專利名稱：一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)用材料、醫(yī)療器械及化妝品相關領域，特別涉及一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，用于組織引導生長膜、軟組織補片、促皮膚愈合傷口敷料、 組織工程皮膚及保健面膜等領域。
背景技術：
膠原是由3條肽鏈擰成螺旋形的纖維狀蛋白質。在體內以膠原纖維形式存在，在水中加熱即溶解成膠。約占人體蛋白質總是的1/3以上。主要分布在結締組織中，如皮膚干重的70%為膠原。人體四肢活動時，皮膚中膠原蛋白發(fā)揮功能，使皮膚具有保護功能，又有適當彈性及堅硬度。I、III型膠原蛋白是皮膚膠原的主要類型，兩者共同組成膠原原纖維， 其中I型膠原是主體，III型膠原包繞與外周。檢測皮膚創(chuàng)傷傷口時發(fā)現(xiàn)，傷口處纖維母細胞與膠原纖維接觸提示I型膠原和III 型膠原蛋白產物減少，同時基因的表達和膠原酶的活性增強。傷口愈合后相當時間內，甚至一年時間，組織張力強度繼續(xù)增大，膠原含量逐漸恢復正常水平。因此，膠原蛋白的補充在傷口修復和改善老化皮膚機能方面有著不可替代的作用。目前膠原在皮膚上的應用主要有透皮、口服和注射兩種方法，口服主要通過食品途徑攝入以保健品為主，注射用膠原蛋白由于成本高而主要應用于美容行業(yè)。廣泛用于傷口敷料和面膜的是透皮使用，以涂覆和貼敷為主，其中涂覆的膠原蛋白流失較快效果持續(xù)時間短，而貼敷使用的膠原蛋白膜主要有純膠原膜和復合膠原膜。純膠原膜的成本較高，而復合膠原膜的關鍵在于找到合適的基質膜， 優(yōu)異的基質膜能提供良好的創(chuàng)口修復環(huán)境或用于面膜的高濕環(huán)境。細菌纖維素(BC)，又稱微生物纖維素。細菌纖維素是一種天然的生物高聚物，由 β-D-葡萄糖通過β-1，4-糖苷鍵連接而成的一種無分支的大分子直鏈聚合物。具有生物活性、生物可降解性、生物適應性，具有高結晶度、高純度、高持水性、超細納米纖維網絡、高抗張強度和彈性模量等許多獨特的物理、化學和機械性能。此外細菌纖維素持水性高，其內部有很多“孔道”，有良好的透氣、透水性能，能吸收60-700倍于其干重的水分，并具有高濕強度?；谏鲜黾毦w維素的優(yōu)異性能，其在生物醫(yī)用材料領域具有廣泛的應用前景， 目前國外已經有研究機構推出了一些細菌纖維素的生物醫(yī)用制品。以細菌纖維素生產人造皮膚，在潮濕情況下所具有的高機械強度，對氣體和液體的高滲透性，這些指標均優(yōu)于常規(guī)皮膚代用品。由此可見，細菌纖維素膜是膠原用于傷口和化妝品用途的優(yōu)異基質膜。近40年來大量關于創(chuàng)面的基礎研究和臨床治療驗證了為創(chuàng)面提供合適的濕潤環(huán)境有利于傷口的愈合。新型敷料既能保持創(chuàng)面的濕潤。又能促進傷口的愈合。目前，新型敷料在發(fā)達國家使用得較為普及，國內也開始將其應用于各種急、慢性創(chuàng)面的治療中。新型功能性醫(yī)用敷料將是未來技術發(fā)展的主要趨勢，一些新型醫(yī)用敷料，例如含銀抗菌醫(yī)用敷料、生物活性敷料、人工皮膚等已經在國外開始應用或者即將投入使用。目前國內敷料產業(yè)品種單一，沒有形成系列產品，并且功能性欠缺，以低端產品為主，在高檔產品上缺乏競爭力。針對膠原蛋白和細菌纖維的特點和國內外傷口敷料各自存在問題，本發(fā)明采用溶液浸漬法和表面涂布法等在細菌纖維素基體中復合膠原蛋白制得的創(chuàng)傷敷料，能夠補充傷口愈合期間缺失的I型膠原和III型膠原蛋白，從而更好地促進傷口的愈合。另外，此方法制備的膠原修飾細菌纖維素復合膜也可用于組織引導生長膜、軟組織補片、組織工程皮膚及保健面膜等領域。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提出一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，該方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜具有優(yōu)良的力學性能以及良好的透水、透氣或引流、吸濕效果，同時可促進創(chuàng)面愈合，用于組織引導生長膜、軟組織補片、促皮膚愈合傷口敷料、組織工程皮膚及保健面膜等領域。本發(fā)明的技術方案是制備一種膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級別纖維網絡結構上附著有膠原蛋白，甚至可包覆細菌纖維素纖維。通過物理或化學方法在細菌纖維素的表面和網絡結構中形成膠原蛋白層，物理方法基本原理為膠原蛋白在細菌纖維素發(fā)達的表面和網絡結構中通過物理吸附沉積，而化學反應的基本原理為膠原蛋白殘基與功能化細菌纖維素膜中的醛基或羧基形成化學鍵。本發(fā)明通過以下方法實現(xiàn)膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備。其制備方法包括以下步驟 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，8(Γ100 下水浴60min或以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，8(TlO(TC下水浴30-60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素(記為BC)，之后置于陰涼處保存；
步驟三、細菌纖維素基團功能化
選用TEMPO、高碘酸或高碘酸鹽、二氧化氮等一系列適用于纖維素材料的氧化體系，將細菌纖維素上的羥基氧化成羧基或者醛基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜(記為0BC)； 步驟四、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
用20-1000N的壓力將細菌纖維素(BC和0BC)脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜， 然后將細菌纖維素膜通過高溫蒸煮、紫外線或者Co60輻射消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟五、膠原修飾細菌纖維素復合膜的復合工藝 方法1物理復合法膠原與BC的復合工藝
將膠原產品分別配成0. 01%-20%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于BC膜表面，單位涂覆量為10-200 μ L/cm2 ；或將膠原產品分別配成0. 01%_20%的溶液，將上述BC膜浸于膠原溶液中l(wèi)s-Mh，制得物理復合膠原修飾細菌纖維素復合膜。方法2化學復合法膠原與OBC的復合工藝
將膠原產品分別配成0. 01%-20%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于OBC膜表面，單位涂覆量為10-200 μ L/cm2 ；或將膠原產品分別配成0. 01%_20%的溶液，將上述OBC浸于膠原溶液中l(wèi)s-Mh，制得化學復合膠原修飾細菌纖維素復合膜。方法2制得的膠原修飾細菌纖維素復合膜中膠原蛋白殘基與功能化細菌纖維素膜中的醛基或羧基形成化學鍵，達到穩(wěn)定的化學結合。步驟六、將通過步驟五得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜進行干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合干膜；或者將通過步驟五得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜脫水， 再次調整得到不同水含量的膠原修飾細菌纖維素復合濕膜。所述細菌纖維素膜是由醋桿菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、無色桿菌屬、產堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、土壤桿菌屬等九屬細菌中的某種經發(fā)酵產生，所產細菌纖維素具有三維多孔網絡結構。方法一所述步驟五中的干燥處理的方法包括以下3種方法
a、通風狀態(tài)下常溫或20°C 60°C下恒溫干燥處理；
b、將細菌纖維素在_20°C _60°C的冷凍干燥機中干燥處理，或真空干燥處理；
c、將細菌纖維素濕膜急冷處理后，再在真空干燥機、恒溫箱或者常溫下干燥處理，得到脆性較低的膠原修飾細菌纖維素復合膜。由本發(fā)明制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的0. 1-20%。
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和有益效果
1、本發(fā)明所獲得膠原修飾細菌纖維素復合膜，可促進缺損皮膚中膠原蛋白含量的恢
復；
2、本發(fā)明利用細菌纖維素具有的獨特結構和性質，制備含膠原的細菌纖維素膜，使細菌纖維素獲得了優(yōu)異的生物相容性和創(chuàng)傷修復能力，并且膠原的含量可控；
3、本發(fā)明采用獨特的復合工藝制備膠原修飾細菌纖維素復合膜，克服了現(xiàn)有膠原藥劑存在的透水、透氣或引流、吸濕效果差的問題，提供膠原在燒傷創(chuàng)傷上應用的新方法，細胞親和性好，促進傷口生長；
4、化學復合法制備所得的膠原修飾細菌纖維素復合膜中，膠原蛋白中的殘基與細菌纖維素中的功能化基團通過亞胺鍵等化學鍵結合，其復合更牢固。同時亞胺鍵在一定條件下可發(fā)生斷裂，從而使膠原達到控制釋放的目的；
5、本發(fā)明的制備過程簡單，工藝成熟，適合于不同需求的膠原修飾細菌纖維素復合膜的工業(yè)生產，可用于組織引導生長膜、軟組織補片、促皮膚愈合傷口敷料、組織工程皮膚及保健面膜等領域。


圖1為細菌纖維素的微觀結構圖，顯示了細菌纖維素獨特的納米網絡結構；
圖2為膠原修飾細菌纖維素復合膜的微觀結構圖，顯示了膠原在細菌纖維素網絡中良好的結合情況。
具體實施例方式以下結合附圖，通過具體實例對本發(fā)明的一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法做進一步說明。實施例一
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，90°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，90°C下水浴30min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
細菌纖維素預處理調整至中性后，用200N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過高溫蒸煮消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟四、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品配成1%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于細菌纖維素膜表面，單位涂覆量為 20μ L/cm2。步驟五、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜在通風狀態(tài)下20°C恒溫干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合膜復合干膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的1. 2%，含水量為初始量的63. 7%。
實施例二
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，80°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，80°C下水浴60min，然后用蒸餾水多次沖洗；
步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素基團功能化
選用TEMPO氧化體系，將細菌纖維素上C6位的羥基氧化成羧基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜； 步驟四、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
將步驟三中的細菌纖維素，用500N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟五、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成5%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于細菌纖維素膜表面，單位涂覆量為 50 μ L/cm2 ；
步驟六、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜在-50°C的冷凍干燥機中干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合膜復合干膜；。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的4. 7%，含水量為初始量的35. 4%。
實施例三
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOX IOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，85°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，85°C下水浴45min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
細菌纖維素預處理調整至中性后，用50N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過Co60輻射消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟四、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成m的溶液，將上述細菌纖維素浸于膠原溶液中60s。步驟五、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜脫水，再次調整得到不同水含量的膠原修飾細菌纖維素復合膜濕膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的2. 7%，含水量為初始量的78. 9%。
實施例四
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，90°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，80°C下水浴30min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素基團功能化
選用高碘酸氧化體系，將細菌纖維素C2、C3位上的羥基氧化成醛基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜； 步驟四、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
將步驟三中的細菌纖維素，用500N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟五、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成6%的溶液，將上述細菌纖維素浸于膠原溶液中l(wèi)h。步驟六、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜脫水，再次調整得到不同水含量的膠原修飾細菌纖維素復合膜濕膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的6. 4%，含水量為初始量的45%。
實施例五
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，95°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，90°C下水浴30min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡4次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
細菌纖維素預處理調整至中性后，用800N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過高溫蒸煮消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。
步驟四、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成15%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于細菌纖維素膜表面，單位涂覆量為25 μ L/cm2 ；
步驟五、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜急冷處理后，再在真空干燥機中干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合膜復合干膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的7. 2%，含水量為初始量的17. 3%。
實施例六
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，85°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，100°C下水浴45min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素基團功能化
選用二氧化氮氧化體系，將細菌纖維素上C6位的羥基氧化成羧基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜； 步驟四、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
將步驟三中的細菌纖維素，用100N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過Co60輻射消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟五、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成1%的溶液，將上述細菌纖維素浸于膠原溶液中120s。步驟六、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜在_45°C的冷凍干燥機中干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合膜復合干膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的3. ，含水量為初始量的70. 1。
實施例七
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，100°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，95°C下水浴60min，然后用蒸餾水多次沖洗；步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
細菌纖維素預處理調整至中性后，用1000N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過紫外線消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟四、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成10%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于細菌纖維素膜表面，單位涂覆量為 100μ L/cm2。步驟五、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜脫水，再次調整得到不同水含量的膠原修飾細菌纖維素復合膜濕膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的11. 2%，含水量為初始量的12. 8%。實施例八
將市售由木醋桿菌制得的細菌纖維素膜剪取成IOXlOcm的細菌纖維素樣品，膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備步驟如下 步驟一、細菌纖維素膜的預處理
取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質。再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，95°C下水浴60min以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基。再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，95°C下水浴40min，然后用蒸餾水多次沖洗； 步驟二、細菌纖維素膜的純化
將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡4次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0. 2，得到純化后的細菌纖維素，之后置于陰涼處保存。步驟三、細菌纖維素基團功能化
選用高碘酸鹽氧化體系，將細菌纖維素C2、C3位上的羥基氧化成醛基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜； 步驟四、細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝
將步驟三中的細菌纖維素，用150N的壓力將細菌纖維素脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過Co60輻射消毒，達到工藝滅菌要求(之后的工藝要求無菌操作)。步驟五、膠原與細菌纖維素的復合工藝
將膠原產品分別配成7. 5%的溶液，將上述細菌纖維素浸于膠原溶液中600s。步驟六、將通過步驟四得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜急冷處理后，再在真空干燥機、恒溫箱或者常溫下干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合膜復合干膜。由本方法制備出的膠原修飾細菌纖維素復合膜，細菌纖維素的納米級纖維網絡結構上附著有膠原，所述的復合膜的膠原含量為總重的6. 3%，含水量為初始量的70. 6%。以上對本發(fā)明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發(fā)明的較佳實施例， 不能被認為用于限定本發(fā)明的實施范圍。凡依本發(fā)明申請范圍所作的均等變化與改進等，均應仍歸屬于本發(fā)明的專利涵蓋范圍之內。
權利要求
1. 一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，所述方法包括如下步驟1. 1細菌纖維素膜的預處理取細菌纖維素用清水多次沖洗，除去膜表面培養(yǎng)基及雜質；再將膜浸泡于0. lmol/L的 NaOH溶液，8(Γ100 下水浴60min或以上，洗出細菌纖維素膜中的菌體和殘留培養(yǎng)基；再將細菌纖維素膜浸泡于0. 05mol/L的NaOH溶液，8(Γ100 下水浴30-60min，然后用蒸餾水多次沖洗；1.2細菌纖維素膜的純化將上述預處理之后的細菌纖維素膜用蒸餾水浸泡3-5次，用pH試紙輕壓膜測pH值，最終控制細菌纖維素PH值為7. 2士0.2，得到純化后的細菌纖維素，記為BC，之后置于陰涼處保存；1. 3細菌纖維素基團功能化選用TEMPO、高碘酸或高碘酸鹽、二氧化氮等一系列適用于纖維素材料的氧化體系，將細菌纖維素上的羥基氧化成羧基或者醛基，然后用去離子水反復浸泡沖洗或者用離子交換法去除殘余的氧化劑，得到基團功能化的細菌纖維素膜，記為OBC ；1. 4細菌纖維素含水量的調整及滅菌工藝用20-1000N的壓力將細菌纖維素BC和OBC脫水，得到不同含水量的細菌纖維素膜，然后將細菌纖維素膜通過高溫蒸煮、紫外線或者Co60輻射消毒，達到工藝滅菌要求；1. 5膠原修飾細菌纖維素復合膜的復合；1.6將通過步驟1. 5得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜進行干燥處理，得到膠原修飾細菌纖維素復合干膜；或者將通過步驟1. 5得到的膠原修飾細菌纖維素復合膜脫水，再次調整得到不同水含量的膠原修飾細菌纖維素復合濕膜。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，其特征在于 所述步驟1. 5復合工藝具體如下物理復合法膠原與BC的復合工藝將膠原產品分別配成0. 01%-20%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于BC膜表面，單位涂覆量為10-200 μ L/cm2 ；或將膠原產品分別配成0. 01%_20%的溶液，將上述BC膜浸于膠原溶液中l(wèi)s-Mh，制得物理復合膠原修飾細菌纖維素復合膜；或化學復合法膠原與OBC的復合工藝將膠原產品分別配成0. 01%-20%的溶液，將上述膠原溶液涂覆于OBC膜表面，單位涂覆量為10-200 μ L/cm2 ；或將膠原產品分別配成0. 01%_20%的溶液，將上述OBC浸于膠原溶液中l(wèi)s-Mh，制得化學復合膠原修飾細菌纖維素復合膜。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，其特征在于 所述細菌纖維素膜是由醋桿菌屬、八疊球菌屬、假單胞菌屬、根瘤菌屬、無色桿菌屬、產堿菌屬、氣桿菌屬、固氮菌屬、土壤桿菌屬等九屬細菌中的某種經發(fā)酵產生，所產細菌纖維素具有三維多孔網絡結構。
4.根據(jù)權利要求1所述的一種膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，其特征在于 所述步驟1. 6中干燥處理的方法包括以下3種方法a、通風狀態(tài)下常溫或20°C 60°C下恒溫干燥處理；或b、將細菌纖維素在-20°C -60°C的冷凍干燥機中干燥處理，或真空干燥處理；或C、將細菌纖維素濕膜急冷處理后，再在真空干燥機、恒溫箱或者常溫下干燥處理，得到脆性較低的膠原修飾細菌纖維素復合膜。
全文摘要
本發(fā)明提出了膠原修飾細菌纖維素復合膜的制備方法，涉及生物醫(yī)用材料、醫(yī)療器械及化妝品相關領域。制備方法包括以下步驟取細菌纖維素膜進行預處理和純化處理得到純化后的細菌纖維素，同時將純化細菌纖維素的羥基功能化。將細菌纖維素膜與膠原混懸液進行物理復合或者經化學結合得到膠原修飾細菌纖維素復合膜。本發(fā)明所獲得膠原修飾細菌纖維素復合膜，可促進缺損組織中膠原蛋白含量的恢復；同時克服了現(xiàn)有膠原藥劑存在的透水、透氣或引流、吸濕效果差的問題，提供膠原應用的新方法，細胞親和性好，促進組織生長。本發(fā)明的制備過程簡單，工藝成熟，適合于不同需求的膠原修飾細菌纖維素復合膜的工業(yè)生產。
文檔編號C08J7/04GK102352051SQ20111030049
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月30日 優(yōu)先權日2011年9月30日
發(fā)明者丁尋, 何欣揚, 余弈, 劉向陽, 吳健, 崔秋艷, 鄭裕東, 高爽 申請人:北京科技大學