專利名稱：提高蛋白質與聚乙二醇(peg)結合度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白(特別是高結合度蛋白)療法領域以及生成此類蛋白的方法。
背景技術：
聚乙二醇(PEG)化的蛋白藥物已經(jīng)顯示出不可小看的治療優(yōu)勢，包括血清半衰期的延長和抗原性的降低(Kozlowski，A.，et al.，J.ControlledRelease(2001)72217-224)。PEG的每個環(huán)氧乙烷(ethylene oxide)單元與兩個或三個水分子結合，因此，從其活動來看，該分子大小似乎是分子量相近的普通蛋白大小的五至十倍(Kozlowski，A.，supra)。聚乙二醇化蛋白的清除率與分子量成反比(Yamaoka，T.，et al.，J.Pharm.Sci.(1994)83601-606)。分子量低于20,000的分子通過尿液清除。具有更高分子量的PEG蛋白通過尿液和糞便以更緩慢的速度清除(Yamaoka，T.，supra)。聚乙二醇化蛋白溶解度更高、抗原性更低、水解穩(wěn)定性更高，而且其腎清除率得到了降低，腫瘤導向性更強。
當前，聚乙二醇化的腺苷脫氨酶、天(門)冬酰胺酶、α-IFN和生長激素拮抗劑已經(jīng)通過藥品注冊審批。(Maeda，H.，et al.(eds.)，Advances inexperimental medicine and biologypolymer drugs in the clinical stage，(2003)Vol.519，Dordrecht，The NetherlandsKluwer Academic/Plenum Publishers)。兩種PEG-α-IFN被批準用于丙型肝炎治療。(Kozlowski，A.，supra和Gilbert，C.W，et al.，U.S.patent 5,951,974(1999))。對頑固性或復發(fā)性急性淋巴細胞白血病(ALL)患者采用聚乙二醇化天(門)冬酰胺酶與氨甲葉酸、長春新堿和波尼松相結合的方式進行治療(Aguayo，A.，et al.，Cancer(1999)861203-1209)。研究還表明，PEG-ADA可以顯著增強腺苷脫氨酶(ADA)缺乏癥患者的免疫系統(tǒng)，此類病人由于免疫系統(tǒng)的發(fā)育受到抑制，幾乎對各種傳染病都缺乏抵抗力。(Pool，R.，Science(1990)248305；和Hershfield，M.S.，Clin.Immunol.Immunopathol.(1995)76S228-S232)。雖然聚乙二醇化蛋白表現(xiàn)出了理想的治療特性，但蛋白質上可結合PEG的位點的數(shù)目和分布卻限制了蛋白質的PEG化。
發(fā)明公開本發(fā)明涉及高結合度蛋白以及生成此類蛋白的方法。具體來說，本發(fā)明涉及聚氧亞烷基(polyoxyalkylene)與治療蛋白的化學偶聯(lián)方法，該方法可生成免疫原性更低、循環(huán)半衰期更長的高結合度蛋白。
一方面，本發(fā)明涉及使用非蛋白聚合鏈修飾蛋白質的方法，包括a)將蛋白質與非蛋白聚合物偶聯(lián)，生成初級修飾蛋白，此時該蛋白具有一條或多條非蛋白聚合鏈；b)將初級修飾蛋白(具有一條或多條非蛋白聚合鏈)與具有至少兩個氨基的多官能氨偶聯(lián)，生成具有一個或多個附加氨基的修飾蛋白；c)將含有一個或多個附加氨基的修飾蛋白與另一種非蛋白聚合物偶聯(lián)，生成次級修飾蛋白，它比初級修飾蛋白含有更多的非蛋白聚合鏈。
在一個示例中，使用能與蛋白質的N端氨基反應的官能團，對非蛋白聚合物進行衍生化反應。例如，非蛋白聚合物可與N-羥基丁二酰亞胺進行衍生化反應。在一個示例中，非蛋白聚合物為聚氧亞烷基，例如聚乙二醇。在特殊示例中，官能化的非蛋白聚合物為甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸。通常，非蛋白聚合物的分子量大約為5000。
在步驟a)中，初級修飾蛋白可通過蛋白質N端氨基與非蛋白聚合物的酯基偶聯(lián)來形成。在步驟2中，修飾蛋白(含有一個或多個附加氨基)可通過將初級修飾蛋白的C端羧基與多官能胺中的氨基團相偶聯(lián)來形成。多官能胺可以是二氨基丁烷。在一個示例中，羧基在催化劑(例如碳二亞胺)存在時，與多官能胺進行偶聯(lián)。在特殊示例中，羧基在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺存在時與多官能胺偶合。在另一示例中，第二次偶聯(lián)生成修飾蛋白時，初級修飾蛋白之間沒有發(fā)生交聯(lián)。
在一個示例中，首次偶聯(lián)步驟中的蛋白質與非蛋白聚合物的比為1∶15。在另一個示例中，第二次偶聯(lián)時，初級修飾蛋白與非蛋白聚合物的比為1∶60。
本發(fā)明還提供了根據(jù)上述方法修飾的蛋白質。在一個示例中，蛋白質為高結合度蛋氨酶。此外，本發(fā)明提供了使用聚乙二醇鏈兩次修飾的蛋白質，其中首次修飾是將蛋白質的N端氨基與聚乙二醇酯衍生物偶聯(lián)，形成初級聚乙二醇化蛋白質，然后將初級聚乙二醇化蛋白的C端羧基與多官能胺(至少含有兩個氨基)偶聯(lián)以形成初級修飾蛋白(含有聚乙二醇鏈和一個或多個附加氨基)；其中第二次修飾是將次級修飾蛋白的一個或多個附加氨基與其它聚乙二醇酯衍生物偶聯(lián)，以形成次級修飾蛋白，它含有比初級修飾蛋白更多的聚乙二醇鏈。本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明修飾蛋白的醫(yī)藥組合物，以及可接受的制藥賦形劑。
此外，本發(fā)明提供了調節(jié)腫瘤活動的方法，包括讓有此需要的受治者使用有效治療劑量的本發(fā)明中提到的修飾蛋白或其醫(yī)藥組合物。受治者可以是人或動物。
本文使用的術語“多官能胺”指至少含有一個氨基官能團的胺。在一個示例中，脂肪多官能胺(最好二胺)被用作偶合劑。含有三個或更多氨基官能團的脂肪多官能胺以及芳香多官能胺也擬用作偶合劑。脂肪多官能胺的示例包括但不限于1，4-二氨基丁烷、1，2-二氨基-2-甲基丙烷、1，5-二氨基戊烷、2，2-二甲基-1，3-丙烷二胺、1，6-已烷二胺、二乙烯三胺和三乙烯四胺。在一個示例中，1，4-二氨基丁烷用作偶合劑。芳香族多官能胺的示例包括但不限于p-苯二胺、p-甲代亞苯基二胺和二氨基萘。
本文使用的術語“偶合劑”指能在兩種反應物之間形成聚合連接的所有物質。在一個示例中，碳二亞胺被用于將氨基與羰基(例如酯或酸)偶聯(lián)。碳二亞胺的示例包括但不限于1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺、雙(三甲基甲硅烷基)碳二亞胺或N-環(huán)己基-N’-(β-[N-馬啉代甲基]乙基)碳二亞胺p-甲苯磺酸鹽。在一個示例中，1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺被用于偶聯(lián)蛋白質的N端氨基與羰基(例如酯或酸)。
本文使用的術語“活化的聚乙二醇”或“活化的PEG”指使用反應活性更強的官能團與聚乙二醇進行衍生反應獲得的產(chǎn)物。在特殊示例中，活化的聚乙二醇可以通過使用能夠與賴氨酸或蛋白質的N端氨基進行反應的官能團進行衍生反應得到?；罨垡叶嫉姆椒ㄒ褳楸拘袠I(yè)專業(yè)人員所熟知。例如，聚乙二醇可以酯化為N-羥基丁二酰亞胺，以形成活化的PEG酯。
繪圖簡要說明

圖1描述制備super-PEG-rMETase的方案。
圖2說明NHS/EDC摩爾比對rMETase的羧基酰胺化程度的影響。
圖3說明EDC/rMETase摩爾比對rMETase的羧基酰胺化程度的影響。
圖4說明二氨基丁烷(DAB)/rMETase摩爾比對rMETase的羧基酰胺化程度的影響。
圖5顯示rMETase和聚乙二醇化的rMETases的SDS-PAGE。
圖6說明rMETase羧基酰胺化期間交聯(lián)對于初次聚乙二醇化的影響。
圖7對天然rMETase(◆)、PEG-rMETase(■)和高結合度PEG-rMETase(▲)進行免疫原性比較。
實施發(fā)明的模式本發(fā)明涉及高結合度蛋白以及生成此類蛋白的方法。具體地講，本發(fā)明涉及使用具有活性的聚乙二醇(PEG)連接劑連接蛋白質更多部位(但不使蛋白質變性)的方法。本發(fā)明還涉及免疫原性更弱，循環(huán)半衰期更長的高結合度蛋白質。
要使PEG與蛋白質結合，首先將羥(基)端轉變?yōu)榭膳c賴氨酸和蛋白質N端氨組團進行反應官能團，以此活化聚合物(Kozlowski，A.，supra)。因為PEG修飾基于蛋白質賴氨酸殘基中的ε氨基與活化的PEG酯之間發(fā)生的反應，所以任何蛋白質的PEG修飾效果主要依賴于PEG結合點的數(shù)目和分布(Hershfield，M.S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)887185-7189)。一個增加聚乙二醇化可用點的方法是定點突變，它利用賴氨酸代替蛋白質中的特定氨基酸(Hershfield，M.S.，supra；和He，X.H.，et al.，Life Sci.(1999)65355-368)。另外可以使用化學耦合法。(Davis，F(xiàn).F.，et al.，U.S.patent 4,179,337(1979)；Veronese，F(xiàn).M.，Biomaterials(2001)22405-417；和Kimura，M.，et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.(1988)188364-369)。
增加蛋白質中聚乙二醇結合點的化學耦合方法是基于碳二亞胺介導的水溶反應，該反應可以使蛋白質中的羧基團與多官能胺中的其它氨基反應。因此，該方法可以向蛋白質的羧基添加能進行聚乙二醇化的氨基基團。然而，該方法受到交聯(lián)反應的限制；交聯(lián)反應可產(chǎn)生羧基酰胺化蛋白或肽段的聚合形式(Davis，F(xiàn).F.，supra)。
本發(fā)明的方法使蛋白質具有更多的連接位點，用于與活化的聚乙二醇(PEG)連接劑結合，本方法不會使蛋白質變性。(Li et al.，Anal.Biochem.330264-271(2004)，特此引用)。高結合度蛋白一直表現(xiàn)出較低的免疫原性和較長的半衰期。(Yang et al.，Cancer Res.646673-6678(2004)，特此引用)。一直有跡象表明，高結合度蛋白的循環(huán)半衰期對于輔助因子吡哆醛-5’-磷酸鹽的量具有很強的依賴性。(Yang et al.，Cancer Res.645775-5778(2004)，特此引用)。
該方法總體上包括a)將蛋白質與非蛋白聚合物偶聯(lián)，生成初級修飾蛋白，此時該蛋白具有一條或多條非蛋白聚合鏈；b)將初級修飾蛋白(具有一條或多條非蛋白聚合鏈)與具有至少兩個氨基的多官能氨偶聯(lián)，生成具有一個或多個附加氨基的修飾蛋白；c)將含有一個或多個附加氨基的修飾蛋白與另一種非蛋白聚合物偶聯(lián)，生成次級修飾蛋白，它比初級修飾蛋白含有更多的非蛋白聚合鏈。
本發(fā)明方法通過重組蛋白模型L-蛋氨酸-α-脫氨-γ-巰基甲烷裂解酶(rMETase)進行說明。但本發(fā)明方法不限于rMETase的結合，它通常還可用于其它蛋白。每個rMETase單體的398個氨基酸中只有9個賴氨酸殘基，遠遠低于這種氨基酸(賴氨酸)在大多數(shù)蛋白質中出現(xiàn)的一般頻率。相反，每個rMETase亞基含有37個羧基，這些羧基可以偶聯(lián)更多的氨基，用于聚乙二醇化。
Pseudomonas putida的L-蛋氨酸α-脫氨-γ-巰基甲烷裂解酶(METase)[EC 4.4.1.11]此前已在Escherichia coli中進行過克隆和表達(Tan Y.，et al.，Protein Expr.Purif.(1997)9233-245；Inoue，H.，et al.，J.Biochem.(1995)1171120-1125；和Hori，H.，et al.，Cancer Res.(1996)562116-2122)。重組蛋氨酸酶(rMETase)在人類癌癥的小鼠模型中具有活力。rMETase通過消耗血漿中的蛋氨酸發(fā)揮作用，腫瘤通常對蛋氨酸具有異常大需求。此外，短暫的蛋氨酸耗盡可導致腫瘤對幾種化學療法試劑的敏感度顯著增加(Tan，Y.，et al.，Clin.Cancer Res.(1999)52157-2163；Yoshioka，T.，et al.，CancerRes.(1998)2583-2587；和Kokkinakis，D.M.，et al.，Cancer Res.(2001)614017-4023)。
此前，研究人員曾將rMETase與甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸-5000(MEGC-PEG-5000)結合以延長其循環(huán)半衰期，進而延長體內血漿和腫瘤中蛋氨酸處于耗盡狀態(tài)的時間。當rMETase分別以30/1、60/1和120/1的PEG/rMETase摩爾比進行聚乙二醇化修飾時，一個rMETase亞基大約被4、6和8個PEG分子修飾。與未修飾的rMETase相比，PEG-rMETase(120/1)的血清半衰期增加了20倍，蛋氨酸耗盡的時間增加12倍。體內半衰期的增加取決于rMETase聚乙二醇化的程度。聚乙二醇化還降低了rMETase的免疫原性。免疫原性降低的程度取決于聚乙二醇化的殘基數(shù)量(Sun，X.，et al.，Cancer Research(2003)638377-8383)。
表1顯示了不造成rMETase分子交聯(lián)的super-PEGylated rMETase三步制備法，它包括初級聚乙二醇化、羧基酰胺化以及高級聚乙二醇化。首先，通過甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸(MEGC-PEG-5000)對rMETase進行初級聚乙二醇化。在具體的實施例中，在PEG和rMETase之比為15∶1的情況下進行初級聚乙二醇化。
第二步，初步聚乙二醇化蛋白的羧基隨后與多官能胺(例如二氨基丁烷(DAB))結合，從而實現(xiàn)羧基酰胺化。在具體實施例中，羧基酰胺化在催化劑(例如水溶性碳二亞胺)的參與下進行。盡管本發(fā)明未受結合機制的限制，但是羧基酰胺化期間rMETase分子之間的交聯(lián)仍可被已經(jīng)與蛋白質結合的PEG鏈所形成的空間位阻所抑制。
第三步，將羧基酰胺化的聚乙二醇化rMETase與甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸結合，形成高級聚乙二醇化的rMETase。在具體實施例中，高級聚乙二醇化在PEG與PEG-rMETase比為60∶1時進行。生化分析表明，高級聚乙二醇化后有13條PEG鏈結合到每個rMETase亞基，而對于非羧基酰胺化PEG-rMETase來說，這一數(shù)字僅為6～8。高級聚乙二醇化后的分子仍保留著非聚乙二醇化rMETase活性的大約15-20％。與PEG-rMETase和rMETase相比，super-PEG-rMETase的免疫原性顯著降低。初期結果表明，高級聚乙二醇化可能成為蛋白質生物制劑聚乙二醇化的一個全新策略。
表1顯示每步反應對rMETase比活力的影響。表1中，起始物為200mg的rMETase，它具有56U/mg的比活力。活力回收率根據(jù)比較裸rMETase與每種經(jīng)過修飾的rMETase的比活力計算得出。如表1所示，羧基酰胺化反應是導致比活力降低的最重要原因。
表一在羧基酰胺化介導的重組蛋氨酸酶(rMETase)高級PEG化過程中蛋白質和rMETase活力的回收率

不同反應條件對于rMETase羧基酰胺化的作用。
圖2表明N-羥基丁二酰亞胺與1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺的摩爾比(NHS/EDC)對于rMETase的羧基酰胺化程度的影響。rMETase的羧基酰胺化在不同的NHS/EDC比下進行。用熒光胺法和非變性凝膠電泳(native PAGE)評估羧基酰胺化程度。475nm波長激發(fā)下的熒光強度和475nm波長的放射反映蛋白質中自由氨基的數(shù)量。凝膠(塞劑)氛明羧基酰胺化造成了rMETase的MW上升。rMETase與丁二胺(DAB)之比和rMETase與EDC之比分別為1∶600和1∶800。將羧基酰胺化的rMETase與rMETase的熒光強度和電泳遷移率進行對比，得出差異。
NHS/EDC為0.2時，DAB和rMETase的結合程度最高。更小或更大的DAB比都會降低結合程度。NHS可增強EDC介導的羧基酰胺化反應。然而，最佳增強效果取決于NHS/EDC的最佳比。此項研究的結果與其他研究者所獲得的結果相似(Kuijpers，A.J.，et al.，J.Biomater.Sci.Polym.(2000)11225-243)。
將DAB的濃度固定為9.4mg/ml，并保持NHS與EDC的比為0.2，以此確定EDC/rMETase對于羧基酰胺化反應的影響。結果表明rMETase與DAB的結合程度取決于EDC與rMETase的比(圖3)。rMETase的羧基酰胺化在不同的EDC與rMETase摩爾比下進行。使用熒光胺法和非變性凝膠電泳分析羧基酰胺化r-METase(見圖2)。NHS與EDC的比和rMETase與DAB的比分別為0.2和1∶600。將羧基酰胺化的rMETase與rMETase的熒光強度和電泳遷移率進行對比，得出差異。EDC與rMETase的比越高，rMETase羧基酰胺化的程度越高。在具體實施例中，EDC與rMETase的摩爾比不會超過800。
圖4表明DAB和rMETase之比對于羧基酰胺化程度的作用。rMETase的羧基酰胺化在不同的EDC與rMETase摩爾比率下進行。NHS與EDC的摩爾比和rMETase與EDC的摩爾比分別為0.2和1∶800。用熒光胺法和非變性凝膠電泳對羧基酰胺化r-METase進行分析，并與rMETase對比。當DAB與rMETase之比增加到600時，羧基酰胺化的程度開始進入穩(wěn)定水平。在具體實施例中，DAB與rMETase在羧基酰胺化反應中的摩爾比不超過600。
EDC介導的rMETase羧基酰胺化在30分鐘內完成。這個反應能生成高級PEG-rMETase，產(chǎn)物中PEG與羧基酰胺化PEG-rMETase的比為60∶1(圖5)。因此，在某些實施例中，如早些時候的報道所稱，不必將蛋白質長時間保留在反應系統(tǒng)中(Kimura，M.，supra)。相反，較短的培養(yǎng)時間可以降低苛刻的反應條件造成的rMETase活力損失。
高級PEG化PEG-rMETase鑒定用10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠分析天然rMETase、PEG-rMETase和高級PEG化rMETase。圖5表明新的高級PEG化rMETase具有最低的遷移率和最高的分子量。在圖5中，泳道1、泳道2和泳道3分別代表天然rMETase、高級PEG-rMETase和PEG-rMETase。用考馬斯亮藍染色10％SS凝膠。這些數(shù)據(jù)表明高級PEG化的PEG-rMETase結合的PEG鏈數(shù)量比PEG-rMETase更多。
PEG-rMETase和高級PEG-rMETase最終產(chǎn)品中游離和結合的PEG的含量都可以用比色法定量測定(Li，S.，et al.，Anal. Biochem.(2003)313335-337)，大約13個PEG鏈與super-PEG-rMETase的每個亞基結合而大約7個PEG鏈與PEG-rMETase結合。這些結果表明羧基酰胺化引入了更多的氨基基團。
作為對照，在沒有中間羧基酰胺化步驟的情況下，對一些rMETase進行了兩個步驟的PEG化。在PEG∶rMETase為15∶1的條件下，進行初級PEG化，制備super-PEG-rMETase，接著進行羧基酰胺化，然后在PEG∶rMETase的條件下進行高級PEG化。如表2所示，這只能使每個rMETase亞基結合6個PEG，表明了羧基酰胺化對于rMETase高級酰胺化的作用。
表2蛋白盾羧基酰胺化對rMETase的PEG化程度的影響

羧基酰胺化反應中，初級PEG化對于減少rMETase交聯(lián)所起得作用如果不進行初級PEG化，直接讓未修飾的rMETase與DAB反應，由于交聯(lián)，rMETase明顯地在反應溶液中形成沉淀，導致rMETase活力的嚴重損失。因此，使用羧基酰胺將氨基加入蛋白質的主要限制是反應蛋白質的交聯(lián)。初級PEG化可以顯著降低羧基酰胺化反應過程中的交聯(lián)。如果進行了初級PEG化，則在通過堿水解去除所有PEG鏈后，PEG-rMETase和super-PEG-rMETase的分子量沒有區(qū)別(圖6)。對天然rMETase和PEG-rMETase進行堿性水解，并在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行分析。
在圖6中，泳道1-4與以下描述相對應1)天然rMETase；2)非PEG化rMETase進行羧基酰胺化后的Super-PEG-rMETase；3)通過三個步驟(初級PEG化、羧基酰胺化和高級PEG化)制備的superPEG-rMETase；4)對照PEG-rMETase。所有檢測樣品，包括天然rMETase，都以4mg/ml的比例溶于100μl蒸餾水。將2μl氫氧化鈉(10N)添加到每個樣品中。30分鐘后，添加1.8μg鹽酸(HCl)(10N)中止堿性水解反應。在凝膠的每個點樣孔中加入約12μg的rMETase。
這些數(shù)據(jù)表明在羧基酰胺化反應中，未檢測到交聯(lián)。反之，如果沒有在羧基酰胺化之前進行初級PEG化，則高級PEG化過程中有顯著的交聯(lián)現(xiàn)象，進行堿水解后，對rMETase進行的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)顯示，交聯(lián)的rMETase位于凝膠頂端(圖6，泳道2)，正好說明了這一點。盡管如此，在實施本發(fā)明時，利用初級PEG化來防止羧基酰胺化過程中出現(xiàn)交聯(lián)的做法并非必不可少，研究人員認為，活化的PEG總是與rMETase分子表面最易接近的氨基基團反應，從而顯著降低它們與其它rMETase分子羧基基團反應的幾率。此外，PEG鏈具有很大的排斥體積(Knoll，D.，et al.，J.Biol.Chem.(1983)2585710-5715)，因而可以防止其它大分子與初級PEG化的rMETase反應。因此，在初級PEG化過程中，rMETase結合的PEG鏈可以避免隨后的羧基酰胺化過程中的交聯(lián)。
rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase免疫反應性對比PEG化最重要的特點之一是降低PEG蛋白的抗原性和免疫原性降低?？乖?抗體(Ag-Ab)識別的程度是蛋白質免疫原性的重要衡量標準。因此，通過測量裸rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase與小鼠抗rMETase血清的結合能力來評估它們的免疫反應性。
圖7將天然rMETase和這兩種PEG化rMETase與抗體結合的能力作為其濃度的函數(shù)進行表示。用三明治型酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)進行免疫反應性分析。兔抗-rMETase抗血清用于涂抹酶標盤表面。捕獲天然rMETase、PEG-rMETase和super-PEG-rMETase，然后使之與小鼠抗-rMETase抗血清反應。使用結合辣根過氧化酶的羊抗小鼠多價免疫球蛋白檢測反應后的小鼠抗-rMETase抗血清。OD 492的吸收值確定天然rMETase或PEG-rMETase與抗-rMETase抗體的結合。比較三種稀釋程度下的結果。(◆)Native rMETase、(■)PEG-rMETase和(▲)SuperPEG-rMETase。
數(shù)據(jù)表明PEG-rMETase與anti-rMETase的結合能力有一定程度的降低。高級PEG-rMETase與anti-rMETas抗血清的結合能力比正常的PEG-rMETase要低很多。這一結果表明super-PEG-rMETase具有較低的抗原性?？乖缘娘@著降低證實了通過羧基酰胺化增力rMETase的PEG化程度的有效性。今后的實驗將確定super-PEG-rMETase的體內效力。
示例下面的示例旨在闡明本發(fā)明，但本發(fā)明的用途不限于此。在以下示例中，重組蛋氨酸酶(rMETase)由E.coli發(fā)酵產(chǎn)生(Tan，Y.，supra)。丙烯葡聚糖凝膠S-300，交聯(lián)葡聚糖凝膠G-25采購自Amersham PharmaciaBiotech公司(Piscateway，N.J)。預制Tris-甘氨酸凝膠購自NOVEX(SanDiego，CA)。兔抗-rMETase抗血清從H.T.I Bio-Products，Inc.，San Diego，CA獲得。羊抗小鼠多價免疫球蛋白與辣根過氧化酶聚合購自Sigma(St.Louis，MO)。熒光胺、1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)、1，4-丁二胺(DAB)二鹽酸、N-羥基丁二酰亞胺和硫氰酸銨皆購自FisherScientific(Fairlawn，NJ)。單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸-5000(MEGC-5000)PEG由NOF corporation(Tokyo，Japan)饋贈。
示例1熒光胺法評估rMETase中羧基酰胺化程度通常使用熒光胺法評估蛋白質的PEG程度，其依據(jù)是蛋白質的氨基結合活化的PEG后，熒光強度將降低。在這里，使用熒光胺法檢測rMETase與丁二胺(DAB)結合后熒光胺強度的增加，進而評估rMETase羧基酰胺化的程度。分析過程基本上遵照Stocks描述的方法(Stocks，S.J.，et al.，Anal.Biochem.(1986)154232-234)。簡言之，不同數(shù)量的rMETase和PEG化的rMETase在2ml 0.1M pH8.0的磷酸鈉緩沖液中與1ml熒光胺溶液(0.3mg/ml丙酮中)混合，并在室溫下反應5分鐘。接下來，用熒光分光光度計測量樣本在390納米波長激發(fā)下的475納米發(fā)射強度。結果以熒光胺強度與rMETase濃度的關系曲線圖顯示，通過線性回歸確定曲線的斜率。
熒光強度增加的百分比(％)表示為[(與DAB結合后的熒光強度斜率-裸rMETase熒光強度斜率)/裸rMETase熒光強度斜率]×100。
蛋白質測定根據(jù)說明手冊，用Wako Protein Assay Kit(Wako Pure Chemical，Osaka，Japan)測量天然rMETase的蛋白質濃度。牛血清白蛋白(BSA)作為標準使用。通過(UV)280nm處的紫外線吸收值確定PEG-rMETase結合物的物質比例。裸rMETase用于繪制標準曲線。
聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)所有的電泳實驗根據(jù)說明手冊在Xcell II系統(tǒng)上進行，該系統(tǒng)使用10％NOVX預制凝膠。在SDS-PAGE實驗中，使用包含SDS的tris-glycine電泳緩沖液。凝膠中的蛋白質用考馬斯亮藍染色。將所有修飾rMETase與裸rMETase進行比較。
示例2r-METase羧基酰胺化的反應條件A.最優(yōu)化N-羥基丁二酰亞胺(NHS)與1-乙基1-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(EDC)的比例保持rMETase/DAB和rMETase/EDC的摩爾比分別為1∶600和1∶800，確定NHS/EDC的最佳摩爾比。取四份質量均為14.1mg的DAB，將它們與質量分別為4.0mg、2.7mg、1.3mg和0mg的NHS(分別對應0.6、0.4、0.2、0的NHS/EDC比例)溶解到蒸餾水中。使用0.5N NaOH將每種溶液的pH值調整至6.5，使最終溶液體積為1ml。將這些溶液分別轉移至組織培養(yǎng)板的四個點樣孔中。然后將溶于0.5ml的0.2M磷酸鈉緩沖液的rMETase 25mg添加至每個孔中。添加22.2mg EDC后，羧基酰胺化反應即開始。在室溫下攪拌4小時后，將產(chǎn)物置于事先用濃度為0.1M、pH值為7.4的PBS平衡過的Sephadex G-25柱上，去除小分子雜質。然后，使用凝膠電泳和熒光法測定rMETase與DAB的結合程度。
B.最優(yōu)化rMETase/EDC和rMETase/DAB的比例上例實驗A中所確定的最佳NHS/EDC的摩爾比為0.2，通過此最佳值，再結合1∶600的rMETase/DAB，可確定EDC對羧基酰胺化反應的影響。向五個分別裝有1.5ml的PBS(0.2M，pH6.5)混合液(含有25mgrMETase、14.1mg DAB、1.3mg NHS)的孔中，按rMETase/EDC為1∶200、1∶400、1∶600、1∶800和1∶1000的摩爾比，分別取相應量的EDC添加到每個孔中。其它反應條件、處理方法和最終結合產(chǎn)品的測定方法與實驗A相同。為獲得rMETase/DAB的最佳摩爾比，保持NHS/EDC的摩爾比為0.2，同時保持已確定的rMETase/EDC的最佳摩爾比1∶800，執(zhí)行與上述相同的過程。
C.羧基酰胺化反應的時程變化時程反應實驗使用2ml含有33mg rMETase的PBS(0.2M，pH6.5)溶液，并保持NHS/EDC為0.2、rMETase/DAB為1∶800、rMETase/EDC為1∶800。添加EDC開始發(fā)生反應后，以不同的時間間隔，去除0.4ml的反應物并進行凈化。按上述方法對rMETase和DAB結合的程度進行分析。
示例3高級乙二醇化rMETase的制備按照圖1所示的三個步驟制備高級PEG化的rMETase(具有比此前通過非羧基酰胺化rMETase所獲得的產(chǎn)物更多的PEG鏈)。為了引入更多的伯胺而不引起rMETase分子間的交聯(lián)，首先對天然rMETase進行PEG化，該步驟防止羧基酰胺化過程中發(fā)生交聯(lián)。最后，對羧基酰胺化了的r-METase進行“超”聚乙二醇化修飾。進行初級聚乙二醇化時，首先使用0.5N NaOH將含有2ml(200mg)rMETase的PBS(0.1M，pH7.4)溶液的pH值調整至8.5，然后使其與87.2mg的MEGC-5000 PEG(PEG與rMETase的摩爾比為15∶1)發(fā)生反應，在室溫下攪拌1小時。
為了將DAB結合到進行了初級聚乙二醇化修飾的rMETase，先使用4ml的PBS(0.2M，pH6.5)將上一步驟中所得的反應物稀釋為8ml的溶液，該溶液中含有21.3mg NHS(NHS/EDC為0.2)、149.8mg DAB(rMETase/DAB為1∶600)、178.3mg EDC(rMETase/EDC為1∶800)。攪動30分鐘后，將此混合液置于采用PBS(0.05M，pH7.4)洗提過的Sephacryl S-300柱(26×60)上，以去除游離的PEG和其它的小分子雜質。然后，按照如下方法對羧基酰胺化的PEG-rMETase進行高級聚乙二醇化進行高級聚乙二醇化反應時，先將152mg新添加了伯胺的PEG-rMETase濃縮為2ml。要開始高級聚乙二醇化反應，添加0.2ml硼酸鹽緩沖液(1M，pH9.0)，同時添加265.1mg MEGC-PEG-5000(PEG/PEG-rMETase的摩爾比為60∶1)，將pH值調整為8.5。經(jīng)過凈化和濃縮后，獲得112mg高級聚乙二醇化rMETase。作為對照，同時通過兩步模式制備了PEG-rMETase，其中PEG∶rMETase分別采用15∶1和60∶1，方法如上，只是沒有進行羧基酰胺化這一步。
示例4rMETase聚乙二醇化程度的確定rMETase聚乙二醇化的程度根據(jù)每個rMETase亞基中PEG的平均含量來確定。經(jīng)凈化的最終PEG-rMETase結合物中所含PEG的量采用堿水解比色法確定，Li，S.，et al.，supra對該方法進行過說明。簡言之，就是將要進行分析的PEG-rMETase分成兩份樣品；對其中一份進行堿水解30分鐘，以釋放與rMETase結合的PEG。而對另一份PEG-rMETase則不進行堿水解。然后，將兩份樣品分別放入含有1ml三氯甲烷和1ml硫氰酸銨的兩相系統(tǒng)。將它們高速旋轉30分鐘，并在3500g離心力下進行3分鐘的離心分離，然后去除三氯甲烷的下層。通過510nm處的光密度確定三氯甲烷層中游離或所釋放的PEG的含量。從沒有執(zhí)行堿水解處理的樣品確定PEG-rMETase中游離PEG的含量。從執(zhí)行了堿水解處理的樣品中確定出PEG-rMETase中所含PEG的總量。PEG的總量減去游離的量便可得與rMETase結合的PEG的量(Li，S.，supra)。
示例5IrMETase、PEG-rMETase以及Super-PEGylated rMETase的免疫反應性裸rMETas和聚乙二醇化rMETases的免疫反應性是通過它們與抗rMETase抗血清的結合能力確定的。使用ELISA和夾心法進行免疫反應性分析。將100μl采用0.1M碳酸鈉包埋緩沖液(pH9.5)稀釋過的兔抗rMETase抗血清添加到酶標板中的每個點樣孔中，在4℃下培養(yǎng)一整夜。使用含有0.05％吐溫20活性劑的PBS(pH7.4)對酶標板進行三次清洗，使用200μl含有10％FBS的pH7.4 PBS分析緩沖液在室溫下封閉酶標板2小時，然后再次清洗酶標板。將各100μl的rMETase、聚乙二醇化rMETase和super-PEGylated rMETase(均已采用PBS分析緩沖液將濃度從25μg/ml稀釋到0.25μg/ml)添加至酶標板上相應的孔中，并在室溫下培養(yǎng)1小時。清洗酶標板后，將100μl的小鼠抗rMETase抗血清添加至酶標板的每個孔中，并在室溫下培養(yǎng)1小時，然后進行清洗。將100μl具有最佳稀釋度的羊抗小鼠多價免疫球蛋白和辣根過氧化酶聚合物添加到每個孔中。在室溫下培養(yǎng)酶標板1小時，然后清洗3次。將100μl的底物溶液(O-苯二胺二鹽酸鹽+過氧化氫)添加至每個孔中，然后在室溫下培養(yǎng)30分鐘。將50μl的2N硫酸添加至每個孔中以停止顯色反應。測量492nm處每個孔的吸光度值。
上述詳細說明和附隨的示例僅是說明性的，不應將它們視為是對發(fā)明范圍的限制，請務必理解這一點。對精通此技術的人而言，已公布的方案明顯可以進行各種更改和修改。這類更改和修改-包括但不限于涉及化學結構、取代基、誘導法、中間物、合成法、配方和/或發(fā)明使用方法的更改和修改-可以在不背離本發(fā)明精神和脫離發(fā)明范圍的情況下進行。在此通過引用包含本文涉及的美國專利案和出版物。
權利要求
1.使用非蛋白質聚合鏈修飾蛋白質的方法，包括a)將蛋白質與非蛋白質聚合物結合，以形成具有一個或多個非蛋白質聚合鏈的初級修飾蛋白。b)將上述所得的具有一個或多個非蛋白質聚合鏈的初級修飾蛋白與至少具有兩個氨基基團的多官能胺結合，以形成具有一個或多個附加氨基基團的修飾蛋白質。c)將上述所得的具有一個或多個附加氨基團的修飾蛋白質與另外的非蛋白質聚合物結合，以形成比初級修飾蛋白質具有更多非蛋白質聚合鏈的次級修飾蛋白質。
2.權利要求1的方法，其中所述的非蛋白質聚合物是由可與上述蛋白質的N端氨基團發(fā)生反應的多官能團衍生而來。
3.權利要求2的方法，其中所述的非蛋白質聚合物為聚氧亞烷基。
4.權利要求3的方法，其中所述的聚氧亞烷基為聚乙二醇。
5.權利要求2的方法，其中所述的功能團為N-羥基丁二酰亞胺。
6.權利要求5的方法，其中所述的非蛋白質聚合物為甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺戊二酸。
7.權利要求2的方法，其中所述的非蛋白質聚合物分子量約為5000。
8.權利要求1的方法，其中所述的多官能胺為丁二胺。
9.權利要求1的方法，其中步驟a)中所述的初級修飾蛋白質是通過將所述蛋白質中的N端氨基團與所述非蛋白質聚合物中的酯基相結合而形成。
10.權利要求1的方法，其中步驟b)中所述的具有一個或多個附加氨基團的修飾蛋白質，是通過將上一步驟中所述的初級修飾蛋白質中的C端羧基與所述多官能胺中的氨基基團相結合而生成。
11.權利要求10的方法，其中所述的羧基是在催化劑的作用下與上述氨基結合的。
12.權利要求11的方法，其中所述的催化劑為碳二亞胺。
13.權利要求12的方法，其中所述的碳二亞胺為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺。
14.權利要求10的方法，在生成其中所述的步驟b)中的修飾蛋白質時，沒有發(fā)生初級修飾蛋白質之間的交聯(lián)。
15.權利要求1的方法，其中所述蛋白質與所述非蛋白質聚合物之間的摩爾比在首次結合步驟中為1∶15。
16.權利要求1的方法，其中所述的首次修飾蛋白質與所述的非蛋白質聚合物之間的摩爾比在再次聚合步驟中為1∶60。
17.根據(jù)權利要求1的方法進行修飾的蛋白質。
18.權利要求17中所述的蛋白質為蛋氨酶。
19.使用聚乙二醇鏈兩次進行修飾的蛋白質，其中首次修飾包含將蛋白質的N端氨基與聚乙二醇脂衍生物結合，從而形成初級聚乙二醇化蛋白質，以及將最初形成的聚乙二醇化蛋白質的C端羧基與多官能胺(至少含有兩個氨基)結合以形成初級修飾蛋白質(含有聚乙二醇鏈和一個或多個附加的氨基團)；其中再次修飾包含將再次修飾蛋白質中的一個或多個附加氨基與其它聚乙二醇脂衍生物結合，以形成次級修飾蛋白質，它含有比第一次修飾的蛋白質更多的聚乙二醇鏈。
20.包含權利要求19中所述蛋白質的一種醫(yī)藥組合物，以及藥學上可接受的一種賦形劑。
21.調節(jié)腫瘤活動的一種方法，包括對有此需要的受治者使用有效治療劑量的化合物(權利要求19所述)或其醫(yī)藥組合物。
22.權利要求21的方法，其中所述的受治者為人或動物。
全文摘要
本發(fā)明涉及高結合度蛋白以及生成此類蛋白的方法。具體地講，本發(fā)明涉及使用具有活性的聚乙二醇(PEG)連接劑連接蛋白質更多部位(但不使蛋白質變性)的方法。本發(fā)明還涉及免疫原性更弱，循環(huán)半衰期更長的高結合度蛋白質。
文檔編號C08G63/48GK1984924SQ200580015792
公開日2007年6月20日 申請日期2005年3月11日 優(yōu)先權日2004年3月17日
發(fā)明者李樹寬, 楊志堅, 孫興華, 譚玉英, 八木繁雄 申請人:抗癌公司