專利名稱：蠶絲蛋白納米微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于納米技術(shù)、高分子化學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)、醫(yī)藥學(xué)、生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種天然生物大分子—蠶絲蛋白納米微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
蠶絲是人類最早利用的天然蛋白之一，是一種由絲蛋白(70～80％)和絲膠組成的蛋白質(zhì)纖維，作為性能優(yōu)良的天然纖維一直用于紡織行業(yè)。近年來，隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的迅速發(fā)展，絲蛋白由于其良好的生物相容性、無抗原性、易降解性等特性，已廣泛應(yīng)用于保健品、醫(yī)藥、生物技術(shù)、精細化工等諸多領(lǐng)域，如醫(yī)用縫合線、組織工程、醫(yī)用敷料、智能水凝膠、載藥緩釋膜以及生物傳感器等。本發(fā)明人曾用絲蛋白溶液和脲酶、葡萄糖氧化酶混合制備靈敏度很高的酶電極。
納米生物技術(shù)是國際生物技術(shù)領(lǐng)域的前沿和熱點問題，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用和明確的產(chǎn)業(yè)化前景，特別是納米藥物載體、納米生物傳感器和成像技術(shù)以及微型智能化醫(yī)療器械等，將在疾病的診斷、治療和衛(wèi)生保健方面發(fā)揮重要作用。近年來納米生物技術(shù)取得了重大進展，納米微粒作為基因、抗癌藥、蛋白質(zhì)以及多肽藥物和抗生素等載體，在生物醫(yī)藥界引起了廣泛的興趣與重視。載藥納米微粒作為一種藥物緩釋和控釋的新劑型在藥物輸送方面具有許多優(yōu)越的性能，藥物納米載體具有高度靶向、藥物控制釋放、提高難溶藥物的溶解率和吸收率等優(yōu)點，還可提高藥物療效和降低毒副作用，提高藥物的生物利用度，還可提高藥物的穩(wěn)定，建立新的給藥途徑，為蛋白質(zhì)或多肽類藥物口服提供了可能。
目前，納米藥物載體，主要為天然或人工合成的可降解高分子為基質(zhì)。常用的天然生物高分子有白蛋白、明膠、海藻酸鈉、殼聚糖等；人工合成的高分子材料有聚酯、聚酸酐、聚氨酯等，如聚丙交脂(PLA)、聚己交脂(PGA)、聚己內(nèi)脂(PCL)、PMMA、聚苯乙烯(PS)、纖維素-聚乙烯、聚羥基丙酸脂等。
由于合成高分子材料中痕量的引發(fā)劑和有毒有機物以及其它雜質(zhì)的殘留問題在生物安全要求日益嚴(yán)格的今天越來越成為了一個有待爭議的問題。近年來，天然生物高分子材料由于其獨特的生物相容性而頗受人們的關(guān)注。特別是海藻酸鈉、殼聚糖、白蛋白等已部分進入臨床試驗研究。
蠶絲蛋白由十八種氨基酸組成，可以通過外界或集體本身的作用，將絲蛋白降解為有益人體健康的小分子多肽甚至游離氨基酸，進而被機體組織完全吸收或排除。
目前，蠶絲蛋白用于藥物釋放載體的研究剛剛起步，劑型比較單一，主要為膜和水凝膠的形式。由于絲蛋白溶液在外界擾動等外界影響下很容易變性，用常規(guī)的方法很難得到微?；蚣{米微粒，這大大的限制了他的應(yīng)用范圍。目前廣泛研究幾類天然高分子納米微粒均或多或少存在諸如抗原性、引發(fā)劑殘留、表面活性劑殘留以及需加交聯(lián)劑等一系列問題，對人體存在潛在的威脅。
基于以上的情況，本發(fā)明用蛋白質(zhì)易變性的特點，在特定條件下誘導(dǎo)蛋白質(zhì)自組裝形成納米微球，從根本上徹底解決了以上問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種全新的蛋白質(zhì)納米微球及其制備方法。
本發(fā)明提出的制備納米微球的方法，是一種蠶絲蛋白自組裝的方法，具體以再生絲蛋白為原料，用甲醇等有機溶劑作變性劑誘導(dǎo)蛋白質(zhì)變性，然后冷凍-解凍后得乳白色乳液；對乳液進行離心處理，去除上清液，再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥，即得到納米微球。
上述方法中，所用的絲蛋白由工業(yè)廢蠶絲，經(jīng)脫膠、中性鹽溶解后透析制備獲得，濃度為0.1～10％。
上述方法中，添加的變性劑為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、乙二醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、丙酮等之一種或幾種。變性劑的用量為絲蛋白溶液體積的0.01～10倍。
上述方法中，冷凍溫度為-80～0℃，時間為12～96小時。解凍可以在室溫下解凍。
上述方法的操作步驟如下將廢蠶絲用0.1～3.0％的NaHCO3或NaCO3溶液，或0.1～1.0mol/l的硼酸-硼砂緩沖溶液，在90～100℃的溫度下處理20～90分鐘，然后用去離子水漂洗干凈；按需要重復(fù)1～5次以完全脫除絲膠；65～40℃下干燥20～30小時，接著將脫膠干燥后的絲蛋白用中性鹽(如7～10mol/L的BrLi溶液)或CaCl2-H2O-C2H5OH三元體系恒溫25～90℃攪拌下溶解，溶液灌入通量為10,000～1,4000的纖維素透析袋中，用去離子水透析60-80小時，制備的絲蛋白調(diào)配成濃度為0.1～10.0％的溶液。
取5ml絲蛋白溶液，在20-30℃低速攪拌下滴加0.1～20ml變性劑，放入變溫冰箱冷凍12～96小時。取出結(jié)冰的絲蛋白溶液室溫下解凍之后即得到白色乳液，乳液經(jīng)10000-15000G高速離心5～30min，去除上層清液再放入真空干燥機干燥或低溫冷凍干燥即得到絲蛋白納米微粒。
上述方法制備的絲蛋白納米微球具有很好的單分散性和外形規(guī)整性，用掃描電子顯微鏡和光散射檢測如附

圖1、2所示。其粒徑為80-2000nm，單分散指數(shù)為0.04-0.36。制備時可以通過調(diào)節(jié)絲蛋白濃度、變性劑添加量、冷凍時間、冷凍溫度等參數(shù)控制粒徑大小。產(chǎn)物穩(wěn)定性、再分散性良好。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，采用本發(fā)明的的有益效果如下本發(fā)明的技術(shù)方案比已有的技術(shù)有顯著的進步和創(chuàng)新本發(fā)明利用變性劑誘導(dǎo)絲蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)變后在低溫下自組裝制得單分散性好的球形納米微粒，整個工藝工程無需添加任何引發(fā)劑、表面活性劑、交聯(lián)劑和有毒有機溶劑，具有更高的生物安全性。此外，絲蛋白是一種弱的兩性聚電解質(zhì)，pI為3.9～4.2，具有潛在的pH敏感性，可以在不同的pH條件下控制釋放。同時絲蛋白是一種純天然生物大分子，在體內(nèi)可完全降解，是作為藥物載體的理想材料。本發(fā)明的工藝過程簡單，成本低廉，因此，本發(fā)明在生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價值。
具體實施例方式
以下利用實施例進一步詳細說明本發(fā)明。
實施例1將20g左右廢蠶絲浸入1L 0.5％NaHCO3溶液中，攪拌煮沸45min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲5g溶解于100ml濃度為9.6mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為4.32％的絲蛋白水溶液。
取上述絲蛋白溶液5ml，25℃恒溫水浴下滴加1ml甲醇，穩(wěn)定5min后放入低溫冰箱-5℃下冷凍96h。絲蛋白冷凍96h后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成牛奶狀乳白色乳液，乳液經(jīng)1,2000G高速離心10min，去除上層清液再真空干燥即得到粒徑335.8nm、多分散指數(shù)PI為0.332的絲蛋白納米微粒。
實施例2將15g左右廢蠶絲浸入1L 0.5％Na2CO3溶液中，攪拌煮沸50min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作兩次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲5g溶解于100ml濃度為10.0mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為3％的絲蛋白水溶液，再通過稀釋，調(diào)節(jié)絲蛋白溶液濃度為1.5％。
取上述絲蛋白溶液10ml，25℃恒溫水浴下滴加3ml丙酮，穩(wěn)定5min后放入低溫冰箱-20℃下冷凍48h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成牛奶狀乳白色乳液，乳液經(jīng)1,2000G高速離心10min，去除上層清液再真空干燥即得到粒徑270.3nm、多分散指數(shù)PI為0.04的絲蛋白納米微粒。
實施例3將20g左右廢蠶絲浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液溶液中，攪拌煮沸60min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲4g溶解于100ml濃度為10.0mol/L的BrLi溶液中，45℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為2.0％的絲蛋白水溶液。
取上述絲蛋白溶液10ml，25℃恒溫水浴下滴加5ml乙醇，穩(wěn)定5min后放入低溫冰箱-40℃下冷凍36h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成牛奶狀乳白色乳液，乳液經(jīng)1,2000G高速離心25min，去除上層清液再真空干燥即得到粒徑276.1nm、多分散指數(shù)PI為0.16的絲蛋白納米微粒。
實施例4將20g左右廢蠶絲浸入2L 0.5mol/L的硼酸-硼砂緩沖溶液溶液中，攪拌煮沸60min后取出，用去離子水洗滌干凈。重復(fù)以上操作一次后將蠶絲65℃下烘干備用。
稱取上述處理后的脫膠蠶絲10g溶解于100ml濃度為CaCl2-H2O-C2H5OH三元溶液中，80℃下恒溫低速磁力攪拌下溶解。將此蛋白質(zhì)溶液灌入纖維素透析袋中，用去離子水透析三天，得到濃度為5.0％的絲蛋白水溶液。
取上述絲蛋白溶液5ml，25℃恒溫水浴下滴加3.0ml丙醇，穩(wěn)定5min后放入低溫冰箱-80℃下冷凍36h。絲蛋白冷凍后形成乳白色冰塊，室溫下解凍形成牛奶狀乳白色乳液，乳液經(jīng)1,5000G高速離心30min，去除上層清液再真空干燥即得到粒徑667.5nm、多分散指數(shù)PI為0.356的絲蛋白納米微粒。
權(quán)利要求
1.一種蠶絲蛋白納米微球，其特征在于粒徑為80～2000nm，單分散指數(shù)為0.04～0.36。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蠶絲蛋白納米微球，其特征在于粒徑為100～1000nm。
3.一種如權(quán)利要求1所述的蠶絲蛋白納米微球的制備方法，其特征在于絲蛋白溶液和有機溶劑混合，經(jīng)冷凍-解凍后獲得白色乳液；乳液經(jīng)離心除去上層清液后再經(jīng)真空干燥或冷凍干燥得到絲白色納米微球。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于絲蛋白的濃度為0.1～10％。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于有機溶劑為甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丙三醇、丁醇、異丁醇、叔丁醇、乙二醇、丙酮之一種或幾種。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于有機溶劑加入的體積為蠶絲蛋白溶液體積的0.01～10倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于冷凍溫度為-80～0℃，冷凍時間為12～96小時。
全文摘要
本發(fā)明屬于一種全新的納米微球及其制備方法。制備過程運用生物納米技術(shù)，使蠶絲蛋白質(zhì)在適當(dāng)條件下發(fā)生自組裝形成納米微球，整個制備過程中無需加入任何引發(fā)劑、表面活性劑、交聯(lián)劑等，從而徹底解決了現(xiàn)有傳統(tǒng)載藥納米微球制備方法引入上述物質(zhì)對人體存在潛在威脅的問題。本發(fā)明制備工藝簡單易行，可以制備粒徑80～2000nm的單分散納米微球，制備的納米微球穩(wěn)定性和再分散性好，可長時間穩(wěn)定保存。
文檔編號C08H1/00GK1560115SQ20041001685
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月10日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月10日
發(fā)明者邵正中, 曹正兵, 陳新 申請人:復(fù)旦大學(xué)