專利名稱：一種基于青霉素結(jié)合蛋白的檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法及專用試劑盒和試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于青霉素結(jié)合蛋白的檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素的方法及專用試劑盒和試紙條。
背景技術(shù)：
內(nèi)酰胺類抗生素是一類含有四元內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)抗生素的統(tǒng)稱，是目前醫(yī)藥和獸藥行業(yè)應(yīng)用最多的一類抗生素，廣泛用于治療和預(yù)防葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、 大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌引起的動物尿道、胃腸道、呼吸道感染以及奶牛乳房炎等疾病。長期攝入含有內(nèi)酰胺類抗生素殘留的食物可引起細菌耐藥性增加，消化系統(tǒng)菌群失調(diào)，甚至誘發(fā)過敏反應(yīng)。隨著人們對食品安全的日益重視，歐盟、中國、美國、日本等國家相繼對動物源性食品中內(nèi)酰胺類藥物最大殘留限量值作出了規(guī)定，其中歐盟規(guī)定青霉素G、氨芐西林、 阿莫西林的MRL為4ppb，苯唑西林、鄰氯西林、雙氯西林、新青霉素III的MRL為30ppb，頭孢噻呋、頭孢氨芐的MRL為lOOppb，頭孢唑啉、頭孢哌酮的MRL為50ppb，頭孢喹肟的MRL為 20ppb。免疫分析方法是目前藥物殘留檢測常用方法之一，其原理是基于抗原抗體的特異性結(jié)合，具有高靈敏度、高特異性的特性，其中酶聯(lián)免疫吸附法和膠體金法又具備高通量、 檢測快速、操作簡便、適用于現(xiàn)場篩查等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于藥物殘留篩查。免疫分析方法建立的基礎(chǔ)是抗體，常規(guī)的抗體制備方法主要是免疫動物獲得多克隆血清以及采用雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體，周期長、過程復(fù)雜、費用高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測內(nèi)酰胺類抗生素的受體試劑盒。本發(fā)明所提供的用于檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素的受體試劑盒，包括SEQ ID NO 1 所示蛋白、酶標記的氨芐西林和標準品溶液，所述標準品為青霉素G。上述受體試劑盒中，所述受體試劑盒還包括底物顯色液、終止液、洗滌液、樣品稀釋液、包被緩沖液和封閉液；底物顯色液由A液和B液組成，A液為2% (質(zhì)量百分含量)過氧化脲的水溶液， B液為(質(zhì)量百分含量)四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；終止液為0. 2M的硫酸水溶液；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將0. 5ml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, pH值為 7.4 ；樣品稀釋液0. lmol/L、pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液；每1升包被緩沖液按照如下方法制備將Na2CO3L 59g和NaHC032. 93g溶于1升水
4中，用水定容至1升，得到所述包被緩沖液；每1升封閉液按照如下方法配制將50mgBSA、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 02M, pH值為 7. 2。上述任一所述受體試劑盒中，所述酶標記的氨芐西林為HRP標記的氨芐西林；上述任一所述受體試劑盒中，所述標準品溶液為青霉素G濃度如下的溶液 8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 1 μ g/L。上述任一所述受體試劑盒中，所述β -內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測內(nèi)酰胺類抗生素的膠體金試紙。本發(fā)明所提供的檢測內(nèi)酰胺類抗生素的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標記的帶有HIS標簽的 SEQ ID NO :1所示蛋白；所述反應(yīng)膜上含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有阿莫西林與載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體。上述任一所述膠體金試紙中，所述β -內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。上述任一所述膠體金試紙中，所述載體蛋白為OVA。本發(fā)明的另一個目的是提供一種檢測樣品中內(nèi)酰胺類抗生素的方法。本發(fā)明所提供的檢測樣品中β -內(nèi)酰胺類抗生素的方法，為如下I或II所示I、檢測樣品中β -內(nèi)酰胺類抗生素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述受體試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述待測樣品為牛奶將牛奶用樣品稀釋液按1 4稀釋，4°C、IOOOOrpm離心，取上清液，作為待測樣本溶液；所述待測樣品為奶粉稱取Ig奶粉，溶于5mL樣品稀釋液中，混合均勻，作為待測樣本溶液。所述待測樣品為尿液將尿液直接作為待測樣本溶液；所述待測樣品為肌肉、魚、蝦或蛋將待測樣品勻漿處理，得到均質(zhì)樣品，將每5g 均質(zhì)樣品加入IOmL乙腈水溶液中，上下顛倒震蕩10min，5000rpm離心lOmin，取上清，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的體積比為9 1 ；所述待測樣品為蜂蜜將每5g待測樣品加入15mL去離子水中，混合；將所述混合溶液用Oasis固相萃取柱進行純化，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣本溶液。II、檢測樣品中β -內(nèi)酰胺類抗生素的方法包括如下步驟
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1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用上述任一所述所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測；所述樣品稀釋液為0. lmol/L、pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液。SEQ ID NO :1所示蛋白在檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。上述應(yīng)用中，所述β-內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、 阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在
內(nèi)酰胺類抗生素的檢測中將發(fā)揮重大作用。


圖1為PBP h基因PCR瓊脂糖電泳圖。圖2為PBP 2x基因與ρΕΤ2^載體連接后酶切鑒定圖。圖3為IPTG誘導后不同時間點全蛋白SDS-PAGE圖。
圖4為PBP 2χ蛋白純化SDS-PAGE圖。圖 5 為 PBP 2χ 蛋白 western blot 圖。圖6為試劑盒標準曲線。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。氨芐西林購自美國Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品目錄號為A9518。表達載體ρΕΤ2^3購自德國Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號為69865 ；大腸桿菌 BL21(DE3)購自德國Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號為69387 ；蛋白純化用His · Bind Columns購自德國Merk(Novagen)公司，產(chǎn)品目錄號為70971 J4 DNA Ligase購自美國 Promega公司，產(chǎn)品目錄號為M1801S。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae) R6購自美國標準生物品收藏中心 (Americantype culture collection，ATCC)，編號為 ATCC 49619 (http// www. atcc. org/ ATCCAdvancedCatalogSearch/ProductDetails/tabid/452/Default. aspx)。辣根過氧化物酶(HRP)購自美國Sigma公司。BCA蛋白定量試劑盒購自美國Pierce公司。載體PMD19-T購自TAKARA，產(chǎn)品目錄號為D102A。His-tag單克隆抗體和HRP標記的羊抗鼠抗體購自天根生化科技(北京)有限公司，產(chǎn)品目錄號分別為AB102-02和SAlOl-Ol。實施例1、重組菌的制備肺炎鏈球菌R6基因組作為模板，應(yīng)用下述引物進行PCR擴增，得到PCR產(chǎn)物；用限制性內(nèi)切酶NdeI和SioI酶切PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，回收2250bp左右的目的基因片段(即PBP2x目的基因)；電泳結(jié)果如圖1所示，泳道1-6為目的基因，泳道7 為 markerο上游引物5，-TTCATATGATGAAGTGGACAAAAAGA-3，(5，端含有NdeI 酶切位點、保護
堿基)下游引物5，-TTCTCGAGTTAGTCTCCTAAAGTTAAT-3’(3，端含有 XhoI 酶切位點、保護堿基)回收目的基因片段，將其與PMD19-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，通過抗性篩選陽性單克隆，將陽性單克隆進行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行測序。結(jié)果在PMD19-T 中插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，表明構(gòu)建的重組載體正確，記作PMD 19-Τ-ΡΒΡ2χο用限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI酶切PMD19_T_PBPh，回收2250bp左右的目的基因片段；用限制性內(nèi)切酶NdeI和B10I酶切pED8b，回收載體大片段；將目的基因片段和載體大片段用T4 DNA Ligase連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，通過抗性篩選陽性單克隆， 將陽性單克隆進行液體培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，進行測序和分別作NdeI單酶切、XhoI單酶切以及 NdeI+XhoI雙酶切鑒定。結(jié)果在pET28b的NdeI和XhoI酶切位點間(沿著從NdeI至XhoI 的方向)插入的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :2所示，其編碼的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0:1所示(記作青霉素結(jié)合蛋白PBP2x)。表明重組載體中基因插入方向和序列均正確， 將陽性重組載體記作重組表達載體pET28b-PBPh。酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，單酶切大小在7300bp左右，雙酶切有2300bp左右和5000bp左右的條帶，說明目的基因已經(jīng)正確連接入pET28b。圖2中，泳道1 :NdeI單酶切；泳道2 =XhoI單酶切；泳道3 =NdeI/XhoI雙酶切； 泳道 4 :Marker。構(gòu)建好的重組表達載體pET28b_PBPh轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，卡那霉素抗性篩選，獲得陽性單克??；將獲得的陽性單克隆接種于含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，測序，結(jié)果表明提取的質(zhì)粒正確，表明構(gòu)建的重組菌正確，記作重組菌 BL21-pET28b-PBPh。同時以轉(zhuǎn)入pET28b的大腸桿菌BL21 (DE3)為對照菌，記作重組菌BL21_pEI^8b。實施例2、蛋白的制備與純化一、蛋白的制備將重組菌BL21-pEI^8b-PBPh接種至含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基中， 250rpm 37°C振搖，過夜培養(yǎng)(1 )，得到種子液；取ImL種子液接種于IOOmL含卡那霉素 30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基，250rpm 37°C振搖，至培養(yǎng)體系的A_為0. 6時，先取出ImL菌液，作為未誘導對照，其余菌液加入IPTG至終濃度ImM，200pm 30°C搖菌，從誘導第3個小時開始(加入IPTG時記作第O小時)，每小時取出ImL菌液，誘導時間分別為!3h、4h、 5h、6h、7h、8h以及過夜(12h)；將收集的菌液在4°C下IOOOOrpm離心5min，收集菌體；用 Tris-HCLdOmM Tris ρΗ7. 0)重懸菌體，200W功率冰浴超聲(超聲10s，停IOs)破碎菌體至懸液變澄清，再4°C、12000 Xg離心20min，收集上清液，即為青霉素結(jié)合蛋白提取液。將培養(yǎng)容器內(nèi)的所有物質(zhì)記作菌液。含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基的制備向LB液體培養(yǎng)基中添加卡那霉素， 使卡那霉素在LB液體培養(yǎng)基中的濃度為30ug/mL，得到的混合溶液為含卡那霉素30ug/mL的LB液體培養(yǎng)基。LB液體培養(yǎng)基組成由酵母提取物、蛋白胨、NaCl和水組成，溶液中各成分的濃度為酵母提取物0.5% (質(zhì)量百分含量)，蛋白胨(質(zhì)量百分含量)，NaCl 1% (質(zhì)量百分含量)。二、蛋白的純化青霉素結(jié)合蛋白純化利用表達載體上帶有的組氨酸標簽(His-tag)標記通過鎳離子親和層析純化青霉素結(jié)合蛋白。先用10倍柱體積的binding buffer平衡His· Bind Columns，取上述青霉素結(jié)合蛋白提取液，然后用5倍柱體積的wash buffer洗脫雜蛋白，最后用10倍柱體積的elution buffer洗脫目標蛋白，收集洗脫液，透析，得到純化的青霉素
結(jié)合蛋白ο同時以重組菌BL21_pEI^8b的表達產(chǎn)物為對照。binding buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 IOmmol 咪唑用水溶解，用 HCL 調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升binding buffer。wash buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol NaCl 和 20mmol 咪唑用水溶解，用 HCL調(diào) PH 值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升wash buffer。elution buffer 將 20mmol Tris、0. 5mol Nacl 和 500mmol 咪唑用水溶解，用 HCL 調(diào)PH值至8. 0，再用水定容至1L，得到1升elution buffer。三、蛋白驗證1、將純化前后產(chǎn)物及IPTG誘導前后產(chǎn)物進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果如圖3和圖4 所示。圖3為重組菌BL21-pEI^8b_PBPh的結(jié)果，泳道1 未誘導對照組；泳道2 8 分別為重組菌株經(jīng)3、4、5、6、7、8小時以及過夜誘導后蛋白表達圖；泳道9 =Marker0圖4為重組菌BL21-pEI^8b_PBPh的結(jié)果，泳道1 :Marker ；泳道2 未誘導的未純化的重組菌株全蛋白；泳道3 誘導但未純化的重組菌株全蛋白；泳道4 誘導且純化后的蛋白。結(jié)果顯示，在IPTG誘導下，經(jīng)IPTG誘導的重組菌BL21-pEI^8b-PBPh中含有80kD 左右有明顯的條帶，與目的蛋白的預(yù)期大小一致，PBPh蛋白表達成功。而未經(jīng)IPTG誘導的重組菌BL21-pEI^8b-PBPh中不含有目的條帶。無論誘導與否，重組菌BL21-pED8b的表達產(chǎn)物中不含目的條帶。2、蛋白驗證 Western blot 收集上述制備過程中各階段產(chǎn)物，進行10% SDS-PAGE電泳；將電泳條帶印跡到NC 膜上，再依次與His-tag單克隆抗體以及HRP標記的羊抗鼠抗體雜交，DAB顯色。結(jié)果如圖5所示。圖5中，泳道1 :Marker ；泳道2 未誘導的未純化的重組菌 BL21-pEI^8b-PBPh全蛋白；泳道3 誘導但未純化的重組菌BL21-pEI^8b_PBPh全蛋白； 泳道4 重組菌BL21-pEI^8b-PBPh的誘導且純化后的蛋白。結(jié)果表明重組菌BL21-pEI^8b_PBPh表達得到的蛋白分子量為80kD左右，與預(yù)期的蛋白分子量一致。重組菌BL21-pED8b的表達產(chǎn)物中未含有目的蛋白。實施例3、檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素的試劑盒一、試劑盒由下述物質(zhì)組成
1、包被青霉素結(jié)合蛋白的酶標板實施例2中制備純化的青霉素結(jié)合蛋白，用包被緩沖液配置成lug/mL ；每孔100uL。2、酶標物工作液HRP標記的氨芐西林工作液，其工作濃度lug/mL，用樣品稀釋液稀釋HRP標記的氨芐西林得到。3、β-內(nèi)酰胺類抗生素標準品標準品為青霉素G凍干粉，青霉素G購自美國 Sigma-Aldrich公司；產(chǎn)品目錄號為46616 ；將青霉素G用樣品稀釋液溶解，得到如下不同濃度的標準品溶液8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/L、0. 1 μ g/L。4、底物顯色液由A液和B液組成，A液為2% (質(zhì)量百分含量)過氧化脲的水溶液，B液為(質(zhì)量百分含量)四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；5、終止液0. 2M硫酸水溶液；6、洗滌液每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將0. 5ml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, PH值為7.4;7、樣品稀釋液0. lmol/L的磷酸鹽緩沖液，pH值為7. 2。8、包被緩沖液0. 05mol/L的碳酸鈉的水溶液、pH9. 6。9、封閉液每1升封閉液按照如下方法配制將50mgBSA、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為 0. 02M, pH 值為 7. 2。0. 01M、pH值為7. 4的PBS緩沖液的配制每1升磷酸鹽緩沖液(PBS)按照如下方法制備將8g NaCl,0. 2g KCl,3. 53g Na2HPO4. 12H20、0. 24g KH2PO4和去離子水混合，用去離子水定容至1升。如此得到的磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, pH值為7. 4。0. 1Μ、ρΗ值為7. 2的PBS緩沖液的配制先分別配置0. lmol/L Na2HPO4溶液(稱取 Na2HPO4. 12H20 35. 8g，加去離子水至 1000m L)和 0. lmol/L NaH2PO4溶液(稱取NaH2PO4. 2H20 15. 6g，加去離子水至 1000m L)；取 0. lmol/L Na2HPO4 溶液 72m L 和 0. ImoVLNaH2PO4 溶液 28m L，加入8. 5g NaCL，混合均勻。0. 02M、pH值為7. 2的PBS緩沖液的配制取0. 1Μ、ρΗ值為7. 2的PBS緩沖液200mL， 加入去離子水800mL，混勻即得。0. 05mol/L、pH 值為 9. 6 的碳酸鈉的水溶液的配制=Na2CO3L 59g，NaHC032. 93g，加去離子水定容至1升。二、試劑盒的制備(一 )包被有青霉素結(jié)合蛋白的酶標板及其制備包被有青霉素結(jié)合蛋白的聚苯乙烯酶標板用包被緩沖液將青霉素結(jié)合蛋白稀釋至1. 0μ g/mL，包被96孔聚苯乙烯酶標板，每孔100 μ L，4°C過夜，甩干孔中液體，用洗滌液 (20倍稀釋后)洗滌1次，拍干，然后在每孔中加入200 μ L封閉液，37°C溫育2h，傾去孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。(二)標準品的制備將青霉素G標準品用凍存液(含5% BSA的0. OlM PBS, pH 7. 4)配制成濃度為 8. 1 μ g/L，每凍干瓶分裝lmL，置于凍干機中凍干，密封后4°C保存。(三)酶標物的制備
用EDC法將半抗原氨芐西林偶聯(lián)于HRP上。a.取 50mg 氨節(jié)西林，溶于 5mL PBS (0. 05mol/L, ρΗ7· 0)溶液中；b.加入 40mg EDC，4°C攪拌反應(yīng) Ih ；c.取 IOOmg 的 HRP 以及 IOmg EDC 溶于 IOmLPBS (0. 05mol/L，pH7. 0)溶液中，與上
述溶液混合，4°C攪拌反應(yīng)48h ；d.裝入透析袋，PBS (0. 05mol/L,pH7. 0)透析，得到氨芐西林與HRP的偶聯(lián)物，即為酶標物。0. 05M、pH值為7. 0的PBS緩沖液的配制先分別配置0. 05mol/L Na2HPO4溶液 (稱取 Na2HPO4. Iffl2O 17. 9g,加去離子水至 1000m L)和 0. 05mol/L KH2PO4 溶液(稱取 KH2PO4. 2H20 8. 6g，加去離子水至 1000m L)；取 0. 05mol/L Na2HPO4 溶液 60m L 和 0. 05mol/ LKH2PO4溶液40m L，加入8. 5g NaCL,混合均勻。三、試劑盒檢測方法1、標準曲線的制作向包被有青霉素結(jié)合蛋白的酶標板微孔中加入不同濃度的青霉素G標準品溶液 50 μ L，再加入酶標物工作液50 μ L，用蓋板膜封板，37°C恒溫箱中反應(yīng)30min，甩干孔中液體，每孔加入350 μ L洗滌液，30s后倒出孔中液體，如此重復(fù)操作共洗板4次，用吸水紙拍干。每孔加入底物顯色液，輕輕振蕩混勻，37°C恒溫箱避光顯色lOmin，每孔加入終止液 50 μ L，輕輕振蕩混勻，用酶標儀，測定每孔吸光度值。用每個濃度的標準品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(O標準) 的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。以標準品濃度(yg/L)的半對數(shù)值為 X軸，百分吸光度值為Y軸，繪制標準曲線圖。得到的標準曲線如圖6所示。該標準曲線的函數(shù)關(guān)系式為 y = -18. 95Ln(x)+43. 087，R2 = 0. 9918.百分吸光度值(%) = (B/B0) X100%2、樣品中內(nèi)酰胺類抗生素濃度的測定方法與標準曲線的制備中基本相同，不同的是用待測樣本溶液代替標準品溶液。 測定每孔吸光度值。用每個檢測樣本溶液的吸光度平均值(B)除以第一個標準品溶液(O 標準)的吸光度值(Btl)再乘以100%，得到百分吸光度值。將百分吸光度值代入標準曲線的函數(shù)關(guān)系式，即得到樣本溶液中內(nèi)酰胺類抗生素的殘留量。3、檢測樣品的前處理方法檢測樣本為牛奶、奶粉牛奶用樣品稀釋液按1 4稀釋后4°C IOOOOrpm離心，取 50μ L上清液用于檢測。稱取Ig奶粉，溶于5mL樣品稀釋液中，混合均勻，取50μ L用于檢測。檢測樣本為尿液直接取50 μ L尿液用于檢測。檢測樣本為肌肉、魚、蝦及蛋類稱取5g均質(zhì)樣品，加入IOmL乙腈水溶液(Vill V 水=9 1)，上下顛倒震蕩10min，5000rpm離心lOmin，取上清，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液重懸，取50 μ L用于檢測。檢測樣本為蜂蜜稱取5g樣品，加入15mL去離子水，于渦旋儀上充分混合lmin， 過Oasis固相萃取柱后(利用離子交換，將目標物富集和純化)，先用5mL去離子水洗柱，負壓下抽干，再用3mL甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液重懸，取50 μ L用于檢測。四、試劑盒的準確度(一)準確度試驗向不含內(nèi)酰胺類抗生素的樣品中添加青霉素G標準品，使青霉素G標準品在樣品中的終濃度分別為4μ g/L、8y g/L ；將添加后的樣品分別按照實驗三中所述方法進行前處理，得到檢測樣本溶液。從三個不同批次的試劑盒中各抽取3個試劑盒進行檢測，每個實驗重復(fù)5次，分別計算變異系數(shù)。結(jié)果分別見表1。回收率的計算方法RG =測定值與真實值的比值X 100% ；變異系數(shù)的計算方法CV=(各平行樣本的標準差與各平行樣本平均值的比 it) X 100% ；批內(nèi)變異系數(shù)的計算方法批內(nèi)CV =同一次測定中各平行樣本的變異系數(shù)的平均值。批間變異系數(shù)的計算方法批間CV =同一樣本在不同批次測定結(jié)果的變異系數(shù)， 取其平均值。結(jié)果表明所有樣品的添加回收率在72. 2% 97. 5%，批內(nèi)變異系數(shù)在6. 4% 9.9%，批間變異系數(shù)在9. 8% 13. 0%。表1、青霉素G準確度的測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.一種用于檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的受體試劑盒，包括SEQ ID NO :1所示蛋白、酶標記的氨芐西林和標準品溶液，所述標準品為青霉素G。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的受體試劑盒，其特征在于所述受體試劑盒還包括底物顯色液、終止液、洗滌液、樣品稀釋液、包被緩沖液和封閉液；底物顯色液由A液和B液組成，A液為2% (質(zhì)量百分含量)過氧化脲的水溶液，B液為(質(zhì)量百分含量)四甲基聯(lián)苯胺的水溶液；終止液為0. 2Μ的硫酸水溶液；每1升所述洗滌液是按照如下方法配制得到的將0. 5ml吐溫20、5g疊氮化鈉和990ml 磷酸鹽緩沖液混合，得到所述洗滌液；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 01M, pH值為7. 4 ；樣品稀釋液0. lmol/L、pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液；每1升包被緩沖液按照如下方法制備將Na2CO3L 59g和NaHC032. 93g溶于1升水中， 用水定容至1升，得到所述包被緩沖液；每1升封閉液按照如下方法配制將50mgBSA、lg疊氮化鈉、30g酪蛋白混合，用磷酸鹽緩沖液溶解并定容至1000ml，得到封閉液；其中，磷酸鹽緩沖液的濃度為0. 02M, pH值為 7. 2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的受體試劑盒，其特征在于所述酶標記的氨芐西林為HRP 標記的氨芐西林；所述標準品溶液為青霉素G濃度如下的溶液8. 1 μ g/L、2. 7 μ g/L、0. 9 μ g/L、0. 3 μ g/ L、0.1 μ g/L0
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的受體試劑盒，其特征在于所述內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素 III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、 頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。
5.一種檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的膠體金試紙，包括樣品吸收墊、膠體金墊、反應(yīng)膜和吸水墊，其依次連接；所述膠體金墊包被有膠體金標記的帶有HIS標簽的SEQ IDNO 1所示蛋白；所述反應(yīng)膜上含有檢測帶和質(zhì)控帶，檢測帶位置包被有阿莫西林與載體蛋白的偶聯(lián)物，質(zhì)控帶位置包被有鼠抗HIS標簽單克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的膠體金試紙，其特征在于所述β-內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的膠體金試紙，其特征在于所述載體蛋白為OVA。
8.—種檢測樣品中內(nèi)酰胺類抗生素的方法，為如下I或II所示I、檢測樣品中內(nèi)酰胺類抗生素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求1-4中任一所述受體試劑盒對所述待測樣本溶液進行檢測；所述待測樣品為牛奶將牛奶用樣品稀釋液按1 4稀釋，4°C、IOOOOrpm離心，取上清液，作為待測樣本溶液；所述待測樣品為奶粉稱取Ig奶粉，溶于5mL樣品稀釋液中，混合均勻，作為待測樣本溶液。所述待測樣品為尿液將尿液直接作為待測樣本溶液；所述待測樣品為肌肉、魚、蝦或蛋將待測樣品勻漿處理，得到均質(zhì)樣品，將每5g均質(zhì)樣品加入IOmL乙腈水溶液中，上下顛倒震蕩lOmin，5000rpm離心lOmin，取上清，氮氣吹干， 用ImL樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣本溶液；乙腈水溶液中乙腈和水的體積比為 9 1 ；所述待測樣品為蜂蜜將每5g待測樣品加入15mL去離子水中，混合；將所述混合溶液用Oasis固相萃取柱進行純化，用甲醇洗脫，收集洗脫液，氮氣吹干，用ImL樣品稀釋液重懸，得到的溶液即為待測樣本溶液。II、檢測樣品中內(nèi)酰胺類抗生素的方法包括如下步驟1)將待測樣品進行前處理，得到待測樣本溶液；2)用權(quán)利要求5-7中任一所述所述膠體金試紙對所述待測樣本溶液進行檢測；所述樣品稀釋液為0. lmol/L、pH值為7. 2的磷酸鹽緩沖液。
9.SEQ ID NO :1所示蛋白在檢測β -內(nèi)酰胺類抗生素中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其特征在于所述β-內(nèi)酰胺類抗生素為如下中的至少一種青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、苯唑西林、鄰氯西林、新青霉素III、雙氯西林、羧芐西林、甲氧西林、頭孢氨芐、頭孢唑啉、頭孢哌酮、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢噻吩、頭孢羥氨芐、頭孢噻呋、頭孢喹肟。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種基于青霉素結(jié)合蛋白的檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的方法及專用試劑盒和試紙條。本發(fā)明的用于檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素的受體試劑盒，包括SEQ IDNO1所示蛋白、酶標記的氨芐西林和標準品溶液，所述標準品為青霉素G。本發(fā)明試劑盒和膠體金試紙卡具有靈敏度高、準確度高、精密度高、成本低、操作簡單、檢測時間短、適合各種單位使用、儲存簡單、保質(zhì)期長的優(yōu)點；能同時快速檢測大批量樣品，可實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測。因此，本發(fā)明的試劑盒、膠體金試紙及檢測方法在β-內(nèi)酰胺類抗生素的檢測中將發(fā)揮重大作用。
文檔編號G01N33/577GK102253216SQ20111005752
公開日2011年11月23日 申請日期2011年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月10日
發(fā)明者吳小平, 徐飛, 李向梅, 李艷偉, 楊麗麗, 江海洋, 沈建忠, 王戰(zhàn)輝, 趙寧 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學, 北京維德維康生物技術(shù)有限公司