專利名稱:新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生產(chǎn)方法
本發(fā)明涉及一種新的α-1，6-葡萄糖苷酶及其生產(chǎn)方法，尤其涉及一種新的芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)，該菌能在最適pH5.0至5.5、最適溫度55℃條件下經(jīng)培養(yǎng)產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶，另外還涉及一個(gè)生產(chǎn)上述新的α-1，6-葡萄糖苷酶的生產(chǎn)過(guò)程，其中包括培養(yǎng)上述菌種并收集α-1，6-葡萄糖苷酶。
α-1，6-葡萄糖苷酶具有對(duì)淀粉類中的α-1，6-葡萄糖苷鍵發(fā)生作用以產(chǎn)生直鏈淀粉的能力，并且廣泛用于制糖工業(yè)，生產(chǎn)麥芽糖、葡萄糖和高果糖玉米糖漿(HFCS)。
α-1，6-葡萄糖苷酶長(zhǎng)期以來(lái)發(fā)現(xiàn)于高等植物和微生物酵母體中，但近期有報(bào)道許多細(xì)菌可以產(chǎn)生這種酶，例如產(chǎn)氣桿菌(Aerobactor aerogenes)，中間埃希氏菌(Escherichia intermedia)，假單孢菌(Pseudomonas amyloderamosa)，緩癥鏈球菌(Sterptococcus mites)，噬纖維菌(Cytophage)，鏈霉菌屬(Sterptomyces)和α-葉紅呋喃菌屬(Flavochromogenes)等。
另外，在產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌種中，已知的種類有蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)(IFO 300)，芽孢桿菌(Bacillus fermus)(IFO 300)，芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)等。
大多數(shù)已知的α-1，6-葡萄糖苷酶具有中性或弱堿性的最適pH值，不適于在糖化工業(yè)中使用，工業(yè)上的糖化作用一般在酸性條件下進(jìn)行。
已知由假單孢菌(Pseudomonus amyloderamora)，芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)等產(chǎn)生的α-1，6-葡萄糖苷酶具有酸性最適pH值，但是由于抗溫性差，前者是不能實(shí)際使用的;同時(shí)后者菌體培養(yǎng)時(shí)間需長(zhǎng)達(dá)60～70小時(shí)，所以是不經(jīng)濟(jì)的。
因此，本發(fā)明人試圖尋找具備抗溫性、酸性的最適pH值和高的α-1，6-葡萄糖苷酶產(chǎn)量的微生物。
在發(fā)現(xiàn)一種新的芽孢桿菌的基礎(chǔ)上，本發(fā)明人完成了本發(fā)明。這是一由本發(fā)明人新近在土壤微生物中發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌(Bacillus)，它經(jīng)過(guò)10～15小時(shí)短時(shí)間的培養(yǎng)再收集其產(chǎn)物能夠得到大量的α-1，6-葡萄糖苷酶。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種生產(chǎn)α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，其中包括培養(yǎng)能產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)使其在培養(yǎng)條件下產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶，然后收集所述的α-1，6-葡萄糖苷酶，它具有如下酶化學(xué)性質(zhì)(1)反應(yīng)該酶對(duì)α-1，6-葡萄糖苷酶鍵起作用并產(chǎn)生線性淀粉;
(2)底物專一性該酶對(duì)多糖具有下列相對(duì)活性多糖 相對(duì)活性(%)支鏈淀粉 100可溶性玉米淀粉 13可溶性淀粉 6.7牡蠣糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米淀粉 3.8馬玲薯淀粉 4.0(3)米氏常數(shù)值(Km)和對(duì)支鏈淀粉的Vmax∶該酶的Km值為0.14mg/ml，Vmax值為70.0μmol/min/mg蛋白質(zhì);
(4)最適pH5.0～5.5(5)pH穩(wěn)定性該酶在pH范圍4.5～6.0、溫度40℃條件下可穩(wěn)定30分鐘;在pH值5.0～6.0，溫度50℃也可穩(wěn)定30分鐘;
(6)最適溫度約5.5℃;
(7)熱穩(wěn)定性該酶在pH值為4.5條件下，分別以不同溫度處置30分鐘所得結(jié)果表明在40℃時(shí)，該酶仍保留其初始活性的80%;60℃時(shí)活性則為10%;
(8)抑制劑的影響作用對(duì)氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸鈉至少可抑制該酶活性的70%，但不受鄰-菲咯啉或氰鐵酸鉀的抑制;
(9)金屬鹽類的影響作用該酶幾乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+或Mn2+的影響，受Fe3+的抑制，并且Hg2+和Ag2+可使其失活;還有(10)分子量約95，500(用SDS電泳法測(cè)得)。
圖1至5顯示本發(fā)明的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化學(xué)性質(zhì)，圖1中的曲線圖顯示最適pH值，圖2中的曲線圖顯示在40℃(○)和50℃(·)時(shí)的穩(wěn)定pH范圍，圖3中的曲線圖顯示最適溫度值，圖4中的曲線圖顯示熱穩(wěn)定值，圖5中的曲線圖在55℃(○)、60℃(□)和65℃(·)及在不同pH條件下酶的穩(wěn)定性。
用于本發(fā)明的α-1，6-葡萄糖苷酶生產(chǎn)菌是一個(gè)新的菌種，被本發(fā)明人命名為(Bacillus sectorramus)芽孢桿菌。該菌種于1987年9月4日保存號(hào)FERM BP-1471(原始保存號(hào)碼FERM P-8973，貯存于1986年9月22日)貯存于日本工業(yè)學(xué)技術(shù)暑發(fā)酵研究所(of 1-3，Higashi 1-chome，Yatabemachi，Tsukuba-gun，Ibaraki 305，Japan)，貯存條件符合“以專利程序?yàn)槟康牡奈⑸镔A存國(guó)際認(rèn)可布達(dá)佩斯公約”，該菌種在下文中將命以“主題菌種”(Subject strain)。
主題菌種具有下列細(xì)菌學(xué)特性A.形態(tài)(1)細(xì)胞形狀 桿狀(2)細(xì)胞大小 1.0～1.3×1.5～5.2μ(3)遷移率 無(wú)(4)孢子 呈現(xiàn)(5)革蘭氏染色 陽(yáng)性(6)耐酸反應(yīng) 陰性B.在不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)(1)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂板培養(yǎng)基菌落為環(huán)形并具整齊外緣。表面平滑為半透明灰白色。
(2)標(biāo)準(zhǔn)瓊脂斜面培養(yǎng)基沿培養(yǎng)基直著生長(zhǎng)并具平滑的表面、奶黃色具光澤，生長(zhǎng)適中。
(3)標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基輕微混濁并具粉狀沉淀物。無(wú)色素形成。
(4)標(biāo)準(zhǔn)明膠穿刺培養(yǎng)基直的并無(wú)液化作用。
(5)石蕊牛乳無(wú)變化。
C.生理學(xué)特性(1)硝酸鹽還原作用 陽(yáng)性(2)脫氮作用 陽(yáng)性(3)甲基紅試驗(yàn) 陽(yáng)性(4)乙酰甲基甲醇的形成 陰性
(5)吲哚的形成 陰性(6)硫化氫的形成 陰性(7)淀粉的水解 陽(yáng)性(8)檸檬酸的同化 陽(yáng)性(9)無(wú)機(jī)氮源的同化(硝酸鹽和銨鹽) 陽(yáng)性(10)色素的形成 陰性(11)脲酶活性 陰性(12)氧化酶活性 陰性(13)過(guò)氧化氫酶活性 陽(yáng)性(14)生長(zhǎng)范圍pH值 4.0～7.1溫度 45.5～15.0℃(15)對(duì)氧的行為 厭氣性(16)二氧化丙酮的形成 陰性(17)馬尿酸的分解 陰性(18)精氨酸的分解 陰性(19)苯丙酸的脫氨基作用 陰性(20)溫度抗性(85℃，10分鐘) 陽(yáng)性(21)氯化鈉抗性 7% 陰性3.5% 陽(yáng)性(22)在Sabouraud氏瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 陽(yáng)性(23)在0.001%溶菌酶培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 陽(yáng)性(24)酪氨酸的分解 陽(yáng)性(25)在檸檬酸胺瓊脂培養(yǎng)基中的堿性生成作用 陽(yáng)性(26)酪蛋白的分解 陰性(27)明膠的分解 陰性
(28)在厭氣性培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 陽(yáng)性(29)在Mc Conkey氏培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 陰性(30)卵磷脂酶反應(yīng) 陰性(31)在VP培養(yǎng)基中產(chǎn)堿能力 陰性(32)糖的同化作用和產(chǎn)酸能力(a)L-阿拉伯糖 陽(yáng)性(b)D-木糖 陽(yáng)性(c)D-葡萄糖 陽(yáng)性(d)D-甘露糖 陽(yáng)性(e)D-果糖 陽(yáng)性(f)D-半乳糖 陽(yáng)性(g)麥芽糖 陽(yáng)性(h)蔗糖 陽(yáng)性(i)乳糖 陰性(j)海藻糖 陽(yáng)性(k)D-山梨[糖]醇 陰性(l)D-甘露[糖]醇 陰性(m)肌醇 陰性(n)甘油 陽(yáng)性(o)淀粉 陽(yáng)性(p)密二糖 陽(yáng)性(q)水揚(yáng)苷 陰性(r)乙醇 陽(yáng)性參考Bergey氏細(xì)菌學(xué)鑒定手冊(cè)，Wiuiams & Wilkins公司，第8版(1974)和國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志，1974-1986年，以及該菌所具有的革蘭氏陽(yáng)性，存在有孢子和厭氣性生長(zhǎng)等特性，由上述特性檢索表可揭示該細(xì)菌是芽孢桿菌屬中的一種。
主題菌種不同于芽孢桿菌屬中的任何一種，但與蠟狀芽孢桿菌或巨大芽孢桿菌相似，由于其細(xì)菌相對(duì)較厚，為1.0～1.3μ。
然而這些菌種與本發(fā)明之菌種可依如下幾點(diǎn)區(qū)分開來(lái)。
蠟狀芽孢桿菌生長(zhǎng)于7%的普通鹽中，并在卵黃反應(yīng)、酪蛋白分解和明膠分解作用中呈陽(yáng)性但主題菌種不在7%的普通鹽中生長(zhǎng)并且在卵黃反應(yīng)、酪蛋白分解和明膠分解中呈陰性。
另外巨大芽孢桿菌也生長(zhǎng)于7%的普通鹽中，并且酪蛋白分解和明膠分解呈陽(yáng)性結(jié)果，但主題菌種不能在7%普通鹽中生長(zhǎng)而且酪蛋白分解和明膠分解呈陰性結(jié)果。
進(jìn)一步講，主題菌種還可與芽孢桿菌屬中一個(gè)新的菌種芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)(于日本專利公開號(hào)No.43994/1986中有描述)區(qū)分開來(lái)，列于表1
表1主題菌種 Bacillusacidopullulyticus)芽孢桿菌氧氣要求 厭氣性 厭氣性對(duì)普通鹽抗性 可在3.5%普通鹽 不能在3.5%普通鹽中生長(zhǎng) 中生長(zhǎng)酪氨酸的分解 陽(yáng)性 陰性檸檬酸鹽的同化 陽(yáng)性 陰性通過(guò)甘露[糖]醇的產(chǎn)酸作用 陰性 陽(yáng)性VP反應(yīng) 陰性 可變的酪蛋白的分解 陰性 可變的通過(guò)阿拉伯糖和木糖的產(chǎn)酸作用 陰性 可變的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的厚度 1.0-1.3μ 0.6-1.0μ因此，如上所述，主題菌種作為一種新菌種而區(qū)別于芽孢桿菌屬中任何已知的和從前經(jīng)過(guò)命名的菌種。
以下將對(duì)通過(guò)培養(yǎng)主題菌種來(lái)生產(chǎn)和收集α-1，6-葡萄糖苷酶的條件作出說(shuō)明。
首先，是一個(gè)含有各種適量無(wú)機(jī)鹽并能為支鏈淀粉酶提供高活性的合適的培養(yǎng)基;其中還具碳源如淀粉-可溶性淀粉，蠟質(zhì)淀粉、土豆淀粉和水解過(guò)的淀粉，像甘露糖和糊精;氮源如水解后的蛋白質(zhì)，像多胨、肉湯、酵母浸出液、玉米漿、二氨基磷酸鹽、酪蛋白、大豆蛋白質(zhì)等。
將主題菌種接種在如上所述的培養(yǎng)基中，調(diào)pH至4.0～7.0，在20～45℃條件下以靜止或有氣條件下?lián)u動(dòng)、或通氣攪拌的方法對(duì)菌種進(jìn)行培養(yǎng)1～2天(若10～20小時(shí)效果最佳)。
經(jīng)過(guò)培養(yǎng)，將細(xì)胞移出液體培養(yǎng)基，得到的上清部分經(jīng)濃縮得到支鏈淀粉酶粗品。該制備物用硫酸銨分餾，然后經(jīng)過(guò)γ-環(huán)狀糊精-cephalose6B親和層析，再利用SDS-聚炳烯酰胺凝膠電泳純化為單帶。其中γ-環(huán)狀糊精同Sepharose 6B(商品名，Pharmacia精密化學(xué)公司)反應(yīng)生成親合層析的基物。如下所述為經(jīng)純化后的α-1，6-葡萄糖苷酶的酶化學(xué)特性。
1.反應(yīng)該酶作用于α-1，6-葡萄糖苷鍵產(chǎn)生直鏈淀粉。
2.米氏常數(shù)Km和對(duì)底物的Vmax本發(fā)明之酶對(duì)底物支鏈淀粉、馬玲薯支鏈淀粉和玉米支鏈淀粉的Km值(mg/ml)和Vmax值(μmol/min/mg蛋白質(zhì))列于表2之中表2底物 Km Vmax支鏈淀粉 0.14 70.0馬玲薯支鏈淀粉 3.3 10.65玉米支鏈淀粉 3.4 10.97
3.對(duì)多糖類的相對(duì)活性表3顯示該酶對(duì)可溶性玉米支鏈淀粉，可溶性淀粉、牡蠣糖元、野兔糖元、玉米支鏈淀粉和馬玲薯支鏈淀粉所具有的相對(duì)活性，相對(duì)于支鏈淀粉的活性。
表3多糖類 相對(duì)活性(%)支鏈淀粉 100可溶性玉米支鏈淀粉 13.5可溶性淀粉 6.7牡蠣糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米支鏈淀粉 3.8馬玲薯支鏈淀粉 4.04.最適pH在25毫摩爾檸檬酸和50毫摩爾的磷酸氫二鈉緩沖溶液中，其最適pH為5.0～5.5(見圖1)。
5.pH穩(wěn)定性在25毫摩爾檸檬酸-50毫摩爾磷酸氫二鈉緩沖溶液中，當(dāng)pH范圍在4.5～6.5時(shí)，該酶可在40℃條件下穩(wěn)定存在30分鐘;當(dāng)pH范圍在5.0～6.0時(shí)，溫度50℃可穩(wěn)定存在30分鐘(參見圖2)。
6.最適溫度在50毫摩爾乙酸緩沖液中(pH4.5)，該酶的最適溫度約55℃(參見圖3)。
7.熱穩(wěn)定性在不同溫度下于50毫摩爾乙酸緩沖液(pH4.5)中分別處置30分鐘，結(jié)果該酶在40℃時(shí)保持其原始活性的80%;但在60℃時(shí)則為10%(參見圖4)。
8.活性試驗(yàn)4毫升0.5%支鏈淀粉溶液(pH4.5)加入1毫升酶溶液，反應(yīng)在40℃下進(jìn)行30分鐘。然后加2毫升Somogyi溶液，將混合物加熱20分鐘后冷卻。冷卻后，加入1毫升鉬砷酸氨，加水至總體積為25毫升。以厚度為1厘米測(cè)該溶液在500納米時(shí)的吸光率。在上述條件下，以每分鐘還原相當(dāng)于1微摩爾葡萄糖的活性確定為一個(gè)活性單位。
9.抑制劑的影響作用對(duì)氯汞苯甲酸(PCMB)或SDS可抑制該酶活性的70%甚至更多，但其活性不受鄰菲咯啉或氰鐵酸鉀的抑制。各種不同抑制劑的影響作用見表4，其中顯示了當(dāng)溫度40℃，在50毫摩爾乙酸緩沖液(pH4.5)中均用1毫升抑制劑處理30分鐘后，該酶所保留的相對(duì)活性。
表4抑制劑 保留的活性(%)無(wú) 100EDTA 93.1鄰菲咯啉 109.0PCMB(對(duì)氯汞苯甲酸) 27.1N-乙基順丁烯二酰亞胺 65.5氰鐵酸鉀 102.0SDS 1.5-碘乙酸 66.5
10.金屬鹽的影響作用該酸幾乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+和Mn2+等的影響，受Fe3+的抑制，Hg2+和Ag+可使其失活。各種不同金屬鹽的影響作用見于表5，其中顯示當(dāng)40℃時(shí)，在50毫摩爾乙酸緩沖液中分別用與5毫摩爾的金屬鹽作用30分鐘的結(jié)果。
表5金屬鹽 保留的活性(%)無(wú) 100MgCl2·6H2O 91.3MgCl2·4H2O 85.9CoCl287.7CaCl279.1SrCl274.5NiCl2·6H2O 102.7BaCl298.9FeCl2·nH2O 82.1CuCl2·2H2O 73.4ZnCl297.3HgCl20AgCl 2.7SnCl2·2H2O 82.1CdCl2·2 1/2H2O 92.4
FeCl357.811.分子量大約95.500(用SDS電泳法)。
如下所示，本發(fā)明所得酶明顯區(qū)別于日本專利公開號(hào)No.174，089/1982(下文稱之為酶A)所公開的那種酶。
1.本發(fā)明的生產(chǎn)菌種是芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)它是芽孢桿菌屬中一種新的菌種而酶A的生產(chǎn)菌是芽孢桿菌(Bacillus acidopullulyticus)。
2.根據(jù)本發(fā)明，該酶的最適溫度為55℃而酶A的則是60℃。
3.考查在不同pH值和溫度時(shí)的酶活性，如圖5所示該主題酶在不同溫度時(shí)活性表現(xiàn)出很大的差異。另外在酶活性對(duì)pH值依賴性方面，其活性在pH值為5.0時(shí)出現(xiàn)蜂值，并隨pH值的增加或減少活性迅速下降。酶A在這方面與該酶的行為則完全不同。
4.在最適pH值方面，同pH范圍為3.5～5.5的酶A相比較，本發(fā)明的酶具有很窄的pH最適范圍5.0～5.5并具有很高的專一性。
因此可以斷定由本發(fā)明所得α-1，6-葡萄糖苷酶是不同于酶A的一種新酶。
可在以葡糖淀粉酶作用淀粉制備葡萄糖的過(guò)程中，加入本發(fā)明所得α-1，6-葡萄糖苷酶，達(dá)到改善產(chǎn)率的目的;或與β-淀粉酶一起用于從淀粉生產(chǎn)甘露糖的過(guò)程中以增加產(chǎn)率。
現(xiàn)以如下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明。
實(shí)施例1將芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接種在含下列成分的培養(yǎng)基上可溶性淀粉 1.5%肉湯 0.5%(NH4)2HPO40.3%K2HPO40.1%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 5.5然后在37℃，于Sakaguchi氏瓶中搖蕩培養(yǎng)20小時(shí)，從培養(yǎng)液中得到一種活性為8.1u/ml的支鏈淀粉酶。經(jīng)離心去除固體物質(zhì)和細(xì)胞，所得上清液用超濾性膜濃縮。接著加入冷乙醇達(dá)到濃度為80%使該酶沉淀，離心分離沉淀并且冷凍干燥得到淀粉的支鏈淀粉酶。
實(shí)施例2將芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接種在含下列成分的培養(yǎng)基上甘露糖 2%酵母浸出液 0.5%K2HPO40.2%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 4.5
填充在一個(gè)30升的發(fā)酵罐中，在37℃下，充氣攪拌培養(yǎng)16小時(shí)，從培養(yǎng)液中獲取一種活性為13.6u/ml的支鏈淀粉酶。經(jīng)離心去除液體中的固體物質(zhì)和細(xì)胞，用超濾性膜將所得上清液濃縮約20倍得到200u/ml(pH4.5)的支鏈淀粉酶液體粗品。將該粗品用硫酸銨分餾再經(jīng)過(guò)γ-環(huán)狀糊精-Sephalose 6B親合層析制得76.7u/mg蛋白質(zhì)的純化酶制品。
實(shí)施例3將芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)(FERE BP-1471)接種在含下列成分的培養(yǎng)基上蠟狀淀粉 2%多胨 1%K2HPO40.2%MgSO4·7H2O 0.1%初始pH值 5.0填充在一個(gè)1000升的罐中，在37℃下，充氣攪拌培養(yǎng)15小時(shí)，從培養(yǎng)液中得到一種活性為18.2u/ml的支鏈淀粉酶。將該液體按與實(shí)施例2相似的方法處理制得大約26升約300u/ml支鏈淀粉酶的液體粗品。
試驗(yàn)實(shí)施例1用于糖化作用的底物玉米淀粉(33克/分升，消光度8.0)。用于糖化作用的酶Gluczyme(Amano Pharmaceution co.，Ltd)(2.5u/g D.S.)。
主題酶由實(shí)施例3所得支鏈淀粉酶液體(0.1u/克D.S.)
糖化作用溫度 62℃糖化作用在上述條件下進(jìn)行，并于不同時(shí)間以高效液相色譜法(HPLC)檢測(cè)其中單糖(G1)、雙糖(G2)、三糖(G3)和多糖(Gn)的含量。對(duì)照反應(yīng)不使用主題酶，在相同的糖化條件下進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果匯總于表6。
表6反應(yīng)時(shí)間 糖類 加入酶 對(duì)照24小時(shí) G1(單糖) 92.6% 90.9%G2(雙糖) 2.4% 2.3%G3(三糖) 0.6% 0.4%Gn(多糖) 4.4% 6.4%48小時(shí) G1(單糖) 95.3% 94.2%G2(雙糖) 2.7% 0.3%G3(三糖) 0.6% 0.3%Gn(多糖) 1.4% 2.9%72小時(shí) G1(單糖) 95.3% 94.7%G2(雙糖) 3.2% 3.1%G3(三糖) 0.6% 0.4%Gn(多糖) 0.9% 1.8%
通過(guò)對(duì)新菌種芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)短時(shí)間的培養(yǎng)，本發(fā)明可以生產(chǎn)出一種新的α-1，6-葡萄糖苷酶，并因此使得大量經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)熱穩(wěn)定的α-1，6-葡萄糖苷酶成為現(xiàn)實(shí)，同時(shí)為淀粉糖化工業(yè)作出貢獻(xiàn)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶的方法，其中包括對(duì)能夠產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶的芽孢桿菌(Bacillus sectorramus)的培養(yǎng)使其在營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基本產(chǎn)生α-1，6-葡萄糖苷酶，集聚具備下列酶化學(xué)特性的該α-1，6-葡萄糖酶(1)反應(yīng)該酶作用于α-1，6-葡萄糖苷鍵產(chǎn)生線性淀粉；(2)底物專一性該酶對(duì)多糖類具如下相對(duì)活性多糖 相對(duì)活性(%)支鏈淀粉 100可溶性玉米淀粉 13.5可溶性淀粉 6.7牡蠣糖元 1.7野兔糖元 2.6玉米淀粉 3.8馬玲薯淀粉 4.0(3)米氏常數(shù)值(Km)和對(duì)支鏈淀粉的Vmax值該酶Km值為0.14毫克/毫升，Vmax值為70.0μmol/min/mg蛋白質(zhì)；(4)最適pH∶5.0～5.5(5)pH穩(wěn)定性該酶在40℃pH范圍4.5～6.5時(shí)可穩(wěn)定30分鐘，50℃pH范圍5.0～6.0時(shí)可穩(wěn)定30分鐘；(6)最適溫度約5.5℃；(7)熱穩(wěn)定性該酶在pH值為4.5條件下，分別以不同溫度處置30分鐘所得結(jié)果40℃時(shí)該酶仍保留其初始活性的80%，而在60℃時(shí)則為10%(8)抑制劑影響作用對(duì)氯汞苯甲酸或十二烷基硫酸鈉至少可抑制該酶活性的70%但該酶不受鄰菲咯啉或氰鐵酸鉀的抑制；(9)金屬鹽的影響作用該酶幾乎不受Ni2+、Ba2+、Zn2+、Cd2+或Mn2+的抑制，受Fe3+的抑制并且Hg2+和Ag+可令其失活；還有(10)分子量約95，500(SDS電泳法測(cè)得)；并回收所述的α-1，6-葡萄糖苷酶。
專利摘要
新的α-1，6-葡萄糖苷酶具下列酶學(xué)性質(zhì)
文檔編號(hào)C12N9/44GK87106597SQ87106597
公開日1988年4月6日 申請(qǐng)日期1987年9月26日
發(fā)明者中井國(guó)治, 塩崎正義, 辻廣二, 森茂治, 廣瀨進(jìn), 橫井信正, 大矢隆一 申請(qǐng)人:天野制藥株式會(huì)社導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan