端連接的融合部分B兩者。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段能結(jié)合CD3ε的第1-27位氨基酸之內(nèi)的表位。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段與非人靈長(zhǎng)類CD3ε交叉反應(yīng)。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，a.所述Fab片段包含：i.免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VL)和免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)(CL)，所述免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:26-28所示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列；和ii.免疫球蛋白重鏈可變區(qū)(VH)和免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)1(CH1)，所述免疫球蛋白重鏈可變區(qū)包含SEQIDNO:23-25所示的CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列；其中所述CL區(qū)和CH1區(qū)任選通過二硫鍵連接；b.所述融合部分A的C端與所述VH結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；或者c.所述融合部分B的C端與所述VL結(jié)構(gòu)域的N末端共價(jià)連接；或者d.b和c兩者；e.任選地，位于所述融合部分A和所述VH結(jié)構(gòu)域之間的第一接頭；以及f.任選地，位于所述融合部分B和所述VL結(jié)構(gòu)域之間的第二接頭。在一個(gè)實(shí)施方案中，VH選自SEQIDNO:34、38、42、46、50和54所示氨基酸序列中的任一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，VL選自SEQIDNO:56、58、62、66和70所示氨基酸序列中的任一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或所述融合部分B包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A和融合部分B序列相同。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A和融合部分B包含不同的序列。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的細(xì)胞表面抗原。在某些實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的細(xì)胞表面抗原。在其它實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的表位。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域并且所述融合部分B包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的表位。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段與CD3的結(jié)合被所述融合部分A和融合部分B導(dǎo)致的空間位阻所抑制。在這方面，在不存在所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述細(xì)胞表面抗原結(jié)合的情況下，所述空間位阻導(dǎo)致不可檢測(cè)到的所述Fab片段與CD3的結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，在不存在所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述細(xì)胞表面抗原結(jié)合的情況下的所述Fab片段與CD3的結(jié)合，相對(duì)于存在所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域與所述細(xì)胞表面抗原的結(jié)合的情況下所述Fab片段與CD3的結(jié)合，降低了50%-90%。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab片段與CD3的結(jié)合相對(duì)于沒有所述融合部分A和融合部分B的相同F(xiàn)ab片段的結(jié)合減少了50%-90%。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)類型選自α、δ、ε、γ和μ。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白重鏈來源于IgG抗體。在另外的實(shí)施方案中，所述IgG抗體的亞型選自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白輕鏈VL和CL選自免疫球蛋白κ輕鏈和免疫球蛋白λ輕鏈。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述融合部分A包含含有scFv抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在所述多特異性Fab融合蛋白的另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一接頭和第二接頭的長(zhǎng)度為1-20個(gè)氨基酸。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述第一接頭和/或第二接頭包含GlyArgAla。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的一個(gè)實(shí)施方案中，所述Fab是人源化的。在本文公開的多特異性Fab融合蛋白的又一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合選自以下的靶標(biāo)：FcγRIIb、CD28、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、CD28、CEA、PSMA、BCMA、CAIX、cMet、EGFR1、Her2/neu、ErbB3、EpCAM、葉酸受體、Ephrine受體、TRAIL受體2、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域選自SEQIDNO:78、88和94所示的氨基酸序列中的任一種。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的靶標(biāo)，所述靶標(biāo)選自：FcγRIIb、CD28、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、CD28、CEA、PSMA、BCMA、CAIX、cMet、EGFR1、Her2/neu、ErbB3、EpCAM、葉酸受體、Ephrine受體、TRAIL受體2、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)榭贵w的抗原結(jié)合片段。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段選自：scFv、CDR、Fv、免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白VH結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白VL結(jié)構(gòu)域和VH結(jié)構(gòu)域、Fab、駱駝科動(dòng)物抗體VHH、dAb。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段是人源化的。在其它實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段來源于小鼠、大鼠或兔的單克隆抗體，并且所述抗原結(jié)合片段也可來源于全人抗體。在這方面，所述全人抗體產(chǎn)生自噬菌體展示、酵母展示或人抗體基因的轉(zhuǎn)基因小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述抗原結(jié)合片段：1)包含分別如SEQIDNO:139-144所示的VHCDR和VLCDR；2)包含分別如SEQIDNO:145-150所示的VHCDR和VLCDR；3)包含SEQIDNO:78、88和94的任一氨基酸序列所示的scFv中存在的VH；4)包含SEQIDNO:78、88和94的任一氨基酸序列所示的scFv中存在的VL；或5)包含選自SEQIDNO:78、88和94所示的任一氨基酸序列的ScFV。在某些實(shí)施方案中，所述多特異性Fab融合蛋白的CL區(qū)包含杵狀結(jié)構(gòu)或臼狀結(jié)構(gòu)突變，并且所述CH1區(qū)包含對(duì)應(yīng)的杵狀結(jié)構(gòu)或臼狀結(jié)構(gòu)突變得使所述CL區(qū)和CH1區(qū)穩(wěn)定地相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文公開的多特異性Fab融合蛋白，包含選自SEQIDNO:84、90、96和100的任一氨基酸序列；和選自SEQIDNO:32、60、64、68和72的任一氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的多特異性Fab融合蛋白包含選自SEQIDNO:86、92、98和102的任一氨基酸序列；和選自SEQIDNO:30、36、40、44、48和52的任一氨基酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述CL區(qū)和CH1區(qū)通過二硫鍵連接。本公開的另一個(gè)方面提供了編碼本文所述的多特異性Fab融合蛋白中任一種的分離的多核苷酸，和包含所述分離的多核苷酸的表達(dá)載體。本公開還提供了包含此類載體的分離的宿主細(xì)胞。本公開還提供了在所述分離的多核苷酸表達(dá)所編碼的多特異性Fab融合蛋白的條件下，通過培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞來表達(dá)多特異性Fab融合蛋白的方法。本公開還提供了包含本文所述的多特異性Fab融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物。本公開的另一個(gè)方面提供了治療癌癥的方法，其包括向患有癌癥或疑似患有癌癥的受試對(duì)象給予有效量的包含本文所述的多特異性Fab融合蛋白和藥學(xué)上可接受的載體的藥物組合物，其中所述癌癥與所述多特異性Fab融合蛋白可結(jié)合的抗原相關(guān)。附圖簡(jiǎn)述圖1：描述了多特異性Fab融合蛋白(MSFP)的示意圖。融合部分A和融合部分B、單域蛋白或多結(jié)構(gòu)域蛋白，通過可被或不可被蛋白酶切割的接頭序列與Fab片段的N末端共價(jià)融合。融合部分A和融合部分B可具有抗原特異性結(jié)合能力或不具有抗原特異性結(jié)合能力。圖2：描述MSFP中融合部分的不同結(jié)構(gòu)以及Fab與細(xì)胞表面靶標(biāo)或靶標(biāo)的可溶形式的結(jié)合親和力的相對(duì)強(qiáng)度的示意圖。圖的下半部分顯示了MSFP中融合部分的構(gòu)象柔性。圖3：說明了不同融合形式的Fab對(duì)可溶靶標(biāo)和細(xì)胞表面靶標(biāo)的結(jié)合性質(zhì)的示意圖。A.Fab的結(jié)構(gòu)、Fab在N端之一帶有單個(gè)融合部分的融合蛋白的結(jié)構(gòu)、在Fab的兩個(gè)N端均帶有融合部分的Fab的融合蛋白的結(jié)構(gòu)；B.描述了全部三種Fab融合形式的能夠結(jié)合其可溶靶標(biāo)的Fab的示意圖；C.描述了沒有融合和在Fab的N端帶有單個(gè)融合部分的Fab結(jié)構(gòu)域可結(jié)合其細(xì)胞表面上的靶標(biāo)的示意圖。然而，在重鏈和輕鏈兩者的N端帶有融合部分的Fab結(jié)構(gòu)域由于空間位阻無法再結(jié)合其細(xì)胞表面上存在的靶標(biāo)。圖4：描述了MSFP結(jié)合T細(xì)胞的必要條件的示意圖：A.在重鏈和輕鏈兩者的N端均帶有抗腫瘤細(xì)胞表面靶標(biāo)結(jié)合部分的MSFP可通過腫瘤相關(guān)抗原(TAA)結(jié)合腫瘤細(xì)胞但不結(jié)合T細(xì)胞上的CD3(因?yàn)榇蟠蠼档偷挠H和力，參見圖3C)。B.當(dāng)MSFP分子以低親和力結(jié)合T細(xì)胞上的CD3時(shí)，可通過親合力效應(yīng)有效結(jié)合腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞。代表性MSFP分子通過TAA結(jié)合在腫瘤細(xì)胞上成簇，CD3結(jié)合臂將通過親合力結(jié)合T細(xì)胞，從而橋聯(lián)腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞。圖5：描述了帶有單個(gè)抗腫瘤細(xì)胞表面靶標(biāo)部分的Fab融合蛋白(或來自Fab融合蛋白在重鏈和輕鏈兩者的單臂切割產(chǎn)物)可結(jié)合腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞兩者上的靶標(biāo)，導(dǎo)致兩種細(xì)胞類型橋聯(lián)的示意圖。圖6：A，顯示了兩條單鏈Fv(scFv)結(jié)構(gòu)域作為融合部分的Fabe的示意圖。Fabe是指其中Fab結(jié)合靶標(biāo)是免疫細(xì)胞表面效應(yīng)分子的MSFP，所述免疫細(xì)胞表面效應(yīng)分子例如T細(xì)胞上的CD3ε鏈或T細(xì)胞受體、NK細(xì)胞上的NKG2D、或NK細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上的Fcγ受體。兩個(gè)scFv結(jié)構(gòu)域可具有相同的特異性或不同的特異性，B，蛋白結(jié)構(gòu)域和一級(jí)序列中的鏈間二硫鍵的示意圖。CH和CL之間的鏈間二硫鍵是任選的。scFv的結(jié)構(gòu)可為VH-VL或VL-VH并且scFv1和scFv2中的VH和VL結(jié)構(gòu)可為相同或不同的。圖7：A，顯示了兩條單鏈Fv(scFv)結(jié)構(gòu)域作為融合部分的Fabe-albu的示意圖。Fabe-albu是Fabe的特定類型，其中一種scFv對(duì)人白蛋白具有結(jié)合特異性并且第二種scFv對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原(TAA)具有結(jié)合特異性；B，蛋白結(jié)構(gòu)域和一級(jí)序列中鏈間二硫鍵的示意圖。scFv的結(jié)構(gòu)可為VH-VL或VL-VH并且scFv1和scFv2中的VH和VL結(jié)構(gòu)可為相同或不同的。圖8：小鼠抗人CD3抗體1F3和人源化1F3抗體，即hu-1F3的4-20%tris甘氨酸SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠分析)(Invitrogen)。凝膠用simplyblue試劑(Invitrogen)染色?！癗R”是在非還原條件下，而“R”是在用5%的巰基乙醇的還原條件下。蛋白條帶表明這兩種抗體均具有完整的IgG、IgGHC和IgGLC的正常大小。圖9：通過小鼠抗CD3抗體即mu-1F3和人源化抗CD3抗體即hu-1F3來檢測(cè)還原和變性的重組CD3相關(guān)蛋白。將100ng所示抗原在4-20%tris甘氨酸凝膠上運(yùn)行，并轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。1μg/ml生物素化mu-1F3IgG(A)和生物素化hu-1F3IgG用于與膜一起孵育，并隨后與鏈霉親和素/HRP孵育。檢測(cè)是由ECL試劑進(jìn)行。Fc(K-H)表示“杵狀結(jié)構(gòu)和臼狀結(jié)構(gòu)”異源二聚化的Fc突變體。CD3εAA1-27.Fc是與人Fc融合的CD3εN-端肽(參見SEQIDNO:18)。對(duì)照肽具有與CD3εAA1-27相同的氨基酸組成但前16個(gè)氨基酸的序列順序反向(參見SEQIDNO:20)。小鼠抗CD3IgG能識(shí)別人及獼猴物種的變性CD3ε鏈以及人CD3εN端的第1-27位氨基酸。帶有反向的前16個(gè)殘基的氨基酸序列的肽并不被小鼠1F3IgG識(shí)別，表明陽性條帶是特異性的。人源化1F3抗體即hu-1F3IgG，顯示出非常相似的識(shí)別相同抗原組的模式，表明該抗體與母體小鼠1F3抗體具有相似的特異性和表位。圖10：小鼠抗人CD3抗體即mu-1F3及其人源化版本hu-1F3對(duì)人PBMC的結(jié)合的流式細(xì)胞分析。FACS染色用生物素化的IgG，隨后第二步用鏈霉親和素-PE綴合物進(jìn)行。mu-1F3和hu-1F3IgG產(chǎn)生了相似的細(xì)胞染色模式：對(duì)于T細(xì)胞而言為大的位移(2-3個(gè)log)，人PBMC中的大部分細(xì)胞。已知小鼠Fc(在mu-1F3中)缺少人Fcγ受體結(jié)合活性。因此，在低位移細(xì)胞群(0-1個(gè)log)中的輕微差異，很可能是由于hu-1F3IgG(人IgG2Fc)與PBMC制備物中的表達(dá)Fcγ受體的細(xì)胞的低親和力結(jié)合。FACS用FACScalibur儀器(BDBioscience)完成。圖11：mu-1F3和hu-1F3IgG對(duì)重組CD3ε相關(guān)蛋白的ELISA結(jié)合研究。將50μl的1μg/ml所示蛋白抗原包被于maxisorpELISA板(每孔)上。加入生物素化的mu-1F3IgG和hu-1F3IgG(0.5μg/ml在4%奶粉TBS-0.05%Tween20中)來結(jié)合固定的抗原，并隨后加入鏈霉親和素/HRP綴合物。ABTS用于顯色并在405nm處測(cè)得吸光度。對(duì)照肽Fc融合蛋白(參見SEQIDNO:20)上的ELISA對(duì)于兩種抗體均為陰性的(數(shù)據(jù)未示出)。結(jié)果表明母體小鼠抗體即mu-1F3及人源化版本即hu-1F3對(duì)不同抗原形式非常相似的結(jié)合模式，這表明該人源化抗體的特異性和表位被保留。圖12：Fab形式中人源化1F3抗體識(shí)別Jurkat細(xì)胞上的CD3。將2μg/ml濃度的帶His標(biāo)簽的Fab蛋白與Jurkat細(xì)胞孵育，并接著與小鼠抗his標(biāo)簽的抗體和抗小鼠-PE綴合物孵育。FACS在FACScalibur儀器(BDBioscience)上運(yùn)行。圖13：人源化抗CD3抗體與重組人CD3ε/δFc(K-H)異源二聚體的ELISA結(jié)合(A圖和B圖)；人源化抗CD3抗體與重組人CD3εN端第1-27位氨基酸的肽Fc融合蛋白的ELISA結(jié)合(C圖和D圖)；人源化抗CD3抗體與重組獼猴CD3ε/δFc(K+L)異源二聚體的ELISA結(jié)合(E圖和F圖)。人源化Fab蛋白在Fd的C端帶有his6標(biāo)簽，并且與96孔板的固定抗原結(jié)合的Fab用綴合了HRP的抗his6標(biāo)簽小鼠抗體檢測(cè)。ABTS用作底物并在405nm處測(cè)得吸光度。圖14：利用FACS分析EpCAMxCD3Fab融合蛋白(MSFP)與表達(dá)人CD3的Jurkat細(xì)胞的結(jié)合。通過鏈霉親和素-PE綴合物檢測(cè)與Jurkat結(jié)合的生物素化Fab和Fab融合蛋白。OKT3Fab顯示出與Jurkat上的CD3的結(jié)合，但與單獨(dú)的LC或HC和LC兩者融合的抗EpCAMscFv完全消除了OKT3Fab部分的CD3結(jié)合能力。人源化抗CD3抗體Fab即hu-1F3能結(jié)合Jurkat細(xì)胞上的CD3。與OKT3Fab融合蛋白不同，與hu-1F3LC的N端融合的抗EpCAMscFv保留了與hu-1F3Fab相似水平的結(jié)合活性；抗EpCAMscFv融合蛋白與hu-1F3Fab的LC和HC的同時(shí)融合顯示出與Jurkat細(xì)胞上CD3的陽性結(jié)合但水平降低。圖15：利用FACS分析EpCAMxCD3MSFP與人PBMC的結(jié)合。與Jurkat細(xì)胞結(jié)合的生物素化Fab和Fab融合蛋白用鏈霉親和素-PE綴合物檢測(cè)。A)與表達(dá)CD3的PBMC(T細(xì)胞)結(jié)合的OKT3Fab；與HC和LC兩者融合的抗EpCAMscFv完全消除了OKT3Fab部分的CD3結(jié)合能力。B)人源化抗CD3抗體Fab即hu-1F3.1能結(jié)合PBMC制備物中T細(xì)胞上的CD3。與OKT3Fab融合蛋白不同，抗EpCAMxhu-1F3.1Fab同時(shí)與Fab的LC和HC融合表現(xiàn)出與Jurkat細(xì)胞上CD3的陽性結(jié)合，但是該結(jié)合水平處于降低的水平。圖16：顯示了以下的ELISA結(jié)合測(cè)定：A)OKT3Fab和EpCAM1.1xOKT3雙特異性Fab融合蛋白對(duì)重組獼猴CD3ε/δ異源二聚體Fc蛋白沒有結(jié)合活性；B)OKT3Fab和雙特異性融合蛋白對(duì)重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)沒有結(jié)合活性。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素化抗體利用鏈霉親和素/HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。圖17：ELISA結(jié)合測(cè)定顯示：hu-1F3Fab和EpCAM1.1xhu-1F3.1雙特異性Fab融合蛋白(MSFP;Fabe)對(duì)以下具有陽性結(jié)合活性：A)重組獼猴CD3ε/δFc(K+H)異源二聚體蛋白；和B)重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素化抗體利用鏈霉親和素/HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。圖18：ELISA結(jié)合測(cè)定顯示：hu-1F3Fab和EpCAM1.2xhu-1F3.1MSFP對(duì)以下具有陽性結(jié)合活性：A)重組獼猴CD3ε/δFc(K+H)異源二聚體蛋白；和B)重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的標(biāo)記的融合蛋白利用鏈霉親和素/HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。圖19：ELISA結(jié)合測(cè)定顯示：hu-1F3Fab和EpCAM2.2xhu-1F3.1MSFP對(duì)以下具有陽性結(jié)合活性：A)重組獼猴CD3ε/δFc(K+H)異源二聚體蛋白；和B)重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素標(biāo)記的融合蛋白利用鏈霉親和素/HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。圖20：通過FACS分析EpCAMxCD3MSFP與在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人EpCAM(hu-EpCAM-FL)靶標(biāo)的CHO細(xì)胞的結(jié)合?？笴D3Fab如所期望地對(duì)相同的CHO細(xì)胞沒有結(jié)合。EpCAMxCD3MSFP對(duì)CHO細(xì)胞上表達(dá)的EpCAM表現(xiàn)出陽性結(jié)合。圖21：基于FACS的測(cè)定以檢測(cè)由EpCAMxCD3MSFP以腫瘤靶標(biāo)依賴的方式重新定向的PBMC(T細(xì)胞)介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷活性。在該測(cè)定中，靶細(xì)胞(在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)人EpCAM-FL的CHO細(xì)胞(A、B、D)和對(duì)照細(xì)胞(僅CHO，C)在測(cè)定前用PKH-26熒光染料(Sigma，依照生產(chǎn)商的說明書)標(biāo)記。TO-PRO-3碘化物(TP3,Invitrogen)用于在細(xì)胞殺傷測(cè)定結(jié)束時(shí)確定死細(xì)胞。在該測(cè)定中，死的靶細(xì)胞從右上象限上的計(jì)數(shù)確定(PKH-26陽性,TP3陽性)，而活的靶細(xì)胞從左上象限確定(PKH-26陽性,TP3陰性)。A)用EpCAM2.2xCD3MSFP但無PBMC孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞有約1.4%的死細(xì)胞(PKH-26標(biāo)記的TP3陽性細(xì)胞)；B)用PBMC但無MSFP孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞在PKH-26標(biāo)記的群中有約14%的死細(xì)胞(PBMC的非特異性殺傷活性)；C)用PBMC和pCAM2.2xCD3MSFP孵育(持續(xù)20小時(shí))的不表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞有約14%的死細(xì)胞(PBMC的非特異性殺傷活性)；以及D)用PBMC和示例性EpCAMxCD3MSFP孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞有約64%的死細(xì)胞計(jì)數(shù)。EpCAM2.2xCD3MSFP的腫瘤細(xì)胞靶標(biāo)依賴性的殺傷活性%為約50%(對(duì)比C和D或B和D)。圖22：利用圖18所述的FACS測(cè)定來檢測(cè)MSFP對(duì)表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞的重新定向的T細(xì)胞殺傷活性。A)OKT3Fab及其MSFP缺少明顯的重新定向的細(xì)胞裂解活性，而hu-1F3.1Fab對(duì)靶細(xì)胞沒有活性，B)EpCAM1.1xhu-1F3.1MSFP具有高水平活性，并且該活性水平即使在60pM的MSFP中仍保持很高；C)通過EpCAM1.2xhu-1F3.1MSFP檢測(cè)劑量依賴性活性；和D)檢測(cè)EpCAM2.2scFv與hu-1F3.1Fab單融合的劑量依賴細(xì)胞裂解活性。對(duì)于EpCAM2.2scFv和hu-1F3.1Fab的HC和LC兩者的雙融合而言，觀察到50%細(xì)胞群的最大殺傷，并且當(dāng)其濃度低至60pM時(shí)，其活性水平仍保持很高(約40%)。殺傷活性百分比通過從樣品測(cè)定中死細(xì)胞百分比減去對(duì)照測(cè)定中的死細(xì)胞百分比(EpCAM-CHO+PBMC+無MSFP)來計(jì)算。圖23：EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1MSFP的T細(xì)胞活化(在PBMC中)是腫瘤靶標(biāo)依賴性的。A)在存在不表達(dá)EpCAM的CHO的情況下，用EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1(30nM)孵育的PBMC，通過FACS分析CD69表達(dá)所測(cè)量的，導(dǎo)致了基礎(chǔ)水平的T細(xì)胞活化。B)在存在不表達(dá)EpCAM的CHO的情況下，用EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1(30nM，16小時(shí))孵育的PBMC，通過FACS測(cè)定檢測(cè)CD69表達(dá)所測(cè)量的，導(dǎo)致了顯著增加的T細(xì)胞活化。詳述本公開涉及多特異性Fab融合蛋白(MSFP)。具體而言，本公開的MSFP包含能結(jié)合特定的目的靶標(biāo)抗原(例如CD3、T細(xì)胞受體、NKG2D或FcγR)的Fab片段，并具有一個(gè)或兩個(gè)融合部分，所述融合部分能結(jié)合一種另外的靶標(biāo)抗原或在一些實(shí)施方案中，能結(jié)合兩種另外的靶標(biāo)抗原(例如血清白蛋白、腫瘤抗原或其它疾病相關(guān)抗原)?？深A(yù)見的是癌癥治療的有效性，包括原料藥的功效、安全性、生產(chǎn)相關(guān)成本以及給藥途徑可通過開發(fā)具有以下大部分或全部屬性的創(chuàng)新藥物來大大提高：1.使用二價(jià)的腫瘤相關(guān)抗原(TAA)結(jié)合分子相對(duì)于正常細(xì)胞增強(qiáng)的靶向腫瘤細(xì)胞的選擇性?？贵w與抗原相互作用的能量學(xué)通常通過術(shù)語親和力和親合力來表示。親合力與親和力不同，親和力是用于描述抗體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和抗原之間的單個(gè)位點(diǎn)相互作用強(qiáng)度的術(shù)語。因此，親合力是親和力的組合協(xié)同強(qiáng)度?？贵w與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合依賴于內(nèi)在的結(jié)合親和力、抗體上存在的結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量(效價(jià))和細(xì)胞上靶標(biāo)抗原的密度(Reynolds,Biochemistry18:264-9,1979)。當(dāng)使用單價(jià)抗體時(shí)，所測(cè)量的結(jié)合強(qiáng)度與親和力相關(guān)。當(dāng)使用二價(jià)或多價(jià)抗體用于細(xì)胞結(jié)合時(shí)，通常測(cè)量親合力。較高的抗原濃度通常導(dǎo)致更高的親合力。已知許多腫瘤細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞表面過表達(dá)TAA。具有兩個(gè)抗腫瘤靶標(biāo)結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MSFP能夠?qū)^表達(dá)TAA的腫瘤細(xì)胞，比對(duì)也表達(dá)相同靶標(biāo)的正常組織細(xì)胞具有選擇性更高的結(jié)合?；谟H合力原則，Adams等人成功證實(shí)利用二價(jià)抗HER2/neu抗體片段比使用相應(yīng)單價(jià)版本的相同抗體片段在腫瘤塊累積方面改善了3倍多(Adamsetal.,ClinCancerRes12:1599-1605,2006)。就腫瘤靶向而言，抗體的高親和力通常會(huì)導(dǎo)致在腫瘤塊周圍積聚而高親合力效應(yīng)導(dǎo)致抗體的更深地透入腫瘤中。2.利用雙特異性抗體相對(duì)于正常細(xì)胞增強(qiáng)的靶向腫瘤的選擇性。雙特異性試劑可出于其目的被改造以相對(duì)于正常細(xì)胞更有選擇性地結(jié)合并殺傷腫瘤細(xì)胞并最終增加超過單特異性試劑的功效和安全性(Changetal.,MolCancerTher1:553,2002;KipriyanovandLeGall,CurrOpinDrugDiscovDevel7:233,2004)。腫瘤細(xì)胞上需要存在兩種抗原和每種抗原結(jié)合臂的適當(dāng)親和力的仔細(xì)設(shè)計(jì)是該方法的關(guān)鍵方面。例如，MM-111為抗Her2和Her3的雙特異性融合蛋白，其旨在使用her2臂以將藥物靶向癌細(xì)胞并使用抗her3臂以抑制her3受體的異源二聚體化和癌細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(Robinsonetal.,BritishJournalofCancer99,1415–1425,2008)。設(shè)計(jì)MM-111所考慮的重要方面包括：1)相對(duì)受限的組織表達(dá)模式和Her2的癌細(xì)胞過表達(dá)、2)Her3的廣泛組織表達(dá)和癌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活中Her3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的至關(guān)重要性、3)對(duì)Her2的高親和力結(jié)合(1.1nM)和對(duì)Her3的低親和力結(jié)合(160nM)。在體外結(jié)合測(cè)定中，MM-111被證實(shí)對(duì)Her2/Her3雙陽性細(xì)胞的結(jié)合比對(duì)Her2單陽性細(xì)胞的結(jié)合高至9.7倍，但在高至1μM的濃度時(shí)對(duì)Her3單陽性細(xì)胞沒有可檢測(cè)到的結(jié)合(Robinsonetal.,BritishJournalofCancer99,1415–1425,2008)。因此，本公開提供了這些優(yōu)點(diǎn)和本文另外所述的其它優(yōu)點(diǎn)。具體而言，本公開的MSFP提供了明顯的優(yōu)點(diǎn)，包括但不限于以下：1)當(dāng)Fab結(jié)合融合部分時(shí)，MSFP不結(jié)合初級(jí)Fab靶標(biāo)或?qū)Τ跫?jí)Fab靶標(biāo)具有降低的結(jié)合。例如，當(dāng)Fab結(jié)合融合部分A和融合部分B時(shí)，特別是當(dāng)所述融合部分不結(jié)合其靶標(biāo)時(shí)，包含抗CD3Fab的MSFP不結(jié)合CD3或?qū)D3具有降低的結(jié)合。這降低了不需要的副作用(例如，在結(jié)合腫瘤細(xì)胞或表達(dá)Fab靶標(biāo)抗原的其它細(xì)胞之前，T細(xì)胞的不需要的一般活化)。2)二價(jià)結(jié)合或雙特異性結(jié)合增強(qiáng)了MSFP相對(duì)于正常細(xì)胞對(duì)腫瘤的選擇性。3)MSFP相對(duì)較大(約75-100KD)，從而避免了快速的腎清除率(腎清除率的過濾閾值大小為70KD)，但比普通抗體(150KD)小，從而允許提高的腫瘤組織滲透性。5)某些MSFP結(jié)合血清白蛋白的能力顯著提高了循環(huán)半衰期。6)MSFP結(jié)構(gòu)往往比僅具有scFv的融合蛋白更穩(wěn)定。在某些實(shí)施方案中，本公開的MSFP就結(jié)合特定的靶標(biāo)抗原(例如，腫瘤抗原)而言是二價(jià)的并且是雙特異性的，因?yàn)槠淠芙?jīng)由融合部分結(jié)合靶標(biāo)腫瘤抗原并經(jīng)由Fab結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合第二靶標(biāo)抗原(例如，CD3、T細(xì)胞受體、NKG2D或FcγR)，這通過激活例如，針對(duì)表達(dá)特定靶標(biāo)抗原的細(xì)胞的免疫系統(tǒng)來提高其功效。本公開的示例性MSFP包含抗CD3的Fab。然而，其他的Fab靶標(biāo)是本文特別考慮的。關(guān)于抗-CD3的Fab，迄今為止，針對(duì)TCR復(fù)合物連同T細(xì)胞活化的蛋白分子，還誘導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞因子風(fēng)暴，這可導(dǎo)致嚴(yán)重的副作用，或在不存在交聯(lián)的情況下對(duì)細(xì)胞無效。本公開的MSFP提供了抑制TCR(CD3)結(jié)合和活化的優(yōu)點(diǎn)，除非MSFP首先結(jié)合次級(jí)靶標(biāo)抗原(例如腫瘤抗原)，從而活化T細(xì)胞。在不存在所需靶細(xì)胞(例如，腫瘤細(xì)胞靶標(biāo))的情況下，這極大降低了不需要的細(xì)胞因子風(fēng)暴和不需要的T細(xì)胞活化。以下描述僅是為了說明本公開的各種實(shí)施方案。因此，所討論的具體修改并不旨在限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)顯而易見的是在不背離本文呈現(xiàn)的主題的精神或范圍的情況下，可作出各種等同物、變化和修改，并且應(yīng)理解這些等同的實(shí)施方案應(yīng)包括在本文中。除非明確指示相反，否則本發(fā)明的實(shí)施將采用病毒學(xué)、免疫學(xué)、微生物學(xué)、分子生物學(xué)和本領(lǐng)域技術(shù)范圍內(nèi)的重組DNA技術(shù)的常規(guī)方法，出于說明的目的其中有許多方法在以下描述。此類技術(shù)在參見例如以下的文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋。CurrentProtocolsinMolecularBiologyorCurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.(2009);Ausubeletal.,ShortProtocolsinMolecularBiology,3rded.,Wiley&Sons,1995;SambrookandRussell,MolecularCloning:ALaboratoryManual(3rdEdition,2001);Maniatisetal.MolecularCloning:ALaboratoryManual(1982);DNACloning:APracticalApproach,vol.I&II(D.Glover,ed.);OligonucleotideSynthesis(N.Gait,ed.,1984);NucleicAcidHybridization(B.Hames&S.Higgins,eds.,1985);TranscriptionandTranslation(B.Hames&S.Higgins,eds.,1984);AnimalCellCulture(R.Freshney,ed.,1986);Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning(1984)和其它類似的參考文獻(xiàn)。如本說明書和所附權(quán)利要求中所使用的，除非上下文另外明確說明，否則單數(shù)形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括復(fù)數(shù)形式。本說明書從始至終，除非上下文另有要求，否則詞語“包含”、或其變化形式例如“包括”或“含有”將被理解為暗含所指出的成分或整數(shù)，或成分或整數(shù)的組，但不排除任何其他成分或整數(shù)或成分或整數(shù)的組。除非另外明確說明，否則本說明書中的每個(gè)實(shí)施方案在細(xì)節(jié)上作必要修改后應(yīng)適用于每個(gè)其他的實(shí)施方案?？墒褂弥亟MDNA、寡核苷酸合成以及組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化(例如，電穿孔、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染)的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。酶促反應(yīng)和純化技術(shù)可根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行，或如本領(lǐng)域通常進(jìn)行的或如本文所述的來進(jìn)行。這些及相關(guān)技術(shù)和程序一般可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的和本說明書所引用或討論的多種一般參考文獻(xiàn)和更具體的參考文獻(xiàn)中所描述的常規(guī)方法來進(jìn)行。除非提供具體定義，否則與本文所述的分子生物學(xué)、分析化學(xué)、合成有機(jī)化學(xué)、以及醫(yī)學(xué)和藥物化學(xué)結(jié)合使用的術(shù)語及其實(shí)驗(yàn)室程序和技術(shù)，為本領(lǐng)域熟知且常用的那些?？梢允褂弥亟M技術(shù)、分子生物學(xué)、微生物學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制和遞送以及患者治療的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。本文所用的多肽的“C端”是指該多肽的最后一個(gè)氨基酸殘基，其貢獻(xiàn)其胺基與其鄰接氨基酸殘基的羧基形成肽鍵。本文所用的多肽的“N端”是指該多肽的第一個(gè)氨基酸，其貢獻(xiàn)其羧基與其鄰接氨基酸殘基的胺基形成肽鍵。本文所用的術(shù)語“共價(jià)連接”是指通過一個(gè)或多個(gè)化學(xué)鍵的直接連接或通過一個(gè)或多個(gè)接頭的間接連接。任何合適的化學(xué)鍵可用于產(chǎn)生直接連接，包括但不限于，諸如肽鍵和二硫鍵的共價(jià)鍵，諸如氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華鍵的非共價(jià)鍵?！肮矁r(jià)鍵”在本文是指共享一個(gè)或多個(gè)電子的兩個(gè)原子之間的穩(wěn)定結(jié)合。共價(jià)鍵的實(shí)例包括但不限于，肽鍵和二硫鍵。本文所用“肽鍵”是指氨基酸的羧基和相鄰氨基酸的胺基之間形成的共價(jià)鍵。本文所用“二硫鍵”是指兩個(gè)硫原子之間形成的共價(jià)鍵。二硫鍵可通過兩個(gè)硫醇基團(tuán)的氧化來形成。在某些實(shí)施方案中，共價(jià)連接是通過共價(jià)鍵直接連接。在某些實(shí)施方案中，共價(jià)連接是通過肽鍵或二硫鍵直接連接。本文“非共價(jià)鍵”是指兩個(gè)分子或兩個(gè)化學(xué)基團(tuán)之間不涉及電子共享的吸引相互作用。非共價(jià)鍵的實(shí)例包括但不限于氫鍵、疏水鍵、離子鍵和范德華鍵。本文“氫鍵”是指第一分子/基團(tuán)的氫原子和第二分子/基團(tuán)的負(fù)電性原子之間的吸引力。本文“疏水鍵”是指導(dǎo)致疏水分子/基團(tuán)或非極性分子/基團(tuán)在水環(huán)境中聚集或結(jié)合在一起的力。本文“離子鍵”是指正離子和負(fù)離子之間的吸引。本文“范德華鍵”是指在電子分布中有瞬間隨機(jī)波動(dòng)的兩個(gè)相鄰的分子/基團(tuán)之間非特異性的吸引力。在某些實(shí)施方案中，非共價(jià)連接是通過非共價(jià)鍵的直接連接。在某些實(shí)施方案中，非共價(jià)連接是通過氫鍵、疏水鍵、離子鍵或范德華鍵的直接連接。結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)，若其以例如大于或等于約105M-1的親和力或Ka(即以1/M為單位的特定結(jié)合相互作用的平衡結(jié)合常數(shù))結(jié)合或連結(jié)靶標(biāo)分子，則其“特異性結(jié)合”靶標(biāo)分子。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其融合蛋白)以大于或等于約106M-1、107M-1、108M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或1013M-1的Ka結(jié)合靶標(biāo)?！案哂H和力”結(jié)合結(jié)構(gòu)域(或其單鏈融合蛋白)是指具有至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1、至少1013M-1或更大的Ka的那些結(jié)合結(jié)構(gòu)域?；蛘?，親和力可定義為以M的單位的特定結(jié)合相互作用的平衡解離常數(shù)(Kd)(例如，10-5M至10-13M，或更小)。根據(jù)本公開，結(jié)合結(jié)構(gòu)域多肽和融合蛋白的親和力可以容易地利用常規(guī)技術(shù)來測(cè)定(參見例如，Scatchardetal.(1949)Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660和美國(guó)專利第5283173號(hào)；第5468614號(hào)或等同物)。本文所用術(shù)語“衍生物”是指化合物(例如，蛋白)的化學(xué)或生物學(xué)修飾版本，其在結(jié)構(gòu)上與母體化合物相似并且(實(shí)際上或理論上)可來源于該母體化合物。術(shù)語“空間位阻”是指由于其大小或空間排列產(chǎn)生的分子之間結(jié)合相互作用的阻礙或妨礙。術(shù)語“親合力”是用來描述多鍵相互作用的組合強(qiáng)度的術(shù)語。親合力與親和力不同，親和力是用于描述單鍵強(qiáng)度的術(shù)語。就抗體而言，親合力是指其中多個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)同時(shí)與靶標(biāo)相互作用的抗體相互作用。單獨(dú)來看，每個(gè)結(jié)合相互作用可很容易被破壞，然而，當(dāng)多個(gè)結(jié)合相互作用同時(shí)存在時(shí)，單個(gè)位點(diǎn)的短暫解開并不允許分子擴(kuò)散，而且該位點(diǎn)的結(jié)合很可能會(huì)被恢復(fù)。整體效應(yīng)是抗原與抗體的協(xié)同的、強(qiáng)烈的結(jié)合。多特異性Fab融合蛋白本公開提供了包含F(xiàn)ab片段(例如基本結(jié)構(gòu)NH2-VL-CL-S-S-CH1-VH-NH2)的多特異性Fab融合蛋白(MSFP，在附圖中也被稱作Fabe，其中Fab能結(jié)合免疫效應(yīng)分子，例如CD3ε鏈、T細(xì)胞受體、NKG2D或FcγR)，所述Fab融合蛋白具有在VL的N末端連接的第一融合部分和/或在VH的N末端連接的第二融合部分。在所述融合部分和VH、VL之間可以有接頭，其任選為蛋白酶可切割的。該通式是基本結(jié)構(gòu)，可以基于該基本結(jié)構(gòu)建立以構(gòu)建更復(fù)雜的同源二聚體多特異性Fab融合蛋白復(fù)合物，這取決于所用的融合部分，如以下進(jìn)一步描述的。在本申請(qǐng)之前，對(duì)在Fab的重鏈和輕鏈兩者的N端均具有融合部分的基于Fab的融合蛋白尚無描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，此類融合蛋白會(huì)嚴(yán)重削弱Fab的結(jié)合親和力并因此使其在幾乎不可用。在MSFP中觀察到在結(jié)合結(jié)構(gòu)域與Fab的N端融合時(shí)，該降低結(jié)合的一般概念。例如，OKT3抗-CD3Fab的N端融合顯著降低了與Fab靶標(biāo)的結(jié)合并導(dǎo)致雙特異性Fab融合蛋白的生物活性的幾乎完全喪失。然而，出乎意料的是抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域與hu-1F3.1(人源化抗-CD3Fab)的N端的融合，在一些情況下并不導(dǎo)致與Fab靶標(biāo)的結(jié)合的顯著喪失。在一些情況下，與細(xì)胞表面靶標(biāo)結(jié)合的喪失比與可溶性蛋白靶標(biāo)結(jié)合的喪失更顯著。在一些其它的情況下，結(jié)合的喪失并不導(dǎo)致生物活性的喪失。與此相反，對(duì)T細(xì)胞上CD3具有較低結(jié)合親和力的MSFP可能具有更高的生物活性。盡管這很出乎意料，但其強(qiáng)調(diào)了至少但不限于以下兩個(gè)因素的重要性：1)通過與腫瘤細(xì)胞高結(jié)合(利用融合部分A和B的結(jié)合結(jié)構(gòu)域)，MSFP表現(xiàn)出高親合力以克服Fab部分與T細(xì)胞結(jié)合的低親和力，從而誘導(dǎo)殺傷；2)因?yàn)镺KT3Fab融合蛋白表現(xiàn)與抗CD3抗體，即1F3衍生的MSFP完全不同，所以其是高度抗體依賴性的，因而是表位依賴性的。本公開的MSFP用來源于與1F3識(shí)別的CD3ε表位結(jié)合的抗體及其人源化變體制成，其具有許多獨(dú)特的特征并且這些特征可用于開發(fā)具有所需屬性(在藥物安全性、藥效和可生產(chǎn)性方面)的人類治療劑。如本文所述，該屬性有利地用于本公開的MSFP以掩飾Fab結(jié)合直至MSFP處于適當(dāng)?shù)沫h(huán)境(例如，在腫瘤附近)中。MSFP的特異性結(jié)構(gòu)組分在以下部分更詳細(xì)地描述。MSFP的功能將在以下標(biāo)題為“多特異性Fab融合蛋白的功能”的部分更詳細(xì)地描述。Fab片段如上所示，本文公開的多特異性Fab融合蛋白在其核心包含F(xiàn)ab片段。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，F(xiàn)ab片段是抗體的抗原結(jié)合片段。Fab由免疫球蛋白重鏈和免疫球蛋白輕鏈的一個(gè)恒定區(qū)和一個(gè)可變區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)和可變區(qū)與輕鏈恒定區(qū)和可變區(qū)異源二聚體化并且通常由重鏈和輕鏈恒定區(qū)之間的二硫鍵共價(jià)連接(參見例如，圖1的示意圖)。因此，就抗體而言，本文所用的“Fab”通常是指抗體的由單個(gè)輕鏈(可變區(qū)和恒定區(qū))通過二硫鏈與單個(gè)重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)連接組成的一部分。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到的，重鏈和輕鏈之間的二硫鍵是優(yōu)選的，但對(duì)于功能不是必需的(Orcutt,etal.(2010),PEDS,23:221-228)。因此，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的Fab片段可不包含二硫鍵。在這方面，重鏈和輕鏈可以以這樣的方式進(jìn)行改造，從而在無需二硫鍵的情況下穩(wěn)定地相互作用。例如，在某些實(shí)施方案中，可改造重鏈或輕鏈以去除半胱氨酸殘基，并且其中重鏈和輕鏈仍然穩(wěn)定地相互作用并如Fab一樣發(fā)揮功能。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行突變以促進(jìn)重鏈和輕鏈之間穩(wěn)定的相互作用。例如，可用“杵入臼”遺傳改造策略來促進(jìn)Fab的重鏈和輕鏈之間的二聚化(參見例如1996ProteinEngineering,9:617–621)。利用該策略，“杵狀結(jié)構(gòu)”通過在相互作用結(jié)構(gòu)域之間的界面處用較大的氨基酸側(cè)鏈取代小的氨基酸側(cè)鏈來產(chǎn)生。相應(yīng)的“臼狀結(jié)構(gòu)”是通過在相互作用分子之間的界面處用小的側(cè)鏈替代大的側(cè)鏈來實(shí)現(xiàn)。因此，還考慮用于本文的是出于特定目的而設(shè)計(jì)變異Fab片段，例如在CH1和/或CL的恒定結(jié)構(gòu)域中的氨基酸改變，以及二硫鍵的去除或用于純化的標(biāo)簽的添加等。在另一個(gè)實(shí)施方案中，F(xiàn)ab片段中可變區(qū)和恒定區(qū)的結(jié)構(gòu)可與天然Fab存在的結(jié)構(gòu)不同。換句話說，在一個(gè)實(shí)施方案中，可變區(qū)和恒定區(qū)的方向在一條鏈中可為VH-CL而在另一條鏈中可為VL-CH1(Shaeferetal.(2011),PNAS,108:111870-92)。此類修飾的Fab片段仍然能結(jié)合其特定的靶標(biāo)抗原，并考慮用于本發(fā)明的MSFP中。因此，在這方面，組成Fab的可變區(qū)和恒定區(qū)被認(rèn)為是模塊化的。在某些實(shí)施方案中，本公開的Fab片段來源于單克隆抗體并且可來源于任何類型的抗體，包括IgA、IgM、IgD、IgG、IgE及其亞型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。輕鏈結(jié)構(gòu)域可來源于κ鏈或λ鏈。本文所用的Fab片段可通過重組制備。如本領(lǐng)域內(nèi)所公知的，抗體為免疫球蛋白分子，其能通過位于免疫球蛋白分子可變區(qū)的至少一個(gè)表位識(shí)別位點(diǎn)特異性地結(jié)合靶標(biāo)(例如碳水化合物、多核苷酸、脂質(zhì)，多肽等)。本文所用的該術(shù)語不僅包括完整的多克隆抗體或單克隆抗體，還包括人源化抗體、嵌合抗體以及包含所需特異性的抗原結(jié)合位點(diǎn)或片段(表位識(shí)別位點(diǎn))的任何其它修飾結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子。本文所公開的Fab片段包含抗原結(jié)合部分，其由免疫球蛋白重鏈可變區(qū)和免疫球蛋白輕鏈可變區(qū)(VH和VL)組成。更具體地，本文所用術(shù)語“抗原結(jié)合部分”是指包含免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的能結(jié)合目的靶標(biāo)抗原(如CD3分子)的至少一個(gè)CDR的多肽片段。在這方面，本文所述的多特異性Fab融合蛋白中的抗原結(jié)合部分可包含母體抗體的VH和VL序列的能結(jié)合目的靶標(biāo)抗原的1、2、3、4、5或所有6個(gè)CDR。在某些實(shí)施方案中，MSFP中Fab片段的抗原結(jié)合部分能結(jié)合CD3。在某些實(shí)施方案中，本文所述的MSFP的特異性VH和/或VL可用于篩選互補(bǔ)可變區(qū)的文庫(kù)以確定具有所需性質(zhì)(例如對(duì)目的靶標(biāo)抗原的增加的親和力)的VH/VL。此類方法描述于，例如Portolanoetal.,J.Immunol.(1993)150:880-887；Clarksonetal.,Nature(1991)352:624-628中。其它方法也可用于混合并匹配CDR以鑒定具有期望結(jié)合活性的Fab(如結(jié)合CD3，或?qū)τ贛SFP的融合部分中存在的其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域，為本文所述的其它目的靶標(biāo)抗原)。例如：Klimkaetal.,BritishJournalofCancer(2000)83:252-260，描述了利用小鼠VL文庫(kù)和人VH文庫(kù)的篩選過程，其從小鼠VH保留了CDR3和FR4。在獲得抗體后，針對(duì)人VL文庫(kù)篩選VH以獲得結(jié)合抗原的抗體。Beiboeretal.,J.Mol.Biol.(2000)296:833-849描述了利用完整的小鼠重鏈文庫(kù)和人輕鏈文庫(kù)的篩選過程。在獲得抗體后，將一條VL與保留小鼠CDR3的人VH文庫(kù)組合。獲得能夠結(jié)合抗原的抗體。Raderetal.,PNAS(1998)95:8910-8915描述了與以上的Beiboeretal相似的過程。這些剛剛描述的技術(shù)本身是本領(lǐng)域已知的。但是技術(shù)人員能夠利用此類技術(shù)，利用本領(lǐng)域的常規(guī)方法來獲得本文所述的本公開的一些實(shí)施方案的抗體的抗原結(jié)合片段。本文還公開了用于獲得特異性針對(duì)靶標(biāo)抗原(例如CD3或本文其他地方所述的為融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域靶標(biāo)的任何靶標(biāo)抗原)的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的方法，所述方法包括通過在本文所示的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列中添加、缺失、替代或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸來提供VH結(jié)構(gòu)域(其為本文所示的VH結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列變體)，任選地將因而提供的VH結(jié)構(gòu)域與一種或多種VL結(jié)構(gòu)域組合，并測(cè)試所述VH結(jié)構(gòu)域或一個(gè)或多個(gè)VH/VL組合以鑒定特定的結(jié)合成員或特異性針對(duì)目的靶標(biāo)抗原(例如CD3)的抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并任選地具有一種或多種所需性質(zhì)。VL結(jié)構(gòu)域可具有基本上如本文所示的氨基酸序列。在將本文公開的VL結(jié)構(gòu)域的一種或多種序列變體與一種或多種VH結(jié)構(gòu)域組合中可以采用類似的方法。“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”(本文中可互換使用)抗體或多肽的表位是本領(lǐng)域熟知的術(shù)語，并且測(cè)定這種特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合的方法也為本領(lǐng)域所熟知。如果與其他細(xì)胞或物質(zhì)相比，分子與特定的細(xì)胞或物質(zhì)更頻繁、更快速、更持久和/或更具親和力地反應(yīng)或結(jié)合，則稱該分子表現(xiàn)出“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”。如果抗體或其Fab或scFv與靶標(biāo)的結(jié)合比其與其他物質(zhì)的結(jié)合更具親和力、親合力、更快速和/更持久，則該抗體其Fab或scFv“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”靶標(biāo)。例如，特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合CD3表位的抗體為結(jié)合一種CD3表位比其結(jié)合其他CD3表位或非CD3表位更具親和力、親合力、更快速和/更持久的抗體。通過閱讀該定義還應(yīng)理解，例如，特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合第一靶標(biāo)的抗體(或部分或表位)可以或不可以特異性結(jié)合或優(yōu)先結(jié)合第二靶標(biāo)。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”并不一定需要(雖然可包括)排他性結(jié)合。一般(但不必然是)，提到結(jié)合意為優(yōu)先結(jié)合。免疫結(jié)合通常是指發(fā)生在免疫球蛋白分子和抗原之間的非共價(jià)的相互作用類型，所述免疫球蛋白由于(例如，通過說明而非限制的方式)靜電、離子、親水性和/或疏水性吸引或排斥、空間力、氫鍵、范德華力和其他相互作用是特異性的。免疫結(jié)合相互作用的強(qiáng)度或親和力可表示為相互作用的解離常數(shù)(Kd)，其中越小KD表示越大的親和力。選定多肽的免疫結(jié)合特性可用本領(lǐng)域熟知的方法進(jìn)行定量。一種此類方法需要測(cè)量抗原結(jié)合位點(diǎn)/抗原復(fù)合物形成和解離的速率，其中那些速率取決于復(fù)合物伴侶的濃度、相互作用的親和力和在兩個(gè)方向上同樣影響速率的幾何參數(shù)。因此，“結(jié)合速率常數(shù)”(Kon)可通過計(jì)算濃度和實(shí)際的結(jié)合速率來確定，并且“解離速率常數(shù)”(Koff)可通過實(shí)際的解離速率來確定。因此Koff/Kon之比等于解離常數(shù)KD。一般參見Daviesetal.(1990)AnnualRev.Biochem.59:439-473。術(shù)語“抗原”是指分子或分子的一部分，其能被選擇性結(jié)合劑(如Fab片段的抗原結(jié)合部分)結(jié)合，并且還能用于在動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生能與該抗原的表位結(jié)合的抗體?？乖删哂幸粋€(gè)或多個(gè)表位。術(shù)語“表位”包括任何決定簇，在某些實(shí)施方案中，為能夠與免疫球蛋白或T細(xì)胞受體特異性結(jié)合的多肽決定簇。表位是能被抗體或其抗原結(jié)合片段結(jié)合的抗原區(qū)域。在某些實(shí)施方案中，表位決定簇包括分子的化學(xué)活性表面基團(tuán)，例如氨基酸或者糖側(cè)鏈、磷?；蚧酋；⑶以谀承?shí)施方案中可具有特定的三維結(jié)構(gòu)特性和/或特定的電荷特性。在某些實(shí)施方案中，當(dāng)MSFP優(yōu)先識(shí)別其在蛋白和/或大分子的復(fù)雜混合物中的靶標(biāo)抗原時(shí)，其被認(rèn)為能特異性地結(jié)合該抗原。當(dāng)平衡解離常數(shù)≤10-5、10-6或10-7M時(shí)，MSFP被認(rèn)為能特異性地結(jié)合抗原。在一些實(shí)施方案中，平衡解離常數(shù)可以≤10-8M或≤10-9M。在其它一些實(shí)施方案中，平衡解離常數(shù)可以≤10-10M或≤10-11M。在某些實(shí)施方案中，本文所述的Fab片段的抗原結(jié)合片段分別包含間插在重鏈框架區(qū)(FR)組和輕鏈框架區(qū)(FR)組之間的重鏈CDR組和輕鏈CDR組，所述框架區(qū)(FR)組提供了對(duì)CDR的支撐并限定了CDR相對(duì)于彼此的空間關(guān)系。本文所述術(shù)語“CDR組”是指重鏈V區(qū)或輕鏈V區(qū)的三個(gè)高變區(qū)。從重鏈或輕鏈的N端開始，這些區(qū)域分別表示為“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此抗原結(jié)合位點(diǎn)包含六個(gè)CDR，包含來自重鏈V區(qū)和輕鏈V區(qū)各自的CDR組。包含單個(gè)CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文被稱為“分子識(shí)別單元”。很多抗原抗體復(fù)合物的晶體分析已證明CDR的氨基酸殘基與結(jié)合抗原形成廣泛的接觸，其中最廣泛的抗原接觸是與重鏈CDR3的接觸。因此，分子識(shí)別單位主要負(fù)責(zé)抗原結(jié)合位點(diǎn)的特異性。本文所用術(shù)語“FR組”是指構(gòu)架重鏈V區(qū)或輕鏈V區(qū)的CDR組的CDR的四條側(cè)翼氨基酸序列。一些FR殘基可接觸結(jié)合的抗原；然而FR主要負(fù)責(zé)使V區(qū)折疊成抗原結(jié)合位點(diǎn)，尤其是直接鄰近CDR的FR殘基。在FR之內(nèi)，某些氨基酸殘基和某些結(jié)構(gòu)特征是非常高度保守的。在這方面，所有V區(qū)序列均包含90個(gè)氨基酸殘基左右的內(nèi)部二硫環(huán)。當(dāng)V區(qū)折疊成結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，CDR表現(xiàn)為形成抗原結(jié)合表面的突出環(huán)基序。公認(rèn)的是，有保守的FR結(jié)構(gòu)區(qū)，其影響CDR環(huán)折疊成某些“經(jīng)典”結(jié)構(gòu)的形狀----而與精確的CDR氨基酸序列無關(guān)。此外，已知某些FR殘基參與了非共價(jià)的域間接觸，其穩(wěn)定了抗體重鏈和輕鏈之間的相互作用。免疫球蛋白可變區(qū)的結(jié)構(gòu)和位置可通過參考Kabat,E.A.etal.,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.第4版.USDepartmentofHealthandHumanServices.1987及其更新(目前可在互聯(lián)網(wǎng)(immuno.bme.nwu.edu)上獲得)來確定?！皢慰寺】贵w”是指均一的抗體群，其中所述單克隆抗體由參與表位的選擇性結(jié)合的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)組成。單克隆抗體是高度特異性的，直接針對(duì)單一表位。術(shù)語“單克隆抗體”不僅包括完整的單克隆抗體和全長(zhǎng)單克隆抗體，還包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、單鏈(ScFv)、其變體、包含抗原結(jié)合部分的融合蛋白、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體、以及任何其它修飾結(jié)構(gòu)的免疫球蛋白分子(其包含所需特異性和能結(jié)合表位的抗原結(jié)合片段(表位識(shí)別位點(diǎn)))。這并非意圖限制抗體的來源或其制備的方式(例如通過雜交瘤、噬菌體選擇、重組表達(dá)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等)。所述術(shù)語包括上述“抗體”定義范圍內(nèi)的完整免疫球蛋白及片段等。蛋白水解酶---木瓜蛋白酶優(yōu)先切割I(lǐng)gG分子以產(chǎn)生幾個(gè)片段，其中兩個(gè)(F(ab)片段)各自均包含含有完整的抗原結(jié)合位點(diǎn)的共價(jià)異源二聚體。胃蛋白酶能夠切割I(lǐng)gG分子以提供幾個(gè)片段，包括含有兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)的F(ab')2片段。本發(fā)明的某些實(shí)施方案使用的Fv片段可通過IgM的優(yōu)先蛋白水解切割以及IgG或IgA免疫球蛋白分子的偶然發(fā)生來產(chǎn)生。然而，F(xiàn)v片段更通常使用本領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)得到。Fv片段包括非共價(jià)的VH::VL異源二聚體，其包含保留了天然抗體分子的大部分抗原識(shí)別能力和結(jié)合能力的抗原結(jié)合位點(diǎn)。Inbaretal.(1972)Proc.Nat.Acad.Sci.USA69:2659-2662;Hochmanetal.(1976)Biochem15:2706-2710和Ehrlichetal.(1980)Biochem19:4091-4096。在本公開的一個(gè)具體的實(shí)施方案中，F(xiàn)ab片段能結(jié)合CD3?！癟細(xì)胞受體”(TCR)是T細(xì)胞表面上存在的分子，其與CD3一起，通常負(fù)責(zé)識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體(MHC)分子結(jié)合的抗原。在大部分T細(xì)胞中，其由二硫鍵連接的高度可變的(α)和(β)鏈的異二聚體組成。在其他的T細(xì)胞中，表達(dá)由可變Y鏈和(δ)鏈組成的另一種受體。TCR的每一條鏈?zhǔn)敲庖咔虻鞍壮易宓某蓡T并且具有一個(gè)N端免疫球蛋白可變區(qū)、一個(gè)免疫球蛋白恒定區(qū)、一個(gè)跨膜區(qū)和位于C末端的短的胞質(zhì)尾區(qū)。(參見AbbasandLichtman,CellularandMolecularImmunology(第五版),Editor:Saunders,Philadelphia,2003;Janewayetai,Immunobiology:TheImmuneSysteminHealthandDisease,第四版,CurrentBiologyPublications,p148,149,and172,1999)。本公開中使用的TCR可來自不同的動(dòng)物物種，包括人、小鼠、大鼠或其他哺乳動(dòng)物。“抗-TCRFab”或“抗-TCRFabe”，是指能特異性結(jié)合TCR分子或其單獨(dú)的鏈(例如TCR(α)鏈、TCR(β)鏈、TCRY鏈或TCR(δ)鏈)之一的Fab或包含此類Fab的MSFP。在某些實(shí)施方案中，抗-TCRFab能結(jié)合TCR(α)鏈、TCR(β)鏈或兩者?！癈D3”在本領(lǐng)域已知為六條鏈的多蛋白復(fù)合物(參見AbbasandLichtman,2003;Janewayetal.,p172and178,1999)。在哺乳動(dòng)物中，該復(fù)合物包含CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈、兩條CD3(ε)鏈和CD3(ζ)鏈的同源二聚體。CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈和CD3(ε)鏈為包含單個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白超家族的高度相關(guān)的細(xì)胞表面蛋白。CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈和CD3(ε)鏈的跨膜區(qū)是帶負(fù)電的，這是允許這些鏈與帶正電的T細(xì)胞受體鏈結(jié)合的特征。CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈和CD3(ε)鏈的胞內(nèi)尾各自均包含一個(gè)被稱作基于免疫受體酪氨酸活化基序或ITAM的保守基序，而每條CD3(ζ)鏈均含有三個(gè)。不希望受到理論的限制，認(rèn)為ITAM對(duì)TCR復(fù)合物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)能力是很重要的。本公開所用的CD3可來自不同的動(dòng)物物種，包括人、小鼠、大鼠或其他的哺乳動(dòng)物。本文所用“抗-CD3Fab”，是指能特異性結(jié)合單獨(dú)的CD3鏈(例如CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈或CD3(ε)鏈)或由兩條或更多條單獨(dú)的CD3鏈形成的復(fù)合物(例如一條以上CD3(ε)鏈的復(fù)合物、CD3(γ)鏈和CD3(ε)鏈的復(fù)合物、CD3(δ)鏈CD3(ε)鏈的復(fù)合物)的Fab。在某些實(shí)施方案中，抗CD3Fab能特異性結(jié)合CD3(γ)、CD3(δ)或CD3(ε)或其任何組合，在某些實(shí)施方案中，能特異性結(jié)合TCR(ε)。在一個(gè)實(shí)施方案中，抗CD3Fab能結(jié)合CD3ε的N端。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，抗CD3Fab能結(jié)合CD3ε的第1-27位氨基酸。本文所用“TCR復(fù)合物”是指CD3與TCR結(jié)合所形成的復(fù)合物。例如，TCR復(fù)合物可由一條CD3(γ)鏈、一條CD3(δ)鏈、兩條CD3(ε)鏈、CD3(ζ)鏈的同源二聚體、一條TCR(α)鏈和一條TCR(β)鏈組成?；蛘撸琓CR復(fù)合物可由一條CD3(γ)鏈、一條CD3(δ)鏈、兩條CD3(ε)鏈、CD3(ζ)鏈的同源二聚體、一條TCRY鏈和一條TCR(δ)鏈組成。本文所用“TCR復(fù)合物的組分”是指TCR鏈(即TCR(α)、TCR(β)、TCRY或TCR(δ))、CD3鏈(即CD3(γ)、CD3(δ)、CD3(ε)或CD3(ζ))、或由兩條或更多條TCR鏈或CD3鏈形成的復(fù)合物(例如TCR(α)和TCR(β)的復(fù)合物、TCRY和TCR(δ)的復(fù)合物、CD3(ε)和CD3(δ)的復(fù)合物、CD3(γ)和CD3(ε)的復(fù)合物、或TCR(α)、TCR(β)、CD3(γ)、CD3(δ)、和兩條CD3(ε)鏈的亞TCR復(fù)合物)。通過背景的方式，TCR復(fù)合物一般負(fù)責(zé)啟動(dòng)對(duì)與MHC分子結(jié)合的抗原的T細(xì)胞應(yīng)答。認(rèn)為肽：MHC配體與TCR和共受體(即，CD4或CD8)的結(jié)合將TCR復(fù)合物、共受體和CD45酪氨酸磷酸酶聚集在一起。這允許CD45去除抑制性磷酸基團(tuán)，從而活化Lck和Fyn蛋白激酶。這些蛋白激酶的活化導(dǎo)致CD3(ζ)鏈上ITAM的磷酸化，其依次致使這些鏈能夠結(jié)合胞內(nèi)酪氨酸激酶ZAP-70。結(jié)合的ZAP-70通過磷酸化的后續(xù)活化觸發(fā)3條信號(hào)通路，其中兩條由PLC-(γ)的磷酸化和活化啟動(dòng)，然后其將磷脂酰肌醇磷酸鹽(PIP)切割為二酰基甘油(DAG)和三磷酸肌醇(IP3)。通過DAG活化的蛋白激酶C導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子NFKB的活化。由于IP3作用而導(dǎo)致的胞內(nèi)游離Ca2+的突然增加活化了胞質(zhì)磷酸酶--鈣調(diào)磷酸酶，其能使轉(zhuǎn)錄因子NFAT(活化T細(xì)胞的核因子)從細(xì)胞質(zhì)易位至細(xì)胞核中。NFAT的全轉(zhuǎn)錄活性也需要AP-1家族轉(zhuǎn)錄因子的成員；Fos和Jun家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的成員的二聚體。由活化的ZAP-70啟動(dòng)的第三條信號(hào)通路為Ras的活化和MAP激酶級(jí)聯(lián)的后續(xù)活化。這最終導(dǎo)致Fos蛋白的活化和由此AP-1轉(zhuǎn)錄因子的活化。NFKB，NFAT和AP-1共同作用于T細(xì)胞染色體，啟動(dòng)新的基因轉(zhuǎn)錄，其導(dǎo)致T細(xì)胞的分化、增殖和效應(yīng)作用。參見Janewayetal.,p178,1999。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab能特異性地結(jié)合單獨(dú)的人CD3鏈(例如，人CD3(γ)鏈、人CD3(δ)鏈和人CD3(ε)鏈)或兩種或兩種以上單獨(dú)的人CD3鏈的組合(例如，人CD3(γ)和人CD3(ε)的復(fù)合物或人CD3(δ)和人CD3(ε)的復(fù)合物)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，F(xiàn)ab能特異性結(jié)合人CD3(ε)鏈。在某些其它實(shí)施方案中，本公開的Fab能特異性結(jié)合TCR(α)、TCR(β)、或由TCR(α)和TCR(β)形成的異二聚體。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab能特異性地結(jié)合人TCR(α)、人TCR(β)、或由人TCR(α)和人TCR(β)形成的異源二聚體中的一種或多種。在某些實(shí)施方案中，本公開的Fab能結(jié)合由一條或多條CD3鏈和一條或多條TCR鏈形成的復(fù)合物，例如由CD3(γ)鏈、CD3(δ)鏈、CD3(ε)鏈、TCR(α)鏈或TCR(β)鏈或以上的任何組合形成的復(fù)合物。在其它實(shí)施方案中，本公開的Fab能結(jié)合由一條CD3(γ)鏈、一條CD3(δ)鏈、兩條CD3(ε)鏈、一條TCR(α)鏈和一條TCR(β)鏈形成的復(fù)合物。在其它實(shí)施方案中，本公開的Fab能結(jié)合由一條或多條人CD3鏈和一條或多條人TCR鏈形成的復(fù)合物，例如由人CD3(γ)鏈、人CD3(δ)鏈、人CD3(ε)鏈、人TCR(α)鏈或人TCR(β)鏈或以上的任何組合形成的復(fù)合物。在某些實(shí)施方案中，本公開的Fab能結(jié)合由一條人CD3(γ)鏈、一條人CD3(δ)鏈、兩條人CD3(ε)鏈、一條人TCR(α)鏈和一條人TCR(β)鏈形成的復(fù)合物。可如本文所述或通過本領(lǐng)域已知的多種方法來產(chǎn)生本公開的Fab(參見例如美國(guó)專利第6,291,161號(hào);第6,291,158號(hào))。Fab的來源包括來自不同物種的單克隆抗體核酸序列(其可以被轉(zhuǎn)換為抗體、Fv、scFv或Fab，例如在噬菌體文庫(kù)中)，包括人、駱駝科動(dòng)物抗體(來自駱駝、單峰駱駝或美洲駝；Hamers-Castermanetal.(1993)Nature,363:446和Nguyenetal.(1998)J.MoI.Biol.,275:413)、鯊魚(Rouxetal.(1998)Proc.Nat'l.Acad.Sci.(USA)95:11804)、魚(Nguyenetal.(2002)Immunogenetics,54:39)、嚙齒動(dòng)物、鳥類、或羊。與猴CD3有交叉反應(yīng)性的抗人CD3抗體是特別理想的，例如SP34小鼠單克隆抗體，其能特異性結(jié)合變性形式的人CD3(免疫印跡或斑點(diǎn)印跡)和天然形式的人CD3(在T細(xì)胞上)(Pressano,S.TheEMBOJ.4:337-344,1985;Alarcon,B.EMBOJ.10:903-912,1991)。SP34小鼠單克隆抗體還能結(jié)合單獨(dú)轉(zhuǎn)染了CD3ε的COS細(xì)胞以及CD3ε/γ或CD3ε/δ雙重轉(zhuǎn)染子(SalmeronA.etal.,J.Immunol.147:3047-52,1991)。SP34抗體還與非人靈長(zhǎng)類交叉反應(yīng)(YoshinoN.etal.,Exp.Anim49:97-110,2000;ConradML.etal.,Cytometry71A:925-33,2007)。另外，當(dāng)交聯(lián)時(shí)，SP34活化T細(xì)胞(Yangetal.,J.Immunol.137:1097-1100,1986)。與猴CD3的交叉反應(yīng)性是很重要的，因?yàn)檫@允許直接利用臨床候選物在非人靈長(zhǎng)類中進(jìn)行毒性研究，而不是在黑猩猩中進(jìn)行或使用替代分子進(jìn)行。因此，利用本公開的MSFP中此類交叉反應(yīng)性抗-CD3Fab的毒性研究提供了更相關(guān)的安全評(píng)估。其它示例性抗CD3抗體包括Cris-7單克隆抗體(Reinherz,E.L.etal.(eds.),LeukocytetypingII.,SpringerVerlag,NewYork,(1986))、BC3單克隆抗體(Anasettietal.(1990)J.Exp.Med.172:1691)、OKT3(OrthomulticenterTransplantStudyGroup(1985)N.Engl.J.Med.313:337)及以上的衍生物如OKT3ala-ala(Heroldetal.(2003)J.Clin.Invest.11:409)、維西珠單抗(Visilizumab)(Carpenteretal.(2002)Blood99:2712)以及145-2C11單克隆抗體(Hirschetal.(1988)J.Immunol.140:3766)?？紤]用于本文中的其它CD3結(jié)合分子包括UCHT-1(Beverley,PCandCallard,R.E.(1981)Eur.J.Immunol.11:329–334)和WO2004/106380；WO2010/037838；WO2008/119567；WO2007/042261；WO2010/0150918中描述的CD3結(jié)合分子。示例性抗TCR抗體是H57單克隆抗體(Lavasanietal.(2007)ScandinavianJournalofImmunology65:39-47)。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab能結(jié)合其他細(xì)胞表面靶標(biāo)，包括但不限于FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIa、NKG2D、CD25、CD28、CD137、CTLA-4、FAS、FGFR1、FGFR2、FGFR3、FGFR4、GITR、LTβR、TLR、TRAIL受體1、TRAIL受體2、EGFR、Her2/neu和ErbB3。Fab片段的抗原結(jié)合片段的序列(例如，重鏈和輕鏈可變區(qū)序列)可在公共數(shù)據(jù)庫(kù)獲得，或利用傳統(tǒng)的雜交瘤開發(fā)策略使用CD3鏈、TCR組分，或其它Fab結(jié)合靶標(biāo)作為常規(guī)系統(tǒng)中的免疫原(例如，小鼠、HuMAb小鼠(R)、TC小鼠(TM)、KM-小鼠(R)、美洲駝、雞、大鼠、倉(cāng)鼠、兔子等可用于開發(fā)本文所用的Fab)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，F(xiàn)ab片段可用本領(lǐng)域中已知的多種技術(shù)產(chǎn)生，包括抗體展示技術(shù)，例如噬菌體、酵母、核糖體和mRNA展示技術(shù)；B細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)如SLAM技術(shù)；或利用針對(duì)從經(jīng)免疫動(dòng)物受試對(duì)象或經(jīng)免疫人受試對(duì)象中分離出來的B細(xì)胞或血漿B細(xì)胞的高通量基因測(cè)序技術(shù)。用于本公開的MSFP的示例性Fab包括VH、Fd、HC、VL和LC氨基酸序列，以及編碼它們的多核苷酸，如SEQIDNO:29-76中所示，包括其CDR，例如SEQIDNO:23-28所示的那些。融合部分本文所述的MSFP的融合部分不僅為MSFP提供其它的結(jié)合特異性和/或功能屬性(例如，增加的血清半衰期、活化ADCC或其它免疫活化級(jí)聯(lián))，還產(chǎn)生了空間位阻以顯著降低Fab與其靶標(biāo)抗原的結(jié)合，除非另有打算(例如在存在腫瘤細(xì)胞的情況下)，尤其是Fab與細(xì)胞表面上的靶標(biāo)，特別是接近細(xì)胞膜并因此具有受限的可及性的Fab靶標(biāo)抗原(尤其是CD3)的結(jié)合。這與其它Fab融合蛋白形成鮮明對(duì)比，例如TRIBODIESTM，其在Fab片段的C端融合了另外的結(jié)合結(jié)構(gòu)域(參見例如,JournalofImmunology,2000,165:7050–7057)。此外，在單個(gè)MSFP內(nèi)，第一融合部分和第二融合部分并不意圖二聚化。這將本公開的MSFP與其它已知的融合蛋白(例如WO2008/024188和WO2009/149185中所描述的那些)區(qū)別開來?！?88和‘185出版物中所描述的構(gòu)建體區(qū)別在于具有VH1-VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3和VL1-VL2-CL的通用格式。在此構(gòu)建體中，VH1和VL1二聚化以形成另外的抗原結(jié)合位點(diǎn)。這不同于本文所述的MSFP(例如圖7B所示)的形式。在本公開的MSFP中，第一融合部分和第二融合部分不結(jié)合形成單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)。如本文其他部分所述，MSFP的另一個(gè)明顯特征在于，當(dāng)MSFP不在諸如細(xì)胞表面靶標(biāo)的靶標(biāo)上成簇時(shí)，融合部分降低了Fab對(duì)其靶標(biāo)的結(jié)合親和力。反之，WO2008/024188和WO2009/149185中所描述的蛋白并不顯示出對(duì)抗體結(jié)合靶標(biāo)降低的結(jié)合親和力。本公開的MSFP的融合部分可包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域、一個(gè)或多個(gè)功能結(jié)構(gòu)域或其組合。如圖1所示，在一個(gè)實(shí)施方案中，本公開的MSFP包含兩個(gè)融合部分，如圖1中融合部分A和融合部分B所示。所述融合部分在本文還可被稱為第一融合部分和第二融合部分，或類似的語言以將一種與另一種區(qū)分開來。示例性融合部分包含SEQIDNO:78、88和94中所示的氨基酸序列，由SEQIDNO:77、87和93所示的多核苷酸編碼，或其CDR、VH或VL(參見例如SEQIDNo:139-150)。在某些實(shí)施方案中，第一融合部分和第二融合部分是相同的。在其它實(shí)施方案中，兩個(gè)融合部分包含相同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但在其他方面不同，可在具有或缺乏功能結(jié)構(gòu)域方面有所不同。在其它實(shí)施方案中，第一融合部分包含能結(jié)合第一靶標(biāo)抗原的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域，而第二融合部分包含能結(jié)合第二靶標(biāo)抗原的第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，第一融合部分和第二融合部分每種均包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域，并且這些結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以分別被稱為第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中,第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的靶標(biāo)。在這方面，在某些實(shí)施方案中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域在靶標(biāo)共享至少一種相似性的層面來說能結(jié)合相同的靶標(biāo)，所述相似性例如但不限于，靶標(biāo)均包含相同的蛋白、多核苷酸或脂質(zhì)；靶標(biāo)是相同的蛋白，盡管可以是不同的剪接形式；或者在某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)具有相同的氨基酸序列，盡管可以具有不同的修飾，例如糖基化。在某些實(shí)施方案中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的靶標(biāo)，但是是在相同靶標(biāo)的不同表位上。在某些實(shí)施方案中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域與第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合不同的靶標(biāo)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，第一融合部分包含第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域而第二融合部分包含第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域，其中所述第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和所述第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合相同的靶標(biāo)分子但是是不同的形式(例如，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能結(jié)合細(xì)胞表面受體的scFv而第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)樗鍪荏w的配體；或類似地，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域是能結(jié)合配體的scFv，而第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域是所述配體的受體的胞外結(jié)構(gòu)域)。結(jié)合結(jié)構(gòu)域如上所述，在某些實(shí)施方案中，第一融合部分和/或第二融合部分包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域。本公開的“結(jié)合結(jié)構(gòu)域”或“結(jié)合區(qū)”，例如，可以是具有特異性識(shí)別并結(jié)合生物分子(例如，細(xì)胞表面受體或腫瘤蛋白或其組分)能力的任何蛋白、多肽、寡肽或肽。結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括任何針對(duì)目的生物分子的天然存在的、合成的、半合成的、或重組產(chǎn)生的結(jié)合伴侶。例如如本文進(jìn)一步所述，結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為抗體輕鏈和重鏈可變區(qū)的區(qū)域，或輕鏈和重鏈可變區(qū)的區(qū)域可以以任一方向(例如，VL-VH或VH-VL)一同連接在一條鏈中。用于鑒定本公開的能特異性結(jié)合特定靶標(biāo)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多種測(cè)定是已知的，包括免疫印跡、ELISA、流式細(xì)胞術(shù)、或表面等離子共振分析(例如，使用BIACORETM分析)。示例性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)⒃谝韵逻M(jìn)一步地描述。在某些實(shí)施方案中，靶標(biāo)分子可為細(xì)胞表面表達(dá)的蛋白，如受體或腫瘤抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，被本文所用的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的靶標(biāo)分子是可溶性抗原如細(xì)胞因子、白蛋白或其它血清蛋白。示例性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括免疫球蛋白抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域，如scFv、scTCR、受體的胞外結(jié)構(gòu)域、細(xì)胞表面分子/受體的配體或其受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及腫瘤結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為scFv、VH、VL、結(jié)構(gòu)域抗體變體(dAB)、駱駝科動(dòng)物抗體(VHH)、纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域變體、錨蛋白重復(fù)序列變體和來源于其他蛋白支架的其他抗原特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域。因此，在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含抗體來源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，但可為非抗體來源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域?？贵w來源的結(jié)合結(jié)構(gòu)域可為抗體片段或一種或多種抗體片段的遺傳改造的產(chǎn)物，所述片段參與與抗原的結(jié)合。實(shí)例包括但不限于，互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)、可變區(qū)(Fv)、重鏈可變區(qū)(VH)、輕鏈可變區(qū)(VL)、重鏈、輕鏈、單鏈可變區(qū)(scFv)、Fab、單域駱駝抗體(駱駝科VHH)和單域抗體(dAB)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解和本文其它地方所描述的，完整的抗體包含兩條重鏈和兩條輕鏈。每條重鏈由可變區(qū)以及第一恒定區(qū)、第二恒定區(qū)和第三恒定區(qū)組成，而每條輕鏈由可變區(qū)和恒定區(qū)組成。哺乳動(dòng)物重鏈分為α、δ、ε、γ和μ，而哺乳動(dòng)物輕鏈分為λ或κ。包含α、δ、ε、γ和μ重鏈的免疫球蛋白分為免疫球蛋白(Ig)A、IgD、IgE、IgG和IgM。完整的抗體形成“Y”形。Y的莖由結(jié)合在一起的兩條重鏈的第二恒定區(qū)和第三恒定區(qū)(并且對(duì)于IgE和IgM，是第四恒定區(qū))組成，并且二硫鍵(鏈間)在鉸鏈內(nèi)形成。重鏈γ、α和δ具有由三個(gè)串聯(lián)(排成一行)Ig結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)和用于增加柔性的鉸鏈區(qū)。重鏈μ和ε具有由四個(gè)免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域組成的恒定區(qū)。第二恒定區(qū)和第三恒定區(qū)分別被稱為“CH2結(jié)構(gòu)域”和“CH3結(jié)構(gòu)域”。Y的每個(gè)臂包括單一重鏈的可變區(qū)和第一恒定區(qū)，其與單一輕鏈的可變區(qū)和恒定區(qū)結(jié)合。輕鏈和重鏈的可變區(qū)負(fù)責(zé)抗原結(jié)合。與抗體有關(guān)的“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”指的是在抗體的重鏈或輕鏈可變區(qū)中的高變環(huán)。CDR可與抗原結(jié)構(gòu)相互作用并在很大程度上決定與抗原的結(jié)合(盡管已知一些構(gòu)架區(qū)參與結(jié)合)。重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)各自均包含3個(gè)CDR。CDR可通過常規(guī)方法來限定或鑒定，如通過Kabatetal的序列(Wu,TTandKabat,E.A.,JExpMed.132(2):211-50,(1970);Borden,P.andKabatE.A.,PNAS,84:2440-2443(1987);Kabat,E.A.etal,Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,PublishedbyDIANEPublishing,1992)，或通過Chothiaetal的結(jié)構(gòu)(Choithia,C.andLesk,A.M.,JMol.Biol.,196(4):901-917(1987),Choithia,C.etal,Nature,342:877-883(1989))。與抗體有關(guān)的“重鏈可變區(qū)”或“VH”是指重鏈的片段，其包含間插在稱為框架區(qū)的側(cè)翼節(jié)段之間的三個(gè)CDR，框架區(qū)比CDR更加保守并形成支架以支撐CDR。與抗體有關(guān)的“輕鏈可變區(qū)”或“VL”是指包含間插在框架區(qū)之間的三個(gè)CDR的輕鏈片段。與抗體有關(guān)的“Fv”是指抗體的攜帶完整抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小片段。Fv片段由與單一重鏈的可變區(qū)結(jié)合的單一輕鏈的可變區(qū)組成。與抗體有關(guān)的“單鏈Fv抗體”或“scFv”是指改造的抗體，其由彼此直接連接或經(jīng)由肽接頭序列連接的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)組成。如本文所用的“單域駱駝抗體”或“駱駝科動(dòng)物VHH”是指重鏈抗體的已知最小的抗原結(jié)合單元(Koch-Nolte,etal,FASEBJ.,21:3490-3498(2007))。“重鏈抗體”或“駱駝科動(dòng)物抗體”是指包含兩個(gè)VH結(jié)構(gòu)域但無輕鏈的抗體(RiechmannL.etal,J.Immunol.Methods231:25–38(1999);WO94/04678;WO94/25591;美國(guó)專利第6,005,079號(hào))?！皢斡蚩贵w”或“dAB”指由抗體重鏈的可變區(qū)(VH結(jié)構(gòu)域)，或抗體輕鏈的可變區(qū)(VL結(jié)構(gòu)域)組成的抗體片段(Holt,L.,etal,TrendsinBiotechnology,21(11):484-490)。本文所用術(shù)語“二硫鍵”是指重鏈片段和輕鏈片段通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵的結(jié)合。一個(gè)或多個(gè)二硫鍵可在兩個(gè)片段之間通過連接兩個(gè)片段中的硫醇基團(tuán)而形成。在某些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)二硫鍵可分別在重鏈片段和輕鏈片段的一個(gè)或多個(gè)半胱氨酸之間形成?！翱勺儏^(qū)連接序列”是這樣的氨基酸序列，其將重鏈可變區(qū)與輕鏈可變區(qū)連接并提供了與兩個(gè)亞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的相互作用兼容的隔離功能，使得所得多肽保留了與包含相同輕鏈和重鏈可變區(qū)的抗體一樣的對(duì)相同靶標(biāo)分子的特異性結(jié)合親和力。在某些實(shí)施方案中，用于連接結(jié)合結(jié)構(gòu)域與免疫球蛋白CH2區(qū)多肽或CH3區(qū)多肽的鉸鏈可用作可變區(qū)連接序列(參見本文其他地方對(duì)鉸鏈的進(jìn)一步討論)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含非抗體組分。能結(jié)合抗原的非抗體組分可為能識(shí)別并結(jié)合目的靶標(biāo)抗原的任何合適的蛋白結(jié)構(gòu)域或組分，諸如例如，參與蛋白-蛋白相互作用、蛋白-脂質(zhì)相互作用、蛋白-多核苷酸相互作用、蛋白-糖相互作用或配體結(jié)合的蛋白結(jié)構(gòu)域。合適的非抗體組分的實(shí)例包括但不限于，纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域(Fn3)、錨蛋白重復(fù)序列和Adnectin。本公開的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的替代來源包括編碼隨機(jī)肽文庫(kù)的序列或編碼替代性非抗體支架環(huán)區(qū)中工程化多樣性的氨基酸的序列，所述替代性非抗體支架如纖維蛋白原結(jié)構(gòu)域(參見例如，Weiseletal.(1985)Science230:1388)、Kunitz結(jié)構(gòu)域(參見例如，美國(guó)專利第6,423,498號(hào))、脂質(zhì)運(yùn)載蛋白結(jié)構(gòu)域(參見例如，WO2006/095164)、V樣結(jié)構(gòu)域(參見例如，美國(guó)專利申請(qǐng)公開號(hào)2007/0065431)、C-型凝集素結(jié)構(gòu)域(Zelensky和Gready(2005)FEBSJ.272：6179)或FCAB(TM)(參見例如，PCT專利申請(qǐng)公開號(hào)WO2007/098934，WO2006/072620)等。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含F(xiàn)n3結(jié)構(gòu)域。本文所用“纖連蛋白3結(jié)構(gòu)域”或“Fn3”是指纖連蛋白中參與結(jié)合生物分子的自主折疊單元(Calaycay,J.etal,J.Biol.Chem.,260(22):12136-41(1985);Koide,A.etal,J.Mol.Biol.,284(4):1141-1151(1998);Bloom,L.etal,DrugDiscoveryToday,14(19-20):949-955(2009))。Fn3結(jié)構(gòu)域可存在于多種蛋白中并且發(fā)現(xiàn)Fn3結(jié)構(gòu)域的不同重復(fù)序列含有生物分子(如DNA和蛋白)的結(jié)合位點(diǎn)。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含adnectin。本文所用“Adnectin”是指基于Fn3結(jié)構(gòu)域的遺傳改造蛋白(Koide,A.etal,MethodsMol.Biol.,352:95-109(2007))。Adnectin中的Fn3結(jié)構(gòu)域包含模仿了抗體可變區(qū)的三個(gè)CDR的三個(gè)環(huán)，并且可被遺傳改造用于特異性結(jié)合不同的靶標(biāo)分子。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域包含錨蛋白重復(fù)序列。本文所用“錨蛋白重復(fù)序列”是指含有紅細(xì)胞錨蛋白中存在的33個(gè)氨基酸殘基的重復(fù)序列的蛋白組分(Davis,L.H.etal,J.Biol.Chem.,266(17):11163-11169(1991))。已知錨蛋白重復(fù)序列為具有不同功能的大量蛋白中出現(xiàn)的最常見的蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)中的一種。如圖中所示，scFv是特別有代表性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。用作融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的scFv可結(jié)合多種靶標(biāo)分子的任何一種，所述靶標(biāo)分子包括但不限于FcγRI、FCγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、CD28、CD137、CTLA-4、FAS、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)、FGFR2、FGFR3、FGFR4、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)(GITR)蛋白、淋巴毒素-β受體(LTβR)、Toll樣受體(TLR)、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體1(TRAIL受體1)和TRAIL受體2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)蛋白、前列腺干細(xì)胞抗原(PSCA)蛋白、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA；也被稱為人腫瘤壞死因子受體超家族成員17(TNFRSF17)和CD269)、腫瘤相關(guān)蛋白碳酸酐酶IX(CAIX)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)、表皮生長(zhǎng)因子受體1(EGFR1)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her2/neu;Erb2)、ErbB3、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、葉酸受體、肝配蛋白受體、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合腫瘤抗原。示例性腫瘤抗原靶標(biāo)分子包括但不限于，p53、cMet、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A10、MAGE-A12、BAGE、DAM-6、DAM-10、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-8、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7B、NA88-A、NY-ESO-1、BRCA1、BRCA2、MART-1、MC1R、Gp100、PSA、PSM、酪氨酸酶、威姆氏瘤抗原(WT1)、TRP-1、TRP-2、ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、Her2/neu、hTERT、hTRT、iCE、MUC1、MUC2、PRAME、P15、RU1、RU2、SART-1、SART-3、WT1、AFP、β-連環(huán)蛋白/m、半胱天冬酶-8/m、CEA、CDK-4/m、ELF2M、GnT-V、G250、HSP70-2M、HST-2、KIAA0205、MUM-1、MUM-2、MUM-3、Myosin/m、RAGE、SART-2、TRP-2/INT2、707-AP、膜聯(lián)蛋白II、CDC27/m、TPI/mbcr-abl、ETV6/AML、LDLR/FUT、Pml/RARα和TEL/AML1。這些和其他的腫瘤蛋白對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是已知的。可用于本公開MSFP的融合部分的其他結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括能結(jié)合細(xì)胞表面受體的配體。示例性配體包括但不限于，針對(duì)以下細(xì)胞表面受體的配體：如CD28、CD137、CTLA-4、FAS、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)、FGFR2、FGFR3、FGFR4、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的TNFR相關(guān)(GITR)蛋白、淋巴毒素-β受體(LTβR)、Toll樣受體(TLR)、腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體1(TRAIL受體1)和TRAIL受體2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)的蛋白、前列腺干細(xì)胞抗原(PSMA)蛋白、B細(xì)胞成熟抗原(BCMA，也稱為人腫瘤壞死因子受體超家族成員17(TNFRSF17)和CD269)、腫瘤相關(guān)蛋白碳酸酸酐酶IX(CAIX)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體(HGFR)、表皮生長(zhǎng)因子受體1(EGFR1)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(Her2/neu;ERB2)、ErbB3、上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)、葉酸受體、肝配蛋白受體、CD19、CD20、CD30、CD33、CD40、CD37、CD38和CD138。在一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合血清白蛋白。結(jié)合人血清白蛋白提供將蛋白藥物的半衰期(t1/2)延長(zhǎng)至數(shù)天或更長(zhǎng)時(shí)間的潛能。本領(lǐng)域已知血清白蛋白結(jié)合或與血清白蛋白融合可顯著延長(zhǎng)治療性分子的半衰期。在某些實(shí)施方案中，能結(jié)合人血清白蛋白的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能夠與非人靈長(zhǎng)類直向同源物交叉反應(yīng)，從而允許在與人體內(nèi)治療更相關(guān)的臨床前動(dòng)物毒理學(xué)研究中評(píng)估藥物的半衰期。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域能特異性地結(jié)合與疾病病癥相關(guān)的抗原靶標(biāo)。所述疾病病癥可包括生理病癥、病理病癥和整容病癥。示例性病癥的實(shí)例包括但不限于，癌癥、炎性疾病、異體移植、I型糖尿病、II型糖尿病和多發(fā)性硬化癥。在某些實(shí)施方案中，抗原靶標(biāo)與病癥負(fù)相關(guān)。在某些實(shí)施方案中，抗原靶標(biāo)由包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MSFP的結(jié)合可滅活或拮抗抗原靶標(biāo)的生物學(xué)功能，從而改善病癥。在某些實(shí)施方案中，抗原靶標(biāo)由包含結(jié)合結(jié)構(gòu)域的MSFP的結(jié)合將激活或拮抗抗原靶標(biāo)的生物學(xué)功能，從而改善病癥。因此本文描述的MSFP可為融合部分靶標(biāo)抗原的激動(dòng)劑或拮抗劑分子。示例性結(jié)合結(jié)構(gòu)域提供于SEQIDNO：78、88、94(氨基酸)和SEQIDNO：77、87、93(多核苷酸)中并包括其CDR、VH和VL(參見例如SEQIDNO：139-150)。因此，本文所述的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能特異性地結(jié)合任何合適的抗原靶標(biāo)。如前所述，合適的抗原靶標(biāo)的實(shí)例包括但不限于，TNF受體(ShenH.M.etal,FASEBJ.20(10):1589-98(2006))、cMet(Bottaro,D.P.etal,Science,251(4995):802-804(1991))、CD3(ChettyR.etal,JPathol.,173(4):303-7(1994))、CD40(ChatzigeorgiouA.etal,Biofactors.,35(6):474-83(2009))、DR3(MeylanF.etal,Immunity.,29(1):79-89(2008))、FcγR(TorkildsenO.etal,ActaNeurolScandSuppl.183:61-3(2006))、NKG2D(ObeidyP.etal,IntJBiochemCellBiol.,41(12):2364-7(2009))或以上的任何衍生物。在某些實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域能特異性結(jié)合單一靶標(biāo)抗原。在另一個(gè)實(shí)施方案中，結(jié)合結(jié)構(gòu)域與一種以上的抗原靶標(biāo)是交叉反應(yīng)的。本文所用“交叉反應(yīng)性”是指結(jié)合結(jié)構(gòu)域能特異性地結(jié)合一種以上的抗原靶標(biāo)。在某些實(shí)施方案中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與完全不同的抗原靶標(biāo)(例如，丙型肝炎病毒核心蛋白和宿主來源的GOR蛋白)具有交叉反應(yīng)性。在某些實(shí)施方案中，第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和/或第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以與來自不同物種的抗原靶標(biāo)(例如，來自人、小鼠或非人靈長(zhǎng)類的蛋白的抗原)具有交叉反應(yīng)性。融合部分A、融合部分B和Fab之間的接合處在某些實(shí)施方案中，融合部分A和/或融合部分B與Fab的VH或VL的N端直接連接(即，之間沒有添加另外的氨基酸)。在其它實(shí)施方案中，融合部分A和/或融合部分B利用接頭連接至Fab的VH或VL的N端(具有如下所述的另外的氨基酸)。在一些實(shí)施方案中，可能需要從給定融合部分A和/或融合部分B的C端去除數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3個(gè)氨基酸或1-10個(gè)氨基酸；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸)，這取決于Fab靶標(biāo)和細(xì)胞表面上Fab靶標(biāo)的周圍空間(細(xì)胞表面上Fab靶標(biāo)的可及性)。在其它實(shí)施方案中，可能需要從Fab的重鏈和/或輕鏈的N端去除數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3個(gè)氨基酸或1-10個(gè)氨基酸；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸)。在其它實(shí)施方案中，可能需要從融合部分的C端去除數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3個(gè)氨基酸或1-10個(gè)氨基酸；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸)，并同時(shí)從Fab鏈的N端去除數(shù)個(gè)氨基酸(例如1-3個(gè)氨基酸或1-10個(gè)氨基酸；例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)氨基酸)。融合部分A、融合部分B和Fab片段之間接合處的長(zhǎng)度和序列可以相同或不同。融合部分和Fab片段之間的接合處可根據(jù)需要使用缺失和接頭的組合。如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，F(xiàn)ab和融合部分之間的接合處可因此進(jìn)行調(diào)整，并利用本領(lǐng)域已知和本文所述的方法來測(cè)試所需的功能(例如，結(jié)合親和力)。接頭本公開的MSFP還可包含位于Fab片段的VH和VL以及融合部分A和B之間的接頭(參見例如，圖1)。示例性接頭包含序列GlyArgAla。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合部分和FabVH或VL之間的接頭長(zhǎng)度為1-10個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，融合部分和FabVH或VL之間的接頭長(zhǎng)度為1-20個(gè)氨基酸或20個(gè)氨基酸。在這方面，接頭的長(zhǎng)度可以為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)氨基酸。在其它實(shí)施方案中，接頭的長(zhǎng)度可以為21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)氨基酸。在某些實(shí)施方案中，適用于本文所述的MSFP的連頭為柔性接頭。合適的接頭能夠被容易地選擇并可以為適合的不同長(zhǎng)度的任何一種，例如1個(gè)氨基酸(例如Gly)-20個(gè)氨基酸、2個(gè)氨基酸-15個(gè)氨基酸、3個(gè)氨基酸-12個(gè)氨基酸、包括4個(gè)氨基酸-10個(gè)氨基酸、5個(gè)氨基酸-9個(gè)氨基酸、6個(gè)氨基酸-8個(gè)氨基酸、或7個(gè)氨基酸-8個(gè)氨基酸，并且可以為1、2、3、4、5、6或7個(gè)氨基酸。示例性的柔性接頭包括甘氨酸聚合物(G)n、甘氨酸-絲氨酸聚合物(包括例如，(GS)n、(GSGGS)n(SEQIDNO：125)和(GGGS)n(SEQIDNO：126)，其中n是至少1的整數(shù))、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-絲氨酸聚合物以及本領(lǐng)域已知的其它柔性接頭。甘氨酸和甘氨酸-絲氨酸聚合物是相對(duì)非結(jié)構(gòu)化的，并且因此可能能夠作為組分之間的中性接頭。甘氨酸明顯比丙氨酸接近更多的phi-psi空間，而且比具有較長(zhǎng)側(cè)鏈的殘基更少受限(參見Scheraga,Rev.ComputationalChem.11173-142(1992))。示例性柔性接頭包括但不限于Gly-Gly-Ser-Gly(SEQIDNO:127)、Gly-Gly-Ser-Gly-Gly(SEQIDNO:128)、Gly-Ser-Gly-Ser-Gly(SEQIDNO:129),Gly-Ser-Gly-Gly-Gly(SEQIDNO:130)、Gly-Gly-Gly-Ser-Gly(SEQIDNO:131),Gly-Ser-Ser-Ser-Gly(SEQIDNO:132)等。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到MSFP的設(shè)計(jì)可包括全部或部分柔性的接頭，使得所述接頭可包含柔性接頭以及賦予更少柔性結(jié)構(gòu)以提供所需的MSFP結(jié)構(gòu)的一個(gè)或多個(gè)部分。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab和融合部分之間的接頭為穩(wěn)定接頭(不被蛋白酶切割，特別是MMP)。在某些實(shí)施方案中，接頭為肽接頭。在某些實(shí)施方案中，MSFP包含穩(wěn)定的肽接頭，并且所述肽接頭的N端共價(jià)連接至融合部分的C端，并且所述肽接頭的C端共價(jià)連接至抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的N端。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭為可切割的接頭。具體而言，F(xiàn)ab的VH或VL和融合部分之間的接頭包含蛋白酶底物切割序列，例如MMP底物切割序列。熟知的底物肽序列PLGLAG(SEQIDNO:133)可被大多數(shù)MMP切割?？梢员籑MP切割的底物序列已被廣泛研究。例如，PLGLAG(SEQIDNO:133)的序列可被大多數(shù)MMP切割。蛋白酶底物切割序列是指可被蛋白酶處理切割的肽序列。MMP底物序列是指可通過與MMP孵育來切割的肽序列。PLGLAG(SEQIDNO:133)是常用的MMP底物切割序列(參見例如Jiang,PNAS(2004)101:17867-72;Olson,PNAS(2010)107:4311-6)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，蛋白酶切割位點(diǎn)被MMP-2、MMP-9或其組合識(shí)別。在其它實(shí)施方案中，蛋白酶位點(diǎn)包含選自GPLGMLSQ(SEQIDNO:134)和GPLGLWAQ(SEQIDNO:135)的序列。穩(wěn)定的接頭或蛋白酶不可切割的接頭是指不屬于已知的蛋白酶底物序列并因此在與蛋白酶孵育后不會(huì)導(dǎo)致明顯的切割產(chǎn)物形成的接頭肽序列。在一些實(shí)施方案中，接頭的切割底物(或切割序列)可包含能夠作為蛋白酶(通常是胞外蛋白酶)的底物的氨基酸序列。在其它實(shí)施方案中，切割序列包含能夠形成二硫鍵的半胱氨酸-半胱氨酸對(duì)，其可通過還原劑的作用被切割。在其它實(shí)施方案中，切割序列包含能夠在光解作用后被切割的底物。切割底物定位在接頭中使得當(dāng)所述切割底物被切割劑切割(例如接頭的切割底物被蛋白酶切割和/或半胱氨酸-半胱氨酸二硫鍵通過暴露于還原劑的還原而斷裂)或由光誘導(dǎo)的光解作用切割時(shí)，在存在靶標(biāo)的情況下，產(chǎn)生具有本文所述的多種功能特性的切割產(chǎn)物。接頭的切割底物可根據(jù)共定位于患病組織的蛋白酶來選擇，或根據(jù)表達(dá)融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的目的靶標(biāo)抗原的細(xì)胞表面進(jìn)行選擇。目的靶標(biāo)與蛋白酶共定位的多種不同的條件是已知的，其中所述蛋白酶的底物是本領(lǐng)域已知的。在癌癥的實(shí)例中，靶標(biāo)組織可為癌變組織，特別是實(shí)體瘤的癌變組織。文獻(xiàn)中已有報(bào)道，在多種癌癥(例如實(shí)體瘤)中具有升高水平的底物已知的蛋白酶。參見例如，LaRoccaetal,(2004)BritishJ.ofCancer90(7):1414-1421。疾病的非限制性實(shí)例包括：所有類型的癌癥(乳腺癌、肺癌、結(jié)腸直腸癌、前列腺癌、頭頸癌、胰腺癌等)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、克羅恩病、黑色素瘤、SLE、心血管損傷、局部缺血等。此外，抗血管生成的靶標(biāo)，例如VEGF是已知的。據(jù)此，如果選擇本公開MSFP的融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使其能夠結(jié)合腫瘤抗原，則接頭的合適的底物切割序列應(yīng)為這樣的序列，其包含可被存在于癌治療部位的蛋白酶(特別是與非癌組織相比在癌治療部位水平升高的蛋白酶)切割的肽底物。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，MSFP的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合例如Her2，并且切割底物序列可為基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)底物，并由此可被MMP切割。在其它實(shí)施方案中，MSFP中融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域能結(jié)合目的靶標(biāo)，并且存在于接頭中的切割底物可以為，例如，豆莢蛋白、纖溶酶、TMPRSS-3/4、MMP-9、MT1-MMP、組織蛋白酶、半胱天冬酶、人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、β-分泌酶、uPA或PSA。在其它實(shí)施方案中，切割底物由癌癥以外的疾病(如多發(fā)性硬化或類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎)中的其它疾病特異性的蛋白酶切割。未修飾或未切割的接頭可允許Fab片段與融合部分連接。當(dāng)接頭被切割時(shí)，可產(chǎn)生如本文進(jìn)一步描述，例如圖中的具有多種功能的多種切割產(chǎn)物。MSFP的接頭(例如，F(xiàn)ab的VH和第一融合部分之間的接頭以及Fab的VL和第二融合部分之間的接頭)可包含相同的切割底物或可包含不同的切割底物，例如，第一接頭可包含第一切割底物并且第二接頭可包含第二切割底物。第一切割底物和第二切割底物可以為相同酶的不同底物(例如對(duì)酶表現(xiàn)出不同的結(jié)合親和力)，或?yàn)椴煌傅牟煌孜?，或者第一切割底物可以為酶底物而第二切割底物可為光解底物，或者在第一切割底物可以為酶底物而第二切割底物可為還原底物等。對(duì)于酶的特異性切割，形成酶和切割底物之間的接觸。當(dāng)包含通過第一和第二接頭(具有切割底物)與第一融合部分和第二融合部分偶聯(lián)的Fab的MSFP，在存在足夠的酶活性的情況下時(shí)，所述切割底物可被切割。足夠的酶活性可以指酶與具有切割底物的接頭接觸并實(shí)現(xiàn)切割的能力。可很容易設(shè)想的是酶可以在MSFP的附近但由于其他細(xì)胞因子或酶的蛋白修飾而不能切割。示例性底物可包括但不限于可被以下的酶或蛋白酶中的一種或多種切割的底物：ADAM10；半胱天冬酶8、組織蛋白酶S、MMP8、ADAM12、半胱天冬酶9、FAP、MMP9、ADAM17、半胱天冬酶10、顆粒酶B、MMP-13、ADAMTS、半胱天冬酶11、Guanidinobenzoatase(GB)、MMP14、ADAMTS5、半胱天冬酶12、Hepsin、MT-SP1、BACE、半胱天冬酶13、人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶腦啡肽酶(HNE)、半胱天冬酶、半胱天冬酶14、豆莢蛋白、NS3/4A、半胱天冬酶1、組織蛋白酶、蛋白裂解酶2、纖溶酶、半胱天冬酶2、組織蛋白酶A、Meprin、PSA、半胱天冬酶3、組織蛋白酶B、MMP1、PSMA、半胱天冬酶4、組織蛋白酶D、MMP2、TACE、半胱天冬酶5組織蛋白酶E、MMP3、TMPRSS3/4、半胱天冬酶6、組織蛋白酶K、MMP7、uPA、半胱天冬酶7、MT1-MMP。在另一個(gè)實(shí)施方案中，切割底物可包含半胱氨酸對(duì)的二硫鍵，其因此可被還原劑切割，所述還原劑諸如例如，但不限于細(xì)胞還原劑如谷胱甘肽(GSH)、硫氧還蛋白、NADPH、黃素類、抗壞血酸鹽等，可大量存在于實(shí)體瘤組織中或?qū)嶓w瘤周圍。用于本文可切割接頭中的其他合適的蛋白酶切割位點(diǎn)為本領(lǐng)域已知或者可利用諸如Turketal.,2001NatureBiotechnology19,661-667描述的那些方法來鑒定。在某些實(shí)施方案中，接頭可為肽接頭、含硫醇?xì)埢碾慕宇^(例如半胱氨酸殘基)、聚合物接頭或化學(xué)接頭。在某些實(shí)施方案中，MSFP包含接頭，其中所述接頭的一端與融合部分的C-端共價(jià)連接，而所述接頭的另一端與Fab片段的VH或VL的N端共價(jià)連接。接合氨基酸在某些實(shí)施方案中，在MSFP的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間(例如在結(jié)合結(jié)構(gòu)域和接頭多肽之間)可有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基，例如由融合蛋白的構(gòu)建設(shè)計(jì)產(chǎn)生的氨基酸殘基(例如在編碼單鏈多肽的核酸分子的構(gòu)建過程中，由利用限制酶位點(diǎn)產(chǎn)生的氨基酸殘基)。如本文所述，此類氨基酸殘基可被稱為“接合氨基酸”或“接合氨基酸殘基”或“肽間隔基”。在某些示例性實(shí)施方案中，肽間隔基為1-5個(gè)氨基酸、5-10個(gè)氨基酸、5-25個(gè)氨基酸、5-50個(gè)氨基酸、10-25個(gè)氨基酸、10-50個(gè)氨基酸、10-100個(gè)氨基酸，或任何中間范圍的氨基酸。在其他示例性實(shí)施方案中，肽間隔基包含長(zhǎng)度約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或更多個(gè)氨基酸。此類接合氨基酸連接MSFP的任何結(jié)構(gòu)域。在某些實(shí)施方案中，接合氨基酸是如本文定義的鉸鏈或鉸鏈的一部分。在某些實(shí)施方案中，用于連接重鏈可變區(qū)至輕鏈可變區(qū)的可變區(qū)連接序列可用作肽間隔基。在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，肽間隔基序列包含例如Gly、Asn和Ser殘基。其它接近中性的氨基酸(例如Thr和Ala)也可包括在間隔基序列中。可有效地用作間隔基的其它氨基酸序列包括Marateaetal.,Gene40:3946(1985);Murphyetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA83:82588262(1986);美國(guó)專利第4,935,233號(hào)和美國(guó)專利第4,751,180號(hào)中公開的那些。其它的示例性間隔基可包括例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-Val-Asp(SEQIDNO:136)(Chaudharyetal.,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQIDNO:137)(Birdetal.,1988,Science242:423-426)。在一些實(shí)施方案中，當(dāng)?shù)谝缓偷诙嚯木哂锌捎糜诜指艄δ芙Y(jié)構(gòu)域并防止空間位阻的非必需N端氨基酸區(qū)時(shí)，不需要間隔基序列。本公開的MSFP的兩個(gè)編碼序列或結(jié)構(gòu)域可無需任何接合氨基酸而直接融合或通過使用柔性多接頭來融合，所述柔性多接頭例如由重復(fù)1-3次的五聚體Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQIDNO:138)組成。此類間隔基已通過插入VH和VL之間被用于構(gòu)建單鏈抗體(scFv)(Birdetal.,1988,Science242:423-426;Hustonetal.,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85:5979-5883)。肽間隔基，在某些實(shí)施方案中，被設(shè)計(jì)成使兩個(gè)β-折疊之間的正確相互作用形成單鏈抗體的可變區(qū)。任何合適的接頭可用于產(chǎn)生間接連接，例如但不限于肽接頭、聚合物接頭和化學(xué)接頭。在某些實(shí)施方案中，共價(jià)接頭是通過肽接頭的間接連接。應(yīng)當(dāng)注意的是，在單個(gè)MSFP內(nèi)，第一融合部分和第二融合部分沒有二聚化。這將本公開的MSFP與其它已知的融合蛋白(如WO2008/024188和WO2009/149185中描述的那些)區(qū)分開來。這些構(gòu)建體的差異在于具有VH1-VH2-CH1-鉸鏈-CH2-CH3和VL1-VL2-CL的通用格式。在該構(gòu)建體中，VH1和VL1二聚化以形成額外的抗原結(jié)合位點(diǎn)。在本公開的MSFP中，第一融合部分和第二融合部分不結(jié)合形成單一的抗原結(jié)合位點(diǎn)。如本文其他部分所述，該MSFP的另一個(gè)區(qū)別特征在于當(dāng)所述MSFP不成簇時(shí)所述融合部分降低了Fab與其靶標(biāo)的結(jié)合親和力。與此相反，在WO2008/024188和WO2009/149185中描述的蛋白沒有表現(xiàn)出對(duì)抗體結(jié)合靶標(biāo)降低的結(jié)合親和力。本公開的示例性MSFP包含選自以下的氨基酸序列中的任一個(gè)：SEQIDNO:84、90、96和100；以及選自以下氨基酸序列中的任一個(gè)：SEQIDNO:32、60、64、68和72。本公開的另外示例性MSFP包含選自以下的氨基酸序列中的任一個(gè)：SEQIDNO:86、92、98和102；以及選自以下氨基酸序列中的任一個(gè)：SEQIDNO:30、36、40、44、48和52。多特異性Fab融合蛋白的功能本公開的MSFP起提高藥物穩(wěn)定性、特異性、選擇性、藥效以及給藥的安全性和便利性的作用。在某些實(shí)施方案中，所述Fab，當(dāng)在其N端沒有融合融合部分的情況下表達(dá)時(shí)，能結(jié)合其可溶重組形式的靶標(biāo)抗原(通常為受體蛋白的的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，例如T細(xì)胞受體組分如CD3)以及細(xì)胞表面上的靶標(biāo)抗原。在某些實(shí)施方案中，所述Fab抗原結(jié)合片段，當(dāng)在其重鏈和輕鏈兩者的N端融合融合部分并以單體形式(非聚集形式或非多聚體形式)表達(dá)時(shí)，在不存在融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶標(biāo)抗原的情況下，處于藥物的藥理濃度(治療患者的多肽濃度)時(shí)，對(duì)其呈現(xiàn)在細(xì)胞表面上的特異性抗原不結(jié)合或具有降低的結(jié)合或與單獨(dú)的Fab具有相似水平的結(jié)合。在不存在融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶標(biāo)抗原的情況下，對(duì)細(xì)胞表面抗原缺少結(jié)合或具有極大降低的結(jié)合可通過抗原結(jié)合位點(diǎn)周圍設(shè)計(jì)的空間位阻產(chǎn)生的顯著降低的親和力來解釋。在不存在融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合靶標(biāo)抗原的情況下，對(duì)細(xì)胞表面抗原缺少結(jié)合或具有極大降低的結(jié)合，可視為作為人類治療劑的MSFP所需要的。重要的是注意到，單獨(dú)的MSFP(在沒有腫瘤靶細(xì)胞的情況下)對(duì)例如T細(xì)胞無結(jié)合或顯著降低的結(jié)合可，1)顯著提高非所需的系統(tǒng)性T細(xì)胞活化，因此顯著改善藥物安全概況，2)顯著提高給藥的皮下途徑的可行性，以及3)顯著增加血液循環(huán)中高藥物濃度的藥物耐受性。重要的是注意到，抗體(諸如OKT3或UCHT-1)通過構(gòu)象性表位對(duì)T細(xì)胞的結(jié)合可以轉(zhuǎn)導(dǎo)部分信號(hào)，導(dǎo)致非所需的T細(xì)胞活化(引起細(xì)胞因子風(fēng)暴)或T細(xì)胞無能(導(dǎo)致T細(xì)胞無法殺死腫瘤細(xì)胞)。在不存在CD3交聯(lián)的情況下，Mu-1F3、hu-1F3及其變體與CD3線性表位的結(jié)合可預(yù)想地不太可能誘導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。該性質(zhì)對(duì)于減少利用OKT3和UCHT-1樣抗體時(shí)發(fā)生的系統(tǒng)副作用可能是有利的。同樣重要的是要注意，一旦MSFP中的融合部分被蛋白酶切割，其起作用以便去除Fab抗原結(jié)合位點(diǎn)周圍的空間位阻，使得其能夠以高親和力結(jié)合其(Fab)靶標(biāo)，特別是細(xì)胞表面上表達(dá)的靶標(biāo)抗原。因此，在接頭中的切割底物序列處切割以后(從而釋放融合部分)，MSFP被轉(zhuǎn)換成腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間更有效的交聯(lián)劑。此外，重要的是注意到，一旦融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域與其靶標(biāo)抗原結(jié)合，MSFP分子在腫瘤細(xì)胞表面變得高度集中以產(chǎn)生針對(duì)T細(xì)胞上的Fab靶標(biāo)(如CD3)的基于高親和力的結(jié)合。因此，只有在存在融合部分的情況下，結(jié)合才是Fab抗原結(jié)合片段能夠結(jié)合其靶標(biāo)從而使MSFP充當(dāng)腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞之間的交聯(lián)劑。本公開的MSFP的性質(zhì)允許循環(huán)中相對(duì)高劑量的MSFP而無沒有不想要的副作用(例如，循環(huán)時(shí)，MSFP不結(jié)合Fab片段靶標(biāo)抗原(例如，CD3)。這也允許減少的給藥頻率并通過濃度梯度驅(qū)動(dòng)的擴(kuò)散促進(jìn)組織滲透。本公開的MSFP的性質(zhì)還允許皮下給藥的潛能，其可提高對(duì)靶標(biāo)的可及性。此外，盡管在某些實(shí)施方案中，MSFP在無需蛋白酶處理的情況下就允許交聯(lián)，但在某些具體的實(shí)施方案中，在蛋白酶處理后結(jié)合活性和腫瘤殺傷效力急劇增加。在一個(gè)實(shí)施方案中，由VH和VL形成的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Fv)通過CH1和CL異源二聚體結(jié)構(gòu)域穩(wěn)定，并通過二硫鍵進(jìn)一步穩(wěn)定，或通過CH1和CL之間的其它穩(wěn)定相互作用(例如，杵狀結(jié)構(gòu)/臼狀結(jié)構(gòu)相互作用)。在一個(gè)實(shí)施方案中，MSFP中的Fab在空間上受到其N端的融合部分的阻礙，使得與Fab靶標(biāo)抗原(特別是涉及細(xì)胞表面靶標(biāo)抗原時(shí))的結(jié)合以統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的方式降低(即，相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適對(duì)照，例如與在其N端(VH和VL兩者)不帶有融合部分的形式的相同F(xiàn)ab相比)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MSFP中的Fab在空間上受到其N端的融合部分的阻礙，使得與期望抗原(特別是涉及細(xì)胞表面靶標(biāo)抗原時(shí))的結(jié)合相對(duì)于在其N端(VH和VL兩者)不帶有融合部分的形式的相同F(xiàn)ab減少了至少1/2、1/3、1/4、1/5、1/6、1/7、1/8、1/9、1/10、1/11、1/12、1/13、1/14、1/15、1/20、1/30、1/100或1/1000或1/10000。在某些實(shí)施方案中，融合蛋白形式的Fab抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域?qū)ab細(xì)胞表面靶標(biāo)抗原的親和力在500nm以下。在其它實(shí)施方案中，融合蛋白形式(即MSFP)中Fab抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和力，處于人體內(nèi)使用的治療劑的濃度范圍時(shí)，如使用FACS或其他結(jié)合測(cè)定法(例如，細(xì)胞結(jié)合ELISA)所測(cè)量的，證明無顯著可檢測(cè)的結(jié)合。在一個(gè)實(shí)施方案中，不到1%的Fab靶細(xì)胞群(例如，CD3+細(xì)胞)被治療濃度的Fab融合蛋白結(jié)合(這是在不存在表達(dá)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)抗原的細(xì)胞的情況下)。在一個(gè)實(shí)施方案中，不到5%的Fab靶細(xì)胞群被治療濃度的MSFP結(jié)合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，不到10%的Fab靶細(xì)胞群被治療濃度的MSFP結(jié)合。腫瘤組織中存在的升高水平的蛋白酶，尤其是MMP，將在接頭的MMP底物切割位點(diǎn)產(chǎn)生切割產(chǎn)物。由于接頭的蛋白酶底物序列的切割導(dǎo)致Fab抗原結(jié)合區(qū)的空間位阻的解除，對(duì)所述Fab細(xì)胞表面靶標(biāo)的結(jié)合將完全恢復(fù)或至少部分恢復(fù)。所述恢復(fù)的結(jié)合可利用FACS技術(shù)、基于細(xì)胞的ELISA或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他細(xì)胞結(jié)合技術(shù)來證實(shí)。術(shù)語“顯著降低的親和力”是指相對(duì)于Fab的VH和VL的N端不含融合部分時(shí)的結(jié)合，F(xiàn)ab抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合降低至少30%。降低的百分比可為例如但不限于30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、或約99%或更高。檢測(cè)結(jié)合的方法對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的并且可利用FACS、細(xì)胞結(jié)合ELISA或使用放射性同位素標(biāo)記抗體的細(xì)胞結(jié)合來進(jìn)行。如本文所述，本公開的MSFP中使用的示例性Fab是抗CD3的Fab。在這方面，MSFP起作用使得當(dāng)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤細(xì)胞抗原時(shí)，F(xiàn)ab能夠結(jié)合T細(xì)胞的CD3，從而重新定向T細(xì)胞并活化它們以殺死腫瘤細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，MSFP(在本文也被稱為Fabe，其中Fab片段能結(jié)合免疫效應(yīng)蛋白或免疫分子，如CD3)當(dāng)經(jīng)由融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合腫瘤抗原而在腫瘤細(xì)胞表面成簇時(shí)，可表現(xiàn)出親合力效應(yīng)。因此，在空間上受阻礙的Fab對(duì)免疫細(xì)胞的明顯結(jié)合可由于親合力而提高。因此，F(xiàn)abe/MSFP變得能夠橋聯(lián)免疫細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，從而介導(dǎo)抗腫瘤活性。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab與其靶標(biāo)抗原或者融合部分結(jié)合劑與其靶標(biāo)抗原的分別的結(jié)合不會(huì)導(dǎo)致靶標(biāo)活化。然而，當(dāng)同時(shí)結(jié)合時(shí)，F(xiàn)ab抗原靶標(biāo)和融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原靶標(biāo)可產(chǎn)生信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。例如，MSFP可結(jié)合Fab抗原靶標(biāo)(例如，CD3)和融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原靶標(biāo)(其為腫瘤表面抗原)。當(dāng)MSFP分別與CD3或腫瘤表面抗原結(jié)合時(shí)，T細(xì)胞不會(huì)被活化，然而，當(dāng)CD3和腫瘤表面抗原同時(shí)被MSFP結(jié)合并且當(dāng)結(jié)合的復(fù)合物的多個(gè)拷貝被錨定在腫瘤細(xì)胞表面并在腫瘤細(xì)胞表面上成簇時(shí)，攜帶腫瘤表面抗原的癌細(xì)胞附近的T細(xì)胞被活化，并且因此顯著增強(qiáng)了T細(xì)胞的局部腫瘤殺傷效率并避免了由于細(xì)胞因子風(fēng)暴產(chǎn)生的副作用。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab抗原靶標(biāo)和融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的抗原靶標(biāo)的組合可為CD3和腫瘤表面抗原，所述組合可增強(qiáng)T細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab抗原靶標(biāo)和融合部分抗原靶標(biāo)的組合可為FcγR和腫瘤表面抗原，所述組合可誘導(dǎo)表達(dá)FcγR的免疫細(xì)胞殺死腫瘤細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab抗原靶標(biāo)和融合部分抗原靶標(biāo)的組合可為NKG2D與腫瘤細(xì)胞表面抗原，所述組合可誘導(dǎo)自然殺傷(NK)細(xì)胞以殺死腫瘤細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，第一融合部分和第二融合部分包含能結(jié)合第一靶標(biāo)抗原和第二靶標(biāo)抗原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。以這種方式，MSFP能結(jié)合三種不同的靶標(biāo)抗原(即，F(xiàn)ab靶標(biāo)外加兩種不同的融合部分靶標(biāo))。因此，在某些實(shí)施方案中，F(xiàn)ab抗原靶標(biāo)選自CD3、TCR、FCγR和NKG2D，并且第一融合部分和第二融合部分的第一結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)閮?yōu)先表達(dá)在癌細(xì)胞上的兩種不同的抗原。此類具有三種不同的靶標(biāo)抗原的MSFP，可增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向特異性并防止對(duì)正常細(xì)胞的殺傷作用，所述正常細(xì)胞可表達(dá)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)抗原的一種或可表達(dá)低水平的融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)抗原的兩種。因此，在一個(gè)示例性實(shí)施方案中，本公開的MSFP包含F(xiàn)ab抗原結(jié)合片段，其能結(jié)合TCR或其組分(如CD3多肽)。如以上所指出的，本公開的MSFP不結(jié)合Fab靶標(biāo)抗原，除非當(dāng)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合其靶標(biāo)抗原或在接頭切割事件以后。因此，在某些實(shí)施方案中，在不存在融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域與靶標(biāo)抗原結(jié)合的情況下，本公開的MSFP不活化或最低限度地活化T細(xì)胞。若與在存在表達(dá)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)抗原的細(xì)胞(例如，適當(dāng)?shù)哪[瘤細(xì)胞/細(xì)胞系)的情況下的T細(xì)胞活化相比，MSFP并不導(dǎo)致活化T細(xì)胞的百分比的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加(如在至少一種體外或體內(nèi)測(cè)定中所測(cè)量的)，則所述MSFP“不活化T細(xì)胞或最低限度地活化T細(xì)胞或極少地活化T細(xì)胞”。此類測(cè)定是本領(lǐng)域已知的，并且包括但不限于，增殖測(cè)定、CTL鉻釋放試驗(yàn)(參見例如，Lavieetal.,(2000)InternationalImmunology12(4):479-486)、ELISPOT測(cè)定、胞內(nèi)細(xì)胞因子染色測(cè)定，以及例如CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons,NewYork,N.Y.(2009)中所描述的其它測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，T細(xì)胞的活化利用體外觸發(fā)的T細(xì)胞活化測(cè)定來測(cè)量。還參見本文實(shí)施例中所述的測(cè)定。因此，在相關(guān)方面，本公開提供了用于檢測(cè)包含F(xiàn)ab的MSFP誘導(dǎo)的T細(xì)胞活化的方法，所述Fab能特異性地結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分，所述方法包括：(a)提供抗原或絲裂原觸發(fā)的T細(xì)胞，(b)用包含能特異性結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分的Fab的MSFP處理步驟(a)的觸發(fā)的T細(xì)胞和(c)檢測(cè)已在步驟(b)中處理的觸發(fā)的T細(xì)胞的活化。本文所用術(shù)語“絲裂原”是指誘導(dǎo)不同特異性或克隆起源的淋巴細(xì)胞有絲分裂的化學(xué)物質(zhì)?？捎糜谟|發(fā)T細(xì)胞的示例性絲裂原包括：植物血凝素(PHA)、伴刀豆球蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、美洲商陸絲裂原(PWM)和豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)。負(fù)載了抗原的珠子或PBMC也可用于觸發(fā)T細(xì)胞。在用于檢測(cè)本文所提供的T細(xì)胞活化的方法的某些實(shí)施方案中，包含能特異性結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分的Fab的MSFP包含一個(gè)或多個(gè)融合部分，所述融合部分含有能結(jié)合腫瘤抗原的一個(gè)或多個(gè)結(jié)合結(jié)構(gòu)域。T細(xì)胞的活化可通過測(cè)量本領(lǐng)域已知的活化標(biāo)志物如CD25、CD40配體和CD69的表達(dá)來檢測(cè)?；罨腡細(xì)胞還可通過細(xì)胞增殖測(cè)定如CFSE標(biāo)記和胸苷吸收分析來檢測(cè)(Adams(1969)Exp.CellRes.56:55)。可通過例如鉻釋放測(cè)定或使用熒光染料(如TP3)的基于FACS的分析來檢測(cè)T細(xì)胞效應(yīng)功能(例如細(xì)胞殺傷)。在相關(guān)方面，T細(xì)胞的活化和細(xì)胞裂解活性可通過T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的裂解突觸的形成來測(cè)量?？稍诩?xì)胞裂解突觸中檢測(cè)效應(yīng)分子(例如顆粒酶和穿孔素)。在另一個(gè)相關(guān)方面，T細(xì)胞的活化可通過細(xì)胞因子的釋放來測(cè)量。用于檢測(cè)由包含F(xiàn)ab(其能特異性結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分)的MSFP誘導(dǎo)的細(xì)胞因子釋放的方法，可包括：(a)提供觸發(fā)的T細(xì)胞、(b)用包含能特異性結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分的Fab的MSFP處理步驟(a)的觸發(fā)的T細(xì)胞，和(c)檢測(cè)已在步驟(b)中處理的觸發(fā)的T細(xì)胞的細(xì)胞因子釋放。在具體的實(shí)施方案中，在存在或不存在表達(dá)靶標(biāo)腫瘤抗原的合適的癌細(xì)胞或細(xì)胞系的情況下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所述靶標(biāo)腫瘤抗原能被MSFP的第一融合部分和/或第二融合部分中存在的結(jié)合結(jié)構(gòu)域所結(jié)合。在用于檢測(cè)本文提供的細(xì)胞因子釋放的方法的某些實(shí)施方案中，包含能特異性結(jié)合TCR復(fù)合物或其組分的Fab的MSFP為還包含融合部分的MSFP，所述融合部分包含能結(jié)合腫瘤靶標(biāo)抗原的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開的MSFP并不誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴或并不誘導(dǎo)足以誘導(dǎo)毒副作用的細(xì)胞因子釋放。若在不存在次級(jí)靶細(xì)胞(表達(dá)能被融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的抗原的腫瘤細(xì)胞)或合適的接頭切割試劑(例如蛋白酶)的情況下，MSFP并不引起至少一種細(xì)胞因子(包括IFNγ)的量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加，則該MSFP“并不誘導(dǎo)細(xì)胞因子風(fēng)暴”(也被稱作“誘導(dǎo)無法檢測(cè)到的、極少的或最低限度的細(xì)胞因子釋放”或“不誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放或誘導(dǎo)最低限度的可檢測(cè)到的細(xì)胞因子釋放”)。在本領(lǐng)域已知或本文提供的至少一種體內(nèi)或體外測(cè)定中，與存在合適的次級(jí)靶細(xì)胞或接頭切割試劑的情況下從處理的細(xì)胞中的釋放相比，在沒有次級(jí)靶細(xì)胞(例如合適的癌細(xì)胞系)或合適的接頭切割試劑的情況下從處理的細(xì)胞中釋放，在某些實(shí)施方案中，至少兩種細(xì)胞因子包括IFNγ和TNFα或IL-6和TNFα；在一個(gè)實(shí)施方案中，三種細(xì)胞因子包括IL-6、IFNγ和TNFα；在另一個(gè)實(shí)施方案中，四種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-6、IFNγ和TNFα；以及在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少五種細(xì)胞因子包括IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα。在臨床上，細(xì)胞因子釋放綜合征的特點(diǎn)是發(fā)熱、寒戰(zhàn)、皮疹、惡心、有時(shí)呼吸困難和心動(dòng)過速，這與某些細(xì)胞因子的最大釋放是平行的，例如IFNγ、以及IL-2、IL-6和TNFα?？稍隗w外或體內(nèi)測(cè)試釋放的細(xì)胞因子包括G-CSF、GM-CSF、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、IP-10、KC、MCP1、IFNγ和TNFα；在另一個(gè)實(shí)施方案中包括IL-2、IL-6、IL-10、IFNγ和TNFα。在其它實(shí)施方案中，本公開的MSFP導(dǎo)致細(xì)胞如T細(xì)胞內(nèi)鈣流的增加。若在存在合適的次級(jí)靶細(xì)胞(例如，癌細(xì)胞)或接頭切割試劑的情況下用于活化T細(xì)胞，與不存在合適的次級(jí)靶細(xì)胞或接頭切割試劑的情況下處理的細(xì)胞相比，MSFP導(dǎo)致處理細(xì)胞的鈣流的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的、快速的增加(優(yōu)選在處理的300秒內(nèi)、更優(yōu)選在處理的200秒內(nèi)、最優(yōu)選在處理的100秒內(nèi))(如在本領(lǐng)域已知或本文提供的體外測(cè)定中所測(cè)量的)，則該MSFP導(dǎo)致“鈣增加”。在其它實(shí)施方案中，本公開的MSFP誘導(dǎo)了TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子的磷酸化。“TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑”是指經(jīng)由肽：MHC配體與TCR及其共受體(CD4或CD8)的結(jié)合所啟動(dòng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑?！癟CR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子”是指直接參與TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的分子，例如其磷酸化狀態(tài)(例如，無論該分子是否被磷酸化)，其與另一種分子的結(jié)合親和力或其酶活性，在響應(yīng)于肽：MHC配體與TCR及其共受體的結(jié)合的信號(hào)中已發(fā)生改變的分子。TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的示例性分子包括：TCR復(fù)合物或其組分(例如，CD3ζ鏈)、ZAP-70、Fyn、Lck、磷脂酶C-γ、蛋白激酶C、轉(zhuǎn)錄因子NFκB、鈣調(diào)磷酸酶、轉(zhuǎn)錄因子NFAT、鳥嘌呤核苷酸交換因子(GEF)、RAS、MAP激酶激酶激酶(MAPKKK)、MAP激酶激酶(MAPKK)、MAP激酶(ERK1/2)和Fos。若在本領(lǐng)域已知的體外或體內(nèi)測(cè)定或受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定中，本公開的MSFP僅在存在合適的次級(jí)靶標(biāo)抗原或表達(dá)此類抗原的細(xì)胞(例如表達(dá)能被融合部分的結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合的腫瘤抗原的癌細(xì)胞)或接頭切割試劑的情況下，導(dǎo)致TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子(如CD3ζ鏈、ZAP-70和ERK1/2)的磷酸化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的增加，則該MSFP“誘導(dǎo)TCR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的分子的磷酸化”。來自本領(lǐng)域中已知的大多數(shù)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)測(cè)定的結(jié)果利用免疫組織化學(xué)方法(例如蛋白印跡或熒光顯微術(shù))來確定。類似地，本公開的MSFP誘導(dǎo)次級(jí)靶細(xì)胞的殺傷，如表達(dá)融合部分結(jié)合結(jié)構(gòu)域的靶標(biāo)抗原的腫瘤細(xì)胞被T細(xì)胞殺傷。此類細(xì)胞殺傷可利用多種本領(lǐng)域已知的測(cè)定(包括鉻釋放測(cè)定)來測(cè)量。本公開的MSFP的特異性和功能可通過以下來測(cè)試：將MSFP與合適的測(cè)試樣品接觸，并且在某些實(shí)施方案中，用合適的蛋白酶處理MSFP，并測(cè)定切割產(chǎn)物，所述蛋白酶被認(rèn)為對(duì)接頭的切割識(shí)別位點(diǎn)是特異的。蛋白酶可以是例如，從癌細(xì)胞分離的，或其可通過重組制備，例如按照Darket(J.Biol.Chem.254:2307-2312(1988))的方案。切割產(chǎn)物可以例如根據(jù)大小、抗原性或活性來鑒定。MSFP的毒性可通過使MSFP及其切割產(chǎn)物經(jīng)歷體外細(xì)胞毒性、增殖、結(jié)合或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他適當(dāng)?shù)臏y(cè)定來進(jìn)行研究。切割產(chǎn)物的毒性可使用核糖體失活測(cè)定(Westbyetal.,BioconjugateChem.3:377-382(1992))來確定。切割產(chǎn)物對(duì)蛋白合成的影響可在利用部分確定的無細(xì)胞系統(tǒng)的體外翻譯的標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定中來測(cè)量，所述部分確定的無細(xì)胞系統(tǒng)由例如作為核糖體來源的網(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物和各種必要的輔因子(如mRNA模板和氨基酸)組成。在混合物中使用放射性同位素標(biāo)記的氨基酸可對(duì)摻入三氯乙酸可沉淀的蛋白質(zhì)中的游離氨基酸前體進(jìn)行定量?？煞奖愕厥褂猛镁W(wǎng)織紅細(xì)胞裂解物(O'Hare,FEBSLett.273:200-204(1990))。本發(fā)明的MSFP破壞癌細(xì)胞和/或活化T細(xì)胞的能力可容易地利用癌細(xì)胞系、T細(xì)胞系或分離的PBMC或T細(xì)胞在體外進(jìn)行測(cè)試。本公開的MSFP的效應(yīng)可通過例如癌細(xì)胞的選擇性裂解所證明的進(jìn)行確定。另外，蛋白酶的特異性可通過單獨(dú)使用本公開的MSFP或在存在蛋白酶特異性抑制劑的情況下比較細(xì)胞增殖的抑制情況來進(jìn)行測(cè)試。此類蛋白酶抑制劑可包括MMP-2/MMP-9抑制劑GM1489、GM6001和GL-I至GI-IV。毒性還可基于細(xì)胞活力來測(cè)定，例如將暴露于MSFP的正常細(xì)胞培養(yǎng)物和癌細(xì)胞培養(yǎng)物的活力進(jìn)行比較。細(xì)胞活力可通過已知技術(shù)，如臺(tái)盼藍(lán)排除測(cè)定來進(jìn)行評(píng)估。毒性也可根據(jù)細(xì)胞裂解來測(cè)定，例如將暴露于MSFP的正常細(xì)胞培養(yǎng)物和癌細(xì)胞培養(yǎng)物的活力進(jìn)行比較。細(xì)胞裂解可通過已知技術(shù)，如鉻(Cr)釋放測(cè)定或死細(xì)胞指示劑染料(碘化丙啶、TO-PRO-3碘化物)來進(jìn)行評(píng)估。多肽本公開提供了MSFP多肽及其片段。示例性多肽和編碼它們的多核苷酸，都提供于SEQIDNO:23-102和109-150中。術(shù)語“多肽”、“蛋白”、“肽”和“糖蛋白”可互換使用并意指不限于任何特定長(zhǎng)度的氨基酸聚合物。該術(shù)語并不排除修飾，如十四烷基化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信號(hào)序列的添加或缺失。術(shù)語“多肽”或“蛋白”是指氨基酸的一條或多條鏈，其中每條鏈包含通過肽鍵共價(jià)連接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白可包含非共價(jià)連接的和/或通過肽鍵共價(jià)連接的多條鏈，具有天然蛋白(即由天然存在的細(xì)胞，尤其是非重組的細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白)的序列、或遺傳改造的細(xì)胞或重組細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白的序列，并且包含具有天然蛋白的氨基酸序列的分子，或具有天然序列的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、添加、和/或取代的分子。術(shù)語“多肽”和“蛋白”特別地涵蓋本公開的MSFP及其二聚物，或具有如本文公開的MSFP的一個(gè)或多個(gè)氨基酸的缺失、添加、和/或取代的序列。因此，“多肽”或“蛋白”可包括基酸鏈的一條鏈(稱為“單體”)或氨基酸鏈的多條鏈(稱為“多聚體”)。本文提到的術(shù)語“分離的蛋白”表示這樣的個(gè)體蛋白：(1)不含在自然界中通常與其一起存在的至少一些其它蛋白、(2)基本上不含來自相同來源，例如來自相同物種的其它蛋白、(3)由來自不同物種的細(xì)胞表達(dá)、(4)從至少約50%的多核苷酸、脂質(zhì)、碳水化合物或在自然界中與其相關(guān)的其它物質(zhì)分離出來、(5)與自然界中“分離的蛋白”相關(guān)的蛋白的一部分不結(jié)合(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)、(6)與自然界中不相關(guān)的多肽可操作地結(jié)合(通過共價(jià)或非共價(jià)相互作用)或(7)不存在于自然界中。此類分離的蛋白可通過基因組DNA、cDNA、mRNA或其它RNA編碼，或可為合成來源或以上的任何組合。在某些實(shí)施方案中，分離的蛋白基本不含會(huì)干擾其應(yīng)用(治療、診斷、預(yù)防、研究或其他)的天然環(huán)境中存在的蛋白或多肽或其它污染物。術(shù)語“多肽片段”是指可為單體或多聚體的多肽，其具有天然存在的或重組產(chǎn)生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失、和/或內(nèi)部缺失或取代。在某些實(shí)施方案中，多肽片段可包含長(zhǎng)度為至少5-約500個(gè)氨基酸的氨基酸鏈。應(yīng)理解的是在某些實(shí)施方案中，片段長(zhǎng)度為至少5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、150、200、250、300、350、400或450個(gè)氨基酸。特別有用的多肽片段包括功能結(jié)構(gòu)域，包括抗體的抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或抗體的片段。就抗CD3或其他抗體而言，有用的片段包括但不限于：CDR區(qū)、特別是重鏈或輕鏈的CDR3區(qū)；重鏈或輕鏈的可變區(qū)；抗體鏈的一部分或其僅包含兩個(gè)CDR的可變區(qū)等。多肽可在蛋白的N-端包含信號(hào)(或前導(dǎo))序列，其在共翻譯或翻譯后指導(dǎo)蛋白的轉(zhuǎn)移。多肽也可與接頭或其他序列進(jìn)行框內(nèi)融合或綴合以便于多肽(例如，聚組氨酸)的合成、純化或鑒定，或者增強(qiáng)多肽與固相支持物的結(jié)合?？紤]本文所述的MSFP的氨基酸序列修飾。例如，提高M(jìn)SFP的結(jié)合親和力和/或其它生物特性可能是可取的。例如，MSFP的氨基酸序列變體，或其結(jié)合結(jié)構(gòu)域或其Fab可通過將合適的核苷酸變化引入編碼所述MSFP或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸中來制備，或通過肽合成來制備。此類修飾包括例如，MSFP氨基酸序列中殘基的缺失和/或插入和/或取代?？蛇M(jìn)行缺失、插入和取代的任何組合以獲得最終的MSFP，前提是最終構(gòu)建體具有所需特性，諸如通過結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab特異性地結(jié)合目的靶標(biāo)抗原。氨基酸變化還可改變MSFP的翻譯后加工，諸如改變糖基化位點(diǎn)的數(shù)目或位置。針對(duì)本發(fā)明多肽的上述任何變異和修飾都可包括在本發(fā)明的抗體中。本公開提供了本文公開的MSFP的變體。在某些實(shí)施方案中，此類變體MSFP包含其變體結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab片段，或抗原結(jié)合片段或其CDR(其能至少約50%、至少約70%、并且在某些實(shí)施方案中，至少約90%地結(jié)合目的靶標(biāo))，以及給定的參考序列或野生型序列，包括本文具體示出的任何這樣的序列。在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，此類變體以比本文所示的參考序列或野生型序列更高的親和力結(jié)合靶標(biāo)抗原(例如，在量上至少約105%、106%、107%、108%、109%，或110%的結(jié)合)以及本文具體示出的參考序列。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了本文所公開的MSFP的變體，其中此類變體包含已對(duì)VH和VL之間的二硫鍵進(jìn)行修飾的Fab。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所公認(rèn)的，在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的MSFP中使用的Fab片段可不包含二硫鍵。在這方面，可以這樣的方式改造重鏈和輕鏈，以便在無需二硫鍵的情況下穩(wěn)定地相互作用。例如，在某些實(shí)施方案中，可改造重鏈或輕鏈以去除半胱氨酸殘基，并且其中重鏈和輕鏈仍穩(wěn)定地相互作用并作為Fab起作用。在一個(gè)實(shí)施方案中，進(jìn)行突變以促進(jìn)重鏈和輕鏈之間穩(wěn)定的相互作用。例如，“杵入臼”遺傳改造策略可用于促進(jìn)Fab的重鏈和輕鏈之間的二聚化(參見例如，1996ProteinEngineering,9:617–621)。因此，還考慮用于本文的是設(shè)計(jì)用于特定的目的，例如，去除二硫鍵、添加純化標(biāo)簽等的變體Fab片段在具體實(shí)施方案中，個(gè)體MSFP可具有：與本文所述的MSFP至少80%一致、至少95%一致、至少90%一致、至少95%一致或至少98%一致或99%一致的氨基酸序列。代表性多肽的三維結(jié)構(gòu)的確定可通過常規(guī)方法來進(jìn)行，使得用選定的天然或非天然的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、添加、缺失或插入實(shí)際上可被建模，用于確定如此得到的結(jié)構(gòu)變體是否保留本公開種類的空間填充特性的目的。參見例如，Donateetal.,1994Prot.Sci.3:2378;Bradleyetal.,Science309:1868-1871(2005);Schueler-Furmanetal.,Science310:638(2005);Dietzetal.,Proc.Nat.Acad.Sci.USA103:1244(2006);Dodsonetal.,Nature450:176(2007);Qianetal.,Nature450:259(2007);Ramanetal.Science327:1014-1018(2010)?？捎糜谶@些和相關(guān)的實(shí)施方案的計(jì)算機(jī)算法的一些另外的非限制性實(shí)例，包括VMD，其為使用3D圖像和內(nèi)置腳本顯示、繪制、以及分析大生物分子系統(tǒng)的分子可視化程序(參見TheoreticalandComputationalBiophysicsGroup,UniversityofIllinoisatUrbana-Champagne的網(wǎng)頁(yè)，ks.uiuc.edu/Research/vmd/)。許多其他的計(jì)算機(jī)程序?yàn)楸绢I(lǐng)域已知并且是技術(shù)人員可利的，其允許從能量最小化構(gòu)象的空間填充模型(范德華半徑)確定原子尺寸；GRID，其目的是確定針對(duì)不同化學(xué)基團(tuán)的高親和性區(qū)域，從而提高結(jié)合；MonteCarlo搜索，其計(jì)算數(shù)學(xué)比對(duì)；以及CHARMM(Brooksetal.(1983)J.Comput.Chem.4:187-217)和AMBER(Weineretal(1981)J.Comput.Chem.106:765)，其評(píng)估力場(chǎng)計(jì)算和分析(還參見Eisenfieldetal.(1991)Am.J.Physiol.261:C376-386;Lybrand(1991)J.Pharm.Belg.46:49-54;Froimowitz(1990)Biotechniques8:640-644;Burbametal.(1990)Proteins7:99-111;Pedersen(1985)Environ.HealthPerspect.61:185-190和Kinietal.(1991)J.Biomol.Struct.Dyn.9:475-488)。各種適合計(jì)算的計(jì)算機(jī)程序也是可商購(gòu)的，例如來自(Munich,Germany)。編碼多特異性Fab融合蛋白的多核苷酸/載體/宿主細(xì)胞/以及制備多特異性Fab融合蛋白的方法在某些實(shí)施方案中，本公開進(jìn)一步提供了編碼本文所述的多肽MSFP的分離的核酸。示例性多核苷酸、以及由其編碼的多肽及其片段提供于SEQIDNO:23-102和109-150中。核酸包括DNA和RNA。這些實(shí)施方案及相關(guān)實(shí)施方案可包括編碼本文所述的MSFP的多核苷酸。本文所用術(shù)語“分離的多核苷酸”應(yīng)意指基因組多核苷酸、cDNA多核苷酸、或合成來源的多核苷酸或其某種組合，由于其來源，所述“分離的多核苷酸”(1)與自然界中分離的多核苷酸相關(guān)的多核苷酸的全部或一部分不結(jié)合，(2)與其在自然界中不連接的多核苷酸連接，或(3)在自然界中沒有作為較大序列的一部分而存在。術(shù)語“可操作地連接”意指所述術(shù)語所適用的組分處于允許它們?cè)诤线m的條件下發(fā)揮其固有功能的關(guān)系當(dāng)中。例如，“可操作地連接”至蛋白編碼序列上的轉(zhuǎn)錄控制序列與其連接以致能在與所述控制序列的轉(zhuǎn)錄活性相容的條件下，完成所述蛋白編碼序列的表達(dá)。本文所用術(shù)語“控制序列”是指可影響與之連接或可操作地連接的編碼序列的表達(dá)、加工或細(xì)胞內(nèi)定位的多核苷酸序列。此類控制序列的特性可取決于宿主生物體。在具體的實(shí)施方案中，原核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可包括啟動(dòng)子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止序列。在其它具體的實(shí)施方案中，真核生物的轉(zhuǎn)錄控制序列可以包括含有一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別位點(diǎn)的啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和聚腺苷酸化序列。在某些實(shí)施方案中，“控制序列”可包括前導(dǎo)序列和/或融合伴侶序列。本文提及的術(shù)語“多核苷酸”意指單鏈或雙鏈的核酸聚合物。在某些實(shí)施方案中，多核苷酸包含的核苷酸可為核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或任一類型的修飾形式的核苷酸。所述修飾包括堿基修飾如溴尿苷(bromouridine)、核糖修飾如阿拉伯糖苷和2’,3’-二脫氧核糖及核苷酸間連接的修飾如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯。術(shù)語“多核苷酸”明確包括單鏈和雙鏈形式的DNA。術(shù)語“天然存在的核苷酸”包括脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。術(shù)語“修飾的核苷酸”包括具有修飾或取代的糖基等的核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸連接”包括諸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺基硫代磷酸酯、苯胺基磷酸酯、氨基磷酸酯等的寡核苷酸連接。參見例如LaPlancheetal.,1986,Nucl.AcidsRes.,14:9081；Stecetal.,1984,J.Am.Chem.Soc.,106:6077；Steinetal.,1988,Nucl.AcidsRes.,16:3209；Zonetal.,1991,Anti-CancerDrugDesign,6:539；Zonetal.,1991,OLIGONUCLEOTIDESANDANALOGUES:APRACTICALAPPROACH,第87-108頁(yè)(F.Eckstein編輯),OxfordUniversityPress,OxfordEngland;Stecetal.,美國(guó)專利第5,151,510號(hào);UhlmannandPeyman,1990,ChemicalReviews,90:543，其全部?jī)?nèi)容通過引用并入本文中用于所有目的。寡核苷酸可包括可檢測(cè)標(biāo)記物以便能檢測(cè)寡核苷酸或其雜交。在其它相關(guān)的實(shí)施方案中，多核苷酸變體可與編碼本文所述的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列有實(shí)質(zhì)大量的一致性。例如，多核苷酸可以是這樣的多核苷酸：利用本文所述的方法(例如利用如下所述的標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)的BLAST分析，如下文所述)，其可為相對(duì)于與參考多核苷酸序列(例如編碼本文所述的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的序列)相比包含至少70%序列一致性、優(yōu)選至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高的序列一致性的多核苷酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)認(rèn)識(shí)到，通過考慮密碼子簡(jiǎn)并性、氨基酸相似性、閱讀框定位等可適當(dāng)?shù)卣{(diào)整這些值，以確定由兩條核苷酸序列編碼的蛋白的相應(yīng)的一致性。通常，多核苷酸變體將包含一個(gè)或多個(gè)取代、添加、缺失和/或插入，優(yōu)選地使得結(jié)合結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力、或Fab的結(jié)合親和力、或由所述變體多核苷酸編碼的MSFP的功能相對(duì)于由本文具體示出的多核苷酸序列編碼的未經(jīng)修飾的參考蛋白基本不減少。在某些其它相關(guān)的實(shí)施方案中，多核苷酸片段可包含與編碼本文所述的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的序列相同或互補(bǔ)的不同長(zhǎng)度的連續(xù)的序列區(qū)段或由以上區(qū)段組成。例如，提供的多核苷酸包含編碼本文公開的MSFP或其結(jié)構(gòu)域(如其結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab抗原結(jié)合片段)的序列的至少約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、200、300、400、500或1000或更多連續(xù)的核苷酸以及之間所有中間長(zhǎng)度的連續(xù)的核苷酸，或者由以上連續(xù)的核苷酸組成。容易理解的是在本上下文中“中間長(zhǎng)度”意指引用值之間的任何長(zhǎng)度，例如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500;500-1,000等的所有整數(shù)。本文所述的多核苷酸序列可在一端或兩端通過添加天然序列中不存在的核苷酸來延伸。該添加的序列可由編碼本文所述的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的任一端或編碼本文所述的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸的兩端的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20個(gè)核苷酸組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了能夠在中至高嚴(yán)緊條件下與編碼本文提供的MSFP或其結(jié)構(gòu)域(例如其結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab抗原結(jié)合片段)的多核苷酸序列、或其片段、或其互補(bǔ)序列雜交的多核苷酸。雜交技術(shù)為分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。為了闡述的目的，用于測(cè)試本文提供的多核苷酸與其它多核苷酸雜交的合適的中度嚴(yán)緊條件包括：在5XSSC,0.5%SDS,1.0mMEDTA(pH8.0)的溶液中預(yù)洗滌；在50℃-60℃,5XSSC中雜交過夜；隨后在65℃下用含0.1%SDS的2XSSC、0.5XSSC和0.2XSSC各自洗滌20分鐘，洗滌兩次。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，可很容易操作雜交的嚴(yán)緊性，例如通過改變雜交溶液的鹽濃度和/或進(jìn)行雜交的溫度。例如，在另一個(gè)實(shí)施方案中，合適的高嚴(yán)緊雜交條件包括上述那些，除了將雜交的溫度升高至例如60℃-65℃或65℃-70℃。在某些實(shí)施方案中，上述的多核苷酸，例如多核苷酸變體、片段和雜交序列，能編碼MSFP或其結(jié)構(gòu)域，例如結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab，例如能結(jié)合CD3的Fab或能結(jié)合腫瘤抗原靶標(biāo)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在其它實(shí)施方案中，此類多核苷酸編碼能至少約50%、至少約70%，并且在某些實(shí)施方案中，至少約90%地結(jié)合CD3和/或腫瘤抗原的MSFP以及本文具體示出的MSFP序列。在其它實(shí)施方案中，此類多核苷酸編碼MSFP或其結(jié)構(gòu)域(其例如相比本文所示的MSFP或其結(jié)構(gòu)域以更大的親和力結(jié)合CD3和/或靶標(biāo)抗原(例如其在量上至少約105%、106%、107%、108%、109%或110%的結(jié)合))，以及本文具體示出的MSFP序列或其結(jié)構(gòu)域。如本文其它地方所述，代表性多肽(例如本文提供的變體MSFP，例如具有本文提供的結(jié)合結(jié)構(gòu)域和Fab的MSFP)的三維結(jié)構(gòu)的確定可通過常規(guī)方法來進(jìn)行，使得用選定的天然或非天然的氨基酸進(jìn)行一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、添加、缺失或插入實(shí)際上可被建模，用于確定如此得到的結(jié)構(gòu)變體是否保留本公開種類的空間填充特性的目的。本領(lǐng)域技術(shù)人員已知很多用于確定例如抗體或其抗原結(jié)合片段之內(nèi)合適的氨基酸取代(或編碼氨基酸序列的合適的多核苷酸)，以致例如保持親和力或達(dá)到更好的親和力的計(jì)算機(jī)程序。本文所述的多核苷酸或其片段，不管編碼序列本身的長(zhǎng)度如何，都可以與其它DNA序列(例如啟動(dòng)子、聚腺苷酸化信號(hào)、額外的限制性酶位點(diǎn)、多克隆位點(diǎn)、其他編碼片段等)組合，使得其總長(zhǎng)度可變化很大。因此可預(yù)期的是，可應(yīng)用幾乎任何長(zhǎng)度的核酸片段，其總長(zhǎng)度優(yōu)選受方便制備和在預(yù)期的重組DNA方案中使用的限制。例如，考慮可用長(zhǎng)度為約10000、約5000、約3000、約2000、約1000、約500、約200、約100、約50個(gè)堿基對(duì)等(包括所有中間長(zhǎng)度)的示例性多核苷酸片段。當(dāng)比較多核苷酸序列時(shí)，如果兩個(gè)序列中的核苷酸序列在如下文所述進(jìn)行最大對(duì)應(yīng)比對(duì)時(shí)是相同的，則可以認(rèn)為所述兩個(gè)序列是“一致的”。通常通過在比較窗中比較序列來進(jìn)行兩個(gè)序列間的比較，從而鑒定和比較序列相似性的局部區(qū)域。本文所用的“比較窗”是指至少約20個(gè)連續(xù)位置、通常30-約75個(gè)、40-約50個(gè)連續(xù)位置的區(qū)段，其中在將序列與具有相同數(shù)量連續(xù)位置的參照序列最佳比對(duì)后，可以將所述序列與參照序列進(jìn)行比較。可以使用Lasergene生物信息學(xué)軟件套裝中的Megalign程序(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)，使用缺省參數(shù)，進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)。該程序包括以下參考文獻(xiàn)中描述的數(shù)種比對(duì)方案：Dayhoff,M.O.(1978)AmodelofevolutionarychangeinProteins-Matricesfordetectingdistantrelationships；InDayhoff,M.O.(ed.)AtlasofProteinSequenceandStructure,NationalBiomedicalResearchFoundation,WashingtonDCVol.5,Suppl.3,pp.345-358；HeinJ.,UnifiedApproachtoAlignmentandPhylogenespp.626-645(1990)；MethodsinEnzymologyvol.183,AcademicPress,Inc.,SanDiego,CA；Higgins,D.G.andSharp,P.M.,CABIOS5:151-153(1989)；Myers,E.W.andMullerW.,CABIOS4:11-17(1988);Robinson,E.D.,Comb.Theor11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.Mol.Biol.Evol.4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.andSokal,R.R.,NumericalTaxonomy-thePrinciplesandPracticeofNumericalTaxonomy,FreemanPress,SanFrancisco,CA(1973)；Wilbur,W.J.andLipman,D.J.,Proc.Nat'lAcad.,Sci.USA80:726-730(1983)。可選擇地，可以通過以下來進(jìn)行用于比較的序列的最佳比對(duì)：SmithandWaterman,Add.APL.Math2:482(1981)的局部一致性算法、NeedlemanandWunsch,J.Mol.Biol.48:443(1970)的一致性比對(duì)算法、PearsonandLipman,Proc.Nat'lAcad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性方法搜索、這些算法的計(jì)算機(jī)執(zhí)行(Wisconsin遺傳學(xué)軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA,GeneticsComputerGroup(GCG),575ScienceDr.,Madison,WI)、或檢查。適于確定序列一致性和序列相似性百分比的算法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)例是BLAST和BLAST2.0算法，其分別描述于Altschuletal.,Nucl.AcidsRes.25:3389-3402(1977)和Altschuletal.,J.Mol.Biol.215:403-410(1990)中。例如，可以按照本文所述的參數(shù)使用BLAST和BLAST2.0，從而確定兩個(gè)或更多個(gè)多核苷酸之間的序列一致性百分比。通過美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)可以公開獲得進(jìn)行BLAST分析的軟件。在一個(gè)示例性實(shí)例中，對(duì)于核苷酸序列，可以利用參數(shù)M(一對(duì)匹配殘基的獎(jiǎng)勵(lì)分；總是>0)和N(錯(cuò)配殘基的罰分；總是<0)計(jì)算累積評(píng)分。在以下情況時(shí)停止每個(gè)方向的字符命中延伸：當(dāng)累積比對(duì)評(píng)分從其最大達(dá)到的值下降量X時(shí)；由于一個(gè)或多個(gè)負(fù)評(píng)分殘基比對(duì)的累積而使累積評(píng)分達(dá)到0或低于0時(shí)；或達(dá)到任一序列的末端時(shí)。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定了所述比對(duì)的靈敏度和速度。BLASTN程序(對(duì)于核苷酸序列)使用以下作為缺省值：字長(zhǎng)(W)為11，期望(E)為10，BLOSUM62評(píng)分矩陣(參見HenikoffandHenikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915(1989))比對(duì)，(B)為50，期望(E)為10，M=5，N=-4，以及兩條鏈的比較。在某些實(shí)施方案中，通過在至少20個(gè)位置的比較窗中比較兩個(gè)最佳比對(duì)的序列來確定“序列一致性百分比”，其中，與用于兩個(gè)序列最佳比對(duì)的參照序列(其不包含添加或缺失)相比，比較窗中的多核苷酸序列的一部分可以包含20%或更少的、通常為5%-15%、或10%-12%的添加或缺失(即，空位)。通過以下來計(jì)算百分比：確定兩個(gè)序列中都存在的相同很酸堿基的位置數(shù)量來產(chǎn)生配對(duì)位置數(shù)，將配對(duì)位置數(shù)除以參照序列中(即窗的大小)的位置總數(shù)，并且將結(jié)果乘以100以產(chǎn)生序列一致性的百分比。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，有多種編碼本文所述的MSFP的核苷酸序列。這些多核苷酸中的一些與編碼MSFP(例如能結(jié)合CD3或腫瘤靶標(biāo)抗原的MSFP)的天然或原始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列一致性。然而，由于密碼子使用的差異性而不同的多核苷酸明確被本公開涵蓋。在某些實(shí)施方案中，已為哺乳動(dòng)物表達(dá)而進(jìn)行密碼子優(yōu)化的序列是特別考慮的。因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，誘變方法，例如位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)，可用于制備本文所述的MSFP的變體和/或衍生物。通過該方法，多肽序列中的特定修飾可通過對(duì)編碼它們的基礎(chǔ)多核苷酸的誘變來完成。這些技術(shù)提供了制備并測(cè)試序列變體的直接方法，例如，通過將一個(gè)或多個(gè)核苷酸序列變化引入多核苷酸中，來體現(xiàn)一種或多種之前的考慮。位點(diǎn)特異性誘變?cè)试S通過以下產(chǎn)生突變體：使用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡核苷酸序列以及足夠數(shù)量的鄰近核苷酸，以提供足夠大小和序列復(fù)雜性的引物序列，從而在被跨越的缺失接合處的兩側(cè)形成穩(wěn)定的雙螺旋?？梢栽谒x的多核苷酸序列中應(yīng)用突變以提高、改變、減少、修飾或以其它方式改變多核苷酸本身的性質(zhì)、和/或改變編碼多肽的性質(zhì)、活性、組成、穩(wěn)定性或一級(jí)序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明人考慮編碼本文公開的MSFP或其結(jié)構(gòu)域的多核苷酸序列的突變，以改變所編碼的多肽的一種或多種性質(zhì)(例如其結(jié)合結(jié)構(gòu)域或Fab抗原結(jié)合片段的結(jié)合親和力)，或特定Fc區(qū)的功能、或Fc區(qū)對(duì)特定FcγR的親和力。位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且廣泛用于產(chǎn)生多肽和多核苷酸的變體。例如，位點(diǎn)特異性誘變常常用于改變DNA分子的特定部分。在此類實(shí)施方案中，應(yīng)用通常包含長(zhǎng)度為約14-約25個(gè)核苷酸左右的引物，其在待改變的序列接合處的兩側(cè)具有約5-約10個(gè)殘基。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，位點(diǎn)特異性誘變技術(shù)一般是采用以單鏈和雙鏈兩種形式存在的噬菌體載體。用于定點(diǎn)誘變的典型載體包括諸如M13噬菌體的載體。這些噬菌體容易購(gòu)買并且其應(yīng)用對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是眾所周知的。雙鏈質(zhì)粒也常規(guī)地應(yīng)用于定點(diǎn)誘變中，其省去了將目的基因從質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至噬菌體的步驟。通常，在此的定點(diǎn)誘變是通過首先獲得單鏈載體或雙鏈載體的融解來的兩條鏈來進(jìn)行，所述載體在其序列中包含編碼所需肽的DNA序列。制備，通常是通過合成方法，具有所需突變序列的寡核苷酸引物。然后使該引物與單鏈載體退火，并受DNA聚合酶如大腸桿菌聚合酶IKlenow片段的作用，以便完成帶有突變的鏈的合成。由此，就形成了異源雙螺旋，其中一條鏈編碼原始的未突變序列而第二條鏈帶有所需的突變。然后用該異源雙螺旋載體轉(zhuǎn)化合適的細(xì)胞，如大腸桿菌細(xì)胞，并選擇出包含重組載體(其具有突變的序列結(jié)構(gòu))的克隆。利用定點(diǎn)誘變來制備編碼所選肽的DNA區(qū)段的序列變體，提供了產(chǎn)生可能有用的物種的一種方法，而這并不意圖受限，因?yàn)檫€有其它途徑可以獲得肽以及編碼它們的DNA序列的序列變體，例如，可用誘變劑如羥胺對(duì)編碼所需肽序列的重組載體進(jìn)行處理以獲得序列變體。關(guān)于這些方法和方案的具體細(xì)節(jié)參見Maloyetal.,1994;Segal,1976;ProkopandBajpai,1991;Kuby,1994;和Maniatisetal.,1982的教導(dǎo)，每一篇都在此并入本文中，用于該目的。本文所用術(shù)語“寡核苷酸定向誘變程序”是指模板依賴的過程和載體介導(dǎo)的增殖，其導(dǎo)致特定的核酸分子濃度的提高(相對(duì)于其初始濃度而言)，或?qū)е驴蓹z測(cè)信號(hào)(例如擴(kuò)增)的濃度的提高。本文所用術(shù)語“寡核苷酸定向誘變程序”意指涉及引物分子的模板依賴性延伸的過程。術(shù)語模板依賴的過程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中核酸的新合成鏈的序列是通過公知的堿基互補(bǔ)配對(duì)原則來指導(dǎo)的(參照例如，Watson,1987)。通常，載體介導(dǎo)的方法學(xué)涉及將核酸片段引入DNA載體或RNA載體、載體的克隆擴(kuò)增、以及經(jīng)過擴(kuò)增的核酸片段的回收。此類方法學(xué)的實(shí)例由美國(guó)專利第4,237,224號(hào)提供，其全部?jī)?nèi)容在此具體并入本文中。在用于產(chǎn)生多肽變體的另一個(gè)方法中，可應(yīng)用如美國(guó)專利第5,837,458號(hào)中所述的循環(huán)的序列重組(recursivesequencerecombination)。在該方法中，進(jìn)行重組的迭代循環(huán)和篩選或選擇以“進(jìn)化”具有例如增加的結(jié)合親和力的單獨(dú)的多核苷酸變體。某些實(shí)施方案還提供了質(zhì)粒、載體、轉(zhuǎn)錄盒或表達(dá)盒形式的構(gòu)建體，其包含本文所述的至少一種多核苷酸。在某些實(shí)施方案中，將分離的多核苷酸插入載體中。本文所用術(shù)語“載體”是指編碼蛋白的多核苷酸可共價(jià)插入其中以引起蛋白表達(dá)和/或多核苷酸克隆的媒介?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何合適的方法將分離的多核苷酸插入載體中，例如但不限于，可使用合適的限制性酶來消化載體，并接著將其與具有匹配的限制性末端的分離的多核苷酸連接。合適的載體的實(shí)例包括但不限于：質(zhì)粒、噬菌粒、柯斯質(zhì)粒、人工染色體如酵母人工染色體(YAC)、細(xì)菌人工染色體(BAC)或Pl來源的人工染色體(PAC)、噬菌體如λ噬菌體或Μ13噬菌體以及動(dòng)物病毒。用作載體的動(dòng)物病毒種類的實(shí)例包括但不限于：逆轉(zhuǎn)錄病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒(如單純皰疹病毒)、痘病毒、桿狀病毒、乳頭瘤病毒和乳頭多瘤空泡病毒(如SV40)。對(duì)于多肽的表達(dá)，可將載體引入宿主細(xì)胞中以允許多肽在宿主細(xì)胞中表達(dá)。表達(dá)載體可包含用于控制表達(dá)的多種元件，包括但不限于啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列、可選擇標(biāo)志物和信號(hào)序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可視情況選擇這些元件。例如，可選擇啟動(dòng)子序列以促進(jìn)載體中多核苷酸的轉(zhuǎn)錄。合適的啟動(dòng)子序列包括但不限于T7啟動(dòng)子、T3啟動(dòng)子、SP6啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、EF1a啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng)子和SV40啟動(dòng)子?？蛇x擇增強(qiáng)子序列以增強(qiáng)多核苷酸的轉(zhuǎn)錄?？梢赃x擇可選擇標(biāo)志物以便允許將插入載體的宿主細(xì)胞從未插入所述載體的宿主細(xì)胞中選擇出來，例如可選擇標(biāo)志物可為賦予抗生素抗性的基因?？蛇x擇信號(hào)序列以便允許所表達(dá)的多肽被運(yùn)輸至宿主細(xì)胞之外。載體還可包含幫助其進(jìn)入細(xì)胞的物質(zhì)，包括但不限于病毒顆粒、脂質(zhì)體或蛋白衣殼。對(duì)于多核苷酸的克隆，可將載體引入宿主細(xì)胞(分離的宿主細(xì)胞)中以允許載體自身復(fù)制并由此擴(kuò)增包含在其中的多核苷酸拷貝?？寺≥d體可包含序列組分，一般包括但不限于：復(fù)制起點(diǎn)、啟動(dòng)子序列、轉(zhuǎn)錄起始序列、增強(qiáng)子序列和可選擇標(biāo)志物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可視情況選擇這些元件。例如，可選擇復(fù)制起點(diǎn)以促進(jìn)載體在宿主細(xì)胞中的自主復(fù)制。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了包含本文提供的載體的分離的宿主細(xì)胞。包含載體的宿主細(xì)胞可用于所述載體中包含的多核苷酸的表達(dá)或克隆。合適的宿主細(xì)胞可包括但不限于原核細(xì)胞、真菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞或高等真核細(xì)胞例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。用于該目的合適的原核細(xì)胞包括但不限于：真細(xì)菌類，諸如革蘭氏陰性生物體或革蘭氏陽性生物體，例如腸桿菌科，諸如埃希氏菌屬(Escherichia)例如大腸桿菌(E.coli)、腸桿菌屬(Enterobacter)、歐文氏菌屬(Erwinia)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)、變形菌屬(Proteus)、沙門氏菌屬(Salmonella)例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、沙雷氏菌屬(Serratia)例如粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratiamarcescans)、和志賀氏菌屬(Shigella)、以及芽孢桿菌屬(Bacilli)諸如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、假單胞菌屬(Pseudomonas)諸如銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)、和鏈霉菌屬(Streptomyces)。本領(lǐng)域已建立抗體和抗原結(jié)合片段在原核細(xì)胞如大腸桿菌中的表達(dá)。對(duì)于綜述，參見例如Pluckthun,A.Bio/Technology9:545-551(1991)。培養(yǎng)的真核細(xì)胞的表達(dá)也被本領(lǐng)域技術(shù)人員用作產(chǎn)生抗體或其抗原結(jié)合片段的選擇，參見最近的綜述，例如Ref,M.E.(1993)Curr.OpinionBiotech.4:573-576;TrillJ.J.etal.(1995)Curr.OpinionBiotech6:553-560。用于該目的的合適的真菌細(xì)胞包括但不限于絲狀真菌和酵母。真菌細(xì)胞的示例性實(shí)例包括釀酒酵母、普通面包酵母、裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、克魯維酵母(Kluyveromyces)宿主諸如例如乳酸克魯維酵母(K.1actis)、脆弱克魯維酵母(K.fragilis,ATCC12，424)、保加利亞克魯維酵母(K.bulgaricus，ATCC16,045)、威克克魯維酵母(K.wickeramii,ATCC24,178)、瓦提克魯維酵母(K.waltii,ATCC56,500)、果蠅克魯維酵母菌(K.drosophilarum,ATCC36,906)、耐熱克魯維酵母(K.thermotoIerans)和馬克斯克魯維酵母(K.marxianus)；耶氏酵母屬(yarrowia,EP402,226)；畢赤酵母(Pichiapastoris,EP183,070)；假絲酵母屬(Candida)；里氏木霉(Trichodermareesia,EP244,234)；粗糖脈抱菌(Neurosporacrassa)；許旺酵母屬(Schwanniomyces)諸如西方許旺酵母(Schwanniomycesoccidentalis)；和絲狀真菌，諸如例如脈孢菌屬(Neurospora)、青霉菌屬(Penicillium)、彎頸霉屬(Tolypocladium)和曲霉屬(Aspergillus)宿主，諸如溝巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。高等真核細(xì)胞，特別是來源于多細(xì)胞生物體的那些可用于本文提供的糖基化多肽的表達(dá)。合適的高等真核細(xì)胞包括但不限于無脊椎動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞，以及脊椎動(dòng)物細(xì)胞。無脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括植物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。已鑒定出來自以下宿主的大量桿狀病毒株和變體以及相應(yīng)寄主性昆蟲宿主細(xì)胞：例如草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛蟲)、埃及伊蚊(Aedesaegypti)(蚊子)、白紋伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)(果蜆)、和家蠶(Bombyxmori))。多種用于轉(zhuǎn)染的病毒株可公開獲得，例如，苜猜銀紋夜蛾(Autographacalifornica)NPV的K-1變體和家蠶NPV的Bm-5株，并且這些病毒可依照本發(fā)明用作本文中的病毒，尤其是用于草地貪夜蛾細(xì)胞的轉(zhuǎn)染。棉花、玉米、馬鈴薯、大豆、矮牽牛、西紅柿和煙草的植物細(xì)胞培養(yǎng)物亦可用作宿主。脊椎動(dòng)物細(xì)胞的實(shí)例包括，哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞系，如通過SV40轉(zhuǎn)化的猴腎CVl細(xì)胞系(COS-7,ATCCCRL1651)；人胚腎細(xì)胞系(293或亞克隆用于在懸浮培養(yǎng)物中生長(zhǎng)的293細(xì)胞，Grahametal.,J.GenVirol.36:59(1977))；幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞(BHK,ATCCCCL10)；中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞/-DHFR(CHO,Urlaubetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:4216(1980))；小鼠塞爾托利細(xì)胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980))；猴腎細(xì)胞(CVlATCCCCL70)；非洲綠猴腎細(xì)胞(VERO-76,ATCCCRK-1587)；人子宮頸癌細(xì)胞(HELA,ATCCCCL2)；犬腎細(xì)胞(MDCK,ATCCCCL34)；布法羅大鼠肝細(xì)胞(BRL3A,ATCCCRL1442)；人肺細(xì)胞(W138,ATCCCCL75)；人肝細(xì)胞(HepG2,HB8065)；小鼠乳腺腫瘤(MMT060562,ATCCCCL51)；TRI細(xì)胞(Matheretal.,AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982))；MRC5細(xì)胞；FS4細(xì)胞；和人肝癌細(xì)胞系(HepG2)?？衫帽绢I(lǐng)域已知的任何合適方法將載體引入宿主細(xì)胞中，所述方法包括但不限于：DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的遞送、磷酸鈣沉淀法、陽離子脂質(zhì)介導(dǎo)的遞送、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、電穿孔法、微粒轟擊、受體介導(dǎo)的基因遞送、由聚賴氨酸，組蛋白，殼聚糖，和肽介導(dǎo)的遞送。用于目的載體表達(dá)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)方法為本領(lǐng)域已知。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼第一多肽的第一載體和編碼第二多肽的第二載體。在某些實(shí)施方案中，所述第一載體和所述第二載體可為相同或不同的。在某些實(shí)施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽可為相同或不同的。在某些實(shí)施方案中，所述第一載體和所述第二載體可被同時(shí)引入或不同時(shí)引入。在某些實(shí)施方案中，可將所述第一載體和所述第二載體一同引入宿主細(xì)胞中。在某些實(shí)施方案中，可先將所述第一載體引入宿主細(xì)胞中，并接著引入所述第二載體。在某些實(shí)施方案中，可將所述第一載體引入宿主細(xì)胞中，并接著建立表達(dá)所述第一多肽的穩(wěn)定細(xì)胞系，再接著將所述第二載體引入所述穩(wěn)定的細(xì)胞系中。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞包含編碼第一多肽和第二多肽的載體。在某些實(shí)施方案中，所述第一多肽和所述第二多肽可為相同或不同的。在某些實(shí)施方案中，本公開提供了表達(dá)本文提供的多肽的方法，所述方法包括在表達(dá)載體中插入的多核苷酸的條件下，培養(yǎng)包含所述載體的宿主細(xì)胞。多核苷酸表達(dá)的合適的條件可包括但不限于：合適的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中宿主細(xì)胞的合適的密度、存在必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、存在補(bǔ)充因子、合適的溫度和濕度以及不存在微生物污染物。本領(lǐng)域技術(shù)人員可視情況選擇用于表達(dá)目的的合適的條件。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽可形成二聚體，并由此產(chǎn)生本文提供的MSFP二聚體或多肽復(fù)合體。在某些實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞中表達(dá)的多肽可形成同源二聚體的多肽復(fù)合體。在某些實(shí)施方案中，如果宿主細(xì)胞中表達(dá)第一多肽和第二多肽，則所述第一多肽和所述第二多肽可形式異源二聚體的多肽復(fù)合體。在某些實(shí)施方案中，多肽復(fù)合體可在宿主細(xì)胞中形成。例如，二聚體可在相關(guān)酶和/或輔因子的幫助下在宿主細(xì)胞中形成。在某些實(shí)施方案中，多肽復(fù)合體可分泌至細(xì)胞外。在某些實(shí)施方案中，所述第一多肽和第二多肽可分泌至細(xì)胞外并在宿主細(xì)胞外形成二聚體。在某些實(shí)施方案中，所述第一多肽和第二多肽可分別表達(dá)并允許在合適的條件下二聚化。例如，可將所述第一多肽和第二多肽在合適的緩沖液中組合并允許第一蛋白單體和第二蛋白單體通過合適的相互作用例如疏水相互作用來二聚化。對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，可將所述第一多肽和第二多肽在包含酶和/或輔因子的合適的緩沖液中組合，所述酶和/或輔因子可促進(jìn)所述第一多肽和第二多肽的二聚化。對(duì)于另一個(gè)實(shí)例，可將所述第一多肽和第二多肽在合適的媒介中組合并允許其在存在合適的試劑和/或催化劑的情況下彼此相互作用?？衫萌魏魏线m的方法來收集所表達(dá)的多肽和/或多肽復(fù)合體。多肽和/或多肽復(fù)合體可在細(xì)胞內(nèi)、在細(xì)胞周質(zhì)間隙中表達(dá)，或分泌至細(xì)胞外進(jìn)入培養(yǎng)基中。如果多肽和/或多肽復(fù)合體在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，可裂解包含所述多肽和/或所述多肽復(fù)合體的宿主細(xì)胞，并可通過離心或超濾去除不想要的碎片來從裂解物中分離所述多肽和/或所述多肽復(fù)合體。若所述多肽和/或所述多肽復(fù)合體分泌至大腸桿菌的細(xì)胞周質(zhì)間隙，可在存在諸如醋酸鈉(PH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的試劑的情況下在約30分鐘內(nèi)將胞漿解凍，并通過離心除去細(xì)胞碎片(Carteretal.,BioTechnology10:163-167(1992))。若所述多肽和/或所述多肽復(fù)合體分泌至培養(yǎng)基中，可利用市售的蛋白濃縮過濾器(例如Amicon或MilliporePellicon超濾裝置)收集并濃縮細(xì)胞培養(yǎng)物的上清液。在收集和濃縮步驟中可包含蛋白酶抑制劑和/或抗生素以抑制蛋白降解和/或污染微生物的生長(zhǎng)?？赏ㄟ^合適的方法來進(jìn)一步純化所表達(dá)的多肽和/或多肽復(fù)合體，所述方法例如包括但不限于：親和層析法、羥基磷灰石層析法、尺寸排阻層析法、凝膠電泳、透析、在離子交換柱上的離子交換分離法、乙醇沉淀、反相HPLC、硅膠色譜法、肝素瓊脂糖色譜法、陰離子或陽離子交換樹脂的層析(例如聚天冬氨酸柱)、色譜聚焦法、SDS-PAGE和硫酸銨沉淀法(參見綜述Bonner,P.L.,Proteinpurification,Taylor&Francis,2007出版;Janson,J.C.,etal,Proteinpurification:principles,highresolutionmethodsandapplications,Wiley-VCH,1998出版)。在某些實(shí)施方案中，所述多肽和/或多肽二聚體可通過親和層析法來純化。在某些實(shí)施方案中，蛋白A層析或蛋白A/G(蛋白A和蛋白G的融合蛋白)層析可用于純化包含來源于抗體CH2結(jié)構(gòu)域和/或CH3結(jié)構(gòu)域的組分的多肽和/或多肽復(fù)合體(Lindmarketal.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983));Zettlit,K.A.,AntibodyEngineering,PartV,531-535,2010)。在某些實(shí)施方案中，蛋白G層析可用于純化包含IgGγ3重鏈的多肽和/或多肽復(fù)合體(Gussetal.,EMBOJ.5:15671575(1986))。在某些實(shí)施方案中，蛋白L層析可用于純化包含κ輕鏈的多肽和/或多肽復(fù)合體(Sudhir,P.,Antigenengineeringprotocols,Chapter26,HumanaPress,1995出版;Nilson,B.H.K.etal,J.Biol.Chem.,267,2234-2239(1992))。親和配體連接的基質(zhì)最常見的是瓊脂糖，但可使用其它基質(zhì)。相比瓊脂糖能實(shí)現(xiàn)的，機(jī)械穩(wěn)定的基質(zhì)諸如可控多孔玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯具有更快的流速和更短的處理時(shí)間。如果抗體包含CH3結(jié)構(gòu)域，BakerbondABX樹脂(J.T.Baker,Phillipsburg,N.J.)可用于純化。在任何初步純化步驟之后，包含目的抗體和污染物的混合物可采用pH在約2.5-4.5的洗脫緩沖液，進(jìn)行低pH疏水相互作用層析，優(yōu)選在低鹽濃度(例如約0-0.25M鹽)下進(jìn)行。藥物組合物及使用方法本公開提供了包含本文所述的MSFP的組合物及此類組合物在多種治療設(shè)施中的給藥。呈純的形式或處于合適的藥物組合物中的本文所述的MSFP的給藥，可經(jīng)由任何可接受的藥劑給藥方式來進(jìn)行，用于提供相似的功效。所述藥物組合物可通過將MSFP或包含MSFP的組合物與合適的生理上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合，并可配制成呈固體、半固體、液體或氣體形式的制劑，例如片劑、膠囊劑、粉劑、顆粒體、軟膏劑、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球和氣溶膠。此外，所述組合物中可存在但非必需存在其它的藥物活性成分(包括本文其它地方所述的其它抗癌劑)和/或合適的賦形劑例如鹽、緩沖劑和穩(wěn)定劑。給藥可通過多種不同的途徑(包括口服、腸胃外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、皮下或局部)來實(shí)現(xiàn)。優(yōu)選的給藥方式視待治療或預(yù)防的病癥的性質(zhì)而定。給藥后，減少、抑制、預(yù)防或延遲癌癥進(jìn)程和/或癌癥轉(zhuǎn)移的量被認(rèn)為是有效的。在某些實(shí)施方案中，施用量足以導(dǎo)致腫瘤消退，如通過活腫瘤量的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著的下降(例如，腫瘤塊減少至少50%)所示，或通過改變(例如，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的降低)掃描尺寸所示。在其它實(shí)施方案中，施用量足以導(dǎo)致臨床醫(yī)師已知的疾病癥狀的臨床相關(guān)的減少。精確的劑量和治療持續(xù)時(shí)間是所治療的疾病的函數(shù)，并且可以利用已知的試驗(yàn)方案或通過在本領(lǐng)域中已知的模型系統(tǒng)中測(cè)試組合物并從其推斷憑經(jīng)驗(yàn)來確定。也可以進(jìn)行受控的臨床試驗(yàn)。劑量也可以隨待緩解的疾病的嚴(yán)重程度而變化。通常配制和給予藥物組合物以發(fā)揮治療上有用的效果，同時(shí)盡量減少不希望的副作用。所述組合物可以給予一次，或可以被分成許多較小的劑量在一定時(shí)間間隔給藥。對(duì)于任何特定受試對(duì)象，具體的劑量方案可根據(jù)個(gè)體需要隨著時(shí)間的推移進(jìn)行調(diào)整。含MSFP的組合物可單獨(dú)給予或與其它已知的癌癥治療，例如放射療法、化學(xué)療法、移植、免疫療法、激素療法、光動(dòng)力學(xué)療法等聯(lián)用。所述組合物還可與抗生素聯(lián)用。因此，給予這些及相關(guān)藥物組合物的典型途徑包括但不限于：口服、局部、透皮、吸入、腸胃外、舌下、口腔、直腸、陰道和鼻內(nèi)。本文所用術(shù)語腸胃外包括皮下注射、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、胸骨內(nèi)注射或輸注技術(shù)。依照本發(fā)明的某些實(shí)施方案的藥物組合物如此配制以便在將所述組合物給予患者后，允許其中包含的活性成分為生物可利用的。將給予受試對(duì)象或患者的組合物可采用一個(gè)或多個(gè)劑量單位的形式，例如，其中片劑可為單個(gè)劑量單位，而呈氣溶膠形式的本文所述的MSFP的容器可容納多個(gè)劑量單位。制備此類劑型的實(shí)際方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員已知或?qū)Ρ绢I(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的；例如參見Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,20thEdition(PhiladelphiaCollegeofPharmacyandScience,2000)。待給予的組合物，在任何情況下應(yīng)包含有效量的本公開的MSFP，用于依照本文的教導(dǎo)治療目的疾病或目的病癥。藥物組合物可呈固體或液體形式，在一個(gè)實(shí)施方案中，載體為顆粒，從而使組合物例如呈片劑或粉劑形式。載體可為液體，組合物是例如，口服油、可注射液或氣溶膠，其可在例如吸入給藥中使用。當(dāng)預(yù)期用于口服給藥時(shí)，藥物組合物優(yōu)選呈固體或液體形式，其中半固體、半液體、懸浮液和凝膠形式均包括在本文考慮的諸如固體或液體的形式之內(nèi)。作為用于口服給藥的固體組合物，所述藥物組合物可配制為粉劑、顆粒劑、壓縮片劑、丸劑、膠囊劑、咀嚼膠、薄片等。此類固體組合物通常包含一種或多種惰性稀釋劑或可食用載體。另外，可存在一種或多種以下物質(zhì)：粘合劑如羧甲基纖維素、乙基纖維素、微晶纖維素、黃蓍膠或明膠；賦形劑如淀粉、乳糖或糊精；崩解劑如藻酸、藻酸鈉、羥乙酸鈉、玉米淀粉等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂或Sterotex；助流劑如膠體二氧化硅；甜味劑如蔗糖或糖精；調(diào)味劑如薄荷、水楊酸甲酯或橙調(diào)味劑以及著色劑。當(dāng)藥物組合物呈膠囊形式如明膠膠囊時(shí)，除以上類型的特質(zhì)之外其可包含，液態(tài)載體如聚乙二醇或油。藥物組合物可呈液體形式，例如酏劑、糖漿、溶液、乳液或懸浮液。作為兩個(gè)實(shí)例，液體可用于口服給藥或通過注射遞送。當(dāng)預(yù)期用于口服給藥時(shí)，優(yōu)選的組合物除包含本發(fā)明的化合物之外，還包含甜味劑、防腐劑、染料/著色劑和增味劑中的一種或多種。在預(yù)期通過注射給藥的組合物中，可以包含表面活性劑、防腐劑、潤(rùn)濕劑、分散劑、助懸劑、緩沖液、穩(wěn)定劑和等滲劑中的一種或多種。液體藥物組合物，無論其是溶液、懸浮液還是其它類似的形式，均可包含一種或多種以下佐劑：無菌稀釋劑例如注射用水、鹽溶液、優(yōu)選生理鹽水、林格氏溶液、等滲氯化鈉、不揮發(fā)性油如可用作溶劑或懸浮介質(zhì)的合成的單甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶劑；抗菌劑如芐醇或羥苯甲酸甲酯；抗氧化劑如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑如乙二胺四乙酸；緩沖劑如乙酸鹽、檸檬酸鹽或磷酸鹽；以及用于調(diào)整滲透壓的試劑，如氯化鈉或葡萄糖。腸胃外制劑可封裝于安瓿、一次性注射器或玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。生理鹽水是優(yōu)選的佐劑。可注射藥物組合物優(yōu)選是無菌的。旨在腸胃外給藥或口服給藥的液體藥物組合物應(yīng)包含這樣的量的本文公開的MSFP，該量使得將獲得合適的劑量。通常，該量為組合物的至少0.01%。當(dāng)預(yù)期用于口服給藥時(shí)，該量可為組合物重量的0.1-約70%。某些口服藥物組合物包含約4%-約75%的MSFP。在某些實(shí)施方案中，制備本發(fā)明的藥物組合物和制劑致使稀釋之前腸胃外劑量單位包含0.01-10%重量比的MSFP。藥物組合物可旨在局部給藥，在該情況下載體可適合地包括溶液、乳液、軟膏或凝膠基質(zhì)。所述基質(zhì)例如，可包括以下的一種或多種：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蠟、礦物油，稀釋劑如水和醇，以及乳化劑和穩(wěn)定劑。用于局部給藥的藥物組合物中可存在增稠劑。若預(yù)期用于透皮給藥，所述組合物可包含透皮貼劑或離子電滲裝置。所述藥物組合物可預(yù)期用于直腸給藥，例如呈栓劑的形式，其將在直腸中融化并釋放藥物。用于直腸給藥的組合物可包含油脂性基質(zhì)作為合適的無刺激性賦形劑。此類基質(zhì)包括但不限于：羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。藥物組合物可包含修改固體或液體劑量單位的物理形式的多種物質(zhì)。例如，組合物可包含在活性成分周圍形成涂層外殼的物質(zhì)。形成涂層外殼的物質(zhì)通常是惰性的，并且可選自例如，糖、蟲膠和其它的腸溶包衣劑?；蛘撸龌钚猿煞挚砂庥诿髂z膠囊中。呈固體或液體形式的藥物組合物可包含能結(jié)合本發(fā)明的抗體并從而有助于化合物的遞送的藥劑?？梢杂羞@種能力的合適的藥劑包括其他的單克隆抗體或多克隆抗體，一種或多種蛋白或脂質(zhì)體。所述藥物組合物可基本上由可作為氣溶膠給藥的劑量單位組成。術(shù)語氣溶膠用于表示從膠體性質(zhì)的系統(tǒng)至由加壓包組成的系統(tǒng)的各種系統(tǒng)。遞送可以通過液化或壓縮氣體或通過適當(dāng)?shù)哪芊峙浠钚猿煞值谋孟到y(tǒng)。氣溶膠可以以單相、雙相或三相系統(tǒng)遞送以遞送活性成分。氣溶膠的遞送包括必要的容器、活化劑、閥、子容器等，其可一同形成試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多的實(shí)驗(yàn)就可確定優(yōu)選的氣溶膠。藥物組合物可通過在制藥領(lǐng)域中熟知的方法來制備。例如，旨在通過注射給藥的藥物組合物可通過以下來制備：將包含本文所述的MSFP的組合物和任選的鹽、緩沖劑和/或穩(wěn)定劑中的一種或多種，以及無菌蒸餾水組合以形成溶液?？杉尤氡砻婊钚詣┮源龠M(jìn)均勻的溶液或懸浮液的形成。表面活性劑為與MSFP組合物非共價(jià)地相互作用，以促進(jìn)含水遞送系統(tǒng)中MSFP組合物的溶解或均勻懸浮的化合物?？梢砸灾委熡行Я拷o予組合物，所述治療有效量應(yīng)取決于多種因素，包括應(yīng)用的特定化合物(例如MSFP)的活性；化合物的代謝穩(wěn)定性和作用時(shí)間；患者的年齡、體重、一般健康狀況、性別及飲食、給藥方式和給藥時(shí)間；排泄速率；藥物組合；特定疾病或病癥的嚴(yán)重程度；以及受試對(duì)象進(jìn)行治療的情況。一般而言，治療有效日劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物)為約0.001mg/kg(即0.07mg)-約100mg/kg(即7.0g)；優(yōu)選的治療有效劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物)為約0.01mg/kg(即0.7mg)-約50mg/kg(即3.5g)，更優(yōu)選的治療有效劑量(對(duì)于70kg的哺乳動(dòng)物)為約1mg/kg(即70mg)-約25mg/kg(即1.75g)。包含本公開的MSFP的組合物也可與一種或多種其它治療劑同時(shí)給藥、在其之前或之后給藥。這樣的組合療法可包括含有本發(fā)明的化合物和一種或多種另外的活性藥劑的單一藥物劑型的給藥，以及包含本發(fā)明的MSFP的組合物和以其各自獨(dú)立的藥物劑型的每種活性藥劑的給藥。例如，本文所述的MSFP及其他活性藥劑可以以單一口服劑量組合物(如片劑或膠囊劑)一同給予患者，或以單獨(dú)的口服劑劑型給予每種藥劑。類似地，本文所述的MSFP及其他活性藥劑可以以單一腸胃外給藥組合物(例如鹽溶液或其他生理上可接受的溶液)一同給予患者，或者以單獨(dú)的腸胃外劑型給予每種藥劑。如果使用單獨(dú)的劑型，包含MSFP的組合物及一種或多種另外的活性藥劑可基本在同一時(shí)間(即同時(shí))給藥，或在錯(cuò)開的時(shí)間(即，相繼和以任何順序)單獨(dú)給藥；聯(lián)合治療應(yīng)理解為包含所有這些方案。因此，在某些實(shí)施方案中，還應(yīng)考慮的是本公開的MSFP組合物與一種或多種其它治療劑的聯(lián)合給藥。此類治療劑可在本領(lǐng)域中被公認(rèn)為是用于本文所述的特定疾病狀態(tài)(例如癌癥、炎性疾病、異體移植、I型糖尿病和多發(fā)性硬化癥)的標(biāo)準(zhǔn)治療。所考慮的示例性的治療劑包括細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、類固醇、NSAID、DWARD、抗炎劑、化療劑、放療劑、或其它活性劑和輔助劑。在某些實(shí)施方案中，本文公開的MSFP可與多種化療劑聯(lián)合給藥。化療劑的實(shí)例包括烷化劑類，諸如噻替哌(thiotepa)和環(huán)磷酰胺(cyclosphosphamide)(CYTOXANTM)；烷基磺酸酯類，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶類，諸如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)和烏瑞替哌(uredopa)；乙撐亞胺類(ethylenimines)和甲基蜜胺類(methylemelamines),包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撐蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撐磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撐硫代憐酉先胺(triethylenethiophosphaoramide)和三輕甲蜜胺(trimethylmelamine)；氮芥類，諸如氯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、環(huán)磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)、雙氯乙基甲胺(mechlorethamine)、鹽酸氧氮芥(mechlorethamineoxidehydrochloride)、美法侖(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥膽留醇(phenesterine)、松龍苯芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracilmustard)；硝基脲類，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(1mustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)；抗生素類，諸如阿克拉霉素(aclacinomysin)、放線菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、氮絲氨酸(azaserine)、博來霉素(bleomycin)、放線菌素C(cactinomycin)、加利車霉素(calicheamicin)、carabicin、洋紅霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放線菌素D(dactinomycin)、柔紅霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依達(dá)比星(idambicin)、麻西羅霉素(marcel1mycin)、絲裂霉素(mitomycin)、霉酌酸(mycophenolicacid)、諾加霉素(nogalamycin)、橄欖霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(porfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三鐵阿霉素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲霉素(streptozocin)、殺結(jié)核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、凈司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物類，諸如甲氨喋呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸(denopterin)、甲氨噪呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達(dá)拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙脫氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)、5-FU；雄激素類，諸如卡普睪酮(calusterone)、丙酸甲雄烷酮(dromostanolonepropionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄焼(mepitiostane)、睪內(nèi)酯(testolactone)；抗腎上腺類，諸如氨魯米特(aminoglutethimide)、曼托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補(bǔ)充劑，諸如亞葉酸；醋葡內(nèi)酯(aceglatone)；醒磷酰胺糖苷(aldophosphamideglycoside)；氨基酮戊酸(aminolevulinicacid)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依達(dá)曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(efornithine)；依利醋銨(elliptiniumacetate)；依托格魯(etoglucid)；硝酸鎵；輕脲；香燕多糖(Ientinan)；氯尼達(dá)明(1nidamine)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達(dá)醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；卩吡柔比星(pirarubicin)；鬼臼酸(podophyllinicacid)；2-乙基肼；甲基芐肼(procarbazine)；PSK.RTM；雷佐生(razoxane)；西佐喃(sizofiran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細(xì)格孢氮雜酸(tenuazonicacid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；烏拉坦(urethan)；長(zhǎng)春地辛(vindesine)；達(dá)卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine);二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛(wèi)矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)；噻替哌；紫杉醇(taxoid)，例如帕立他塞(paclitaxel)(Bristol-MyersSquibbOncology,Princeton,NJ)和多西他塞(doxetaxel)(Rhtoe-PoulencRorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；吉西他濱(gemcitabine)；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨喋呤；鉬類似物，諸如順鉬和卡鉬；長(zhǎng)春堿(vinblastine)、鉬(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；異環(huán)磷酰胺(ifosfamide)；絲裂霉素C(mitomycinC)；米托蒽醌(mitoxantrone)；長(zhǎng)春新喊(vincristine)；長(zhǎng)春瑞賓(vinorelbine)；諾維本(navelbine)；諾安托(novantrone)；替尼泊苷(teniposide)；柔紅霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；希羅達(dá)(xelodd)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；CPT-11；拓?fù)洚悩?gòu)酶抑制劑RFS2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；視黃酸；埃斯波霉素(esperamicins)；卡培他濱(capecitabine)及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。在此治療劑中還包括作用于調(diào)節(jié)或抑制激素對(duì)腫瘤的作用的抗激素劑，諸如抗雌激素類，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-輕基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、奧那司酮(onapristone)、和托瑞米芬(toremifene)(Fareston)；和抗雄激素類，諸如氟他米特(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、尼魯米特(nilutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)、和戈舍瑞林(goserelin)及上述任何物質(zhì)的藥學(xué)可接受的鹽、酸或衍生物。多種其它治療劑可與本文所述的MSFP一同使用。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述MSFP與抗炎劑一起給藥。抗炎劑或抗炎藥包括但不限于，類固醇和糖皮質(zhì)激素(包括倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氫化可的松、氫化可的松、氫化可的松、甲潑尼龍、潑尼松龍、潑尼松、曲安西龍)、非甾體抗炎藥(NSAIDS)，包括阿司匹林、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、抗TNF藥物、環(huán)磷酰胺和麥考酚酸。包含本文所述的MSFP的組合物可給予患有本文所述的疾病的個(gè)體，所述疾病包括但不限于癌癥和自身免疫性疾病和炎性疾病。為了在體內(nèi)用于治療人類疾病，通常在給藥前將本文所述的MSFP摻入藥物組合物。藥物組合物包含本文所述的一種或多種MSFP以及本文其它地方所述的生理上可接受的載體或賦形劑。為了制備藥物組合物，將有效量的一種或多種MSFP與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的適于特定給藥方式的任何藥物載體或賦形劑混合。藥物載體可以是液體、半液體或固體。用于腸胃外、皮內(nèi)、皮下或局部應(yīng)用的溶液或懸浮液可包含，例如無菌稀釋劑(例如水)、鹽溶液、不揮發(fā)性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶劑；抗微生物劑(如芐醇、甲基對(duì)羥基苯甲酸酯、苯酚或甲酚、汞、氯丁醇、甲基和丙基對(duì)羥基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯銨和芐索氯銨)；抗氧化劑(如抗壞血酸和亞硫酸氫鈉、甲硫氨酸、硫代硫酸鈉、鉑、過氧化氫酶、檸檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巰基乙酸、硫代山梨醇、丁基羥基茴香醚、丁基羥基甲苯，和/或沒食子酸丙酯)和螯合劑(如乙二胺四乙酸(EDTA))；緩沖劑(如乙酸鹽，檸檬酸鹽和磷酸鹽)。若靜脈內(nèi)給藥，合適的載體包括生理鹽水或磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)以及含增稠劑和增溶劑例如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物的溶液。包含本文描述的MSFP的組合物可用保護(hù)MSFP免受體內(nèi)快速清除的載體(如緩釋制劑或包衣)制備。此類載體包括：控釋制劑，例如但不限于，植入物和微囊化遞送系統(tǒng)，以及生物可降解的、生物相容的聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他物質(zhì)。本發(fā)明的MSFP可用于治療多種癌癥。例如，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了用于治療癌癥的方法，包括給予癌癥患者治療有效量的本文所述的MSFP：所述癌癥包括但不限于以下的癌癥的治療：黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、漿細(xì)胞瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、腎細(xì)胞癌、子宮癌、胰腺癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、胃癌、食道癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或其它癌癥。在給藥后以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式抑制、預(yù)防或延遲癌癥進(jìn)程和/或癌癥轉(zhuǎn)移的量(即相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適對(duì)照)被認(rèn)為是有效的。另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的方法，包括給予癌癥患者治療有效量的本文所述的MSFP(例如在給藥后以統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的方式(即相對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的合適對(duì)照)抑制、預(yù)防或延遲癌癥轉(zhuǎn)移的量)：所述癌癥包括但不限于黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、漿細(xì)胞瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、腎細(xì)胞癌、子宮癌、胰腺癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、胃癌、食道癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或其它癌癥。另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于預(yù)防癌癥的方法，包括給予癌癥患者治療有效量的本文所述的MSFP：所述癌癥包括但不限于黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、漿細(xì)胞瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、腎細(xì)胞癌、子宮癌、胰腺癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、胃癌、食道癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或其它癌癥。另一個(gè)實(shí)施方案提供了用于治療、抑制以下疾病的進(jìn)程或用于預(yù)防以下疾病的方法，包括給予患有這些疾病中的一種或多種的患者治療有效量的本文所述的MSFP：黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金病、白血病、漿細(xì)胞瘤、肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胸腺瘤、乳腺癌、前列腺癌、結(jié)腸直腸癌、腎癌、腎細(xì)胞癌、子宮癌、胰腺癌、食道癌、腦癌、肺癌、卵巢癌、宮頸癌、睪丸癌、胃癌、食道癌、多發(fā)性骨髓瘤、肝細(xì)胞瘤、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)或其它癌癥。在一個(gè)方面，本公開提供了指導(dǎo)T細(xì)胞活化的方法，所述方法包括給予有所需要的患者有效量的MSFP，所述MSFP包含能特異性結(jié)合TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε或以上的組合的Fab以及融合部分，所述融合部分包含能特異性結(jié)合不同靶標(biāo)(例如腫瘤特異性抗原或在需要T細(xì)胞活化的部位或細(xì)胞處所選的其它抗原)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。實(shí)施例實(shí)施例1：人源化抗CD3抗體的產(chǎn)生通過以下步驟從已建立的抗-CD3雜交瘤中克隆出重鏈和輕鏈抗體基因：1)從雜交瘤細(xì)胞中提取出總RNA，2)雜交瘤總RNA的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和3)利用特異性抗體基因引物對(duì)HC和LC進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RTPCR用M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(NewEnglandBiolabs)與寡-dT16引物在37℃下進(jìn)行2小時(shí)?？贵w重鏈和輕鏈基因用以下引物對(duì)從寡-dT16引發(fā)的第一鏈cDNAPCR擴(kuò)增出來：HC5’:GAGACAGAATTCGCCACCATGGTGTTGGGGCTGAAGTG(SEQIDNO:103)，HC3’:GAGACAGCGGCCGCCTATTTACCAGGGGAGCGAGAC(SEQIDNO:104)和LC5’:GAGACAGAATTCGCCACCATGGCCTGGATTTCACTTATAC(SEQIDNO:105)，LC3’:GAGACAGCGGCCGCTCAGGAACAGTCAGCACGGGAC(SEQIDNO:106)。5’引物被設(shè)計(jì)成與抗體分泌信號(hào)退火，并且3’引物被設(shè)計(jì)成與小鼠抗體恒定區(qū)的3’端退火。洗滌PCR產(chǎn)物并用EcoRI和NotI進(jìn)行限制性消化，并接著將其克隆至pcDNA3.3載體上用于DNA序列測(cè)定和IgG在293F瞬時(shí)哺乳動(dòng)物系統(tǒng)中的重組表達(dá)?？寺〉目笴D3抗體被稱為1F3。1F3VHCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列提供于SEQIDNO:23-25中。1F3VLCDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列提供于SEQIDNO:26-28中。常規(guī)CDR移植技術(shù)用于1F3小鼠抗體的人源化。具體而言，將小鼠1F3的氨基酸序列與人種系序列(VBASE2,www.vbase2.org)進(jìn)行比對(duì)。小鼠1F3VH與人種系區(qū)段子類3(VH3)有最佳匹配。兩個(gè)代表性的種系區(qū)段，即VH3-23和VH3-73被選擇作為移植小鼠1F3CDR的受體。VH3-23已知是人抗體中存在的最常見的V結(jié)構(gòu)域，并且其有相對(duì)高的穩(wěn)定性。VH3-73具有最相似的HCDR2序列，表明相似的HCDR2結(jié)構(gòu)和構(gòu)象。對(duì)于VL，最佳匹配的人種系VLλ7A被選擇作為小鼠1F3輕鏈CDR的受體。通過gblock技術(shù)(整合DNA技術(shù))合成用于初始人源化構(gòu)建體的基因。初始人源化構(gòu)建體中氨基酸的其它變異用基于寡核苷酸的定點(diǎn)誘變(Strategene)來生成。下表1總結(jié)了所產(chǎn)生的各種重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的核苷酸序列和氨基酸序列。表1：1F3和變體序列如下表2總結(jié)了利用不同的人源化1F3VL和VH對(duì)產(chǎn)生的多種人源化抗體/Fab。表2：hu-1F3IgG和Fab變體實(shí)施例2：腫瘤抗原EPCAM蛋白的產(chǎn)生人和獼猴EpCAM(上皮細(xì)胞粘附分子)的胞外結(jié)構(gòu)域?qū)?yīng)的基因用含限制性位點(diǎn)的引物(SEQIDNO:107:N-端引物:GCGTATCCATGGATGGCGCCCCCGCAGGTC,SEQIDNO:108；C-端引物:GCGTATGCGGCCGCTTTTAGACCCTGCATTGAG)，用Phusion聚合酶(NewEnglandBiolabs)(98℃,1分鐘；98℃，15秒；50℃，20秒和72℃，20秒的30個(gè)循環(huán)；72℃,5分鐘)從人和猴cDNA文庫(kù)中PCR擴(kuò)增出來。洗滌后的PCR產(chǎn)物(Fermentaslifesciences)被限制性消化(NcoI和NotI)并克隆至pcDNA3.3載體的人Fc基因的N端。人EpCAM的ECD和全長(zhǎng)多核苷酸序列提供于SEQIDNO:1和5中；編碼的氨基酸序列提供于SEQIDNO:2和6中。獼猴EpCAM的ECD和全長(zhǎng)多核苷酸序列提供于SEQIDNO:3和7中；編碼的氨基酸序列提供于SEQIDNO:4和8中。還產(chǎn)生了人和獼猴的CD3εECD.Fc杵狀結(jié)構(gòu)突變體序列并分別提供于SEQIDNOs:9和11(多核苷酸)以及10和12(氨基酸)中。產(chǎn)生了人和獼猴CD3εECD.Fc臼狀結(jié)構(gòu)突變體序列，并分別提供在SEQIDNOs:13和15(多核苷酸)以及SEQIDNOs:14和16(氨基酸)中。正如本領(lǐng)域已知的，所述杵狀結(jié)構(gòu)突變和全突變可用于形成異源二聚化(參見例如Ridgewayetal.(1996),proteinEngineering9:617-621)。實(shí)施例3：用人ScFv噬菌體展示生成抗EpCAM的抗體一般方案參見噬菌體展示技術(shù)-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(EdsCarlosF.BarbasIII;DennisR.Burton;JamieK.Scott;GreggJ.Silverman,2001ColdSpringHarborLaboratoryPress)。天然人scFv噬菌體展示文庫(kù)用于EpCAM特異性抗體的分離(VivaBiotech,Shanghai,China)。應(yīng)用以下步驟用于第一輪噬菌體選擇：1)將50μL人天然ScFv文庫(kù)用500μl3%脫脂干奶粉/PBS(MPBS)封閉；2)將奶粉封閉的噬菌體用預(yù)包被了5μg/mlFc的免疫管在室溫下孵育30分鐘，重復(fù)2次；3)以500μg/ml的終濃度將Fc蛋白加入以上倒空的噬菌體中并在室溫下孵育以進(jìn)一步捕獲展示抗-FcScFv的噬菌體；4)將以上噬菌體溶液與包被了huEpCAM.Fc的免疫管(用5μg/ml的濃度包被并用MPBS封閉)在室溫下孵育1小時(shí)；5)將管用PBST(含0.1%Tween-20的PBS)洗滌3次并接著用PBS洗滌3次；6)將結(jié)合的噬菌體用500μl新鮮制備的100mM三乙胺溶液在室溫下洗脫10分鐘；7)將洗脫下來的噬菌體用于感染5ml中對(duì)數(shù)期TG1細(xì)胞，在37℃下靜置30分鐘，并在200rpm下振蕩30分鐘；8)將再次感染了洗脫的噬菌體的TG1細(xì)胞在30℃下，在補(bǔ)充了4%葡萄糖和100μg/ml氨芐青霉素的2xYT瓊脂大方形Nunc板上生長(zhǎng)過夜；9)將生長(zhǎng)過夜的TG1細(xì)胞從平板上刮下并接種于25ml的2xYT培養(yǎng)基(添加了100μg/ml氨芐青霉素和2%葡萄糖并在37℃下生長(zhǎng)至OD600)；10)將輔助噬菌體KO7加入TG1培養(yǎng)物中以挽救噬菌體(在37℃下30分鐘靜置，30分鐘振蕩)；11)將超感染的TG1細(xì)胞輕輕沉淀并重新懸浮于補(bǔ)充了100μg/ml氨芐青霉素和100μg/ml卡那霉素的2xYT培養(yǎng)基中，在37℃下振蕩過夜；12)將過夜培養(yǎng)物離心并將1/5體積的20%PEG8000加入含噬菌體的澄清上清液中并在室溫下孵育30分鐘；13)將沉淀的噬菌體在50ml錐形管中以3000rpm離心沉淀，持續(xù)20分鐘；14)沉淀噬菌體重新懸浮于PBS緩沖液中并準(zhǔn)備用于下一輪的選擇。第2輪選擇在cynoEpCAM.Fc上用上述相同的步驟完成。將從第2輪選擇洗脫的噬菌體再次引入TG1細(xì)胞中并在2×YT(100μg/ml的氨芐青霉素和2%葡萄糖)平板上涂板用于產(chǎn)生單菌落。將單個(gè)菌落挑入96孔板中，并進(jìn)行兩個(gè)板作為樣品的樣板。用上述類似的步驟并調(diào)整為更小的體積來培養(yǎng)96孔板中的單克隆噬菌體。清除的噬菌體上清液(通過將96孔板在3000rpm下離心5分鐘來清除)用于人和獼猴EpCAM.Fc抗原的ELISA結(jié)合測(cè)定，使用以下步驟：1)將噬菌體溶液以1:5稀釋于5%MPBS中，在室溫溫育1小時(shí)；2)將噬菌體MPBS溶液轉(zhuǎn)移至預(yù)包被了人EpCAM.Fc或獼猴EpCAM.Fc并用MPBS封閉的96孔Maxisorp板；3)將平板在室溫下孵育1小時(shí)并接著用PBST洗滌3次，4)將100μl的1/1000稀釋的抗M13/HRP綴合物加入平板中并在室溫下孵育1小時(shí)；5)用PBST洗滌3次，之后將100μlTMB過氧化物酶底物溶液加入平板中并在避光條件下孵育20分鐘；6)將50μl0.25M硫酸加入平板上的各孔中以終止底物顯色；7)在酶標(biāo)儀上于450nm處讀取吸光度。EpCAM陽性結(jié)合物是用來自樣板的大腸桿菌儲(chǔ)存液測(cè)序的DNA。實(shí)施例4：全人抗EPCAM抗體的優(yōu)化用gblock技術(shù)(整合DNA技術(shù))合成了抗EpCAM抗體的VH基因和VL基因。V基因gblock與那些分離形式的噬菌體展示技術(shù)相同或包含被設(shè)計(jì)用于提高V基因產(chǎn)物的表達(dá)和/或穩(wěn)定性的突變。突變的設(shè)計(jì)主要是基于與最佳匹配的種系序列或種系的共有序列(VBASE2www.vbase2.org)的序列比較或者通過檢查同源V結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)。VH和VLgblock利用PCR方法組裝成scFv形式。例如，EpCAM1.1包含EpCAM1.0中“HVI”至“QSV”的VL殘基1-3(Kabat編號(hào)，Kabatetal.(1991),sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thedition)的氨基酸改變。后者根據(jù)人種系序列(VBASE2，www.vbase2.org)是常見的。相對(duì)于EpCAM1.1，EpCAM1.2包含在VH的第1、5、6位和在VL的第39位的突變。相對(duì)于母體克隆，EpCAM2.2包含在VH的第5、6、13、40、76、77、81、82位和在VL的第2、8、39、58位的多個(gè)突變(Kabat編號(hào))?？笶pCAM抗體核苷酸和氨基酸序列總結(jié)于下表3中。表3：抗EpCAM抗體構(gòu)建*Δ表示無接頭利用如以下總結(jié)的抗EpCAM和hu-1F3.1構(gòu)建體來產(chǎn)生多種MSFP蛋白。以下總結(jié)的scFv是指抗-EpCAM的scFv。將His-標(biāo)簽與各Fab的Fd鏈的C端連接并且其沒有在圖解中顯示。·scFv-D(H)-hu-1F3.1Fab　-scFv-hu-1F3.1VH-CH1　-hu-1F3.1-LC　scFv-(H)-hu-1F3.1Fab　-scFv-GlyArgAla-hu-1F3.1VH-CH1　-hu-1F3.1-LC　scFv-D(L)-hu-1F3.1Fab　-hu-1F3.1VH-CH1　-scFv-hu-1F3.1-LC　scFv-(L)-hu-1F3.1Fab　-hu-1F3.1VH-CH1　-scFv-GlyArgAla-hu-1F3.1-LC　scFv-D(H+L)-hu-1F3.1Fab　-scFv-hu-1F3.1VH-CH1　-scFvhu-1F3.1-LC　scFv-(H+L)-hu-1F3.1Fab　-scFv-GlyArgAla-hu-1F3.1VH-CH1-scFv-GlyArgAla-hu-1F3.1-LC實(shí)施例5：重組IgG、Fc融合蛋白、Fab和Fab融合蛋白的表達(dá)和純化在采用pcDNA和HEK293F懸浮細(xì)胞(Invitrogen)的瞬時(shí)哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)Fab融合蛋白。將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至HEK293F細(xì)胞(Invitrogen)中，加入含預(yù)制DNA和25kD的聚乙烯亞胺(PEI)復(fù)合物(DNA與線性25kDPEI為1:3的重量比)的1/10細(xì)胞培養(yǎng)物體積的F-17合成培養(yǎng)基(Invitrogen)。轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，為在振蕩的5%濕度的CO2培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞提供25ml的20%TN1(OrganotechnieSA,France)。通常在轉(zhuǎn)染5天后收獲培養(yǎng)上清液，并用蛋白A(用于人IgG和Fc蛋白)、蛋白G(用于小鼠IgG)或HisTrap柱(帶his標(biāo)簽的Fab和帶his標(biāo)簽的Fab融合蛋白)(GEHealthcare)的親和層析來純化蛋白。在用10KD分子量截留旋管來進(jìn)行緩沖液交換之后，將蛋白貯存于4℃的PBS緩沖液中。蛋白通常用4-20%的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳，NOVEX微型凝膠)根據(jù)非還原和/或還原條件下(5%巰基乙醇)來進(jìn)行分析。實(shí)施例6：小鼠1F3和人源化1F3IgG以及CD3ε結(jié)合Fab相關(guān)的蛋白免疫印跡、ELISA和流式細(xì)胞術(shù)分析用于研究小鼠和人IF3抗體與Fab的結(jié)合。具體而言，在含5%巰基乙醇的SDS-PAGE樣品緩沖液中制備以下四種蛋白樣品(樣品1.人CD3ε/δ.Fc(K-H);2.獼猴CD3ε/δ.Fc(K-H)；3).人CD3εAA1-27.Fc，和4)對(duì)照肽Fc融合蛋白(CD3εAA1-27.Fc的前16個(gè)殘基的反向氨基酸序列。Fc(K-H)表示“杵-臼”Fc突變體(Ridgewayetal.(1996),proteinEngineering9:617-621)。將每種樣品的100ng蛋白上樣于4-20%tris-甘氨酸凝膠(NOVEX)各泳道中，并將樣品在1xSDS運(yùn)行緩沖液(25mMTris，192mM甘氨酸，0.1%SDS，pH8.3)中在125V下運(yùn)行1小時(shí)。用NOVEX轉(zhuǎn)移單元，將蛋白條帶在含20%甲醇的1xSDS運(yùn)行緩沖液中，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素(NC)膜上。NC膜用含5%干奶粉的TBS-T封閉，之后用1μg/ml生物素化的小鼠1F3IgG或與生物素化的1F3IgG在室溫下孵育1小時(shí)。在經(jīng)過3次每次5分鐘的洗滌之后，將膜用1:3000稀釋的鏈霉親和素-HRP綴合物孵育1小時(shí)。在經(jīng)過3次每次10分鐘的洗滌之后，將膜用ECL試劑顯色并將信號(hào)暴露于柯達(dá)膠片。如圖9所示，小鼠1F3IgG和人源化版本的1F3以非常類似的方式識(shí)別該組抗原。具體而言，1)小鼠1F3和hu-1F3IgG兩者均能結(jié)合變性的人CD3ε/δ和獼猴CD3ε/δ；2)兩種抗體均能結(jié)合變性的包含對(duì)應(yīng)于CD3ε(SEQIDNO:18)的N端氨基酸1-27的肽序列的Fc融合蛋白；以及3)小鼠1F3和hu-1F3IgG均不結(jié)合帶有對(duì)照肽(SEQIDNO:20)的Fc融合蛋白。來自該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有力地表明，1F3是對(duì)是特異性的并且表位位于ε亞基的N端部分之內(nèi)。流式細(xì)胞術(shù)分析還表明，人和小鼠1F3抗體在人PBMC上具有相似的結(jié)合模式(參見圖10)。值得注意的是，觀察到低熒光細(xì)胞群中MFI的小位移。眾所周知的是相對(duì)于人Fc，小鼠Fc對(duì)人Fcγ受體的結(jié)合大大降低。因此，圖10所示的結(jié)果表明hu-1F3IgG中的人Fc結(jié)合PBMC制備物中該免疫細(xì)胞群(非T細(xì)胞)上的Fcγ受體并造成了小MFI位移。將Maxisorp板用于ELISA結(jié)合測(cè)定。在4℃下將50μl含1μg/ml抗原的50mMNaHCO3用于包被該板過夜，然后用200μl5%干奶粉/TBS-0.05%tween20(MTBS-T)/孔孵育板。通常將抗體稀釋于5%MTBS-T中，轉(zhuǎn)移至包被了抗原的板并在室溫下輕輕振蕩溫育1小時(shí)。結(jié)合的抗體通過鏈霉親和素-HRP(用于檢測(cè)生物素化的抗體)或抗his標(biāo)簽-HRP綴合物(對(duì)帶his標(biāo)簽的抗體)來檢測(cè)。含ABTS溶液的50mM檸檬酸鹽緩沖液與利用酶標(biāo)儀(Biotek)的OD405測(cè)量用來檢測(cè)。圖11顯示了生物素化小鼠抗CD3抗體1F3和生物素化的hu-1F3IgG的結(jié)合活性。這兩種抗體證明了對(duì)人CD3ε/δ“杵-臼(knobandhole)”Fc異源二聚體(Ridgewayetal.(1996),proteinEngineering9:617-621)、獼猴CD3ε/δ“杵-臼”Fc異源二聚體和人CD3εN端肽(AA1-27)Fc融合蛋白的陽性結(jié)合的非常相似的模式。圖13顯示了與圖11中所述的同一組抗原的結(jié)合，其通過用抗his標(biāo)簽/HRP綴合物和ABTS底物檢測(cè)了10種代表性的人源化Fab蛋白。觀察到hu-1F3.1、hu-1F3.2、hu-1F3.3和hu-1F3.5至hu-1F3.10Fab的劑量依賴性結(jié)合。hu-1F3.4Fab結(jié)合是非常低的，即使在測(cè)試的濃度范圍(5-8,000pM)內(nèi)。注意到相比IgG，F(xiàn)ab與所有三種抗原結(jié)合的略低的親和力(圖11)。Fab的單價(jià)結(jié)合可解釋與hu-1F3全長(zhǎng)IgG的結(jié)合相比較低的結(jié)合親和力(圖11)。測(cè)試了10種代表性人源化Fab蛋白中的5種(hu-IF3.1-huIF3.5)能結(jié)合表達(dá)CD3的Jurkat人T細(xì)胞系。如圖12所示，人源化1F3的Fab能結(jié)合Jurkat細(xì)胞。實(shí)施例7：EPCAMXCD3ε雙特異性Fab融合蛋白的表征流式細(xì)胞術(shù)分析和ELISA用于表征EpCAMXCD3Fab融合蛋白。詳細(xì)的材料和方法在本實(shí)施例的結(jié)尾處進(jìn)行了描述。如圖14所示，利用FACS，EpCAMXCD3Fab融合蛋白(MSFP)結(jié)合表達(dá)人CD3的Jurkat細(xì)胞。在該實(shí)驗(yàn)中，與Jurkat細(xì)胞結(jié)合的生物素化的Fab和Fab融合蛋白通過鏈霉親和素-PE綴合物進(jìn)行檢測(cè)。OKT3Fab顯示了對(duì)Jurkat細(xì)胞上CD3的結(jié)合，但抗EpCAMscFv與單獨(dú)的LC或HC和LC兩者的融合完全消除了OKT3Fab部分的CD3結(jié)合能力。人源化抗CD3抗體Fab即hu-1F3能結(jié)合Jurkat細(xì)胞上的CD3。與OKT3Fab融合蛋白相反，與hu-1F3LCN端融合的抗EpCAMscFv保留了與hu-1F3Fab相似水平的結(jié)合活性。抗EpCAMscFv與hu-1F3Fab的LC和HC的同時(shí)融合也顯示出了對(duì)Jurkat細(xì)胞上CD3的陽性結(jié)合，雖然處于降低的水平。圖15顯示了如FACS所示的EpCAMxCD3MSFP與人PBMC的結(jié)合。與Jurkat細(xì)胞結(jié)合的生物素化的Fab和Fab融合蛋白通過鏈霉親和素-PE綴合物來檢測(cè)。圖A顯示了與表達(dá)CD3的PBMC(T細(xì)胞)結(jié)合的OKT3Fab；抗EpCAMscFv與HC和LC二者融合完全消除了OKT3Fab部分的CD3結(jié)合能力。圖B顯示了人源化抗CD3抗體Fab即hu-1F3.1能結(jié)合PBMC制備物中T細(xì)胞上的CD3；與OKT3Fab融合蛋白不同，與Fab的LC和HC同時(shí)融合的抗EpCAMxhu-1F3.1Fab顯示出對(duì)Jurkat細(xì)胞上CD3的陽性結(jié)合并且結(jié)合水平處于降低的水平。如圖16所示，ELISA結(jié)合測(cè)定表明：OKT3Fab和EpCAM1.1xOKT3雙特異性Fab融合蛋白對(duì)重組獼猴CD3ε/δ異源二聚體Fc蛋白沒有結(jié)合活性；以及OKT3Fab和雙特異性融合蛋白對(duì)重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)沒有結(jié)合活性。預(yù)期的是OKT3并不結(jié)合猴CD3或人CD3ε的N端。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素化抗體利用鏈霉親和素-HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。圖17顯示了ELISA結(jié)合的結(jié)果，其表明hu-1F3Fab和EpCAM1.1xHU-1F3.1雙特異性Fab融合蛋白(MSFP；Fabe)能結(jié)合重組獼猴CD3ε/δ異源二聚體Fc蛋白(圖A)和重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)(圖B)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素化抗體利用鏈霉親和素-HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。如圖18所示，ELISA結(jié)合測(cè)定表明hu-1F3Fab和EpCAM1.1xHU-1F3.1MSFP能結(jié)合重組獼猴CD3ε/δ異源二聚體Fc蛋白(圖A)和重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)(圖B)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的標(biāo)記的融合蛋白利用鏈霉親和素-HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。如圖19所示，ELISA結(jié)合測(cè)定表明hu-1F3Fab和EpCAM1.1xHU-1F3.1MSFP能結(jié)合重組獼猴CD3ε/δ異源二聚體Fc蛋白(圖A)和重組人CD3εN端肽(aa1-27.Fc融合蛋白)(圖B)。Fab和Fab融合蛋白是生物素化的，并且與96孔板上固定的抗原結(jié)合的生物素標(biāo)記的融合蛋白利用鏈霉親和素-HRP綴合物以及隨后的ABTS底物來檢測(cè)。如圖20所示，流式細(xì)胞術(shù)分析顯示EpCAMxCD3MSFP能結(jié)合在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)全長(zhǎng)人EpCAM靶標(biāo)的CHO細(xì)胞。抗CD3Fab與相同的CHO細(xì)胞沒有顯現(xiàn)出結(jié)合。材料與方法：流式細(xì)胞術(shù)分析(熒光激活細(xì)胞分選；FACS)用于表征基于IF3的Fab融合蛋白(在此也被稱為Fabe；Fab融合蛋白也通常被稱為MSFP)的細(xì)胞結(jié)合。一般而言，在4℃下將細(xì)胞于1%BSA/PBS中封閉1小時(shí)，并將稀釋于1%BSA/PBS中的目的抗體添加至封閉的細(xì)胞，在4℃下孵育1小時(shí)。用1%BSA/PBS洗滌一次后，染色步驟視可用的抗體或熒光抗體綴合物而有所不同。在某些情況下，使用直接的熒光綴合物。在其它情況下，抗親和標(biāo)簽抗體(二抗)用于與細(xì)胞孵育隨后使用綴合有特定熒光團(tuán)的抗種類抗體。在一些其他的實(shí)驗(yàn)中，帶有熒光綴合物的抗體(或其它親和試劑如鏈霉親和素)直接用作二抗(第二試劑)。在圖10、14、16、17、20A和20B中，用生物素化的抗體孵育細(xì)胞，而在圖12、15、18、19以及20C和20D中，用帶his6標(biāo)簽的抗體孵育細(xì)胞并隨后用抗his標(biāo)簽的抗體并通過抗小鼠-PE綴合物進(jìn)行最終的檢測(cè)。實(shí)施例8：EpCAMXCD3雙特異性Fab融合蛋白重新定向T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷活性細(xì)胞殺傷測(cè)定用于測(cè)試pCAMXCD3雙特異性Fab融合蛋白重新定向T細(xì)胞介導(dǎo)的殺死靶細(xì)胞的能力。如圖21所示，基于FACS的測(cè)定(在實(shí)施例結(jié)尾處詳細(xì)描述的)證明了EpCAMxCD3雙特異性Fab融合蛋白以腫瘤靶標(biāo)依賴方式重新定向T細(xì)胞介導(dǎo)的靶細(xì)胞殺傷活性。在該測(cè)定中，靶細(xì)胞(在細(xì)胞表面上穩(wěn)定表達(dá)人EpCAM-FL的CHO細(xì)胞(圖21，圖A、B、D)和對(duì)照細(xì)胞(僅CHO，圖21圖C)在測(cè)定前用PKH-26熒光染料標(biāo)記。TP3(Invitrogen)用于在測(cè)定完成時(shí)確定死細(xì)胞。在該測(cè)定中，死的靶細(xì)胞從右上象限的計(jì)數(shù)確定，而活的靶細(xì)胞從左上象限確定。未用PBMC和雙特異性抗體孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的細(xì)胞顯示出PKH-26標(biāo)記的群中有約1.4%的死細(xì)胞(TP3陽性)(圖21，A組)；用PBMC但無雙特異性抗體孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞顯示出在PKH-26標(biāo)記的群中有約14%的死細(xì)胞(圖21，B組)；用PBMC和雙特異性抗體孵育(持續(xù)20小時(shí))的不表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞有約14%的死細(xì)胞(圖21圖C)；以及用PBMC和示例性的雙特異性Fab融合蛋白孵育(持續(xù)20小時(shí))的表達(dá)EpCAM的CHO細(xì)胞有約64%死細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖21圖D)。圖22繪出了以上的圖21的圖D所述的多種濃度的EpCAMXCD3雙特異性Fab融合蛋白的殺傷數(shù)據(jù)。OKT3Fab和融合蛋白缺乏明顯的重新定向的細(xì)胞裂解活性(圖22，A組)；EpCAM1.1xHU-1F3.1MSFP具有高水平活性，并且該活性水平即使在60pM融合蛋白濃度時(shí)仍保持很高，而hu-1F3.1Fab對(duì)靶細(xì)胞沒有活性(圖22，圖B)；通過EpCAM1.2xhu-1F3.1MSFP檢測(cè)劑量依賴性活性(圖22，圖C)；以及檢測(cè)EpCAM2.2scFv與hu-1F3.1Fab單融合的劑量依賴細(xì)胞裂解活性(圖22，圖D)。對(duì)于EpCAM2.2scFv和hu-1F3.1Fab的HC和LC兩者的雙融合而言，觀察到50%細(xì)胞群的最大殺傷，并且當(dāng)其濃度低至60pM時(shí)，其活性水平仍保持很高(約40%)。殺傷活性百分比通過從樣品測(cè)定中死細(xì)胞百分比減去對(duì)照測(cè)定中的死細(xì)胞百分比(EpCAM-CHO+PBMC)來計(jì)算。圖23顯示了EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1MSFP的T細(xì)胞活化是腫瘤靶向依賴性的。圖A)在存在不表達(dá)EpCAM的CHO的情況下，用EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1(30nM)孵育的PBMC，通過FACS測(cè)定檢測(cè)CD69表達(dá)所測(cè)量的，導(dǎo)致了基礎(chǔ)水平的T細(xì)胞活化。圖B)在存在不表達(dá)EpCAM的CHO的情況下，用EpCAM2.2-(H+L)-hu-1F3.1(30nM，16小時(shí))孵育的PBMC，通過FACS測(cè)定檢測(cè)CD69表達(dá)所測(cè)量的，導(dǎo)致了顯著增加的T細(xì)胞活化。材料與方法：在測(cè)定前將靶細(xì)胞用PKH-26(Sigma)染料(Sigma)(在FL2中檢測(cè)信號(hào))標(biāo)記，并通過加入TO-PRO-3(TP3)染料(Invitrogen)(在FL4中檢測(cè)信號(hào))來鑒定測(cè)定中被殺死的靶細(xì)胞。靶細(xì)胞的PKH-26標(biāo)記依照生產(chǎn)商的說明書來進(jìn)行。具體而言，將用無血清完全培養(yǎng)基洗滌的2*106個(gè)靶細(xì)胞重新懸浮于0.5ml的稀釋液C(在產(chǎn)品試劑盒中提供)中。將2μl的1mMPKH-26染料也稀釋于0.5ml的稀釋液C中。接著將稀釋的染料加入靶細(xì)胞制備物中并在室溫下孵育5分鐘。將2ml胎牛血清加入混合物中并孵育2分鐘以終止標(biāo)記反應(yīng)。將標(biāo)記的細(xì)胞用完全培養(yǎng)基洗滌三次并重新懸浮于完全培養(yǎng)基中備用。對(duì)標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并檢查活力。對(duì)于細(xì)胞殺傷測(cè)定，取100μl含靶細(xì)胞和PBMC混合物的完全培養(yǎng)基加入FACS管中，接著加入100μl含抗體溶液的完全細(xì)胞培養(yǎng)基并在CO2培養(yǎng)箱中孵育20小時(shí)。在測(cè)定結(jié)束時(shí)，在FACScalibur流式細(xì)胞儀上進(jìn)行FACS測(cè)定之前取5μl10μmTO-PRO-3(TP3)加入細(xì)胞中。PKH-26標(biāo)記的細(xì)胞位于2-3rdlog區(qū)域(FL2)。FL2信號(hào)大于log20的細(xì)胞被認(rèn)為是靶細(xì)胞。FL4信號(hào)(TP3)大于log30的細(xì)胞被認(rèn)為是死細(xì)胞。殺死的靶細(xì)胞從右上象限進(jìn)行計(jì)數(shù)而活的靶細(xì)胞從左上象限進(jìn)行計(jì)數(shù)(參見圖21)。每種樣品共收集共5000個(gè)靶細(xì)胞事件。細(xì)胞裂解活性，細(xì)胞裂解活性通過以下計(jì)算：將樣品測(cè)定的死細(xì)胞計(jì)數(shù)(表達(dá)EpCAM的靶細(xì)胞+PBMC+抗體藥物)減去對(duì)照測(cè)定中的死細(xì)胞計(jì)數(shù)(表達(dá)EpCAM的靶細(xì)胞+PBMC)并除以5000的總靶細(xì)胞計(jì)數(shù)。細(xì)胞裂解活性的百分比通過將以上活性乘以100計(jì)算而來。綜上所述，上述實(shí)施例表明，本公開的包含1F3抗CD3Fab的MSFP，僅在存在合適的腫瘤靶細(xì)胞(例如，表達(dá)EpCAM的細(xì)胞)的情況下起重新定向T細(xì)胞殺傷的作用。令人驚喜的是，抗EpCAM-OKT3Fab融合蛋白不能結(jié)合表達(dá)CD3的JurkatT細(xì)胞。這表明由1F3Fab識(shí)別的CD3ε表位對(duì)于1F3Fab融合蛋白的功能是重要的。以上實(shí)施例中所述的數(shù)據(jù)支持了本公開的MSFP在多種治療設(shè)施中的用途，包括通過T細(xì)胞的募集來治療多種癌癥?？山M合上述的多種實(shí)施方案以提供另外的實(shí)施方案。本說明書中提及的和/或申請(qǐng)數(shù)據(jù)表中列出的所有美國(guó)專利、美國(guó)專利申請(qǐng)出版物、美國(guó)專利申請(qǐng)、外國(guó)專利、外國(guó)專利申請(qǐng)和非專利出版物都通過引入并入本文中。若需要采用各個(gè)專利、申請(qǐng)和出版物的概念來提供進(jìn)一步的實(shí)施方案，可對(duì)本實(shí)施方案的方面進(jìn)行修改。鑒于上述詳細(xì)描述，可對(duì)所述實(shí)施方案作出這些改變和其它的改變。在一般情況下，在以下的權(quán)利要求中，所用術(shù)語不應(yīng)當(dāng)被解釋為將權(quán)利要求限制到本說明書和權(quán)利要求中公開的具體實(shí)施方案，而應(yīng)當(dāng)被解釋為包括所有可能的實(shí)施方案以及這些權(quán)利要求所賦予的等同項(xiàng)的全部范圍。因此，權(quán)利要求不受本公開的限制。