專利名稱：用于治療膿毒癥的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)及其制備方法
發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及含有肝素結(jié)合蛋白質(zhì)的藥物組合物，及其在治療由細菌內(nèi)毒素引起之疾病或病理狀況中的應(yīng)用。
發(fā)明的背景在過去的50年里面對嚴重感染的全身反應(yīng)引起的膿毒性休克的發(fā)生率不斷增加，并且目前是美國特別醫(yī)療單位中病人死亡的最常見原因。據(jù)信膿毒性休克的這種增強和高發(fā)病率的原因是不斷增加了對血管內(nèi)導(dǎo)管等侵入性裝置的使用，增加了細胞毒性和免疫抑制藥物的使用，增加了易于發(fā)生膿毒癥之病人的壽命，以及增加了由抗生素抗性生物體引起的感染。
與膿毒癥相關(guān)聯(lián)的疾病是以陰性血液培養(yǎng)物為特征的茵血癥(也稱為敗血癥)；膿毒癥的特征是表現(xiàn)為呼吸急促、心動過速、體溫過高或過低的對感染的全身性反應(yīng)；膿毒癥綜合病征中有膿毒癥的臨床癥狀和改變了的器官灌注征象，表現(xiàn)形式為乳酸鹽水平異常增加，尿少或精神狀態(tài)的急性改變；早期膿毒性體克中有膿毒癥綜合病征的監(jiān)床癥狀，以及持續(xù)不到1小時的低血壓和對常規(guī)治療有反應(yīng)；而無反應(yīng)性膿毒性休克中則有膿毒癥綜合病征的臨床癥狀，并且盡管進行常規(guī)治療仍有持續(xù)達1小時以上的低血壓。
膿毒癥的已知介體或細胞因子以復(fù)雜的方式相互作用，在感染或損傷部位(如腹腔)發(fā)生吸聯(lián)反應(yīng)以形成膿毒癥。細胞因子級聯(lián)(其為革蘭氏陰性茵血癥中引起膿毒癥的常見原因)的引發(fā)物是細菌在感染或炎癥部位釋放的內(nèi)毒素(也稱為脂多糖，縮寫為LPS)，其在該部位誘導(dǎo)由巨噬細胞或其他細胞釋放腫瘤壞死因子α(TNFα)、白細胞介素-1、白細胞介素-6、白細胞介素-8和血小板活化因子(PAF)。在釋放FNFα、白細胞介素-1及PAF后，花生四烯酸被代謝轉(zhuǎn)化為白三烯、凝血烷A2和前列腺素。白細胞介素-1和白細胞介素-6激活T細胞以產(chǎn)生γ-干擾素、白細胞介素-2、白介素-4及粒細胞-單核細胞集落刺激因子。嗜中性白細胞可直接被其中大多部介體激活。因此嗜中性白細胞誘導(dǎo)的損傷可發(fā)生在因釋放氧自由基和溶酶體酶類所致的脫顆粒期間，即其在感染或炎癥部位聚集期間。
雖然內(nèi)毒素或其他介體在感染或炎癥部位的存在很可能引發(fā)細胞因子級聯(lián)，但因為細胞因子級聯(lián)具有某些對抗細胞因子收聯(lián)無控制活化的固有保護機制，所以其本身不一定導(dǎo)致膿毒癥。因此，前列腺素可抑制細胞因子從巨噬細胞中釋放，并且巨噬細胞也可解抑制T細胞。當(dāng)釋放了太多的內(nèi)毒素或其他介體時，或者當(dāng)不存在能移干擾細胞因子級聯(lián)的介體時，即當(dāng)免疫系統(tǒng)被削弱時才會發(fā)生膿毒癥的臨床癥狀(有關(guān)膿毒癥的預(yù)后和參與其中的合體物質(zhì)可詳見R.C.Bone，“The Pathogenesis ofsepsis”，Ann.Inf.Med.115，1995，pp.457-469)。
革蘭氏陰性膿毒癥所致的這種持續(xù)高的死亡率和發(fā)病率促使人們?nèi)ド钊雽ふ夷軌驅(qū)寡h(huán)細菌的LPS之潛在致死作用的治療劑。許多文章報導(dǎo)了靜脈內(nèi)投用高劑量免疫球蛋白的顯著治療效果。但治療中需要使用得自供體血漿的IgG，因而須篩選那些天然產(chǎn)生高水平抗核心LPS抗體的供體，或需要得自龐大的供體庫(＞1000)的IgG。也有人提出使用抗LPS的單克隆抗體治療菌血癥(如參見WO88/03211)，但結(jié)果表明其作用很小或沒有作用，這可能是因為它們并不抑制由LPS誘導(dǎo)的細胞因子級聯(lián)。
目前已確定了從人和豬的外周嗜中性白細胞中分離之兩種密切相關(guān)蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)(參見H.Flodgaard et al.，Eur.J.Biochem.197，1991，pp.535-547；J.Pohl et al.，F(xiàn)EBS Lett.272，1990，pp.200 ff.)。兩種蛋白質(zhì)顯示出與嗜中性白細胞彈性蛋白酶有高度相似性，但由于活性絲氨酸195和組氨酸57(胰凝乳蛋白酶編號)的選擇性突變(B.S.Hartley，“Homologies in Serine Proteinases”，Phil.Trans.Boy.Soc.Serines257，1970，pp.77ff.)而使得這兩種蛋白質(zhì)缺乏蛋白酶活性。由于其對肝素的高度親合性，已將它們分別定名為h肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(hHBP)和豬肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(pHBP)；又鑒于其抗微生物活性，所以Schafer等人(W.M.Schafer et al.，Infect.Immun.53，1986，pp.651 ff.)將其稱為陽離子抗微生物蛋白質(zhì)(CAP37)。也已顯示該蛋白質(zhì)在1.3×10-9M-10-8M范圍內(nèi)是對單核細胞有趨化性的(H.A.Pereira et al.，J.ChinInvest.85，1990，pp.1468 ff.)，此與Flodgaard等人(引文同上)的結(jié)果相一致。
此外，當(dāng)加入到內(nèi)皮細胞和成纖維細胞的單層培養(yǎng)物中時，可見HBP介導(dǎo)這些細胞的脫附和收縮。HBP還刺激單核細胞存活和血小板反應(yīng)蛋白分泌(E.Dstergaard and H.flodgaard，J.LeukocyteBiol.51，1992，p.316 ff.)。
也已從嗜天青顆粒中分離出一種前20個N末端氨基酸殘基與hHBP和稱為azurocidin之CAB37的相應(yīng)序列完全相同的蛋白質(zhì)(J.E.Gabayet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1989，p.5610；C.G.Wilde et al.J.Biol.Chem.256，1990，p.2038)，并已報導(dǎo)了其抗微生物性質(zhì)(D.Campanelliet al.JClin，Invest.85，1990，p.904 ff.)。
嗜中性白細胞中存在hHBP，以及當(dāng)白細胞吞噬金黃色葡萄球菌時釋放出89％的CAP37(其與hHBP相同)的這一事實(H.A.Peveira etal.，引文同上)表明，hHBP的功能可能是其參予炎癥過程，因為這種蛋白質(zhì)明顯地是從被活化的嗜中性細胞釋放的。Pereira等人(引文同上)提示，CAP37是在炎癥部位發(fā)揮其功能，其可在這里特異地吸引單核細胞，因而是負責(zé)在炎癥的第二個高潮中單核細胞流入的因素之一。Фstergaardt Flodgaard(引文同上)提示，除了對單核細胞聚集很重要外，HBP可能還在嗜中性細胞作用機理及單核細胞外滲上起著關(guān)鍵性作用。
WO89/08666中H.Flodgactrd等人的文章中已說明了HBP的結(jié)構(gòu)。有時也將HBP稱為CAP37(參見WO91/00907)和azurocidin(參見C.G.Wilde et al.，J.Biol.Chem.265，1990，p.2038)。
發(fā)明的概要以前還沒有提示可將HBP用于治療因炎癥或損傷部位存在細菌內(nèi)毒素所致的疾病或病理狀況。
因此，本發(fā)明涉及用于預(yù)防或治療與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)有關(guān)之疾病或病理狀況的藥物組合物，該組合物包含一種糖基化形式的，具有28KD表現(xiàn)分子量(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測定的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)-該蛋白質(zhì)是在多形核白細胞的嗜天青顆粒中產(chǎn)生的，連同一種醫(yī)藥上可接受的載體或稀釋劑。
已發(fā)現(xiàn)HBP具有結(jié)合LPS的能力(參見H.A.Pereira etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90，1993，pp.4733-4737)，而這種能力是與蛋白質(zhì)的抗菌作用相聯(lián)系的。有人報導(dǎo)在PH7(即生理pH)條件下HBP的殺菌效果降低。此外，膿毒性狀況并不是由這樣的革蘭氏陰性茵引起的，而是由激活單核細胞上的CD14受體進而誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)反應(yīng)的死亡細菌的細胞釋放的內(nèi)毒素引起的。因此可看出，HBP的抗茵效應(yīng)對于治療膿毒性狀況并不重要。在這方面，應(yīng)注意到LPS結(jié)合本身不是中和內(nèi)毒素的細胞因子級聯(lián)誘導(dǎo)效應(yīng)之能力的指征，抗LPS抗體在這方面幾乎沒有或完全沒有作用這一事實即證明了這一點(參見E.Th.Rietscheland M.Schlaak，Immun.Infect.21，1993，pp.25-36)。
雖然以前發(fā)表的一些對抗膿毒性狀況的工作主要集中于中和膿毒癥病人循環(huán)中的內(nèi)毒素上(例如WO93/19087中提到的，其中提示CAP37(即HBP)通過結(jié)合并清除循環(huán)中的LPS來治療內(nèi)毒素血癥)，但因為膿毒癥病人一般都沒有增加循環(huán)內(nèi)毒素的水平，所以其中大多數(shù)的努力都徒勞的。然而，在膿毒性癥狀顯露出來之后，即在內(nèi)素血癥發(fā)生之后的過程中，HBP可能在局部炎癥或感染部位是有效的。目前推測HBP可能不僅通過以高親和力與脂質(zhì)A(LPS的毒性部分)特異性結(jié)合進而阻止繼續(xù)誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)發(fā)揮其有益作用，而且還通過阻止單核細胞因應(yīng)力損傷造成的編程性細胞死亡發(fā)揮其作用，其中所說的應(yīng)力損傷是由于作為身體對抗損傷和感染之防御機制的一部分從吞噬細胞(如嗜中性細胞、單核細胞，巨噬細胞)釋放氧自由基和細胞因子而引起的。
單核細胞遷移到損傷或感染部位，并在該部位吞噬感染性微生物和有害物質(zhì)例如內(nèi)毒素。HBP也可刺激單核細胞的吞噬作用。HBP調(diào)動單核細胞的能力似乎取決于其以一種尚不清楚的方式結(jié)合LPS的能力。
此外，已令人驚奇地證實，HBP在37-45℃(即正常體溫至高燒體溫)下與LPS不可逆地結(jié)合。這一事實也可能對HPB中和LPS有所影響。
另一方面，本發(fā)明涉及預(yù)防或治療與LPS誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)的疾病或病理狀況的方法，該方法包括給需要這種治療的病人投用有效量的糖基化形式的、表現(xiàn)分子量為28KD(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測得的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)，其中所說的蛋白質(zhì)是在多形核白細胞的嗜天青顆粒中產(chǎn)生的。
再一方面，本發(fā)明涉及使用糖基化形式的，表現(xiàn)分子量為28KD(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測得的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)制造用于預(yù)防或治療與LPS誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)之疾病或病理狀況的藥物。
發(fā)明的詳細描述HBP可以是哺乳動物，特別是人或豬來源的。具體地說，HBP是具有序列表中SEQ ID No1所示之氨基酸序列的人HBP，或者是具有序列表中SEQ ID NO2所示之氨基酸序列的豬HBP，或者是其能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的功能類似物或肽片段。這類功能類似物的例子包括經(jīng)在天然蛋白質(zhì)的C和/或N末端加入一個或多個氨基酸殘基，在天然蛋白質(zhì)的一個或兩個末端取代一個或多個氨基酸殘基、在天然蛋白質(zhì)的一個或兩個末端或氨基酸序列內(nèi)的一個或多個位點缺失一個或多個氨基酸殘基、或在天然氨基酸序列的一個或多個位點插入一個一個或多個氨基酸殘基所得到的天然蛋白質(zhì)的衍生物。該術(shù)語特別是指包括HBP的肽片段，特別是那些具有如天然HBP的減少LPS誘導(dǎo)之人單拉細胞中細胞因子級聯(lián)之相似能力的片段。這種能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的片段實例是包括SEQ ID No1中的氨基酸殘基20-53，特別是氨基酸殘基26-42，或SEQ ID NO2中的氨基酸殘基20-53的肽片段。
可以按照已建立的標準方法，例如S.L.Beaucage和M.H.Cancthers(Tetrahedron Letters 22，1981，pp.1859-1869)所述的磷酰胺酸法，或Matthes等人(EMBO J.3，1984，pp.801-805)所述的方法合成制備編碼HBP的DNA序列。根據(jù)磷酰胺酸法，例如可在自動DNA合成儀中合成寡核苷酸，然后純化、退火、連接并在適當(dāng)?shù)妮d體中克隆之。
DNA序列也可以是基因組成cDNA來源的，例如可以制備基因組或cDNA文庫，并按照標準技術(shù)(例如參見Sambrook et al.MolecularCloningA Laboratory Manual.2nd Ed.Cold Spring Harbor，1989)，使用合成的寡核苷酸探針經(jīng)雜交篩選編碼全部或部分HBP的DNA序列，以制得所說的DNA序列。也可以例如按照US 4,683,202或R.K.Saikiet al.，Seience 239，1988，pp.487-491中所述的方法，使用特異性引物經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)制得該DNA序列。
然后將DNA序列插入到重組表達載體中，所說的載體可以是常規(guī)進行重組DNA操作的任何載體。對載體的選擇常常取決于將向其中導(dǎo)入該載體的宿主細胞。因此，該載體可以是自動復(fù)制載體，即作為染色體外實體存在的，其復(fù)制不依賴于染總體復(fù)制的載體，例如可以是質(zhì)粒。另外，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細胞中時即整合到宿主細胞基因組中并與它所整合進去的染色體一起復(fù)制的載體。
在載體中，編碼HBP的DNA序列應(yīng)被可操作地連接到適當(dāng)?shù)膯幼有蛄猩稀幼涌梢允窃谶x擇的宿主細胞中顯示有轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可衍生于編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質(zhì)的基因。指導(dǎo)編碼HBP的DNA在哺乳動物細胞中轉(zhuǎn)錄的適當(dāng)啟動子的例子是SV40啟動子(Subramani et al.，Mol.Cell Biol.1，1981，pp.854-864)、MT-1(金屬硫蛋白基因)啟動子(Palmiter et al.，Science 222，1983，pp.809-814)或腺病毒2主要脫期啟動子。一個適于在昆蟲細胞中使用的啟動子是多角體啟動子(Vasuvdan et al.，F(xiàn)EBS Lett.，311，1992，pp.7-11)。適于在酵母宿主細胞中使用的啟動子包括酵母糖酵群基因(Hitzermanet al.，J.Biol.Chem.255，1980，pp.12073-12080；Alber and Kawasaki，J.Mol.Appl.Gren.1，1982，pp.419-434)或乙醇脫氫酶基團(young etal.，in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals(Hollaender et al.eds.)，Plenum Press，New York，1982)或TPI1(US4,599,311)或ADH2-4C(Russel et al.，Nature 304，1983，pp.652-654)啟動子。適用于絲狀真菌宿主細胞的適當(dāng)啟動子例如是ADH3啟動子(Mcknight et al.，The EMBO J.4，1985，pp.2093-2099)或tpiA啟動子。
也可以將編碼HBP的DNA序列可操作地連接到適當(dāng)?shù)慕K止子如人生長激素終止子(Plmiter et al.，引文同上)或(適于真菌宿主的)TPI1(Alber and Kawasaki，引文同上)，或ADH3(Mcknight et al.，引文同上)啟動子上。載體還可含有聚腺苷酸化信號(例如來自SV40或腺病毒5E1b區(qū)域)、轉(zhuǎn)錄增強子序列(例如SV40增強子)及翻譯增強子序列(例如編碼腺病毒VA RNA的增強子序列)等元件。
重組表達載體可進一步含有使載體能夠在有關(guān)宿主細胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列(當(dāng)宿主細哺乳動物細胞時)的一個例子是SV40復(fù)制原點。載體還可以含有可選擇標志，例如其表達產(chǎn)物能夠補償宿主細胞中缺陷的基因，如編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)的基因，或賦予抗藥物如新霉素或潮霉素抗性的基因。
用來分別連接編碼HBP的DNA序列、啟動子和終止子的方法，以及將其插入含有復(fù)制所需信息之適當(dāng)載體中的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的(例如參見Sambrook et al.引文同上)。
可在其中導(dǎo)入表達載體的宿主細胞可以是能夠產(chǎn)生HBP的任何細胞并且較好是真核細胞，如無椎脊動物(昆蟲)細胞或脊椎動物細胞，例如非洲爪蟾(Xepopus leavis)卵母細胞或哺乳動物細胞，特別是昆蟲和哺乳動物細胞。適用的哺乳動物細胞系的例子是COS(例如ATCCCRL 1650)、BHK(例如ATCC CRL 1632，ATCC CCL10)或CH0(例如ATCC CCL61)細胞系。例如在Kaufman andSharp，J.Mol.Biol.159，1982，pp.601-621；Southern and Berg，J.Mol.Appl.Genet.1，1982，pp.327-341；Loyter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79，1982，pp.422-426；Wigler et al.，Cell 14，1978，pp.725；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7，1981，p.603；Graham and van der Eb，Virology，52，1973，p.456；和Neumann et al.，EMBO J.1，1982，pp.841-845中描述了轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞及表達導(dǎo)入細胞中之DNA序列的方法。
另外，也可使用真菌細胞(包括酵母細胞)作為宿主細胞。適用的酵母細胞的例子包括酵母屬數(shù)種或裂殖酵母屬數(shù)種的細胞，特別是釀酒酵母的菌株。其他真菌細胞的例子是絲狀真菌細胞，例如曲霉屬數(shù)種或鏈孢霉屬數(shù)種特別是米曲霉和黑曲霉的菌株。例如EP238023中描述了使用曲霉屬數(shù)種真菌表達蛋白質(zhì)。
用于培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基可以是適于培養(yǎng)哺乳動物細胞的任何常規(guī)培養(yǎng)基，例如含血清培養(yǎng)基或含有適當(dāng)添加劑的無血清培養(yǎng)基，或適于培養(yǎng)昆蟲、酵母或真菌細胞的培養(yǎng)基。可以從供應(yīng)商處購得或按照已公布的配方(例如見美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄)制備適用的培養(yǎng)基。
然后用常規(guī)方法從培養(yǎng)基中回收由細胞產(chǎn)生的HBP，包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離出宿主細胞，借助鹽例如硫酸銨沉淀出上清液或濾液中的蛋白質(zhì)成分，并列用各種層析方法，例如離子交換層析、親和層析等純化HBP。
已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，當(dāng)作為前HBP表達HBP時，可得到特別好的HBP產(chǎn)率。因此在一個特定實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)HBP的方法，其中包括在允許表達HBP的條件下，在適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼前面按有N末端延伸部分之成熟HBP的DNA序列的宿主細胞，并從培養(yǎng)基中回收所得到的作為N末端延伸之HBP的HBP產(chǎn)物。
N末端延伸部分可以是大約有5至25個氨基酸殘基，特別是有大約8至15個氨基酸殘基的序列。一般認為N末端序列中氨基酸殘基的性質(zhì)不是很關(guān)鍵的。N末端延伸部分可以是帶有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Asp的HBP前肽。
為了有利于成熟HBP的產(chǎn)生，編碼N末端延伸之HBP的DNA序列一般較好包括編碼蛋白酶切割位點的DNA序列，所說的DNA序列位于編碼N末端延伸部分的DNA序列和編碼成熟HBP的DNA序列之間。適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈钗稽c的例子是帶有氨基酸序列(Asp)4-Lys的腸激酶切割位點或帶有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg的因子Xa切割位點。
從培養(yǎng)基中回收后，可以用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈頝末端延HBP，以產(chǎn)生出成熟(有活性的)HBP。適用的酶是腸激酶或因子Xa。
用于生產(chǎn)HBP的宿主細胞有利地是昆蟲細胞，例如鱗翅目(Lepidoptera)或果蠅屬(Qrosophila)昆蟲的細胞。在此情況下，可用例如US4,745,051或WO92/01801中所述桿狀病毒載體轉(zhuǎn)染細胞。
另外還發(fā)現(xiàn)，較好于肝素或另一種硫酸化多糖存在下產(chǎn)生HBP，以避免HBP與存在于培養(yǎng)基中的脂多糖結(jié)合。因此，在一特定實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)HBP的方法，其中包括在允許表達HBP的條件下，在含有硫酸化多糖的適當(dāng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼HBP之DNA序列的宿主細胞，然后從培養(yǎng)基中回收所得到的HBP。HBP將與存在于培養(yǎng)基中的硫酸化多糖結(jié)合，然后即可在適當(dāng)條件下，例如用氯化鈉等鹽洗脫以從多糖中釋放出所需的HBP。
硫酸化多糖較好是肝素，但也可以使用其他硫酸化多糖，例如硫酸肝素、硫酸葡聚糖、硫酸皮膚素、多硫酸戊聚糖或硫酸魚精蛋白。最好將硫酸化多糖固定在惰性載體上，以有利于從培養(yǎng)基中分離與多糖結(jié)合的HBP。惰性載體例如可以是瓊脂糖(如Sepharose)。
在該實施方案中，編碼成熟HBP的DNA序列前面可接有如上文所述的N末端延伸部分。
在另一實施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)HBP的方法，其中包括在允許表達HBP和其他蛋白質(zhì)之融合蛋白質(zhì)的條件下，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)含有前面接有編碼為一蛋白質(zhì)之DNA序列并與之融合的成熟HBP之DNA編碼序列的宿主細胞，并從培養(yǎng)基中回收所得到的融合蛋白質(zhì)。其他蛋白質(zhì)例如可以是因子VIII輕鏈(編碼因子VIII輕鏈的DNA序列例如可以是按照EP232112中所述的方法制得的)。
在該實施方案中，較好在N末端延伸部分和成熟HBP之間導(dǎo)入如上文所述的編碼蛋白酶切割位點的DNA序列。
可以按已建立的配制藥物組合物的方法，例如Remington’sPharmaceutical Scienc，1985中所述的方法配制含HBP的藥物組合物。組合物一般可以是適于局部或全身注射或輸注給藥之形式的，并可用無菌水或等滲鹽水或葡萄糖溶液進行配制?？捎帽绢I(lǐng)域已知的常規(guī)滅菌技術(shù)對組合物進行滅菌處理。可以包裝所得到的含水溶液備用，或在無菌條件下過濾并凍干，用藥前將凍干的制劑與無菌水溶液合并。必要時，組合物可含有藥學(xué)上可接受的輔助物質(zhì)，以使之接近生理條件，例如可含有緩沖劑、離子強度調(diào)節(jié)劑等，其可以是乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣等。HBP的濃度可以從小于0.5％，例如從1％到15-20％(重量)。組合物的單位劑量一般可含有大約10ml至1g HBP。
本發(fā)明的藥物組合物可優(yōu)先適用于治療目的，例如用于治療膿毒癥，膿毒性休克、彌漫性血管內(nèi)凝血或腦膜炎球菌性腦膜炎。如上文所指出的，本組合物特別適于在炎癥或感染部位(如腹腔)局部用藥。因為這對于阻止單核細胞遷移到這些部位并確保它們能夠使內(nèi)毒素和感染菌內(nèi)在化是極為重要的。依據(jù)被治療的病理狀況的嚴重程度和病人狀態(tài)，目前HBP的每日劑量定為每公斤體重0.1-100mg是適宜的。
本發(fā)明的組合物還可包括治療致病茵感染的抗微生物劑。適用的抗微生物劑的例子是β-內(nèi)酰胺抗生素(如青霉素)、氨基糖苷、四環(huán)素、桿菌肽，多粘菌素、磺胺、硝基呋喃、萘啶酮酸等。對了全身用藥，組俁物中也可含有肝素或另一種硫酸化的葡糖胺聚糖作抗凝劑，因為已令人驚奇地發(fā)現(xiàn)肝素并不抑制HBP結(jié)合LPS的能力。除了作抗凝劑外，肝素的存在也可能導(dǎo)致HBP有更長的血漿半衰期，因為它可阻止HPB與血管內(nèi)皮上的葡糖胺聚糖結(jié)合。
附圖的簡要說明以下借助實施例并參考附圖進一步描述本發(fā)明。所說的附圖中

圖1顯示質(zhì)粒pKFN-1783之編碼hHBP的901bp EcoRI-XbaI片段的DNA序列和由之推導(dǎo)的氨基酸序列；圖2顯示插入到質(zhì)粒pSX221中之編碼hHBP的772bp BamHI-Hiad III片段的DNA序列和由之推導(dǎo)的氨基酸序列。
圖3是圖解顯示在10mg/ml LPS存在下，用10μg/ml HSA或不同濃度的HBP處理之血液單核細胞中的細胞因子水平；圖4是圖解顯示在100μg/ml LPS存在下，用10μg/ml HSA或不同濃度的HBP處理的血液單核細胞中的細胞因子水平。
實施例1從酵母菌株KFN-1775產(chǎn)生人肝素結(jié)合蛋白質(zhì)一般方法按照已描述的常規(guī)方法(Sambrook，J.，F(xiàn)ritch，E.F.，andManiatis，T.(1989)Molecular CloningA Labortory Manual，2ndedn.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，Ny)進行標準DNA操作。使用市售的試劑在自動DNA合成儀(380B，AppliedBiosystems)上制備合成的寡核苷酸。用二脫氧鏈終止技術(shù)(Sanger，F(xiàn).，Mieklen，S.，and Coulson，A.R.，Proc.Natl.Acad.Sci.USa74(1977)，5463-5467)進行DNA序列測定。在DNA熱循環(huán)儀(PerkinLemer Cetus)上進行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。
使用Applied Biosystems477A氣相序列儀，以自動Edman降解漢測得N末端氨基酸序列。進行聯(lián)機反相HPLC分析，以檢測并定量從各序列分析循環(huán)中釋放的PTH氨基酸。在含有各100pmole引物NOR-3176(GTTGGAATTCAT(A/T/C)CA(A/G)AA(T/C)CA(A/G)GGN(A/C/G)和NOR-3174(CA(T/C)TG(A/G)TC(T/C)TCNGGNGT)(其中N是所有四種核苷酸的混合物)的PCR反應(yīng)中，使用1μg(106pfu)人骨髓cDNA文庫(Clontech，PaloAlto，CA，U.S.A.)作為模板。正向引物NOR-3176的5’部分含有EORI位點且3’部分相當(dāng)于hHBP之氨基酸序列中氨基酸殘基no.18-23，而反向引物NOR-2174則相當(dāng)于氨基酸殘基no.149-154(Floodgaard，H.，Фstergaard，E.，Bayne，S.，Svendsen，A.，Thomsen，J.Engels，M.，andWollmer，A.(1991)Eur.J.Biochem.197，535-547)。
使用商品試劑盒(Geneamp.Perkin Elmer Cetus)和下列熱循環(huán)，以100μl體積進行PCR反應(yīng)94℃，1分鐘；50℃，2分鐘；和72℃，3分鐘。35次循環(huán)后，在72℃保持10分鐘以完成最后的循環(huán)。在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離PCR產(chǎn)物，即420bp片段。
在PCR反應(yīng)中使用如上文所述的相似引物NOR-3173(ACNCCNGA(A/G)GA(T/C)CA(A/G)TG)和NOR-3175(GGTTTCTAGATTATCCCGG(A/G)TT(A/G)TTNA(A/G)NACNCC)和相同的cDNA模板。正向引物NOR-3173互補于NOR-2174，反向引物NOR-3175相當(dāng)于HBP之氨基酸序列中的氨基酸殘基215-221，且其后是終止密碼子和XbaI位點。按上述方法進行PCR反應(yīng)并以瓊脂糖凝膠電泳法分離232bp片段。
使用NOR-3176和NOR-3175作為末端引物，以重疊延伸PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.N.，Pullen，J.K.and Pease，L.R(1989)Gene 77，61-68)連接上述兩個PCR片段。分離所得到的635bp片段，然后用EcoRI和Xbai消化得到621bp片段，將此片段連接到質(zhì)粒pTZ19R(Mead，D.A.，Szczesna-Skorupa，E.andKemper，B.，Prot.Engin，1(1986)67-74)的2.8kb EcoRI-XbaI片段上。
用連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌菌株(r-，m+)并基于氨芐青霉素抗性選擇之。DNA測序顯示從所得集落之-分離的質(zhì)粒pKFN-1726編碼預(yù)期的hHBP18-221氨基酸序列。用PstI和XbaI消化質(zhì)粒PKFN-1726，分離所得到的329bp片段并按后述方法使用之。
使用如上文所述的同樣cDNA模板和引物MHJ-206(GCTGAGAGATTGGAGAAGAGAATCGTTGGCGGCCGGAAGGCGAG)和MHJ-200(CGGCTTCCACCGTGGCGTTCTG)經(jīng)PCR分離作為379bp片段的HBP的N末端部分。MHJ-206的3’部分相同于人HBP基因的N末端編碼部分，MHJ-206的5’部分相同于以前描述過的雜合酵母前導(dǎo)基因的C末端部分(Thim，L.，Norris，K.，Norris，F(xiàn).，Nielsen，P.F.，BjФrn，S.E.，Christensen，and Petersen，J.EEBS Lett.(1993)318，345-352)。
經(jīng)重疊延伸PCR(Horton，R.M.，Hunt，H.D.，Ho，S.H.，Pullen，J.K.，and Pease，L.R.(1989)Gene 77，61-68)得到雜合前導(dǎo)基因和編碼HBP的N末端部分之379bp PCR片段的符合讀框的融合。用EcoRI和PstI消化該產(chǎn)物并作為572bp片段分離之。
將上述572bp EcoRI-PstI片段和329bp PStI-XbaI片段連接到來自質(zhì)粒pT219R(Mead，D.A.，Szczesna-Shorupa，E.and Kemper，B.，Brot.Engin.1(1986)67-74)的2.8Kb EcoRI-XbaI片段上。用連接混合物轉(zhuǎn)化根據(jù)氨芐青霉素抗性選擇的感受態(tài)大腸桿菌菌株(r-，m-)。從所得到的茵落之一中選擇質(zhì)粒pKFN-1780備用。
用EcoRI和XbaI消化質(zhì)粒pKFN-1780。將所得到的901bp片段連接到來自pMT636的9.5Kb NcoI-XbaI片段和來自pMT636的1.4Kb NcoI-EcoRI片段上。國際專利申請No.WO89/01968中描述了質(zhì)粒pMT636。
pMT636是含有梭酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces Pombe)TPI基因(POT)(Russell，P.R.，Gene 40(1985)125-130)、釀酒酵母丙糖磷酸異物酶啟動子和終止子，TPIP和TPIT的大腸桿菌-釀酒酵母穿梭載體(Alber，T.，and Kawasaki，G.，J.Mol.Appl.Gen.1(1982)，419-434)。
用連接混合物轉(zhuǎn)化可根據(jù)氨芐青霉素抗性選擇的感受態(tài)大腸桿菌株(r-，m+)。DNA測序顯示由所得茵落分離的質(zhì)粒含有與合成的酵母信號前導(dǎo)基因正確融合的編碼人HBP的正確DNA序列。
選擇一個質(zhì)粒pKFN-1783備用。
質(zhì)粒pKFN-1783的表達彈夾含有下列序列TPIP-信號前導(dǎo)序列-HBP-TPIT圖1中顯示了來自pKFN-1783之901bp EcoRI-XbaI片段的DNA序列。
酵母轉(zhuǎn)化使釀酒酵母茵性MT663(E2-7B XE11-36a/α，△tpi/△tpi，pep4-3/pep4-3)在ypGaL(1％Bacto酵終提取物，2％Bacto蛋白胨，2％半乳糖、1％乳酸鹽)上生長至600mm的0.D.值為0.6。
離心收集100ml培養(yǎng)物，用10ml水洗滌，再次離心并重新懸浮在含1.2M山梨醇、25mM Na2EDTA(pH8.0)和6.7mg/ml二硫蘇糖醇的10ml溶液中。將懸液于30℃保溫15分鐘，離心并重新懸浮在含有1.2M山梨醇、10mM Na2EDTA、0.1M檸檬酸鈉(pH5.8)和2mgNovozym234的10ml溶液中。將懸液于30℃保溫30分鐘，離心收集細胞，在10ml1.2M山梨醇和10mlCAS(1.2M山梨醇、10mM CaCl3、10mM Tris-HCl，pH7.5)中洗滌，然后重新懸浮在2ml CAS中。為了進行轉(zhuǎn)化，將0.1ml CAS重新懸浮的細胞與大約1μg質(zhì)粒pKFN-1783混合并在室溫下放置15分鐘。加入1ml含20％聚乙二醇4000、20mMCaCl2、10mM CaCl2、10mM Tris-HCl，pH7.5的混合物，并將所得混合物繼續(xù)室溫放置30分鐘。離心該混合物，將沉淀物重新懸浮在0.1mlSOS(1.2M山梨醇、33％(V/V)YPD、6.7mM CaCl2、14μg/ml亮氨酸)中并于30℃保溫2小時。然后離心該懸液并將沉淀餅重新懸浮在0.5ml 1.2M山梨醇中。然后于52℃加入6ml頂層瓊脂(含有1.2M山梨醇加2.5％瓊脂的Sherman等人(Methods in yeast Genetics，ColdSpring Harbor Laboratory(1982))的SC培養(yǎng)基)，并將懸液倒到含有同樣的瓊脂固化的，含山梨醇培養(yǎng)基之平板的頂面上。
30℃培養(yǎng)3天后挑取轉(zhuǎn)化的菌落，再次分離并用以制備液體培養(yǎng)物。選擇一個這樣的轉(zhuǎn)化株KFN-1775用于進一步的表征。
發(fā)酵使酵母菌株KFN-1775生長于YPD培養(yǎng)基(1％酵母提取物、2％蛋白胨(Difco Laboratories)和3％葡萄糖)。將1升該茵株培養(yǎng)物于30℃振蕩培養(yǎng)至650nm光密度為24。離心后分離上清液。
基本上按照WO89/08666中所述的方法從上清液中純化HBP。對殘基1-20的氨基酸序列分析表明N末端序列與SEQ ID NO1中所示者完全相同。
實施例2為了使用桿狀病毒系統(tǒng)在昆蟲細胞中表達HBP(為前體形式)，制得下列PCR引物MHJ 20875′-AAA AAG GAT CCA CCA TGA CCC GGC TGA CAG TCC TGGCCC TGC TGG CTG GTC TGC TGG CGT CCT CGA GGG CCGGCT CCA GCC CCC TTT TGG ACA TCG TTG GCG GCC GGAAGG C-3′MHJ 20895′-AAA AAA GCT TCC TAG GCT GGC CCC GGT CCC GGA TTGTTT AAA ACG CCA TC-3′MHJ2087編碼Bam HI位點、起始密碼子和人cDNA的前原部分(Morgan，J.G.et al.，(1991)，J.Immun.，147，3210-3214)，然后是從pKFN1780上基因之成熟部分開始的前20個核苷酸。
MHJ2089互補于pKFN 1780上HBP基因之編碼部分的后8個密碼子加上根據(jù)上列cDNA序列的兩個額外的密碼子。其終止在Hind III位點。
按下列程序使用這兩個引物和作為模板的pKFN1780進行PCR3次循環(huán) 95℃60秒 50℃120秒 72℃120秒12次循環(huán) 95℃30秒 65℃60秒72℃90秒在1％瓊脂糖凝膠上電泳分離作為760bp片段的PCR產(chǎn)物，用BamHI和Hind III切割，并插入到用同樣兩種酶切割的PSX221中(PSX221是PUC19(Yannisch-Perron，C.et al.，(1985)Gene 33，103-119)的衍生質(zhì)粒)。經(jīng)序列測定證實克隆的DNA并切掉Bam HI-Hind III片段(如圖2中所示)，分離后將其插入到用于在昆蟲細胞內(nèi)表達的pBlueBac III(Invitrogen Corporation)中。將所得質(zhì)粒稱為pSX556。
為了產(chǎn)生表達HBP的重組桿狀病毒，使用Invitrogen corp(SanDiego，CA)的MAXBAC試劑盒并按照其中包括的“肝狀病毒表達系統(tǒng)手冊(1.5.5版本)進行所有操作。簡單地說，將1μg線性化的AcMNPVDNA和3μg pSX556共轉(zhuǎn)染到SF9昆蟲細胞中(2×106個細胞，60mm平皿)。7天后收集所得到的培養(yǎng)物上清。用不同稀釋度的病毒上清液感染100mm平皿中的新鮮SF9細胞單層，然后覆蓋以含有完全TNM-FH培養(yǎng)基(其中含150μg/ml X-gal)的1.5％瓊脂糖。8天后根據(jù)其藍顏色鑒定6個假定的重組體噬斑并用于感染含有SF9細胞的6孔平板。5天后純化相應(yīng)的病毒DNA，并用側(cè)翼接有病毒DNA中重組位點的正向和反向引物進行PCR反應(yīng)。在瓊脂糖凝膠上估測PCR產(chǎn)物后，對相應(yīng)最純的重組病毒進行另一輪噬斑純化，以確保最后的重組病毒儲備物中沒有野生型病毒。在適應(yīng)于生長在無血清SF900-II培養(yǎng)基(Gibco BRI/Cife-Technologies)中的昆蟲細胞(SF9和SF21)內(nèi)產(chǎn)生重組HBP。一般說來，以MOI為1的病毒量感染細胞密度均為1×106/ml的5升旋動培養(yǎng)液或10升發(fā)酵罐，并在感染后3天收獲培養(yǎng)基。按WO89/08666中所述的方法純化HBP。
實施例3沒有前區(qū)域的HBP制得覆蓋圖2中所示序列的前99bp(從Bam HI到EagI)但不包括覆蓋前區(qū)域之部分(從73至87，斜體字)的寡核苷酸接頭(見下文)，以其取代pSX556中的原始Bam HI-Eag I得到pSX559。期望該構(gòu)建在桿狀病毒系統(tǒng)中表達時所能產(chǎn)生成熟的HBP。
接頭由配對退火的四種寡核苷酸組成，得到下列兩個雙鏈體MHJ2568/LWN57465′-GATCCACCATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCC-3′3′-GTGGTACTGGGCCGACTGTCAGGACCGGGACGACC-P-5′LWN5745/MHJ25665′-P-TGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCATCGTTGGC-3′3′-GACCAGACGACCGCAGGAGCTCCCGGTAGCAACCGCCGG-5′實施例4表達在前肽和成熟HBP之間加有牛腸激酶切割位點的HBP衍生物用編碼HBP(信號-前肽-成熟HBP)的桿狀病毒載體感染的昆蟲細胞不能切掉前肽。由編碼沒有前肽之HBP(直接與成熟HBP序列融合的信號序列)的病毒感染的昆蟲細胞可產(chǎn)生成熟形式的HBP，但量很低。為了增加成熟HBP的產(chǎn)率，產(chǎn)生一個編碼帶有牛腸激酶切割位點(Asp4-Lys，插入在前肽和成熟HBP之間)之HBP衍生物的桿狀病毒載體，這樣便有可能經(jīng)體外加工所產(chǎn)生的延伸形式的HBP而得到成熟的HBP用pfu聚合酶和引物241(CCGGG GATCCGATGAC CCG GCTGACAGT CCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGG CGTC CTCGAGGGCCGG CTCCAGCCCCCTTTTGGACGA CGACGAC AA GATCGTTGGCGGC)和PBRa246(CCGGGGATCCAAC TAGG CTGGCCCCGGTCCCGG)，經(jīng)PCR產(chǎn)生編碼信號-Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp-Asp3-Lys-成熟HBP的cDNA片段。用Bam HI消化PCR產(chǎn)物并克隆到pVL1393轉(zhuǎn)移載體(Invitrogen，San Diego，CA)。按照實施例2中所述的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒并生產(chǎn)蛋白質(zhì)(但這種情況下根據(jù)它們的包含體陰性表型來鑒定推測的重組噬斑)。
為了產(chǎn)生N末端延伸形式的HBP，離心掉生長于SF900II無血清培養(yǎng)基(Gibco)中的108個SF9細胞，并重新懸浮在給出MOI(感染復(fù)數(shù))為1之病毒原種的樣品中。將帶有病毒的細胞轉(zhuǎn)移至0.5升Bellco旋轉(zhuǎn)瓶(#1965-00500)中，并加入新鮮的SF900II培養(yǎng)基至終體積為400ml。最后向培養(yǎng)物中加入已在25ml無茵0.9％NaCl中高壓滅菌的1.5g肝素-Sepharose(CL-6B，Pharmacia)。將培養(yǎng)物于27℃保溫3天。
為了從昆蟲細胞培養(yǎng)物中分離出肝素-Sepharose小珠，將900ml發(fā)酵培養(yǎng)基等分成各50ml的8個管，并在Sorvall InstrumentsTECHNOSPIN R離心機中以300rpm離心3分鐘。抽吸掉帶有細胞的上清液并浮沉淀部分重新懸浮在加至各管內(nèi)的30ml無菌NaCl中，然后以300rpm離心而將肝素-Sepharose小珠與余留的污染細胞分離開。整個過程重復(fù)兩次。在加于各管中的20ml無菌0.5M NaCl中仔細洗小珠。然后將小珠收集在一個含小體積0.5M無菌NaCl(20-30ml)的50ml試管中，并轉(zhuǎn)移到無茵玻璃過濾漏斗中。使小珠排出并用30ml無菌的3MNaCl從小珠上仔細洗脫rHBP。按照WO89/08666中所述的方法從3MNaCl洗脫物中純化HBP。
將200μm包含前序列和位于前序列與成熟蛋白質(zhì)之間的腸激酶切割位點的純化的HBP溶解于含有25mM CaCl2(pH5.1)的50mM乙酸鈉緩沖液中。以1.2ml的體積加入400單位腸激酶(BiozymeLaboratonies Limited GB Batch 18×2 Code EK3)，并將混合物于37℃保溫1小時。按照WO89/08666中所述的方法經(jīng)反相高壓液相層析(RP HPLC)從保溫混合物中純化出HBP。對1等份純化的HBP(1mmol)進行N末端序列測定，結(jié)果證明主序列代表了以1le開始的正確的成熟HBP，這表明切割是成功的。
實施例5表達在前肽和成熟HBP之間加有因子Xa切割位點的HBP衍生物產(chǎn)生成熟HBP的另一個對策是使用因子Xa以體外切割所產(chǎn)生的材料。因子Xa識別/切割位點是Ile-Glu-Gly-Arg。T.J.Gardella等人(J.Biol.Chem.，26，15854-15859，1990)已報導(dǎo)，正好在因子a識別位點的N末端安插三個小氨基酸(Gly-Gly-Ser)也許會減小空間阻礙作用，并因而可增加因子Xa切割的效率。為了產(chǎn)生分別編碼信號序列-前肽-Ile-Glu-Gly-Arg-成熟HBP和信號序列-前肽-Gly-Gly-Ser-Ile-Glu-Gly-Arg-成熟HBP的cDNA片段，合成引物PBRa249(CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)和PBRa250(CCGGGGATCCGATGACCCGGCTGACAGTCCTGGCCCTGCTGGCTGGTCTGCTGGCGTCCTCGAGGGCCGGCTCCAGCCCCCTTTTGGACGGTGGTTCCATCGAGGGTAGGATCGTTGGCGGC)
在用pfu聚合酶進行的PCR反應(yīng)中使用這兩個引物及前述的引物PBRa246(實施例4)。用Bam HI消化這兩個片段并插入到pVI1393中。重組桿狀病毒的產(chǎn)生和蛋白質(zhì)的生產(chǎn)均按實施例4中所述的方法進行。
實施例6在Lymphoprep(Nycomed，Uslo，Norway)上離心檸酸酸鹽抗凝處理的血沉棕黃色層，以從健康成年人血液供體(BloodBand，Rigshospitalet)制備外周血單核細胞(BMNC)。在某些實驗中，將BMNC與PTX預(yù)保溫1小時，然后加入終濃度為1μg/ml的脂多糖(LPS)(E.col055B5；Difco Laboratories，Detroit，MI)，或終濃度20μg/ml的PHA(Difco)，或終濃度為25μg/ml純化的結(jié)核菌素蛋白質(zhì)衍生物(PPD)(State SerumInstitute，Copenhagen，Denmark)。在含有3％于56℃加熱失活30分鐘之正常人血清(NHS)，并添加了0.8mM谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素(BRL-Gibco，Denmark)(各20IE/ml)的RPMI-1640培養(yǎng)基(BRL-Gibco，Roskilde，Denmark)中進行保溫。保溫后收獲細胞并立即于-20℃冷凍上清液；在液氮中快速冷凍細胞沉淀物并于-80℃下保存不超過1周，然后提取RNA。
使用抗純化之重組細胞因子的單特異性多克隆免抗體，以雙夾心ELISA法檢測IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-6、IFNr、TNFα和TNFβ(M.B.Hansen et al.，Immunol.Lett.30，1991，pp.156)。用蛋白 A 親合純化的IgG包被Immuno-Maxisorp平板(Nunc.Roskilde，Denmarle)。用加在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中的5％人血清白蛋白封閉未結(jié)合的部位。在添加有2％正常兔血清(Dako，Glostrup，Denmark)10mMEDTA、2000KIE/ml抑蛋白酶肽和5mM DL-二硫蘇糖醇的PBS中稀釋樣品。用各細胞因子的國際標準品(National Institute for Biological Standards and Controls，PottersBar，Hevtfordshire，UK)校準測定值。使用生物素化的多克隆免抗體作為檢測抗體，同時使用抗生蛋白鏈菌素-過氧化物酶(Kirkegaard andPerry la.，Gaithersburg，MD)進行檢測。用1，2-苯二胺二鹽酸化物進行顯色并于492mm檢測之。在8pg/ml和1mg/ml濃度范圍之間的測定間偏離系數(shù)小于15％。這些ELISA法的靈敏性限度為8-10pg/ml。
融化BMNC，并分別在10和100mg/ml LPS存在下用10μg/ml和100μg/ml量的人血清白蛋白，以及0.2μg/ml、2μg/ml和20g/ml量的HBP處理之。
附圖3和4中顯示了檢測的結(jié)果。從圖中可以看出，在HBP存在下，顯著降低了BMNC的細胞因子釋放。序列表(1)一般信息(i)申請人(A)名稱Novo Nordisk A/S(B)街Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國家Denmark(F)郵碼(ZIP)2880(G)電話+4544448888(H)傳真+4544493256(I)電傳37304(ii)發(fā)明名稱用于治療膿毒癥的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(iii)序列數(shù)2(iv)計算機可讀形式(A)介質(zhì)類型Floppy盤(B)計算機PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)長度221氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體人(xi)序列描述SEQ ID NO1Ile Val Gly Gly Arg Lys Ala Arg Pro Arg Gln Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Asn Gln Gly Arg His Phe Cys Gly Gly Ala Leu Ile His20 25 30Ala Arg Phe Val Met Thr Ala Ala Ser Cys Phe Gln Ser Gln Asn Pro35 40 45Gly Val Ser Thr Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Arg Arg Glu50 55 60Arg Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Ser Ser Met Ser Glu Asn Gly65 70 75 80Tyr Asp Pro Gln Gln Asn Leu Asn Asp Leu Met Leu Leu Gln Leu Asp85 90 95Arg Glu Ala Asx Leu Thr Ser Asx Val Thr Ile Leu Pro Leu Pro Leu100 105 110Gln Asx Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Arg Cys Gln Val Ala Gly Trp115 120 125Gly Ser Gln Arg Ser Gly Gly Arg Leu Ser Arg Phe Pro Arg Phe Val130 135 140Asx Val Thr Val Thr Pro Glu Asp Gln Cys Arg Pro Asn Asn Val Cys145 150 155 160Thr Gly Val Leu Thr Arg Arg Gly Gly Ile Cys Asn Gly Asp Gly Gly165 170 175Thr Pro Leu Val Cys Glu Gly Leu Ala His Gly Val Ala Ser Phe Ser180 185 190Leu Gly Pro Cys Gly Arg Gly Pro Asp Phe Phe Thr Arg Val Ala Leu195 200 205Phe Arg Asp Trp Ile Asp Gly Val Leu Asn Asn Pro Gly210 215 22O(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長度219氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體豬(xi)序列描述SEQ ID NO2(i)序列特征(A)長度219氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈數(shù)單股(D)拓撲結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白質(zhì)(vi)原始來源(A)生物體豬(xi)序列描述SEQ ID NO2Ile Val Gly Gly Arg Arg Ala Gln Pro Gln Glu Phe Pro Phe Leu Ala1 5 10 15Ser Ile Gln Lys Gln Gly Arg Pro Phe Cys Ala Gly Ala Leu Val His20 25 30Pro Arg Phe Val Leu Thr Ala Ala Ser Cys Phe Arg Gly Lys Asn Ser35 40 45Gly Ser Ala Ser Val Val Leu Gly Ala Tyr Asp Leu Arg Gln Gln Glu50 55 60Gln Ser Arg Gln Thr Phe Ser Ile Arg Ser Ile Ser Gln Asn Gly Tyr65 70 75 80Asp Pro Arg Gln Asn Leu Asn Asp Val Leu Leu Leu Gln Leu Asp Arg85 90 95Glu Ala Arg Leu Thr Pro Ser Val Ala Leu Val Pro Leu Pro Pro Gln100 105 110Asx Ala Thr Val Glu Ala Gly Thr Asn Cys Gln Val Ala Gly Trp Gly115 120 125Thr Gln Arg Leu Arg Arg Leu Phe Ser Arg Phe Pro Arg Val Leu Asx130 135 140Val Thr Val Thr Ser Asn Pro Cys Leu Pro Arg Asp Met Cys Ile Gly145 150 155 160Val Phe Ser Arg Arg Gly Arg Ile Ser Gln Gly Asp Arg Gly Thr Pro165 170 175Leu Val Cys Asn Gly Leu Ala Gln Gly Val Ala Ser Phe Leu Arg Arg180 185 190Arg Phe Arg Arg Ser Ser Gly Phe Pne Thr Arg Val Ala Leu Phe Arg195 200 205Asn Trp Ile Asp Ser Val Leu Asn Asn Pro Pro210 21權(quán)利要求
1.用于預(yù)防或治療與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)相關(guān)之疾病或病理狀況的藥物組合物，該組合物包含糖基化形式的，表現(xiàn)分子量為28KD(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測得的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑，其中該蛋白質(zhì)是在多形核白細胞的嗜天青顆粒中產(chǎn)生的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是人HBP。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的組合物，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO1所示的氨基酸序列，或其能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的組合物，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包括SEQ ID NO1中氨基酸殘基20-53，特別是氨基酸殘基26-42的肽片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的組合物，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是豬HBP。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的組合物，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，或其能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO2之氨基酸殘基20-53的肽片段。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-7之任何一項的藥物組合物，其包含每個單位劑量形式約為10mg至1g量的HBP。
9.預(yù)防或治療與由LPS誘導(dǎo)細胞因子級聰慧相關(guān)之疾病或病理狀況的方法，該方法包括綸需要這種治療的病人投用有效量的糖基化形式的，表現(xiàn)分子量為28KD(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測知的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是在多形核白細胞的嗜天青顆粒中產(chǎn)生的。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其用于預(yù)防或治療革蘭氏陰性茵膿毒癥，膿毒性休克或彌漫性血管內(nèi)凝血。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其用于治療腦膜炎球菌性腦膜炎。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是人HBP。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO1所示的氨基酸序列，或該序列的能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包含SDQ ID NO1之氨基酸殘基20-53，特別是氨基酸殘基26-42的肽片段。
15.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是豬HBP。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中HBP具有序列表中SEQ IP NO2所示的氨基酸序列，或該序列的能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO2中氨基酸殘基20-53的肽片段。
18.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中HBP的有效量是在每公斤體重0.1-100mg范圍內(nèi)，較好為每公斤體重0.5-50mg，最好每公斤體重1-25mg。
19.應(yīng)用肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)制造用于預(yù)防或治療與LPS誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)相關(guān)之疾病或病理狀況的藥物，其中所說的HBP為糖基化形式的，具有28KD表現(xiàn)分子量的(如在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測知的)，該蛋白質(zhì)是在多形核向細胞的嗜天青顆粒中產(chǎn)生的。
20.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其為應(yīng)用于預(yù)防或治療革蘭氏陰性茵膿毒癥，膿毒性休克或彌漫性血管內(nèi)凝血。
21.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其為應(yīng)用于治療腦膜炎球菌性腦膜炎。
22.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是人HBP。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的應(yīng)用，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO1所示的氨基酸序列，或該序列的能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的應(yīng)用，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO1中氨基酸殘基20-53，特別是氨基酸殘基26-42的肽片段。
25.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是豬HBP。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的應(yīng)用，其中HBP具有如序列表中SEQ IDNO2所示的氨基酸序列，或其能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的類似物或肽片段。
27.根據(jù)權(quán)利要求26的應(yīng)用，其中能夠結(jié)合LPS之脂質(zhì)A部分的肽片段是至少包含SEQ ID NO2的氨基酸殘基20-53的肽片段。
28.根據(jù)權(quán)利要求19的應(yīng)用，其中藥物含有大約每個單位劑量形式約10mg至1g量的HBP。
29.生產(chǎn)HBP的方法，其中在允許表達HBP的條件下在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼前面接有N末端延伸部分之成熟HBP的DNA-序列的宿主細胞，生成的HBP作為N末端延伸的HBP從培養(yǎng)基中被回收。
30.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中編碼N末端延伸之HBP的DNA序列包括編碼蛋白酶切割位點的DNA序列，其中后者位于編碼N末端延伸部分的DNA序列和編碼成熟HBP的DNA序列之間。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中蛋白酶切割位點是具有氨基酸序列(Asp)4-Lys的腸激酶切割位點。32.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中蛋白酶切割位點是具有氨基酸序列Ile-Glu-Gly-Arg的因子Xa切割位點。
33.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中N末端延伸部分是帶有氨基酸序列Gly-Ser-Ser-Pro-Leu-Leu-Asp的HBP的前肽。
34.根據(jù)權(quán)利要求29的方法，其中宿主細胞是昆蟲細胞。
35.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其中用適當(dāng)?shù)牡鞍酌盖懈頝末端延伸的HBP以產(chǎn)生成熟HBP。
36.生產(chǎn)HBP的方法，其中在允許HBP表達的條件下在含有硫酸化多糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)包含編碼HBP之DNA序列的宿主細胞，并從培養(yǎng)基中回收所得到的HBP。
37.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中硫酸化多糖是肝素。
38.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中硫酸化多糖被固定在惰性載體上。
39.根據(jù)權(quán)利要求38的方法，其中惰性載體是瓊脂糖。
40.根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其中宿主細胞包含編碼前面接有N末端延伸部分之成熟HBP的DAN序列。
41.根據(jù)權(quán)利要求40的方法，其中編碼N末端延伸之HBP的DNA序列包括編碼蛋白酶切割位點的DNA序列，其中后者位于編碼N末端延伸部分的DNA序列和編碼成熟HBP的DNA序列之間。
42.生產(chǎn)HBP的方法，其中在允許表達HBP和其他蛋白質(zhì)之融合蛋白質(zhì)的條件下，在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)含有編碼成熟HBP之DNA序列的宿主細胞，其中所說的DNA序列前面接有并融合有編碼另一種蛋白質(zhì)的DNA序列。
43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中編碼蛋白酶切割位點的DNA序列位于編碼其他蛋白質(zhì)的DNA序列和編碼成熟HBP的DNA序列之間。
全文摘要
公開了用于預(yù)防或治療與脂多糖(LPS)誘導(dǎo)細胞因子級聯(lián)相關(guān)之疾病或病理狀況的藥物組合物，該組合物包含由多形核白細胞的嗜天青顆粒產(chǎn)生的、糖基在形式的、表現(xiàn)分子量為28KD(在還原條件下經(jīng)SDS-PAGE測得的)的肝素結(jié)合蛋白質(zhì)(HBP)，以及醫(yī)藥上可接受的載體或稀釋劑。肝素結(jié)合蛋白質(zhì)是在含有編碼N末端延伸之HBP或編碼HBP的DNA序列的縮主細胞中產(chǎn)生的，其中所說的DNA序列前面接有并融合有編碼另一種蛋白質(zhì)的DNA序列。另外還公開了生產(chǎn)HBP的方法，其中培養(yǎng)基含有硫酸化的多糖。
文檔編號C12N15/12GK1146724SQ95192688
公開日1997年4月2日 申請日期1995年3月17日 優(yōu)先權(quán)日1994年4月21日
發(fā)明者H·J·H·夫羅德加爾德, P·B·拉斯姆森 申請人:諾沃挪第克公司