專利名稱：一種毛細管動態(tài)包被聚合物凝膠及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供一種能夠動態(tài)包被毛細管的凝膠的組分及配制方法。該聚合物是一種篩分聚合物及一種包被聚合物的混合物。本發(fā)明的聚合物具有毛細管自涂層作用及生物大分子篩分的作用。
背景技術(shù)：
毛細管電泳是一種在生命科學(xué)應(yīng)用最為廣泛的生物分子分離技術(shù)。目前，可應(yīng)用于遺傳學(xué)領(lǐng)域，進行DNA測序，SNP檢測，DNA片段分析等。由于具有高效的熱消散，毛細管電泳可實現(xiàn)帶電物質(zhì)的高效、快速分離。帶電物質(zhì)將受到兩種電泳遷移力的作用。一種是電泳遷移率，它取決于電場及電場強度本身。另一種電滲作用，它能夠在不受遷移率影響的情況下，使中性和離子性物質(zhì)以一個固定的速度，向電極一端移動。電滲流的強度在很大程度上取決于表面的電荷以及毛細管表面附近的粘度。這些性質(zhì)受毛細管管壁物質(zhì)組成、緩沖液、分離介質(zhì)、PH值等條件的影響。在使用硅包毛細管的情況下，在離子化后，毛細管內(nèi)壁負電荷會吸附一層正電荷(Buffer中)。在電位的影響下， 這些移動的離子流向陰極。一定容積的溶液也流向這個位置以維持電中性。電滲流控制的抑制提高了毛細管電泳分離的分辨力。如不能抑制電滲效應(yīng)將導(dǎo)致分離不完全，特別是核酸和蛋白的分離?；谌诤瞎璧慕?jīng)驗，硅表面硅羥基的離子化將產(chǎn)生負電荷表面。已有多種用于抑制硅毛細管中電滲作用的處理方法被紛紛研制出來，通過抑制電滲能夠最小化被分析樣本與毛細管內(nèi)壁之間的相互作用。也就是說減少了電荷的產(chǎn)生。為了抑制電滲與DNA與毛細管內(nèi)壁作用，在使用毛細管電泳進行DNA測序時，控制毛細管內(nèi)表面需要使用憎水篩分聚合物，如聚丙烯酰胺和羥乙基纖維素。永久性的共價修飾和動態(tài)的暫時性的修飾這兩種方式都可以應(yīng)用于毛細管內(nèi)壁的修飾。然而，形成共價包被的工藝比較復(fù)雜，且浪費時間，同時，在多次反復(fù)使用的過程中，包被層的化學(xué)穩(wěn)定性仍然是很難解決的問題。為了減少DNA檢測費用，提高重復(fù)性和穩(wěn)定性，有必要采用吸附包被去取代昂貴的不理想的共價包被法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供毛細管電泳的篩分介質(zhì)的制備方法。本發(fā)明提供的毛細管電泳的篩分介質(zhì)的制備方法，是在溶膠緩沖液中，將疏水性聚合物和親水性聚合物混合，得到所述篩分介質(zhì)。該篩分介質(zhì)是一種毛細管動態(tài)包被聚合物凝膠。進一步，上述疏水性聚合物和親水性聚合物的質(zhì)量配比是(0.8-1.2) (8-12)， 優(yōu)選配比是1 10。更進一步，所述溶膠緩沖液、所述疏水性聚合物和所述親水性聚合物的配比是 (450-550)ml (0. 8-1. 2) g (8-12) g，優(yōu)選配比是 500ml Ig 10g。
在具體實施例中，上述疏水性聚合物可以是由二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺在引發(fā)劑存在下反應(yīng)得到的聚合物。上述二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的質(zhì)量配比可以為0-4) (6-8)，優(yōu)選質(zhì)量比為3 7。上述引發(fā)劑為過硫酸銨和N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺的混合物。在實施例中，上述二乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、硫酸銨和N，N，N’，N’ -四甲基乙二胺的配比是 1.5g 3. 5g 0. 005g 0. Olml0上述反應(yīng)是在無氧條件下進行的，所述反應(yīng)的溫度為30-40°C，優(yōu)選為35°C ；所述反應(yīng)的時間為8-12小時，優(yōu)選為10小時。在具體實施例中，上述親水性聚合物可以為線性聚丙烯酰胺；優(yōu)選是，所述線性聚丙烯酰胺的數(shù)均分子量為414kDa、重均分子量為3105kDa、多分散性為7. 5。上述溶膠緩沖液是由電泳緩沖液、變性劑和水組成；每50ml溶膠緩沖液優(yōu)選由 5ml 10倍所述電泳緩沖液、19g變性劑和25ml水混勻制備得到；所述10倍電泳緩沖液的溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)0. 5M Tris,0. 5M TAPS、0. 02M EDTA-Na2 ；所述變性劑優(yōu)選是尿素、甲酰胺和/或SDS。優(yōu)選地是，上述制備方法還包括疏水性聚合物和親水性聚合物混合步驟之后的搖勻、過濾和去除氣體。上述過濾是將所述搖勻后的溶液經(jīng)5 μ m的尼龍濾器過濾。上述的方法制備的篩分介質(zhì)屬于本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。進行毛細管電泳所使用的篩分介質(zhì)通常是一種混合的非交聯(lián)聚合物，這種聚合主要應(yīng)起到兩種作用一是包被毛細管內(nèi)壁；二是作為一種分離的介質(zhì)。聚合物的成分包括一系列不同親水性/疏水性的聚合物。其中包含一種主要起包被作用的成分(包被聚合物)，還包含一種起篩分作用的成分(篩分聚合物)。每種成分的聚合物可以是共聚物或同聚物，還可以是共聚物和同聚物的混合物。聚合物可以是自然存在的聚合物，也可以是修飾過的自然存在的聚合物或人工合成的聚合物。聚合物的化合將產(chǎn)生水溶性不同的聚合物，特別注意的是聚丙烯酰胺的交聯(lián)， 在交聯(lián)時，混合物中聚丙烯酰胺將因其N位取代的不同而不同。聚合物水溶性因篩分聚合物(親水性更強)與包被聚合物(親水性弱)的不同而不同。篩分聚合物包括，聚丙烯酰胺、聚醚、多糖類如羥乙基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖等；包被聚合物可以包括同聚合和共聚體，兩者皆可自然生成，或?qū)ψ匀簧傻木酆线M行修飾，也可人工合成，包被聚合物包括丙烯酰胺的聚合物(包括甲基丙烯酰胺)，取代纖維素，取代可以是甲基和羥基或是兩者皆發(fā)生，如二甲基聚丙烯酰胺、二乙基聚丙烯酰胺、氧化聚乙烯、 甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙纖維素、聚乙烯吡咯烷酮等；包被共聚物包括兩至三種單體，通常是如下單體中的兩種N-甲基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-甲基甲基丙烯酰胺、 N-丙基丙烯酰胺、N-丙基甲基丙烯酰胺、N-哌啶基甲基丙烯酰胺、N-吡咯烷基甲基丙烯酰胺等。混合聚合物時，應(yīng)避免沉淀的產(chǎn)生。所使用的緩沖液應(yīng)與毛細管電泳過程所使用的緩沖液兼容。緩沖液包括Tris堿，雙(三羥甲基)氨基甲烷，硼酸鹽，EDTA，MOPS, N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸，檸檬酸三鈉，磷酸鉀、磷酸鈉、等。每種組分將以0. 001-0. 5M的濃度存在于緩沖液中，可能是0. 075-0. 15M，而其他組分如EDTA，DETPA等將以0. 001-0. 005M的濃度存在。除其他加入物外，需加入一種變性劑進行dsDNA變性(DNA 測序或序列分析)如尿素，甲酰胺，SDS0變性劑的量依變性劑種類、電泳條件，所分析的物質(zhì)成分的不同而不同。一般變性劑的量在0. 2-50 (w/v)。對于水溶性較差的聚合物，必須在其與溶液混合時進行強烈攪拌，然后進行過濾。對于可溶性強的聚合物，離心后進行過濾就足以形成澄清的溶液了。兩種溶液然后以 1 1-10的比例混合，可以是1 10。應(yīng)盡量避免沉淀的產(chǎn)生。通過分階段的混勻成分避免沉淀的產(chǎn)生，然后取出殘渣或沉淀物。實驗證明本發(fā)明所制備的凝膠能夠在保證較高分辨率的前提下，具有動態(tài)涂層的能力，兼具篩分能力與動態(tài)涂層能力(圖1)。


圖1為實施例3制備得到的凝膠進行Typer 500分子量內(nèi)標(biāo)的檢測的峰圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例1、疏水性動態(tài)包被共聚物的制備疏水性動態(tài)包被聚合物是一種非交聯(lián)的聚合物，由含自由基的溶液聚合而成。聚合反應(yīng)在一種單體水相溶液中進行，如二乙基丙烯酰胺與二甲基丙烯酰胺(3 7)。單體的濃度應(yīng)低于10g/100ml。具體步驟如下在圓底燒瓶中加入1. 5g 二乙基丙烯酰胺與3. 5g 二甲基丙烯酰胺，然后加入60mL 的超純水，用高純氦氣(99. 99% )對溶液進行除氧1個小時。然后通過注射器加入0. 005g 過硫酸銨(APS)和0. OlmL N, N, N’，N，_四甲基二乙胺(TEMED)為引發(fā)劑，在35°C下反應(yīng) 10小時，然后對溶液進行透析和凍干除去多余的水分和未反應(yīng)的單體，獲得固體形態(tài)的聚合物(疏水性動態(tài)包被共聚物)。研究發(fā)現(xiàn)這種聚合物具有理想的篩分和包被能力。實施例2 可溶性高的聚合物的制備(線性聚丙烯酰胺)在一個圓底燒瓶中，加入5g丙烯酰胺、0. Ig span80、20g礦物油和0. 005g過硫酸銨(APS)，加入攪拌子在600rpm下攪拌30min，體系呈乳液狀態(tài)。通入高純氦氣除氧一個小時，通過注射器加入0. OlmL N，N，N’，N’ -四甲基二乙胺(TEMED)催化反應(yīng)然后把圓底燒瓶放在35°C油浴中在氦氣保護下反應(yīng)18小時。反應(yīng)結(jié)束后，用丙酮去沉淀聚丙烯酰胺，用丙酮在漏斗上沖洗沉淀數(shù)次，最后用真空烘箱在45°C下干燥12小時，得到白色粉末固體(親水性篩分聚合物)，轉(zhuǎn)化率約40%。經(jīng)凝膠滲透色譜儀(GPC)測試分子量為Mn = 414kDa, Mw = 3105kDa,多分散性為7. 5。實施例3 混合篩分介質(zhì)(1 10疏親)的制備一、10倍電泳緩沖液的配制1.稱取6.05g 1Tris堿、12. 16g N-三(羥甲基)甲基_3_氨基丙磺酸(超純級)、 0. 74gEDTA-Na2加入到含80ml無菌水的100ml容量瓶中混勻，加入無菌水定容至IOOmL,形成10倍電泳緩沖液，其中Tris終濃度0.5M、N-三(羥甲基)甲基_3_氨基丙磺酸終濃度0. 5M、EDTA-Na2 終濃度 0. 02M。二、溶膠緩沖液的配制2.稱25ml無菌水在一個干凈的IOOml玻璃瓶。3.稱量19g尿素(超純級)，加入到步驟2的IOOml玻璃瓶中。蓋上蓋子，手動溫和搖勻直到所有的尿素溶解。4.加入5ml本實施例步驟1配制的10倍電泳緩沖液溶液，溫和震蕩，得到50ml溶膠緩沖液。三、篩分介質(zhì)制備5.稱量實施例1中的0. Ig疏水性動態(tài)包被共聚物并加入上述瓶中。6.稱量實施例2中的Ig親水性篩分聚合物的制備，并加入上述瓶中。7.溫和震蕩瓶子，并混合所有成分。然后IOOOrpm離心15min，所有的內(nèi)容物將在瓶底。8.過夜震蕩(12小時)步驟7的瓶子，使用磁力攪拌器(Corning公司)以低速 60rpm運行，得到帶有泡沫的溶液。9.過夜搖勻后，帶有泡沫的溶液透過5 μ m的尼龍濾器(CameoNS，Osmonics)，過濾使用氮氣壓力。收集濾過物入一干凈的瓶中。10.過濾后的溶液離心(lOOOrpm、離心60min)去除氣體，得到混合篩分介質(zhì)，也即 2%的凝膠。計算方法為lg親水性篩分聚合物質(zhì)量/50mL溶膠緩沖液=2%。11. 4 °C儲存，防止尿素的降解。實施例4、Typer 500分子量內(nèi)標(biāo)的檢測1.采用實施例3中制備的凝膠；2.在AB3130型遺傳分析儀上進行DNA片段分離的的電泳條件電泳電壓是15kV;進樣時間是IOs毛細管長度是36cm ；電泳溫度是60°C。3、換新配的Running buffer (實施例3步驟一制備的電泳緩沖液稀釋10倍后的溶液)和TyperTM15(公安部物證鑒定中心)分子量內(nèi)標(biāo)(IuyL內(nèi)標(biāo)+20yL去離子甲酰胺)。4、將實施例3制備的2%的凝膠裝入膠瓶中，并將注膠管置于膠瓶中，固定好。5、啟動自動換膠系統(tǒng)。6、按照操作說明進行毛細管電泳檢測其電泳結(jié)果如圖1所示，2%的凝膠對Typer^OO分子量內(nèi)標(biāo)能夠?qū)崿F(xiàn)良好的分離。實施例3所制備的凝膠能夠在保證較高分辨率的前提下，具有動態(tài)涂層的能力，兼具篩分能力與動態(tài)涂層能力。
權(quán)利要求
1.毛細管電泳的篩分介質(zhì)的制備方法，是在溶膠緩沖液中，將疏水性聚合物和親水性聚合物混合，得到所述篩分介質(zhì)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述疏水性聚合物和親水性聚合物的質(zhì)量配比是(0.8-1. 2) (8-12)，優(yōu)選配比是1 10。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于所述溶膠緩沖液、所述疏水性聚合物和所述親水性聚合物的配比是G50-550)ml (0. 8-1. 2) g (8_12) g，優(yōu)選配比是 500ml Ig IOg0
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述疏水性聚合物是由二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺在引發(fā)劑存在下反應(yīng)得到的聚合物；所述二乙基丙烯酰胺和二甲基丙烯酰胺的質(zhì)量配比為0-4) (6-8)，優(yōu)選質(zhì)量比為3 7。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述引發(fā)劑為過硫酸銨和N，N，N’，N’-四甲基二乙胺的混合物。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述二乙基丙烯酰胺、二甲基丙烯酰胺、硫酸銨和N，N，N，，N，-四甲基乙二胺的配比是1.5g 3. 5g 0. 005g 0.01ml。
7.如權(quán)利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)是在無氧條件下進行的； 所述反應(yīng)的溫度為30-40°C，優(yōu)選為35°C ；所述反應(yīng)的時間為8-12小時，優(yōu)選為10小時。
8.如權(quán)利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于所述親水性聚合物為線性聚丙烯酰胺；優(yōu)選是，所述線性聚丙烯酰胺的數(shù)均分子量為414kDa、重均分子量為3105kDa、多分散性為7.5。
9.如權(quán)利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于所述溶膠緩沖液是由電泳緩沖液、變性劑和水組成；每50ml溶膠緩沖液優(yōu)選由5ml 10倍所述電泳緩沖液、19g變性劑和 25ml水混勻制備得到；所述10倍電泳緩沖液的溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)0. 5M Tris,0. 5M TAPS、0. 02M EDTA-Na2 ；所述變性劑優(yōu)選是尿素、甲酰胺和/或SDS。
10.權(quán)利要求1-9中任一所述的方法制備的篩分介質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毛細管動態(tài)包被聚合物凝膠及其制備方法。本發(fā)明提供的毛細管電泳的篩分介質(zhì)的制備方法，是在溶膠緩沖液中，將疏水性聚合物和親水性聚合物混合，得到所述篩分介質(zhì)。本發(fā)明所制備的凝膠能夠在保證較高分辨率的前提下，具有動態(tài)涂層的能力，兼具篩分能力與動態(tài)涂層能力。
文檔編號C08J3/075GK102276852SQ20111011537
公開日2011年12月14日 申請日期2011年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月5日
發(fā)明者葉健, 姜伯瑋, 趙興春 申請人:公安部物證鑒定中心