專利名稱：一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物藥用原料的制備純化方法，屬于生物工程領(lǐng)域，具體是一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝。
背景技術(shù)：
肝素鈉是一種富含陰離子的粘多糖硫酸酯，由動(dòng)物體內(nèi)的肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生，因最初從肝臟中提取，故名肝素。臨床使用的肝素是從動(dòng)物腸、肺粘膜、血管壁等處提取獲得的鈉(鋰)鹽，肝素鈉(鋰)具有抗凝血、抗炎、抗癌等多種生物學(xué)功能，但長(zhǎng)期使用會(huì)有諸如出血、骨折等負(fù)作用。20世紀(jì)80年代初期發(fā)現(xiàn)低分子肝素鈉(LMWH，<8000Da)具 有更強(qiáng)的活性和較小負(fù)作用，成為主要的臨床抗凝血藥。目前國(guó)外已有10多種LMWH相繼問(wèn)世，全球四大制藥企業(yè)均有該類產(chǎn)品的銷售，我國(guó)是主要的肝素原料國(guó)，產(chǎn)量約占全球的一半。應(yīng)用于臨床的LMWH是由普通肝素為原料制備獲得，制備方法主要有生物酶法、化學(xué)裂解法兩種。它們各有優(yōu)勢(shì)，肝素酶降解反應(yīng)條件溫和、專一性高、副產(chǎn)物少而且引入一個(gè)紫外生色團(tuán)，檢測(cè)方便，但酶的價(jià)格昂貴，難以跨越工業(yè)生產(chǎn)的界線?；瘜W(xué)裂解法不可避免的會(huì)改變肝素鈉的結(jié)構(gòu)、影響活性等。中國(guó)專利(授權(quán)號(hào)CN1096034)公開了一種純化的肝素裂分其制備方法和含有它們的藥物組合物。純化的肝素裂分通過(guò)如下步驟制備向肝素鈉中加入亞硝酸鹽，PHl 5處理20 50分鐘，再在堿介質(zhì)中以硼氫化鈉還原，用HCL破壞過(guò)量硼氫化鈉并用乙醇沉淀分級(jí)，將得到的溶液暴露在紫外照射系統(tǒng)下，溫度為5°C 50°C，pH為3 8，色譜純化，最后用氯化鈉和乙醇沉淀分離得降解肝素鈉。美國(guó)專利(公開號(hào)3099600)公開了一種色譜技術(shù)分離純化肝素鈉的方法將肝素鈉粗品溶于緩沖溶液中，加入5 12倍肝素鈉重量的離子交換樹脂TEAM-celIulose或DEAE-cellulose，后用緩沖液洗滌，鹽洗脫，乙醇沉淀、干燥得產(chǎn)品。上述方法為工業(yè)上典型的制備及純化肝素鈉的過(guò)程，生產(chǎn)工藝復(fù)雜、成本高，而且沒(méi)有提及對(duì)肝素鈉的結(jié)構(gòu)類似物多硫酸軟骨素這一主要雜質(zhì)的去除方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為了改進(jìn)現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝；該發(fā)明提供一種簡(jiǎn)便的低分子肝素鈉制備、純化技術(shù)，制得的低分子肝素鈉平均分子質(zhì)量在4. 5KDa左右，效價(jià)不低于180U/mg，高于中國(guó)藥典要求的170U/mg，且依據(jù)中國(guó)藥典肝素鈉檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)合格。本發(fā)明的技術(shù)方案為一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝，其具體步驟如下(I)將粗品肝素鈉溶于NaCl溶液中，機(jī)械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入堿液直至產(chǎn)生沉淀，靜置，過(guò)濾除去不溶物，得濾液；(2)將步驟(I)中濾液以堿液調(diào)pH至9. 5 10. 5，加入H2O2溶液，在10 30°C下反應(yīng)2. 5 3. 5小時(shí)，得反應(yīng)液；(3)將步驟(2)得到的反應(yīng)液升溫至30 50°C，此后每隔2. 5 3. 5小時(shí)補(bǔ)加H2O2溶液，并調(diào)節(jié)PH ;補(bǔ)料后共反應(yīng)15 21h ；(4)向步驟(3)得到的反應(yīng)液中加入吸附劑，磁力攪拌，過(guò)濾除不溶物，得濾液；(5)將步驟(4)中的濾液通過(guò)平衡好的凝膠色譜柱，收集低分子量的肝素鈉洗脫液；(6)將步驟(5)中的低分子量的肝素鈉洗脫液用弱堿性離子交換樹脂吸附，分別以三種濃度的NaCl溶液洗脫，收集第一種(最低)、第三種(最高)濃度的NaCl洗脫液并混合；(7)將步驟(6)中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一 5 8°C，再用乙醇沉淀、
真空干燥得產(chǎn)品。 優(yōu)選步驟(I)中NaCl溶液的質(zhì)量百分濃度為I. 2 I. 8% ；NaCl溶液的用量為2 3mL/g肝素鈉粗品量；靜置時(shí)間I 2小時(shí)；優(yōu)選步驟(I)和(2)的堿液均為NaOH或KOH溶液；堿液的濃度為I I. 5mol/L。優(yōu)選步驟(2)和(3)中所加入的H2O2溶液和NaCl溶液的體積比為3 5 :100 ;步驟(2)中H2O2溶液的濃度為I 5mol/L，步驟(3)中H2O2溶液的濃度為I 3mol/L。步驟
(3)中每次補(bǔ)加完H2O2溶液后測(cè)定pH，使pH在6. 8 7. 5之間。優(yōu)選步驟(4)中所述的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入量為3 5g/100mlNaCl 溶液量。優(yōu)選步驟(5)中所述的凝膠色譜柱為S印hadex G_25，樣品層為15 25%柱床體積，柱的徑/高為I :5 7 ;以質(zhì)量百分濃度4 6%NaCl溶液平衡并洗脫，流速為一個(gè)柱床體積/I. 5 2小時(shí)，收集60 90mim時(shí)的洗脫液。優(yōu)選步驟(6)中三種濃度的NaCl溶液分別為O. I O. 3g/L、0. 4 O. 6g/L、0. 7 O. 9g/L ;其洗脫時(shí)間均為I. 8 2. 5小時(shí)，樣品層為15 25%柱床體積。優(yōu)選步驟(6)中所用的弱堿性離子交換樹脂是D301、D315、D318或330，柱的高/徑比為6 8 :1。有益效果(I)本發(fā)明采用補(bǔ)料升溫氧化結(jié)合離子交換樹脂法制備并純化得到平均分子量4. 5KDa低分子肝素鈉，其效價(jià)不低于180U/mg，回收率不低于75%。(2)通過(guò)升溫補(bǔ)加H2O2可以有效的控制肝素鈉氧化失活，并且實(shí)現(xiàn)了氧化與脫色同步進(jìn)行。(3)依據(jù)肝素鈉及其結(jié)構(gòu)類似物多硫酸軟骨素所含陰離子強(qiáng)度的差異，采用弱堿性陰離子交換樹脂吸附所有的多硫酸軟骨素和少量的肝素鈉，最后用低濃度鹽分步洗脫，得到肝素鈉產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)采用的弱堿性陰離子交換樹脂，使得多硫酸軟骨素雜質(zhì)被吸附，而肝素鈉產(chǎn)品直接流出，并用分步鹽法洗脫吸附的少量肝素鈉，極大的提高了其回收率。最終得到的低分子肝素鈉產(chǎn)品達(dá)到中國(guó)藥典標(biāo)準(zhǔn)，并且經(jīng)檢測(cè)不含多硫酸軟骨素成分。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施案例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。實(shí)施例I將50g粗品肝素鈉溶于IOOmL質(zhì)量百分濃度I. 2%NaCl溶液中，機(jī)械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入Imol/LNaOH直至產(chǎn)生沉淀，靜置I小時(shí)，過(guò)濾除去不溶物，得濾液；以lmol/L NaOH調(diào)pH至9. 5，加入3mLlmol/L的H2O2,10°C，反應(yīng)2. 5小時(shí)。將反應(yīng)液升溫至30°C，此后每隔3. 5小時(shí)補(bǔ)加3mLlmol/L H2O2，維持pH6. 8，補(bǔ)料后共反應(yīng)21h。向反應(yīng)液中加入5g活性碳，磁力攪拌，過(guò)濾除不溶物，得濾液；以質(zhì)量百分濃度為4%NaCl溶液平衡S印hadex G_25柱，樣品層為15%柱床體積，柱徑/高為I :5，將濾液通過(guò)該柱，以質(zhì)量百分濃度4%NaCl洗脫，流速為一個(gè)柱床體積/2小時(shí)，收集70 90min洗脫液；把洗脫液流經(jīng)D301色譜柱，樣品層為15%柱床體積，柱高/徑為6 :1，分別以O(shè). 1,0. 4,0. 7 (g/L)NaCl洗脫I. 8h，收集O. 1,0. 7g/LNaCl洗脫液并合并；將該洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一 5°C，此后用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)，其效價(jià)為182U/mg,回收率79. 1%,硫酸軟骨素
O.01 mg/mL,硫酸皮膚素O. 01mg/mL,各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典要求。實(shí)施例2將50g粗品肝素鈉溶于120mL質(zhì)量百分濃度I. 8%NaCl溶液中，機(jī)械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入I. 5mol/LNa0H直至產(chǎn)生沉淀，靜置2小時(shí)，過(guò)濾除去不溶物，得濾液；以 1.5mol/L NaOH 調(diào) pH 至 10. 0，加入 5mL 3mol/L 的 H2O2, 20°C，反應(yīng) 3. O 小時(shí)。將反應(yīng)液升溫至40°C，此后每隔2. 5小時(shí)補(bǔ)加5mL2mol/L H2O2,維持pH7. 0，補(bǔ)料后共反應(yīng)18h。向反應(yīng)液中加入5g皂土，磁力攪拌，過(guò)濾除不溶物，得濾液；以質(zhì)量百分濃度5%NaCl溶液平衡S印hadexG-25柱，樣品層為20%柱床體積，柱徑/高為I :6，將濾液通過(guò)該柱，以質(zhì)量百分濃度5%NaCl洗脫，流速為一個(gè)柱床體積/ I. 5小時(shí)，收集60 80min洗脫液；把洗脫液流經(jīng)D315色譜柱，樣品層為20%柱床體積，柱高/徑為7 :1，分別以O(shè). 2,0. 5,0. 8g/L NaCl洗脫
2.Oh,收集合并O. 2、0. 8g/LNaCl洗脫液；將該洗脫液，在磁力攪拌下降溫至3°C，此后用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)，其效價(jià)為198U/mg，回收率82. 0%，硫酸軟骨素O. 005mg/mL,硫酸皮膚素O. 001mg/mL,各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典要求。實(shí)施例3將50g粗品肝素鈉溶于150mL質(zhì)量百分濃度I. 6%NaCl溶液中，機(jī)械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入I. 2mol/LK0H直至產(chǎn)生沉淀，靜置I. 5小時(shí)，過(guò)濾除去不溶物，得濾液；以 1.2mol/L KOH 調(diào) pH 至 10. 5，加入 7. 5mL 5mol/L 的 H2O2, 30°C，反應(yīng) 3. 5 小時(shí)。將反應(yīng)液升溫至50°C，此后每隔3小時(shí)補(bǔ)加7. 5mL 3mol/L H2O2,維持pH7. 5，補(bǔ)料后共反應(yīng)15h。向反應(yīng)液中加入4. 5g皂土，磁力攪拌，過(guò)濾除不溶物，得濾液；以質(zhì)量百分濃度6%NaCl溶液平衡S印hadex G_25柱，樣品層為25%柱床體積，柱徑/高為I :7，將濾液通過(guò)該柱，以質(zhì)量百分濃度6%NaCl洗脫，流速為一個(gè)柱床體積/I. 8小時(shí)，收集70 90min洗脫液；把洗脫液流經(jīng)330色譜柱，樣品層為25%柱床體積，柱高/徑為8 :1，分別以0. 3,0. 6,0. 9g/L NaCl洗脫2. 5h，收集0. 3,0. 9g/LNaCl洗脫液；將該洗脫液，在磁力攪拌下降溫至8°C，此后用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。經(jīng)檢測(cè)，其效價(jià)為187U/mg，回收率76. 8%，硫酸軟骨素0. 004mg/mL,硫酸皮膚素0. 003mg/mL,各項(xiàng)指標(biāo)均符合中國(guó)藥典要求。
權(quán)利要求
1.一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝，其具體步驟如下 (1)將粗品肝素鈉溶于NaCl溶液中，機(jī)械攪拌至肝素鈉全部溶解，向溶液中加入堿液直至產(chǎn)生沉淀，靜置，過(guò)濾除去不溶物，得濾液； (2)將步驟(I)中濾液以堿液調(diào)pH至9.5 10. 5，加入H2O2溶液，在10 30°C下反應(yīng)2. 5 3. 5小時(shí)，得反應(yīng)液； (3)將步驟(2)得到的反應(yīng)液升溫至30 50°C，此后每隔2.5 3. 5小時(shí)補(bǔ)加H2O2溶液，并調(diào)節(jié)PH ;補(bǔ)料后共反應(yīng)15 21h ； (4)向步驟(3)得到的反應(yīng)液中加入吸附劑，磁力攪拌，過(guò)濾除不溶物，得濾液； (5)將步驟(4)中的濾液通過(guò)平衡好的凝膠色譜柱，收集低分子量的肝素鈉洗脫液； (6)將步驟(5)中的低分子量的肝素鈉洗脫液用弱堿性離子交換樹脂吸附，分別以三種濃度的NaCl溶液洗脫，收集第一種(最低)、第三種(最高)濃度的NaCl洗脫液并混合； (7)將步驟(6)中的混合洗脫液，在磁力攪拌下降溫至一5 8°C，再用乙醇沉淀、真空干燥得產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(I)中NaCl溶液的質(zhì)量百分濃度為I. 2 I. 8% ；NaCl溶液的用量為2 3mL/g肝素鈉粗品量；靜置時(shí)間I 2小時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(I)和(2)的堿液均為NaOH或KOH溶液；堿液的濃度為I I. 5mol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(2)和(3)中所加入的H2O2溶液和NaCl溶液的體積比為3 5 :100 ;步驟(2)中H2O2溶液的濃度為I 5mol/L，步驟(3)中H2O2溶液的濃度為I 3mol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(3)中每次補(bǔ)加完H2O2溶液后測(cè)定pH，使pH在6. 8 7. 5之間。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(4)中所述的吸附劑為活性碳、皂土或硅酸鹽；吸附劑的加入量為3 5g/100mlNaCl溶液量。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(5)中所述的凝膠色譜柱為SephadexG-25，樣品層為15 25%柱床體積，柱的徑/高為I :5 7 ;以質(zhì)量百分濃度4 6%NaCl溶液平衡并洗脫，流速為一個(gè)柱床體積/I. 5 2小時(shí)，收集60 90mim時(shí)的洗脫液。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(6)中三種濃度的NaCl溶液分別為O. I O. 3g/L、0.4 O. 6g/L、0.7 O. 9g/L ;其洗脫時(shí)間均為I. 8 2. 5小時(shí)，樣品層為15 25%柱床體積。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的工藝，其特征在于步驟(6)中所用的弱堿性離子交換樹脂是D301、D315、D318或330，柱的高/徑比為6 8 :1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種制備高純度低分子肝素鈉的工藝，屬于生物工程領(lǐng)域。主要包括鹽析除雜、補(bǔ)料升溫氧化、凝膠洗脫、離子交換、乙醇沉淀、真空干燥等。解決了目前肝素鈉結(jié)構(gòu)類似物難以去除，純度達(dá)不到藥用要求，制備工藝復(fù)雜等問(wèn)題。該工藝通過(guò)補(bǔ)料升溫氧化法實(shí)現(xiàn)低分子肝素鈉的制備和脫色并用弱堿性離子交換樹脂有效去除肝素鈉結(jié)構(gòu)類似物，縮短了生產(chǎn)周期、節(jié)約了成本、工藝簡(jiǎn)單、易操作、適合工業(yè)化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C08B37/10GK102775523SQ20121026549
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月30日
發(fā)明者于輝, 馮旌, 李佼佼, 李棟蕓, 楊文革, 沈飛, 胡永紅 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué), 南京新百藥業(yè)有限公司