專利名稱：一種金柑多糖的高效提取純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金柑多糖的高效提取純化方法。
背景技術(shù)：
金柑iFortunella mar gar i ta (Lour. ) Swingle )又名金桔、綠桔,是我國(guó)著名的特產(chǎn)水果之一，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特殊的藥用保健功效。中醫(yī)認(rèn)為，金柑生食有理氣、補(bǔ)中、解郁、消食、散寒、化痰、醒酒等作用，可用于治療胸悶郁結(jié)、酒醉口渴、消化不良、食欲不振、咳嗽哮喘等癥。目前，金柑仍然以鮮食為主，粗加工產(chǎn)品也僅見(jiàn)金柑果醋、金柑果脯等，產(chǎn)品附加值低。有關(guān)金柑的基礎(chǔ)研究工作仍比較薄弱，深加工技術(shù)及產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)滯后，制約了金柑產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。多糖是由單糖連接而成的多聚物，廣泛存在于動(dòng)物細(xì)胞膜、植物和微生物的細(xì)胞 壁中，是生物體內(nèi)除核酸和蛋白質(zhì)以外的又一類重要的生物分子。大量研究表明多糖的功能學(xué)特性多種多樣，不僅可以作為貯能物質(zhì)，而且具有許多生物活性，如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖、降血脂、抗輻射、延緩衰老等，并且對(duì)機(jī)體幾乎無(wú)毒副作用。金柑多糖為金柑的主要活性成分之一，但有關(guān)金柑多糖的高效提取和分離純化的研究還尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，如何從金柑中高效提取多糖，獲得高純度、活性強(qiáng)的金柑多糖具有重要意義。多糖的提取方法很多，近年來(lái)開(kāi)發(fā)的微波輔助提取、超聲波強(qiáng)化提取、高壓脈沖法、動(dòng)態(tài)逆流浸提等提取方法，具有效率高，操作簡(jiǎn)單，能耗小，且不會(huì)引入雜質(zhì)、多糖純度高等優(yōu)點(diǎn)，在多糖提取中得到廣泛應(yīng)用。目前已有將多種技術(shù)結(jié)合應(yīng)用于多糖的提取，如超聲波逆流提取技術(shù)、微波逆流提取技術(shù)，以利用各種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)提高多糖提取率。多糖純化的方法有分級(jí)沉淀法、Sevag法、層析柱法、膜分離法等，其中離子交換層析能有效分離粗多糖中的中性組分和酸性組分，凝膠過(guò)濾層析可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)不同分子量的多糖分離。充分利用各種提取純化技術(shù)，提供一種金柑多糖的高效提取與純化的方法是本發(fā)明的主要目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種金柑多糖的高效提取純化方法，獲得提取時(shí)間短、溶劑消耗少、純度高、活性強(qiáng)的金柑多糖，以填補(bǔ)金柑多糖高效提取與分離技術(shù)的空白，豐富糖類科學(xué)，為金柑多糖的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)，提升金柑產(chǎn)業(yè)價(jià)值、拓展金柑深加工途徑。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
一種金柑多糖的高效提取純化方法，將新鮮金柑榨汁，采用微波、超聲波耦合動(dòng)態(tài)逆流浸提技術(shù)進(jìn)行浸提，經(jīng)離心過(guò)濾得到金柑水提液，再采用酶法結(jié)合Sevag法脫蛋白、大孔吸附樹(shù)脂脫色素得到金柑多糖溶液，經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱、S^hacryl S-400HR凝膠柱分離，再經(jīng)超濾、減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥、粉碎制得金柑多糖的精制干粉。所述方法的具體步驟為
(1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用；
(2)將金柑汁由一端進(jìn)料口按液料比10:f 30:1定量送入微波提取室，微波功率400 620W，微波處理時(shí)間15 30min ；
(3)在超聲波浸提室，純凈水由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自進(jìn)液口向出料口流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2)中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為20:1 30:1，超聲波功率16(T250W，超聲波作用時(shí)間2(T45min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下
一步工序；
(4)步驟(3)的浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液；
(5)將步驟(4)的金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解6(T80min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液； (6)將步驟(5)的上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液；
(7)將步驟(6)的金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水和0. rimol/L的NaCl溶液進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(8)將步驟(7)的洗脫液，過(guò)平衡好的S^hacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. rimol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(9)將步驟(8)的洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal，工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7MPa，溫度2(T60°C，得到金柑多糖溶液；
(10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液醇沉過(guò)夜，所得沉淀冷凍干燥后，粉碎過(guò)60目篩，即得到金柑多糖的精制干粉。
本發(fā)明的有益效果
(I)本發(fā)明采用微波超聲波耦合動(dòng)態(tài)逆流浸提技術(shù)提取金柑多糖，充分發(fā)揮微波技術(shù)、超聲波技術(shù)、動(dòng)態(tài)逆流浸提技術(shù)的優(yōu)勢(shì)。微波對(duì)固體的穿透作用較強(qiáng)，物料在微波的作用下細(xì)胞破裂，細(xì)胞內(nèi)有效成分快速地?cái)U(kuò)散到溶劑中。微波提取后，物料被送入超聲波提取室，超聲波獨(dú)特的機(jī)械粉碎與振動(dòng)作用以及通過(guò)液體時(shí)形成的空化效應(yīng)，進(jìn)一步破壞物料組織細(xì)胞，增加溶劑的穿透力。連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流浸提充分利用兩相的濃度梯度，實(shí)現(xiàn)提取過(guò)程中物料與溶劑中多糖的快速平衡。該發(fā)明具有提取率高、節(jié)約溶劑用量、能耗低的特點(diǎn)，金柑多糖提取率> 10%，可實(shí)現(xiàn)金柑多糖大批量連續(xù)性提取，適于工業(yè)化生產(chǎn)。(2)本發(fā)明采用酶法結(jié)合Sevag法脫蛋白，大孔吸附樹(shù)脂脫色素，并結(jié)合DEAESepharose CL-6B離子交換層析、Sephacryl S-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，獲得精制的金柑多糖，其純度> 90%。(3)本發(fā)明整個(gè)操作過(guò)程溫度較低，能最大限度保持金柑多糖活性，對(duì)進(jìn)一步研究金柑多糖構(gòu)效關(guān)系，充分利用我國(guó)金柑資源優(yōu)勢(shì)開(kāi)發(fā)應(yīng)用金柑多糖具有重要意義。
具體實(shí)施例方式 一種金柑多糖的高效提取純化方法，具體步驟如下
(1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用；
(2)將金柑汁由一端進(jìn)料口按液料比10:f 30:1定量送入微波提取室，微波功率400 620W，微波處理時(shí)間15 30min ；
(3)在超聲波浸提室，溶劑由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自加液端向出料端流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2 )中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為20:1 30:1，超聲波功率16(T250W，超聲波作用時(shí)間2(T45min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下
一步工序；
(4)步驟(3)中浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液；
(5)將步驟(4)中所得金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解6(T80min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液；
(6)將步驟(5)所得上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液；
(7)將步驟(6)所得金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水、0. rimol/L NaCl進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組 分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(8)將步驟(7)所得洗脫液，過(guò)平衡好的S^hacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. lmol/L NaCl進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(9)將步驟(8)中洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal (工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7Mpa，溫度2(T60°C )，得到金柑多糖溶液；
(10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入80%乙醇醇沉過(guò)夜，所得沉淀冷凍干燥后，粉碎過(guò)60目篩，即得到精制金柑多糖干粉。以下是本發(fā)明的幾個(gè)具體實(shí)施例，進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但是本發(fā)明不僅限于此實(shí)施。實(shí)施例I
(1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用；
(2)將金柑汁由一端進(jìn)料口按液料比10:1定量送入微波提取室，微波功率微波功率450W，微波處理時(shí)間20min ；
(3 )在超聲波浸提室，溶劑由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自加液端向出料端流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2)中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為25:1，超聲波功率220W，超聲波作用時(shí)間20min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑粉形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下一步工序；
(4)步驟(3)中浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液；
(5)將步驟(4)中所得金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解60min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液；
(6)將步驟(5)所得上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液；
(7)將步驟(6)所得金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水、0. rimol/L NaCl進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(8)將步驟(7)所得洗脫液，過(guò)平衡好的S^hacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. lmol/L NaCl進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；(9)將步驟(8)中洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal (工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7Mpa，溫度2(T60°C )，得到金柑多糖溶液；
(10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入80%乙醇醇沉過(guò)夜，所得沉淀冷凍干燥后 ，粉碎過(guò)60目篩，即得到精制金柑多糖干粉。實(shí)施例2
(1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用；
(2)將金柑汁由一端進(jìn)料口按液料比10:1定量送入微波提取室，微波功率微波功率500W，微波處理時(shí)間18min ；
(3 )在超聲波浸提室，溶劑由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自加液端向出料端流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2)中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為30:1，超聲波功率200W，超聲波作用時(shí)間30min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑粉形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下一步工序；
(4)步驟(3)中浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液；
(5)將步驟(4)中所得金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解60min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液；
(6)將步驟(5)所得上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液；
(7)將步驟(6)所得金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水、0. rimol/L NaCl進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(8)將步驟(7)所得洗脫液，過(guò)平衡好的SephacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. lmol/L NaCl進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(9)將步驟(8)中洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal (工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7Mpa，溫度2(T60°C )，得到金柑多糖溶液；
(10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入80%乙醇醇沉過(guò)夜，所得沉淀冷凍干燥后，粉碎過(guò)60目篩，即得到精制金柑多糖干粉。實(shí)施例3
(1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用；
(2)將金柑干粉由一端進(jìn)料口按液料比12:1定量送入微波提取室，微波功率微波功率600W，微波處理時(shí)間15min ；
(3 )在超聲波浸提室，溶劑由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自加液端向出料端流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2)中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為28:1，超聲波功率250W，超聲波作用時(shí)間40min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑粉形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下一步工序；
(4)步驟(3)中浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液；
(5)將步驟(4)中所得金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解70min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液；
(6)將步驟(5)所得上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液；
(7)將步驟(6)所得金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水、0. rimol/L NaCl進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(8)將步驟(7)所得洗脫液，過(guò)平衡好的S^hacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. lmol/L NaCl進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液；
(9)將步驟(8)中洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal (工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7Mpa，溫度2(T60°C )，得到金柑多糖溶液；
(10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入80%乙醇醇沉過(guò)夜，所 得沉淀冷凍干燥后，粉碎過(guò)60目篩，即得到精制金柑多糖干粉。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
權(quán)利要求
1.一種金柑多糖的高效提取純化方法，其特征在于將新鮮金柑榨汁，采用微波、超聲波耦合動(dòng)態(tài)逆流浸提技術(shù)進(jìn)行浸提，經(jīng)離心過(guò)濾得到金柑水提液，再采用酶法結(jié)合Sevag法脫蛋白、大孔吸附樹(shù)脂脫色素得到金柑多糖溶液，經(jīng)DEAE Sepharose CL-6B離子交換柱、Sephacryl S-400 HR凝膠柱分離，再經(jīng)超濾、減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥、粉碎制得金柑多糖的精制干粉。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的金柑多糖的高效提取純化方法，其特征在于所述方法的具體步驟為 (1)篩選新鮮金柑，經(jīng)清洗、去核、榨汁，備用； (2)將金柑汁由一端進(jìn)料口按液料比10:f 30:1定量送入微波提取室，微波功率400 620W，微波處理時(shí)間15 30min ； (3)在超聲波浸提室，溶劑由另一端進(jìn)液口經(jīng)流量計(jì)控量注入，溶劑自進(jìn)液口向出料口流動(dòng)，待溶劑流動(dòng)穩(wěn)定時(shí)，將步驟(2 )中物料螺旋輸送入超聲波浸提室，液料比為20:1 30:1，超聲波功率16(T250W，超聲波作用時(shí)間2(T45min，在螺旋裝置的推動(dòng)下，溶劑與金柑形成流向相反的連續(xù)動(dòng)態(tài)逆流進(jìn)行充分混合提取，提取所得浸提液由出料口進(jìn)入下一步工序； (4)步驟(3)的浸提液離心除去不溶性雜質(zhì)，得到金柑水提液； (5)將步驟(4)的金柑水提液，加入蛋白酶40°C酶解6(T80min，然后采用Sevag法脫蛋白，脫蛋白3次后離心，得到上清液； (6)將步驟(5)的上清液，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行脫色，所選大孔吸附樹(shù)脂為D101，脫色后得到金柑多糖溶液； (7)將步驟(6)的金柑多糖溶液，過(guò)平衡好的DEAESepharose CL-6B離子交換柱進(jìn)行分離純化，用蒸餾水和0. rimol/L的NaCl溶液進(jìn)行分段洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液； (8)將步驟(7)的洗脫液，過(guò)平衡好的S^hacrylS-400 HR凝膠過(guò)濾柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化，用0. rimol/L的NaCl溶液進(jìn)行洗脫，用苯酚硫酸法跟蹤檢測(cè)流出的組分，分別收集洗脫峰，得到洗脫液； (9)將步驟(8)的洗脫液分別通過(guò)中空纖維超濾膜脫鹽并將其濃縮，其截留分子量為5000Dal，工作壓力控制在0. 2MPa 0. 7MPa，溫度2(T60°C，得到金柑多糖溶液； (10)將步驟(9)所得金柑多糖濃縮至原體積的3/101/5，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液醇沉過(guò)夜，所得沉淀冷凍干燥后，粉碎過(guò)60目篩，即得到金柑多糖的精制干粉。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的金柑多糖的高效提取純化方法，其特征在于步驟(3)中所述的溶劑是純凈水。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種金柑多糖的高效提取純化方法，將新鮮金柑榨汁，采用微波、超聲波耦合動(dòng)態(tài)逆流浸提技術(shù)進(jìn)行浸提，經(jīng)離心過(guò)濾得到金柑水提液，再采用酶法結(jié)合Sevag法脫蛋白、大孔吸附樹(shù)脂脫色素得到金柑多糖溶液，經(jīng)DEAESepharoseCL-6B離子交換柱、SephacrylS-400HR凝膠柱分離，再經(jīng)超濾、減壓濃縮、醇沉、冷凍干燥、粉碎制得金柑多糖的精制干粉。本發(fā)明首次從金柑中提取多糖，提取時(shí)間短，提取率高，并對(duì)金柑多糖進(jìn)行精制，為充分利用我國(guó)金柑資源優(yōu)勢(shì)和開(kāi)發(fā)應(yīng)用金柑多糖提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C08B37/00GK102827299SQ201210307338
公開(kāi)日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2012年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月27日
發(fā)明者張怡, 曾紅亮, 張翀, 鄭寶東, 曾紹校 申請(qǐng)人:福建農(nóng)林大學(xué)