專利名稱：一種殼聚糖聚合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種外科手術(shù)用醫(yī)用材料，特別涉及一種能夠作為醫(yī)學生物工程支架及攜載活性生長因子的載體的殼聚糖聚合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
以殼聚糖為支架的材料在骨組織工程中的應用正受到越來越多的關(guān)注。殼聚糖是一種理想的高分子生物材料，它具有機體反應小、良好的生物降解性、無毒、來源廣泛、價格便宜、天然抗菌性以及具有可任意塑性如多孔結(jié)構(gòu)的特點，使其能夠適合細胞的內(nèi)在生長以及骨的傳導，在骨組織工程中顯示出巨大的應用價值。但是，目前現(xiàn)有的殼聚糖多只能作為支架材料，而不能作為攜載活性生長因子的載體，并且多種細胞在其表面及內(nèi)部不能很好的生長，從而不能很好的促進骨再生。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種殼聚糖聚合物的制備方法，以及由所述方法所制成的殼聚糖聚合物，所述殼聚糖聚合物成凝膠狀，因此又稱為殼聚糖聚合物水凝膠，其可作為活性組織細胞生長的支架，對細胞分裂增值有促進作用，被載物的釋放時間、釋放量可控制， 其具有組織支架作用，可促進組織愈合和組織再生。一種殼聚糖聚合物的制備方法，在該方法中所用原材料包括天然殼聚糖粉、明膠粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二鈉粉劑；所述制備方法具體包括合成前原材料的準備階段和合成階段；在合成前原材料的準備階段，需要利用醋酸溶液將天然殼聚糖粉溶解成質(zhì)量濃度為(1-2)%的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為(1.5-2)%的明膠溶液， 利用醫(yī)用酒精將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為(0. 3-0. 7)%京尼平-酒精溶液，用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為(0. 5-0. 9) g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段中使天然殼聚糖分別與京尼平和甘油-2-磷酸二鈉實現(xiàn)化學交鏈和離子交聯(lián)，從而獲得凝膠狀的殼聚糖聚合物。所述合成前原材料的準備階段具體為
(1)利用質(zhì)量濃度為0. 4%的醋酸溶液，將天然殼聚糖粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 85%的殼聚糖溶液，然后加熱至35° C，攪拌2-3天后，過濾溶液并在110° C下高溫消毒待用；(2) 然后，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1.8%的溶液，并在110° C下高溫消毒待用；(3) 之后，利用體積濃度為75%的醫(yī)用酒精將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0. 5%的京尼平-酒精溶液；(4)最后，用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0. 8g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液，并加熱到50° C待用。所述殼聚糖聚合物的合成步驟包括
步驟一、將配制好的殼聚糖溶液、明膠溶液與純水混合形成混合液，上述三者是按照一定體積比進行混合的，所述體積比一般為(3-6) (1-5);步驟二、在攪拌器上攪拌上述混合液20-30分鐘，以使天然殼聚糖與明膠混勻，然后加熱至35° C ；步驟三、然后將稀釋好的京尼平-酒精溶液加入步驟二所形成混合液中，所述京尼平-酒精溶液與步驟二所形成混合液之間的體積比為1 (20-50)，之后攪拌30-60分鐘使混勻，以實現(xiàn)化學交聯(lián)過程；步驟四完成步驟三之后，再將配制好的甘油-2-磷酸二鈉溶液加入，所述甘油-2-磷酸二鈉溶液與步驟三所形成液體的之間的體積比為1:20-200，攪拌5分鐘使混合均勻，實現(xiàn)離子交聯(lián)過程；步驟五將完全交聯(lián)后形成的殼聚糖聚合物放入37° C溫箱待用。在殼聚糖聚合物的合成階段中，步驟一中的體積比為3:1:2 ；步驟三中的體積比為1:35，步驟四中的體積比為1:120。本發(fā)明的方法操作過程簡單，所用材料天然無毒，來源方便，可用于飲食、醫(yī)療和醫(yī)學生物工程，并且利用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的殼聚糖聚合物穩(wěn)定性好、無毒副作用，可作為醫(yī)學生物工程支架及攜載活性生長因子的載體，為一些神經(jīng)外科、骨科等難治性疾病提供了條件。


圖1為本發(fā)明殼聚糖聚合物的流變學實驗曲線；
圖2為本發(fā)明殼聚糖聚合物的藥理學釋放特性實驗曲線； 圖3為對本發(fā)明殼聚糖聚合物樣品進行掃描觀測的電鏡掃描圖片； 圖4為人骨髓基質(zhì)細胞在DMEM殼聚糖聚合物培養(yǎng)基中生長的倒置像差顯微鏡下觀察的2D結(jié)構(gòu)；
圖5為人骨髓基質(zhì)細胞在DMEM殼聚糖聚合物培養(yǎng)基中生長的共聚焦激光掃描顯微鏡觀察的3D結(jié)構(gòu)。
具體實施例方式下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步的描述。本發(fā)明的方法所用原材料為天然殼聚糖粉、明膠粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二鈉粉劑，并且在制備過程中具體包括合成前原材料的準備階段和殼聚糖聚合物的合成階段。在合成前原材料的準備階段，(1)首先利用質(zhì)量濃度為0. 4%的醋酸溶液，將天然殼聚糖粉溶解成質(zhì)量濃度為(1-2)%的殼聚糖溶液，然后加熱至35° C，攪拌2-3天后，過濾溶液并在110° C下高溫消毒待用；(2)然后，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為(1. 5-2)% 的溶液，并在110° C下高溫消毒待用；(3)利用體積濃度為75%的醫(yī)用酒精將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為(0. 3-0. 7)%的京尼平-酒精溶液；(4)再用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為(0.5-0. 9) g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液，并加熱到50° C待用。所述殼聚糖聚合物的合成階段包括如下步驟
步驟一、將殼聚糖溶液、明膠溶液與純水混合形成混合液，上述三者是按照一定體積比進行混合的，所述體積比一般為(3-6) :1: (1-5)；
步驟二、在攪拌器上攪拌上述混合液20-30分鐘，以使天然殼聚糖與明膠混勻，然后加熱至；35° C;
步驟三、然后將稀釋好的京尼平-酒精溶液加入步驟二所形成混合液中，所述京尼平-酒精溶液與步驟二所形成混合液之間的體積比為1 (20-50)，之后攪拌30-60分鐘使混勻，以實現(xiàn)化學交聯(lián)過程；
步驟四完成步驟三之后，再將配制好的甘油-2-磷酸二鈉溶液加入，所述甘油-2-磷酸二鈉溶液與步驟三所形成液體的之間的體積比為1:20-200，攪拌5分鐘使混合均勻，實現(xiàn)離子交聯(lián)過程；
步驟五將完全交聯(lián)后形成的殼聚糖聚合物放入37° C溫箱待用。在本發(fā)明的一個實施例中，在原材料的準備階段中，殼聚糖粉被溶解成質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 5%的溶液，將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0. 5%的京尼平-酒精溶液；用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0. 8g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段，各步驟中的體積比分別按照一定優(yōu)選比例進行混配。步驟一中的體積比優(yōu)選為4:1:3 ；步驟三中的體積比優(yōu)選為1:20，步驟四中的體積比優(yōu)選為1:20。在本發(fā)明的第二實施例中，在原材料的準備階段中，殼聚糖粉被溶解成質(zhì)量濃度為1%的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 5%的溶液，將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0. 6%的京尼平-酒精溶液；用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0. 9g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段，各步驟中的體積比分別按照一定優(yōu)選比例進行混配。步驟一中的體積比優(yōu)選為3:1:2 ；步驟三中的體積比優(yōu)選為1:40，步驟四中的體積比優(yōu)選為1:100。在本發(fā)明的第三實施例中，在原材料的準備階段中，殼聚糖粉被溶解成質(zhì)量濃度為1. 85%的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 8%的溶液，將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0. 5%的京尼平-酒精溶液；用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0. Sg/ ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段，各步驟中的體積比分別按照一定優(yōu)選比例進行混配。步驟一中的體積比優(yōu)選為3:1:2 ；步驟三中的體積比優(yōu)選為1:35，步驟四中的體積比優(yōu)選為1:120。按照本發(fā)明的方法殼聚糖聚合物為凝膠狀的膠體，因此又稱殼聚糖聚合物水凝膠，其在許多領(lǐng)域都具有重要的應用，尤其是在醫(yī)學領(lǐng)域常常用于骨組織的再生。為了驗證按照本發(fā)明的方法制成的殼聚糖聚合物(水凝膠)作為生物支架的物理學特點、作為生物活性物質(zhì)載體的生化學特點和能促進細胞分化增值的生物學特點，本發(fā)明設(shè)計了多組實驗。由于實驗數(shù)據(jù)眾多，本申請記載的實驗采用的是按照本發(fā)明第三實施例中的配比而制備的殼聚糖聚合物，也即，在原材料的準備階段中，殼聚糖粉被溶解成質(zhì)量濃度為1. 85%的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 8%的溶液，將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0. 5%的京尼平-酒精溶液；用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0. 8g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段，步驟一中的體積比為 3:1:2 ；步驟三中的體積比為1:35，步驟四中的體積比為1:120。(1)物理特性檢測
膠體的流變力學特點決定了膠體的強度和交聯(lián)時間、藥物和活性因子的植入時間、以及緩釋速率及膠體自體溶解吸收時間，為了驗證本發(fā)明的殼聚糖聚合物的物理特性，在體外進行了流變學檢測、載體特性檢測和電子顯微鏡表層掃描三項實驗。a.流變學檢測
圖1為流變學實驗(rheology )曲線，圖中G’和G”分別為剛性模量和粘彈性模量，橫軸為交聯(lián)時間。根據(jù)流變學試驗數(shù)據(jù)顯示，利用本發(fā)明方法所制備的殼聚糖聚合物為凝膠狀，其交聯(lián)時間和成膠強度可以控制，交聯(lián)成功后膠體強度穩(wěn)定。本發(fā)明方法在成膠時的交聯(lián)時間在3800秒左右，利于控制載體藥物植入、膠體強度在1000 左右，有利于細胞生長，穩(wěn)定性最佳，因此完全符合載體設(shè)計要求。b.載體特性(vector)檢測
本實驗采用ELISA檢測方法，圖2示出了藥理學釋放特性(Elisa test)實驗曲線，從圖2中可以看出，含不同濃度rhBMP-2 (0. 5ug/ml、lug/ml、5ug/ml)的殼聚糖聚合物(水凝膠)，作為釋放載體的三條不同濃度的釋放曲線，X軸線是時間，Y軸線是實時藥物釋放量。 例如，體積濃度為5ug/ml的rhBMP-2 (人骨形成蛋白2)在水凝膠內(nèi)的體外藥物釋放中，體外浸泡5d時，含rhBMP-2的水凝膠在0. OlM磷酸鹽緩沖液(PBS)中的rhBMP-2釋放量為 3. 64% 士 0. 49%，表現(xiàn)為爆發(fā)性釋放，隨后呈持續(xù)緩慢穩(wěn)定釋放，28天時達6. 40% 士 0. 55%， 同時隨著載體藥物濃度的增加，釋放濃度與載體內(nèi)原始藥物濃度呈正相關(guān)，單位時間內(nèi)的釋放量增加，不需要增加任何緩釋劑，緩釋時間達到30天或更長。其它濃度的rhBMP-2 (人骨形成蛋白2)也呈現(xiàn)出大體相同的趨勢，這說明本發(fā)明的殼聚糖聚合物載體特性良好，符合要求。c.電子顯微鏡掃描(SEM)
利用電子顯微鏡對本發(fā)明的殼聚糖聚合物樣品進行掃描觀測，以便觀測膠體表層形態(tài)特點。圖3為電鏡掃描圖片，從電鏡照片可以看出，本發(fā)明的殼聚糖聚合物表面具有多孔結(jié)構(gòu)，沒有呈現(xiàn)出固定的網(wǎng)孔形態(tài)，表面并不光滑，呈現(xiàn)塊狀結(jié)構(gòu)，這是由于殼聚糖聚合物中在酸性溶液中交聯(lián)，容易形成氫鍵，呈現(xiàn)出網(wǎng)狀，這一結(jié)構(gòu)有利于對細胞的吸附、增值和藥物釋放。同時含有大量水分子，利于液體交換，便于載體中活性物質(zhì)的釋放和細胞生長所需要的營養(yǎng)、代謝物質(zhì)的供給與交換，同時為細胞生長提供支架。從圖4中還可以看出，本發(fā)明的殼聚糖聚合物樣品網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)更清晰、均勻一致，平均孔徑約為500um士80um，結(jié)構(gòu)點的破損點少，表面更加光滑，利于細胞粘附、生長和增值。(2)體外生物學特性檢測
為了解多種細胞在DMEM殼聚糖聚合物(水凝膠)培養(yǎng)基中的生長特點，驗證被載的活性物質(zhì)在本發(fā)明的殼聚糖聚合物中能夠分化、增值，本發(fā)明將8種不同種類的細胞系細胞(人神經(jīng)細胞、人骨髓基質(zhì)細胞、人牙髓細胞、人成纖維細胞、人脂肪細胞、鼠神經(jīng)細胞)置于由本發(fā)明的殼聚糖聚合物制成的DMEM培養(yǎng)基中，使這些細胞在培養(yǎng)基中進行分化和增值， 在不同時間段對其型態(tài)、數(shù)量、增值速率等方面進行觀察，以期得知其與普通培養(yǎng)基之間的差異。圖4和圖5示出的是其中一種細胞(人骨髓基質(zhì)細胞)的觀察圖片。圖4為倒置像差顯微鏡下觀察生長細胞的2D結(jié)構(gòu)，圖5為共聚焦激光掃描顯微鏡觀察生長細胞的3D結(jié)構(gòu)。從圖4和圖5可以看出，細胞生長形態(tài)正常，分化活躍，增值速率明顯快于普通培養(yǎng)基， 胞核形態(tài)、染色正常，細胞蛋白骨架結(jié)構(gòu)無缺陷，證明此種培養(yǎng)基能加速細胞分化、增值， 而不會產(chǎn)生變異。從以上實驗可以看出，利用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的殼聚糖聚合物符合生物支架的物理學特點和生物活性物質(zhì)載體的生化學特點，細胞在本發(fā)明的殼聚糖聚合物培養(yǎng)基中分裂、增值速度明顯強于普通培養(yǎng)基。
本專利申請是通過幾個具體實施例進行說明的，在不脫離本專利申請范圍的情況下，還可以對本專利申請進行各種變換及等同替代。因此，本專利申請不局限于所公開的具體實施例，而應當包括落入本專利申請權(quán)利要求范圍內(nèi)的全部實施方式。
權(quán)利要求
1.一種殼聚糖聚合物的制備方法，其特征在于，制備所述殼聚糖聚合物所用原材料包括天然殼聚糖粉、明膠粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二鈉粉劑；所述制備方法具體包括合成前原材料的準備階段和合成階段；在合成前原材料的準備階段，需要利用醋酸溶液將天然殼聚糖粉溶解成質(zhì)量濃度為(1- %的殼聚糖溶液，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為(1.5- %的明膠溶液，利用醫(yī)用酒精將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為(0.3-0. 7)%京尼平-酒精溶液，用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為(0. 5-0. 9) g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液；在殼聚糖聚合物的合成階段中使天然殼聚糖分別與京尼平和甘油-2-磷酸二鈉實現(xiàn)化學交鏈和離子交聯(lián)，從而獲得凝膠狀的殼聚糖聚合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的殼聚糖聚合物的制備方法，其特征在于，所述合成前原材料的準備階段具體為(1)利用質(zhì)量濃度為0.4%的醋酸溶液，將天然殼聚糖粉溶解成質(zhì)量濃度為1. 85%的殼聚糖溶液，然后加熱至35° C，攪拌2-3天后，過濾溶液并在110° C下高溫消毒待用；(2)然后，用純水將明膠粉溶解成質(zhì)量濃度為1.8%的溶液，并在110°C下高溫消毒待用；(3)之后，利用體積濃度為75%的醫(yī)用酒精將京尼平溶液稀釋成質(zhì)量濃度為0.5%的京尼平-酒精溶液；(4)最后，用純水將甘油-2-磷酸二鈉配成濃度為0.8g/ml的甘油-2-磷酸二鈉溶液， 并加熱到50° C待用。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的殼聚糖聚合物的制備方法，其特征在于，所述殼聚糖聚合物的合成步驟包括步驟一、將配制好的殼聚糖溶液、明膠溶液與純水混合形成混合液，上述三者是按照一定體積比進行混合的，所述體積比為(3-6) :1: (1-5)；步驟二、在攪拌器上攪拌上述混合液20-30分鐘，以使天然殼聚糖與明膠混勻，然后加熱至；35° C;步驟三、然后將稀釋好的京尼平-酒精溶液加入步驟二所形成混合液中，所述京尼平-酒精溶液與步驟二所形成混合液之間的體積比為1 (20-50)，之后攪拌30-60分鐘使混勻，以實現(xiàn)化學交聯(lián)過程；步驟四完成步驟三之后，再將配制好的甘油-2-磷酸二鈉溶液加入，所述甘油-2-磷酸二鈉溶液與步驟三所形成液體的之間的體積比為1:20-200，攪拌5分鐘使混合均勻，實現(xiàn)離子交聯(lián)過程；步驟五將完全交聯(lián)后形成的殼聚糖聚合物放入37° C溫箱待用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的殼聚糖聚合物的制備方法，其特征在于，在殼聚糖聚合物的合成階段，步驟一中的體積比為3 1 2 ；步驟三中的體積比為1 35，步驟四中的體積比為 1:120。
5.一種由權(quán)利要求1 一 4任一方法所制成的殼聚糖聚合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種外科手術(shù)用醫(yī)用材料，特別涉及一種能夠作為醫(yī)學生物工程支架及攜載活性生長因子的載體的殼聚糖聚合物----及其制備方法。在制備方法中，所用原材料包括天然殼聚糖粉、明膠粉、京尼平溶液、甘油-2-磷酸二鈉粉劑；所述制備方法具體包括合成前原材料的準備階段和合成階段；在殼聚糖聚合物的合成階段中使天然殼聚糖分別與京尼平和甘油-2-磷酸二鈉實現(xiàn)化學交鏈和離子交聯(lián)，從而獲得凝膠狀的殼聚糖聚合物。本發(fā)明的方法操作過程簡單，所用材料天然無毒，來源方便，并且利用本發(fā)明的方法所生產(chǎn)的殼聚糖聚合物穩(wěn)定性好，可作為醫(yī)學生物工程支架及攜載活性生長因子的載體。
文檔編號C08J3/075GK102399370SQ20111024235
公開日2012年4月4日 申請日期2011年8月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月23日
發(fā)明者趙文 申請人:趙文