專利名稱：一種分離純化肝素鈉的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種分離純化肝素鈉的方法，特別是一種肝素鈉生產工藝方法。
背景技術：
肝素鈉是一種臨床常用的抗凝血藥物，主要從豬小腸粘膜中提取的粘多糖物質，具有顯著地抗凝血和防止血栓形成的作用。近年來低分子肝素鈉的涌現，使肝素鈉的應用越來越廣泛。傳統的生產工藝方法是將粗提取的肝素鈉(效價60-100U/mg)進行鹽解或酶解，然后進行氧化脫色精制。其局限性在于，核酸及蛋白質類雜質去除程度低，對提取質量要求高(要求效價> 80U/mg)，生產周期長，產品效價低，收率低。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的提供一種新的酶解結合絮凝沉降生產肝素鈉的工藝方法，克服了上述常規(guī)方法存在的問題，有效簡化精制工序，可在更短的時間里生產出雜質含量低、單位效價高、收率好的肝素鈉產品。本發(fā)明的目的通過以下技術方案來達到，依次通過以下幾個步驟來實現。1、將肝素鈉加入到反應罐中用水完全溶解，肝素鈉與水的重量比為1: 6至.1:8;2、調pH = 6. 0-7. 0，升溫至50_55°C，按5_10g/億單位加入胃蛋白酶，按10_20g/億單位加入胰蛋白酶，酶解保溫2-4小時；3、調pH = 8. 0-9. 0，升溫至80_9(TC，靜置20至40分鐘，然后降溫至50-55°C，按20%至30% (v/v)比例加入乙醇，調節(jié)pH = 11. 0-12.0，靜置直至分層；4、虹吸酶解上清液，下層沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。5、調pH = 6. 0-7. O,升溫至60-70。。，按O. 3% -O. 5% (w/v)比例加入絮凝沉淀劑1，攪拌均勻后，靜置直至分層，虹吸上清，沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。6、升溫至 40-50。。，調 pH = 11. 0-12. 0，按 O. 3% -O. 5% (w/v)比例加入絮凝沉淀劑2，靜置直至分層，虹吸上清，沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。7、將步驟6中的上清液用乙醇沉淀，之后用過氧化氫氧化脫色，脫水后烘干，即得分離純化的肝素鈉。本技術方案的有益效果是經酶解結合絮凝沉降工藝方法分離純化的肝素鈉，經過氧化氫一步氧化脫色并用乙醇沉淀精制后，活性效價的回收率> 85%，效價> 180U/mg,吸光度 260nm ^ O.1, 280nm 彡 O.1。第一，本技術方案中，酶解保溫pH = 6. 0-7. O，保溫溫度為50-55°C。酶解條件溫和，在裂解核酸及蛋白雜質的同時，可有效保護肝素鈉較少受蛋白酶的破壞。傳統酶解保溫PH = 8. 0-9. 0，此時胰蛋白酶的活性最好，但此時對肝素鈉的分解作用增加，活性效價損失大。
第二，本技術方案中，酶解液降溫至50_55°C后，按20%-30% (v/v)比例加入乙醇，可使靜置分層效果更好，使上清液的比例增加。第三，本技術方案中，酶解液中仍存在未變性的蛋白多肽等雜質，使用絮凝沉淀劑I進行處理，可有效分離酸性蛋白多肽雜質。第四，本技術方案中，酶解液中仍存在與堿性蛋白相結合的核酸等雜質，使用絮凝沉淀劑2進行處理，可有效分離堿性蛋白核酸等雜質。
具體實施例方式以下實例詳細說明了本發(fā)明1、向反應罐中加入800Kg水，邊攪拌邊將IOOKg肝素鈉(60U/mg)加入到反應罐中
直至完全溶解。2、調pH = 6. O,升溫至55°C停止加熱，加入600g胃蛋白酶及1200g胰蛋白酶，攪拌均勻后保溫作用3小時。3、調pH = 9. O，迅速升高溫度至90°C，靜置30分鐘。降溫至55°C，加入160L95%乙醇，調節(jié)PH= 11.0，靜置12小時。4、虹吸酶解上清液，下層沉淀物離心，合并母液至上清，棄去固體分離物。5、將4中的料液調pH = 7. O,升高溫度至70°C，加入2. 4Kg絮凝沉淀劑I (碳酸鈣)，攪拌均勻后，靜置12小時。虹吸上清，沉淀物離心后，將母液合并至上清，棄去固體分離物。6、將5中的料液 升溫至50°C，調pH = 11. 0，加入絮凝沉淀劑2 (羥基磷灰石)，靜置12小時，虹吸上清，沉淀物離心后，將母液合并至上清，棄去固體分離物。7、將6中的合并上清用95%乙醇沉淀至40%，之后用過氧化氫氧化脫色，脫水后烘干，得分離純化的肝素鈉30Kg。
權利要求
1.一種分離純化肝素鈉的方法，其特征是 (1)、將肝素鈉加入到反應罐中用水完全溶解，肝素鈉與水的重量比為1: 6至1: 8; (2)、調pH= 6. 0-7. O,升溫至50-550C，按5-10g/億單位加入胃蛋白酶，按10_20g/億單位加入胰蛋白酶,酶解保溫2-4小時； (3)、調pH= 8. 0-9. O,升溫至80-90°C，靜置20至40分鐘，然后降溫至50-55°C，按20%至30% (v/v)比例加入乙醇，調節(jié)pH= 11. 0-12.0，靜置直至分層; (4)、虹吸酶解上清液，下層沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。
(5)、調pH= 6. 0-7. O,升溫至60-70°C，按O. 3% -O. 5% (w/v)比例加入絮凝沉淀劑1，攪拌均勻后，靜置直至分層，虹吸上清，沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。
(6)、升溫至40-50°C，調pH= 11. 0-12. 0，按O. 3% -O. 5% (w/v)比例加入絮凝沉淀劑2，靜置直至分層，虹吸上清，沉淀物離心后母液合并至上清液中，棄去固體分離物。
(7)、將步驟￠)中的上清液用乙醇沉淀，之后用過氧化氫氧化脫色，脫水后烘干，即得分離純化的肝素鈉。
2.按照權利要求書I所述的方法，其特征為酶解保溫pH= 6. 0-7.0，保溫溫度為50-55。。。
3.按照權利要求書I所述的方法，其特征為酶解結束后按20%至30%(v/v)比例加入乙醇。
4.按照權利要求書I所述的方法，其特征為絮凝沉淀劑I選自碳酸鈣、氫氧化鋁及殼聚糖或其混合物。
5.按照權利要求書I所述的方法，其特征為絮凝沉淀劑2選自羥基磷灰石(HAP)和十二烷基磺酸鈉(SDBS)或其混合物。
6.按照權利要求書I所述的方法，其特征為步驟(4)和步驟(5)中沉淀物離心母液可直接合并至上清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種分離純化肝素鈉的方法。豬腸粘膜經提取制得的肝素鈉中含有大量蛋白質和核酸等雜質，給肝素鈉的精制純化帶來一定的難題。傳統的工藝方法通過鹽解工藝或酶解工藝去除殘留的雜質，對肝素鈉提取質量要求高，去除效率比較低，后續(xù)氧化沉淀精制時間長，氧化劑(過氧化氫)使用量大，收率低。本發(fā)明方法采用酶解和沉淀劑去除肝素鈉中殘留的雜質，工藝設計合理，去除效率高，縮短了后續(xù)精制工時，提高了產品收率，降低了成本。
文檔編號C08B37/10GK103030715SQ201210555008
公開日2013年4月10日 申請日期2012年12月7日 優(yōu)先權日2012年12月7日
發(fā)明者夏襯來, 遲培升, 刁愛芹 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司