專利名稱：一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物及其作為固相萃取劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物及其作為固相萃取劑的應(yīng)用，屬 于分析化學(xué)與材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，大隆、溴敵隆等抗凝血鼠藥引發(fā)的投毒、自殺、誤服等刑事案件屢見(jiàn)不鮮， 生物樣本中大隆、溴敵隆的分析檢驗(yàn)至關(guān)重要。但由于司法鑒定領(lǐng)域毒物分析檢材復(fù)雜多 樣、雜質(zhì)干擾嚴(yán)重等，在腐敗生物樣本(如體液、毛發(fā)或臟器組織)中的高效分離、提取仍然 是目前法醫(yī)毒物分析工作者們研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)開(kāi)發(fā)的分子印跡術(shù)，為法醫(yī)毒物分析毒物的提取、分離提供了新思路和新 途徑。分子印跡聚合物(MIPs)具有預(yù)定性、識(shí)別性、實(shí)用性三大特點(diǎn)，對(duì)目標(biāo)分子的空間結(jié) 構(gòu)具有“記憶”效應(yīng)，能夠高選擇性識(shí)別復(fù)雜樣品中的印跡分子，這些特點(diǎn)使得MPs能夠成 為非常有吸引力的特異性吸附材料，已在分離領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用研究。分子印跡固相萃取 (MISPE)技術(shù)是將分子印跡聚合物作為固相萃取劑，集分子印跡技術(shù)與固相萃取技術(shù)于一 體，為樣品的采集、富集和分析提供了極大的方便，克服了生物或環(huán)境樣品體系復(fù)雜、預(yù)處 理手續(xù)繁雜等不利因素，適用于腐敗生物樣本中目標(biāo)物的提取分離、凈化。有關(guān)大隆分子印跡聚合物的制備及其在樣本前處理中的應(yīng)有還未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào) 道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了解決已有技術(shù)中復(fù)雜樣本中大隆等抗凝血鼠藥提取分離困 難的問(wèn)題，提出一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物及其作為固相萃取劑的應(yīng)用。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明的一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物，該分子印跡聚合物的制備方法 為1)采用大隆作為模版分子，同功能單體在溶劑中混勻，混勻后在4°C以下保存24h 形成預(yù)聚體；然后在常溫下加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，在4°C以下、用波長(zhǎng)為^Onm的紫外光引 發(fā)聚合Mh，得到球形顆粒聚合物；功能單體為丙烯酰胺，溶劑為二甲基亞砜；交聯(lián)劑為三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸 酯TRIM，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；功能單體、模板分子和溶劑的摩爾比為4 1 20;交聯(lián) 劑的體積用量為溶劑的1.6%，引發(fā)劑的摩爾用量為模版分子的4% ；2)用有機(jī)溶劑甲醇/甲酸浸泡步驟1)得到的球形顆粒聚合物并攪拌池，球形顆 粒聚合物中的模板分子溶解在有機(jī)溶劑甲醇/甲酸中，然后離心分離去除有機(jī)溶劑甲醇和 乙酸；甲醇與甲酸的體積比為9 1 ；3)重復(fù)步驟2) 2次以上；
4)經(jīng)步驟幻清洗后的球形顆粒聚合物中加入乙醇，洗滌除去甲酸；5)重復(fù)步驟4) 2次以上；6)經(jīng)步驟5)清洗后的球形顆粒聚合物中加入丙酮，以除去細(xì)小顆粒，然后真空干 燥，得到大隆分子印跡聚合物。本發(fā)明的一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物作為固相萃取劑的應(yīng)用，具體步驟 為1)大隆分子印跡固相萃取柱的制備將制備的大隆分子印跡聚合物溶于甲醇中制成懸浮液，攪拌均勻后緩慢注入帶有 20 μ m篩板的聚乙烯空固相萃取柱中，真空抽吸使大隆分子印跡聚合物在空固相萃取柱中 分布均勻，然后在大隆分子印跡聚合物上方裝入20 μ m篩板，大隆分子印跡聚合物與甲醇 的比 50mg 5mL ；2)制備樣品取血液lmL，用2mL甲醇沉淀混旋，用6mL去離子水稀釋，離心，取清液；3)大隆分子印跡固相萃取方法依次用ImL甲醇、ImL甲醇/水混合溶劑活化大隆分子印跡固相萃取柱，然后將步 驟2)制備的樣品上固相萃取柱，然后再用2mL甲醇/水混合溶劑洗滌，最后用2mL甲醇/ 甲酸混合溶劑洗脫，收集洗脫液，在空氣流下?lián)]干，然后用200 μ L的甲醇溶解殘?jiān)?，最后?LC, LC-MS 分析；甲醇/水的體積比為3 7，甲醇/甲酸的體積比為9 1。有益效果本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便、快速，對(duì)結(jié)構(gòu)相似物大隆、溴敵隆有很好的吸附性能，具 有高度專一性和吸附選擇性，為復(fù)雜基質(zhì)中抗凝血鼠藥大隆、溴敵隆的快速篩查、提取分離 提供新手段，具有廣闊的應(yīng)用前景，有望實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)并投入實(shí)際應(yīng)用；建立的分子印跡 固相萃取方法，操作簡(jiǎn)單，對(duì)目標(biāo)物選擇性的吸附，對(duì)復(fù)雜基質(zhì)中目標(biāo)物的提取分離起到凈 化作用，有效去除基體雜質(zhì)，提高了分離精度，降低了檢測(cè)限，適用于法庭科學(xué)領(lǐng)域腐敗生 物樣本中抗凝血鼠藥大隆、溴敵隆的提取分離。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施案例在于詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例—種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物，該分子印跡聚合物的制備方法為1)在50mL玻璃試管中放入大隆131. 8mg(0. 25mmol)和71mg丙烯酰胺(Immol)，然 后用20. Oml 二甲基亞砜溶解混勻、密封后放入冰箱內(nèi)自行聚合Mh，冰箱溫度在4°C以下； 然后在常溫下加入320 μ L(Immol)三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯和1. 偶氮二異丁腈 (O.Olmmol)，充分混勻并通氮?dú)釯Omin后放入到紫外燈箱內(nèi)，在4°C以下、用波長(zhǎng)為^Onm的 紫外光引發(fā)聚合Mh，得到球形顆粒聚合物；2)用有機(jī)溶劑甲醇/甲酸浸泡步驟1)得到的球形顆粒聚合物并攪拌池，球形顆 粒聚合物中的模板分子溶解在有機(jī)溶劑甲醇/甲酸中，然后離心分離去除有機(jī)溶劑甲酸； 甲醇與甲酸的體積比為9 1 ；
3)重復(fù)步驟2) 2次；4)經(jīng)步驟3)清洗后的球形顆粒聚合物中加入乙醇，洗滌除去甲酸；5)重復(fù)步驟4)4次；6)經(jīng)步驟5)清洗后的球形顆粒聚合物中加入丙酮，以除去細(xì)小顆粒，然后真空干 燥，得到大隆分子印跡聚合物。非印跡聚合物的制備除不加模板分子外，其余條件與上述一致。大隆分子印跡聚合物的吸附效率的測(cè)定分別稱量50mg已制備好的大隆分子印跡聚合物與非印跡聚合物，分別置于IOmL 含10 μ g大隆二甲基亞砜溶液中，浸泡Mh，離心取上清液，采用LC測(cè)定吸附后溶液濃度分 別為ο. 05μ g/mL、0. 64μ g/mL ；根據(jù)公式(1)計(jì)算大隆分子印跡聚合物和非印跡聚合物對(duì) 大隆的吸附效率。E= X 100%k=-Bmp
C0eMP(1)式中CQ-吸附前大隆濃度(μ g/mL)，Ci-吸附后大隆濃度(μ g/mL)；k為表觀吸附效果；Emip為大隆分子印跡聚合物對(duì)大隆的吸附效率，Enip為非印跡 聚合物對(duì)大隆的吸附效率；Emip = 95%, Enip = 35. 7%，k = 2. 66。通過(guò)上述方法經(jīng)過(guò)對(duì)濃度分別為1. 0mg/mL、2. 0mg/mL、3. 0mg/mL、4. Omg/mL、 5. Omg/mL的大隆水溶液進(jìn)行吸附，得出每克大隆分子印跡聚合物吸附大隆最大飽和吸附量 為36. 3nmolο大隆分子印跡聚合物的選擇性的測(cè)定分別稱量50mg已制備好的大隆分子印跡聚合物和非印跡聚合物，分別置于IOmL 含有ι μ g溴敵隆、ι μ g大隆的水溶液中，浸泡Mh，離心取上清液，采用LC-MS測(cè)定吸附后 溶液中大隆濃度、溴敵隆濃度；根據(jù)公式(1)計(jì)算大隆分子印跡聚合物和非印跡聚合物對(duì) 大隆、溴敵隆的吸附效率；分別稱量50mg已制備好的大隆分子印跡聚合物和非印跡聚合物，分別置于IOmL 同時(shí)含有ι μ g溴敵隆、1 μ g大隆的甲醇溶液中，浸泡Mh，離心取上清液，采用LC-MS測(cè)定 吸附后溶液中大隆濃度、溴敵隆濃度；根據(jù)公式(1)計(jì)算大隆分子印跡聚合物和非印跡聚 合物對(duì)大隆、溴敵隆的吸附效率；分別稱量50mg已制備好的大隆分子印跡聚合物和非印跡聚合物，分別置于IOmL 同時(shí)含有ι μ g溴敵隆、1 μ g大隆的乙腈溶液中，浸泡Mh，離心取上清液，采用LC-MS測(cè)定 吸附后溶液中大隆濃度、溴敵隆濃度；根據(jù)公式(1)計(jì)算大隆分子印跡聚合物和非印跡聚 合物對(duì)大隆、溴敵隆的吸附效率；上述的HPLC/MS 色譜條件Waters Symmetry C18 柱(2. ImmX 150mmX5 μ m)毛細(xì) 管溫度280°C，毛細(xì)管電壓_45V，補(bǔ)償電壓-20kV ；輔助氣30arb，噴霧電壓5. OkV，掃描方 式負(fù)離子MS/MS掃描方式，掃描范圍90-600，大隆母離子523. 0，碰撞能量45%;溴敵隆 母離子527. 2，碰撞能量39% ；流動(dòng)相甲醇水(0. 甲酸)=80 20，5min。測(cè)試結(jié)果如表1所示表1印跡聚合物和非印跡聚合物的吸附率及印跡效果
權(quán)利要求
1.一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物，其特征在于其制備方法為1)采用大隆作為模版分子，同功能單體在溶劑中混勻，混勻后在4°c以下保存24h形成 預(yù)聚體；然后在常溫下加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，在4°C以下、用波長(zhǎng)為260nm的紫外光引發(fā)聚 合Mh，得到球形顆粒聚合物；功能單體為丙烯酰胺，溶劑為二甲基亞砜；交聯(lián)劑為三羥甲 基丙烷三甲基丙烯酸酯TRIM，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈；功能單體、大隆和溶劑的摩爾比為 4:1: 20;交聯(lián)劑的體積用量為溶劑的1.6%，引發(fā)劑的摩爾用量為模版分子的4% ；2)用有機(jī)溶劑甲醇/乙酸浸泡步驟1)得到的球形顆粒聚合物并攪拌池，球形顆粒 聚合物中的模板分子溶解在有機(jī)溶劑甲醇/乙酸中，然后離心分離去除有機(jī)溶劑甲醇和乙 酸；甲醇與乙酸的體積比為9 1 ；3)重復(fù)步驟2)2次以上；4)經(jīng)步驟幻清洗后的球形顆粒聚合物中加入乙醇，洗滌除去乙酸；5)重復(fù)步驟4)2次以上；6)經(jīng)步驟幻清洗后的球形顆粒聚合物中加入丙酮，以除去細(xì)小顆粒，然后真空干燥， 得到苯巴比妥分子印跡聚合物。
2.一種大隆分子印跡聚合物作為固相萃取劑的應(yīng)用，其特征在于具體步驟為1)大隆分子印跡固相萃取柱的制備將制備的大隆分子印跡聚合物溶于甲醇中，攪拌均勻后緩慢注入帶有20 μ m篩板 的聚乙烯空固相萃取柱中，真空抽吸使大隆分子印跡聚合物在空固相萃取柱中分布均 勻，然后在大隆分子印跡聚合物上方裝入20 μ m篩板，大隆分子印跡聚合物與甲醇的比 50mg 5mL ；2)制備樣品取血液lmL，用2mL乙腈沉淀混懸后，用SmL去離子水稀釋，離心，取清液；3)大隆分子印跡固相萃取方法依次用ImL甲醇、ImL甲醇/水混合溶劑活化大隆分子印跡固相萃取柱，然后將步驟2) 制備的樣品上固相萃取柱，然后再用2mL甲醇/水混合溶劑洗滌，最后用2mL甲醇/甲酸混 合溶劑洗脫，收集洗脫液，在空氣流下?lián)]干，然后用200 μ L的甲醇溶解殘?jiān)^(guò)液相專用濾 膜后，LC、LC-MS分析；甲醇/水的體積比為3 7，甲醇/甲酸的體積比為9 1。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗凝血鼠藥大隆分子印跡聚合物及其作為固相萃取劑的應(yīng)用，屬于分析化學(xué)與材料科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。采用大隆作為模版分子，同功能單體在溶劑中混勻，混勻后在4℃以下保存24h形成預(yù)聚體；然后在常溫下加入交聯(lián)劑和引發(fā)劑，用波長(zhǎng)為260nm的紫外光引發(fā)聚合24h，得到球形顆粒聚合物；用有機(jī)溶劑甲醇/乙酸浸泡，清洗除雜質(zhì)，真空干燥，得到大隆分子印跡聚合物。本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便、快速，對(duì)結(jié)構(gòu)相似物大隆、溴敵隆有很好的吸附性能；建立的固相萃取方法，操作簡(jiǎn)單，對(duì)目標(biāo)物選擇性吸附，有效去除基體雜質(zhì)，提高了分離精度，降低了檢測(cè)限，適用于法庭科學(xué)領(lǐng)域生物樣本(血液)中抗凝血鼠藥大隆、溴敵隆的提取分離。
文檔編號(hào)C08F265/10GK102070753SQ20101059137
公開(kāi)日2011年5月25日 申請(qǐng)日期2010年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月16日
發(fā)明者于忠山, 何毅, 何瑞瓊, 孟子暉, 常靖, 張蕾萍, 朱軍, 欒玉靜, 郝紅霞 申請(qǐng)人:公安部物證鑒定中心