專利名稱：平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于包被平面基質(zhì)的包被組成、聚合物包被片基、聚合物包被反應(yīng)器及特異性反應(yīng)器的裝置、特別是定量或/和定性檢測裝置、尤其是生物芯片。
背景技術(shù)：
含有特異性反應(yīng)器的裝置、特別是定量或/和定性檢測裝置，其中一個(gè)日漸重要的類別是含有基于平面基質(zhì)的特異性反應(yīng)器的裝置。目前，這類反應(yīng)器的制備，主要途徑如下先對平面基質(zhì)進(jìn)行表面修飾制備具有結(jié)合配基活性的片基，然后將配基固定至片基上。根據(jù)所用基質(zhì)及配基固定方式的不同，可以有不同種類的反應(yīng)器和裝置，例如配基以隨機(jī)分布的方式固定在聚苯乙烯微孔板中形成的酶標(biāo)微孔板、配基以點(diǎn)陣方式固定在片基(例如活化玻片)上形成的芯片，等等。下面以芯片為例來簡單地說明現(xiàn)有片基和裝置中尚待解決的問題。
芯片，是將微量配基以可尋址的方式固定在片基上形成的檢測裝置。目前最廣泛應(yīng)用的是生物芯片。由于其高通量和微型化特點(diǎn)，生物芯片有著廣泛的應(yīng)用范圍，包括基因表達(dá)檢測、基因篩選、藥物篩選、疾病診斷治療、環(huán)境監(jiān)測和治理、司法鑒定等領(lǐng)域。生物芯片的活性中心是其中固定的配基。生物芯片的配基，包括所有可以固定在固相載體上的具有生物活性的物質(zhì)，例如抗原、抗體、單鏈和多鏈DNA、RNA、核苷酸、配體、親和配基、多肽、細(xì)胞、組織成分等生物成分。最常用的生物芯片是多肽芯片和基因芯片。多肽芯片上固定的配基是多肽(包括蛋白質(zhì))?；蛐酒瞎潭ǖ呐浠ê怂岷秃塑账帷?br> 在芯片中，除了配基外，配基-目標(biāo)物作用的方式及條件、或者說配基的固定化化學(xué)也是一個(gè)重要的方面。配基的固定化在很大程度上決定于片基表面的物理、化學(xué)性質(zhì)，后者又在很大程度上決定于基質(zhì)的活化。目前，芯片應(yīng)用的基質(zhì)，主要是玻璃、金屬、塑料等材料的基質(zhì)。目前的基質(zhì)活化有兩種方式表面修飾和活性聚合物包被。表面修飾，即在基質(zhì)表面衍生出線性活化基團(tuán)。例如，目前市售的胺基玻片、醛基玻片和環(huán)氧基玻片均是通過對玻片進(jìn)行表面修飾制備的片基。由于平面基質(zhì)上的可衍生基團(tuán)的數(shù)目和活性均有限，目前利用表面修飾方法制備的片基，其用以固定配基的活性基的種類、數(shù)目和空間活動性均很有限。
對基質(zhì)進(jìn)行活性聚合物包被，是引入更多種類、更多數(shù)目和更大空間活動性的活性基的一個(gè)重要方法。目前的聚合物包被是基于離子配對機(jī)理。此一方法通常要求包被聚合物具有與基質(zhì)極性相反的極性的基團(tuán)。盡管以此方法來制備片基已有相當(dāng)時(shí)間，目前的包被組成遠(yuǎn)非理想。開發(fā)新的包被組成仍是該領(lǐng)域中一個(gè)活躍的研究課題。新的包被組成研究中的一個(gè)重要的問題，是在保證包被物理穩(wěn)定性和適當(dāng)?shù)呐浠Y(jié)合活性的條件下，滿足其它要求，例如使其對所接觸的目標(biāo)物以外的物質(zhì)的非特異性作用、吸附或鍵合最小化。實(shí)際上，目前的包被組成中的包被聚合物，主要是高活化度聚合物，其典型例子為聚電解質(zhì)，例如聚氨基酸，其活性側(cè)基(氨基)的極性較高且活性側(cè)基的取代率也很高(幾乎100％)。高活化度聚合物雖有很高的配基結(jié)合活性，但此一高活性往往又表現(xiàn)為高的非特異性結(jié)合活性。此外，聚氨基酸包被片基還有包被穩(wěn)定性的問題。為了解決包被聚合物過度活化的問題，有人采用共聚合方法在高活化度聚合物中引入無活性聚合物鏈，然而此一解決方案似乎太復(fù)雜、成本太高(參考美國專利局公開的申請?zhí)枮?0020128234)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用。本發(fā)明的包被組成，在保證包被物理穩(wěn)定性和合適的配基結(jié)合活性的條件下、也具有對應(yīng)用中所接觸的物質(zhì)有較小的、優(yōu)選方案最小化的非特異性作用、吸附或鍵合。本發(fā)明還涉及基于此一包被組成的聚合物包被片基、聚合物包被反應(yīng)器及特異性反應(yīng)裝置、特別是定量或/和定性檢測裝置、尤其是芯片。本發(fā)明還涉及一種制備聚合物包被片基的方法和一種制備反應(yīng)器的方法。
本發(fā)明的包被組成為一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其包括至少一種適度活化聚合物，所述適度活化聚合物包括高分子表面活性劑和優(yōu)化取代聚合物，所述優(yōu)化取代聚合物中活性側(cè)基的取代率為3％-50％、優(yōu)選方案為3％-23％、更優(yōu)選方案為3％-13％。所述適度活化聚合物，其活性水平在保證包被物穩(wěn)定性和合適的配基結(jié)合活性的條件下，也具有對應(yīng)用中所接觸的物質(zhì)有最小化的非特異性作用、吸附或鍵合。本發(fā)明適度活化聚合物的獲得，選自于兩條技術(shù)路線一是引入與離子配對機(jī)理有區(qū)別的作用機(jī)理(高分子表面活性劑)，一是對活性側(cè)基的取代率進(jìn)行優(yōu)化(優(yōu)化取代聚合物)。高分子表面活性劑具有疏水基(通常是非極性基)和親水基(通常是極性基)(參考高分子表面活性劑，沈一丁編著，化學(xué)工業(yè)出版社，2002年12月，北京)。目前的聚合物包被是基于離子配對機(jī)理，而本發(fā)明高分子表面活性劑包被，由于其疏水基的存在而使包被機(jī)理擴(kuò)大。同時(shí)，高分子表面活性劑與基質(zhì)及所接觸的其它物質(zhì)的作用，是其雙基(非極性基和極性基)在反應(yīng)環(huán)境中(通常是水溶液中)共同作用的結(jié)果。在實(shí)施例4和5中，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，高分子表面活性劑聚乙烯吡咯烷酮包被玻片和酶標(biāo)板，比未包被的玻片和聚苯乙烯酶標(biāo)板有明顯的靈敏度提高，但卻未觀察到明顯的特異性提高。選擇活性側(cè)基優(yōu)化取代聚合物，是因?yàn)樵谄渌哂械幕钚詡?cè)基取代范圍內(nèi)，可以滿足本發(fā)明包被組成的目的。例如，本發(fā)明實(shí)施4中，DEAE取代率在6-12％的DEAE-葡聚糖達(dá)到了此一目的。在實(shí)施例4中，此類聚合物包被的芯片與未包被的玻片比較，靈敏度有明顯的提高，但卻未觀察到明顯的特異性提高。
一方面，本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中適度活化聚合物為高分子表面活性劑，優(yōu)選方案為包括聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺在內(nèi)的非離子或弱離子高分子表面活性劑。
又一方面，本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中適度活化聚合物為優(yōu)化取代聚合物，所述優(yōu)化取代聚合物的活性側(cè)基包括化學(xué)鍵合基、陽離子基、陰離子基和疏水基。
本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中優(yōu)化取代聚合物中的活性側(cè)基包括氨基、環(huán)氧基、醛基、酰肼基(-CO-NHNH2)、二乙氨乙基(DEAE-)、二乙基-(2-羥丙基)氨乙基(QAE-)、羧甲基(CM-)、磺酸丙基(SP-)、氨基脲基(H2N-NH-CONH-)、巰乙基吡啶(MEP-)、硅氧烷基、硫醇基及其組合。其中，氨基、環(huán)氧基、醛基、硅氧烷基和氨基脲基是目前常見的通過表面修飾在基質(zhì)表面上引入的活性基團(tuán)。二乙氨乙基(DEAE-)、酰肼基(-CO-NHNH2)、二乙基-(2-羥丙基)氨乙基(QAE-)、羧甲基(CM-)、磺酸丙基(SP-)、巰乙基吡啶(MEP-)、硫醇基則是本發(fā)明引入包被聚合物的。
又一方面，本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中優(yōu)化取代聚合物中的活性側(cè)基至少有一個(gè)是通式為-(CH2)nR的長臂活性基團(tuán)，其中2＜n＜20，R是所述活性側(cè)基。僅管長臂活性基團(tuán)己被證明在親和層析載體上是有用的(參考Spacer arms in affinity chromatographythe need for a morerigorous approach.Biochem.Soc.trans.1(1973)289-290)，但在至此為止的關(guān)于平面片基的工作中未被提及。
又一方面，本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中優(yōu)化取代聚合物包括活性側(cè)基取代率為3％-50％、優(yōu)選方案為3％-23％、更優(yōu)選方案為3％-13％的聚多糖衍生物、聚丙烯酰胺衍生物和聚賴氨酸衍生物。本發(fā)明所選擇的聚多糖衍生物，首先是因?yàn)榫鄱嗵堑木€性長鏈結(jié)構(gòu)易于在平面基質(zhì)上包被和有較好的生物相容性，然后聚多糖上較易定量地引入種類多樣的活性側(cè)基(參考Chemical coupling of peptides and proteins to polysaccharides bymeans of cyanogens halides.Nature 214(1967)1302-1304；美國專利US5372820)。選擇聚丙烯酰胺衍生物和聚賴氨酸衍生物，也是基于類似的考慮。在此，是用以取代聚多糖、聚丙烯酰胺和聚賴氨酸的活性側(cè)基的數(shù)目、而不是聚合物的固有基團(tuán)(例如聚多糖、聚丙烯酰胺和聚賴氨酸的-OH基、酰胺基和氨基)，決定其是否本發(fā)明的優(yōu)化取代聚合物。
本發(fā)明的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，其中包被聚多糖衍生物包括葡聚糖衍生物、瓊脂糖衍生物和纖維素衍生物。
本發(fā)明的片基為一種聚合物包被片基，其基質(zhì)的全部表面、部分表面或點(diǎn)區(qū)域上包被有選自于上述包被組成中的包被聚合物，而且所述包被區(qū)域被所述包被聚合物功能化。本發(fā)明的聚合物包被片基，其功能性質(zhì)主要決定于包被聚合物的包括聚合物骨架、全部側(cè)基和活性側(cè)基取代率的整體性質(zhì)。本發(fā)明的聚合物包被片基，其中聚合物包被為面包被或點(diǎn)包被。面包被包括基質(zhì)全部表面和部分表面的包被。面包被容易形成，例如將基質(zhì)在聚合物液中浸泡。點(diǎn)包被較難進(jìn)行(例如用點(diǎn)樣器將聚合物液點(diǎn)樣至基質(zhì)上進(jìn)行包被反應(yīng))，但產(chǎn)品有其特點(diǎn)，例如包被點(diǎn)之外的區(qū)域內(nèi)的吸附能力較低，等等。
又一方面，本發(fā)明的聚合物包被片基，其中包被聚合物具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)結(jié)構(gòu)的引入是為了提高聚合物包被的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的聚合物包被片基，其中包被聚合物的交聯(lián)結(jié)構(gòu)交聯(lián)結(jié)構(gòu)通過下述一種或多種交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)環(huán)氧氯丙烷、2，3二溴丙醇、次甲基雙丙烯酰胺、丁二醇雙縮水甘油醚。
另一方面，本發(fā)明的聚合物包被片基，其基質(zhì)材料選自于未化學(xué)修飾或已化學(xué)修飾的玻璃、金屬氧化物、金屬和聚合物材料、等等。
本發(fā)明的反應(yīng)器為一種反應(yīng)器，其基質(zhì)上包被有聚合物和配基，所述聚合物至少有一種選自于上述的包被組成中的包被聚合物，而且所述包被聚合物與配基之間有結(jié)合。所述包被聚合物與配基之間的結(jié)合包括相互作用、吸附、鍵合、等等。
本發(fā)明的反應(yīng)器，其中聚合物和配基在片基上的包被，其形成方式為先包被聚合物再包被配基，或同時(shí)包被聚合物和配基，或先包被部分聚合物再同時(shí)包被其它聚合物和配基。同時(shí)包被聚合物和配基的一個(gè)例子是，將聚合物和配基混合，再通過點(diǎn)樣器點(diǎn)樣至基質(zhì)上進(jìn)行包被反應(yīng)。
又一方面，本發(fā)明的反應(yīng)器，其中包被聚合物具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)。交聯(lián)結(jié)構(gòu)的引入是為了提高聚合物包被的穩(wěn)定性。
本發(fā)明的反應(yīng)器，其中包被聚合物的交聯(lián)結(jié)構(gòu)通過下述一種或多種交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)環(huán)氧氯丙烷、2，3二溴丙醇、次甲基雙丙烯酰胺、丁二醇雙縮水甘油醚。
另一方面，本發(fā)明的反應(yīng)器，其中配基為選自于以下組中的一種或多種物質(zhì)抗原、抗體、配體、配基、多肽和單鏈或多鏈DNA、RNA、核苷酸、聚核苷酸(polynucleotide)、糖、共酶、輔因子(cofactor)、抗生素(antibiotic)、類固醇(steroid)。實(shí)際上，能夠固定如此多樣的配基，也是本發(fā)明的目的之一。例如，本行業(yè)的專業(yè)人員應(yīng)當(dāng)知道，糖可以固定在包被聚合物上的活性基團(tuán)氨基、epoxy和AH上，共酶、輔因子(cofactor)、抗生素(antibiotic)和類固醇(steroid)可以固定在含長臂活性基團(tuán)的包被聚合物上。
另一方面，本發(fā)明的反應(yīng)器，其基質(zhì)材料選自于未化學(xué)修飾或已化學(xué)修飾的玻璃、金屬氧化物、金屬和聚合物材料、等等。
本發(fā)明的分析檢測裝置為本發(fā)明的分析檢測裝置，其含有上述的反應(yīng)器。
本發(fā)明的分析檢測裝置，其是其是芯片、芯片試劑盒和含有芯片的檢測分析裝置。
本發(fā)明的分析檢測裝置，其是酶標(biāo)孔、酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑盒和含有酶標(biāo)孔的檢測分析裝置。
本發(fā)明的制備片基的方法為本發(fā)明的制備片基的方法，包括下列步驟(a)準(zhǔn)備含有包被聚合物的包被組成；(b)準(zhǔn)備未化學(xué)修飾或已進(jìn)行化學(xué)修飾的基質(zhì)；(c)將所述包被組成與所述基質(zhì)接觸并形成面包被或點(diǎn)包被；(d)將所述包被進(jìn)行聚合物之間的交聯(lián)以穩(wěn)定包被；以及(e)如有必要，將所述包被進(jìn)行活化。
本發(fā)明的制備片基的方法，其中上述包被、交聯(lián)和/或活化可以同步進(jìn)行或以不同次序分步進(jìn)行。
本發(fā)明的制備反應(yīng)器的方法，包括下列步驟(a)準(zhǔn)備含有包被聚合物的包被組成；(b)準(zhǔn)備未化學(xué)修飾或已進(jìn)行化學(xué)修飾的基質(zhì)；(c)將所述包被組成與配基混合，所述聚合物必須同所述配基結(jié)合但不必須同所述基質(zhì)結(jié)合；(d)將步驟(c)中得到的混合物與所述基質(zhì)接觸并進(jìn)行固定化反應(yīng)；以及(e)如有必要，將所述聚合物交聯(lián)以穩(wěn)定包被。
本發(fā)明所述的“配基”是指固定于固相載體上用以識別樣品中的目標(biāo)物的物質(zhì)，如抗原、抗體、核酸等。
本發(fā)明所述的片基一種活化固相載體，其用以固定配基的表面具有宏觀平面的特征，例如芯片片基、酶標(biāo)板微孔孔底、等等。
本發(fā)明所述的基質(zhì)用以制備活化固相載體的固相載體，例如用以制備芯片片基的玻片等等。
本發(fā)明所述包被是指將聚合物或/和配基固定在基質(zhì)或片基上的過程(作為動詞使用時(shí))或所形成的結(jié)構(gòu)(作為名詞使用時(shí))。
本發(fā)明所述的面包被將聚合物或/和配基固定在基質(zhì)或片基上的全部或部分表面上所形成的結(jié)構(gòu)。
本發(fā)明所述的點(diǎn)包被將聚合物或/和配基固定在基質(zhì)或片基上的一個(gè)點(diǎn)區(qū)域上所形成的結(jié)構(gòu)，所述點(diǎn)區(qū)域?yàn)槠砻嫔系南嗷オ?dú)立的、分布密度大于1個(gè)點(diǎn)/cm2的區(qū)域，例如通過芯片點(diǎn)樣器將配基溶液點(diǎn)樣至片基上形成的配基包被。
本發(fā)明所述的取代率是指取代聚合物主鏈上的側(cè)基被一種基團(tuán)取代的單元總數(shù)與聚合物主鏈上的單元總數(shù)之比。
本發(fā)明所述的活化是指在聚合物上引入無臂活性側(cè)基或/和長臂活性側(cè)基的過程。
本發(fā)明所述的交聯(lián)指聚合物之間形成化學(xué)鍵聯(lián)接的過程。
本發(fā)明所述的反應(yīng)器是指供配基與目標(biāo)物發(fā)生特異性反應(yīng)的場所及與其連通的其它相關(guān)結(jié)構(gòu)，例如開放式多反應(yīng)器生物芯片中的反應(yīng)池和相關(guān)的隔離結(jié)構(gòu)和進(jìn)出液結(jié)構(gòu)等、96孔酶標(biāo)板中的孔、快速檢測試劑盒的試劑條等等。
本發(fā)明所述的裝置是指包含有反應(yīng)器的部件或裝備；所述的檢測裝置，是指定性和/或定量分析方法中包含有反應(yīng)器的相關(guān)裝置，其中反應(yīng)器中固定有用以同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的配基。例如，生物芯片或生物芯片試劑盒、快速檢測試劑條或快速檢測試劑盒、酶標(biāo)板或酶標(biāo)板試劑盒、等等。
本發(fā)明所述的芯片相當(dāng)于英語中的“Biochip”、“Microarray”、“Bioarray”，是指反應(yīng)器中配基同樣品中的目標(biāo)分子發(fā)生特異反應(yīng)的結(jié)果可以以可尋址的方式進(jìn)行識別的一種裝置。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是本發(fā)明的用于包被平面基質(zhì)的包被組成包括適當(dāng)活化聚合物(高分子表面活性劑和優(yōu)化取代聚合物)，以其包被的聚合物包被片基、含聚合物包被的反應(yīng)器和含有此一反應(yīng)器的裝置，特別是芯片裝置具有足夠高的配基的活性和最小化的非特異結(jié)合活性。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1優(yōu)化取代聚合物的制備(1).DEAE-葡聚糖/DEAE-瓊脂糖的制備葡聚糖購自上海化學(xué)試劑公司，瓊脂糖購自Sigma公司，DEAE購自保定加合精細(xì)化工有限公司。
制備方法參考本發(fā)明發(fā)明人之一的文章(COATED SILICA SUPPORTS FORHIGH-PERFORMANCE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF PROTEIN，Journal ofChromatography，476，(1989)195-203，)。
DEAE取代率經(jīng)酸堿滴定法測定為7-14％。
(2).酰肼-聚丙烯酰胺的制備酰肼-聚丙烯酰胺的制備是根椐JK.Inman和HM Dintzis的方法進(jìn)行的(參考The derivatization of cross-linked polyacrylamidebeads，Am.J.Epidemiol.143263-268，1969)。本實(shí)施例所用非離子型聚丙烯酰胺產(chǎn)自北京希濤技術(shù)開發(fā)有限公司，所用水合肼產(chǎn)自湖南株洲化工集團(tuán)有限責(zé)任公司。本實(shí)施例所用非離子型聚丙烯酰胺的沉淀劑為酒精。
酰肼取代率經(jīng)酸堿滴定法測定為13％。
本發(fā)明實(shí)施例中所用包被聚合物如表1所示。
表1.某些包被高聚物

實(shí)施例2聚合物包被片基的制備本實(shí)施例所用包被聚合物如表1所示，所用基質(zhì)分別為用以制備芯片片基的顯微鏡載玻片(美國TeleChem International，Inc)和用以制備酶標(biāo)板片基的96孔微孔板(深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司)。
1).聚合物在基質(zhì)上的包被將表1中的包被聚合物(包括聚乙烯吡咯烷酮、多聚糖衍生物和聚丙烯酰胺衍生物)分別溶入PBS緩沖液，獲得濃度為1％(W/V)的包被聚合物水溶液。然后將其分別稀釋40-100倍。顯微鏡載玻片被放置于獲得的包被聚合物的稀釋液中，在室溫下過夜包被，洗凈烘干，質(zhì)檢合格后備用。96孔微孔板的每個(gè)孔中加入100-200ul獲得的包被聚合物的稀釋液，在室溫下過夜包被，洗凈烘干，質(zhì)檢合格后備用。
2).包被聚合物的交聯(lián)如有必要，上述制備的包被片基可進(jìn)行包被聚合物的交聯(lián)。多聚糖衍生物的交聯(lián)方法可參考本發(fā)明發(fā)明人之一的文章(COATED SILICA SUPPORTS FORHIGH-PERFORMANCE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF PROTEIN，Journal ofChromatography，476，(1989)195-203)。
在本實(shí)施例中，將上述DEAE-葡聚糖包被的玻片充分干燥后，加入到濃度為的環(huán)氧氯丙烷(西安化學(xué)試劑廠)中，升溫至90℃反應(yīng)30分鐘。反應(yīng)完成后，用酒精、無菌蒸餾水洗凈后烘干，質(zhì)檢合格后備用。
3).包被聚合物的活化如有必要，上述制備的包被片基(包被聚合物無交聯(lián)或有交聯(lián)的包被片基)可進(jìn)行活化以有選擇地提高聚合物包被的配基結(jié)合活性?；|(zhì)上包被的多聚糖衍生物和聚丙烯酰胺的活化方法可參考同類層析膠的活化方法(瓊脂糖凝膠的制備及化學(xué)改性研究，《應(yīng)用化工》，第32卷第1期，2003年月；凝膠層析法及其應(yīng)用，袁靜明，科學(xué)出版社)。本實(shí)施例的活化為利用碳化二亞胺(Carbodiimide)對包被DEAE-葡聚糖的活化，活化方法與本發(fā)明發(fā)明人之一的文章(COATEDSILICA SUPPORTS FOR HIGH-PERFORMANCE AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF PROTEIN，Journal of Chromatography，476，(1989)195-203，)中DEAE-葡聚糖包被層析載體的活化方法相同。
4).點(diǎn)包被片基在本實(shí)施例中，點(diǎn)包被片基是通過將濃度在四千分之一到一萬分之一(w/v)的包被聚合物溶液用點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)到基質(zhì)上，然后通過與本實(shí)施例1)中面包被相似的固定化過程制備的，所制備的片基為表2中的片基3’。
表2某些片基

實(shí)施例3芯片的制備本實(shí)施例所用包被聚合物選自表1，所用片基選自表2。作為基質(zhì)的顯微鏡載玻片和作為參照片基的氨基玻片購自美國TeleChem International，Inc。本實(shí)施例所用配基包括HCV抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)、HIV1+2抗原(北京人民醫(yī)院肝病研究所)和EBV抗原。EBV抗原為根椐D.Trabchand-Bunel的方法合成的肽抗原(Detection of human antibodies using“convergent”combinatorial peptide libraries or“mixotopes”designed from anonvariable antigenapplication to the EBVviral capsid antigen p18，D.Trabchand-Bunel et al.，J.Peptide Res，52.1998，pp495-508)。
在包被配基或配基/聚合物前，在選定位置涂上高疏水有機(jī)硅涂料(成都晨光化工設(shè)計(jì)院)形成高疏水層隔離結(jié)構(gòu)(參考我們的另一發(fā)明《一種反應(yīng)器隔離結(jié)構(gòu)高度最小化的生物芯片及制備方法》，申請?zhí)?3117397.7)，從而形成2行8個(gè)反應(yīng)池，反應(yīng)池尺寸為4.5mm×4.5mm。
1).方法A先包被聚合物再包被配基本方法使用實(shí)施例2中制備的片基包被配基。將濃度為1.5mg/ml的抗原溶液，以手工點(diǎn)樣機(jī)點(diǎn)樣到表3中的活化片基和對照片基上，各點(diǎn)2個(gè)點(diǎn)，形成2×2探針陣列?？乖缓螅门Ｑ灏椎鞍兹芤悍忾]后備用。所制備的芯片為表3中的芯片1-5(包括芯片3’)。
2).方法B同時(shí)包被聚合物和配基將濃度為1.5mg/ml的不同的抗原分別與濃度在二千分之一到五分之一(w/v)的聚乙烯吡咯烷酮和酰肼-聚丙烯酰胺溶液混合，在室溫下反應(yīng)半小時(shí)，然后再將所述包被聚合物-配基溶液以陣列的形式點(diǎn)在顯微鏡載玻片上。包備完成后，用牛血清白蛋白溶液封閉后備用。所制備的芯片為表3中的芯片6和7。表3芯片


實(shí)施例4芯片的應(yīng)用本實(shí)施例中，對照芯片為芯片A、B和C。其中芯片A的片基為顯微鏡載玻片，芯片B和C的片基為氨基玻片和高取代DEAE-葡聚糖包被玻片。顯微鏡載玻片和氨基玻片購自美國TeleChem International，Inc。高取代DEAE-葡聚糖為經(jīng)二次DEAE取代、取代率23％的DEAE-葡聚糖。這些芯片的制備與實(shí)施例3一樣。
在本實(shí)施例中，6種樣品分別為HCV抗體陽性血清(HCV+)、HIV1+2抗體陽性人血清、HCV+HIV陽性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體陽性血清對照物的混合物)和HCV+HIV陰性對照物(HCV抗體和HIV1+2抗體都為陰性的血清對照物)、EBV IgA抗體陽性人血清和EBV IgA抗體陰性人血清。所有的樣品，均預(yù)先用經(jīng)典的ELISA方法檢測確定其陰、陽性。
實(shí)驗(yàn)時(shí)，4種樣品分別加入上述制備的芯片(表3)，每種樣品加2個(gè)反應(yīng)池。加樣時(shí)樣品作適當(dāng)稀釋，加樣量為10ul，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間5分鐘。洗滌液每次加入量為15ul，洗滌5次。標(biāo)記物為羅丹明標(biāo)記的羊抗人二抗(JacksonImmunoRresearch Laboratories公司)，加入量為10ul，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間5分鐘。反應(yīng)后以15ul洗滌液洗滌5次。干燥后進(jìn)行掃描(Afymetrix公司GMS 418芯片掃描儀)，數(shù)據(jù)處理(軟件為)后得到結(jié)果如表4。
表4芯片的檢測結(jié)果


實(shí)施例5酶標(biāo)板的制備及應(yīng)用在本例中，所用酶標(biāo)板的片基為實(shí)施例2所制備(表2中的片基6)，所用標(biāo)記物為酶標(biāo)記的羊抗人二抗(北京天壇生物制品股分有限公司)，所用配基為EBV抗原。EBV抗原為根椐D.Trabchand-Bunel的方法合成的肽抗原(Detectionof human antibodies using“convergent”combinatorial peptidelibraries or “mixotopes”designed from a nonvariableantigenapplication to the EBVviral capsid antigen p18，D.Trabchand-Bunel et al.，J.Peptide Res，52.1998，pp495-508)。
將濃度0.3ug/ml的EBV抗原分別包被到表5的片基8(聚乙烯吡咯烷酮包被微孔板)和對照片基(微孔板)上，每一種片基包被8個(gè)孔。包被后用牛血清白蛋白溶液封閉后備用。
在本實(shí)施例中，所用樣品為EBV VCA IgA抗體陽性血清和EBV VCA IgA抗體陰性血清。所有的樣品，均預(yù)先用經(jīng)典的ELISA方法檢測確定其陰、陽性。
實(shí)驗(yàn)時(shí)2種樣品分別加入表5所述對照酶標(biāo)板及酶標(biāo)板中，每種樣品加4個(gè)反應(yīng)池。加樣時(shí)樣品作100倍稀釋，加樣量為100ul，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。洗滌液每次加入量為300ul，洗滌3次。標(biāo)記物為酶標(biāo)記的羊抗人IgA二抗(北京天壇生物制品股分有限公司)，加入量為100ul，反應(yīng)溫度37℃，反應(yīng)時(shí)間30分鐘。加入底物的反應(yīng)條件和與經(jīng)典的ELISA法相同。利用酶標(biāo)儀(Thermo Labsystems上海雷勃分析儀器有限公司)進(jìn)行比色分析，所得平均OD值見表5。
表5 ELISA檢測結(jié)果

權(quán)利要求
1.一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于其包括至少一種適度活化聚合物，所述適度活化聚合物包括高分子表面活性劑和優(yōu)化取代聚合物，所述優(yōu)化取代聚合物中活性側(cè)基的取代率為3％-50％、優(yōu)選方案為3％-23％、更優(yōu)選方案為3％-13％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述高分子表面活性劑的優(yōu)選方案為包括聚乙烯吡咯烷酮和聚丙烯酰胺的非離子或弱離子高分子表面活性劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述優(yōu)化取代聚合物中的活性側(cè)基包括化學(xué)鍵合基、陽離子基、陰離子基和疏水基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述優(yōu)化取代聚合物中的活性側(cè)基包括氨基、環(huán)氧基、醛基、氨基脲基(H2N-NH-CONH-)、酰肼基(-CO-NHNH2)、二乙氨乙基(DEAE-)、二乙基-(2-羥丙基)氨乙(QAE-)、羧甲基(CM-)、磺酸丙基(SP-)、巰乙基吡啶(MEP-)、硅氧烷基、硫醇基中的一種或任意兩種及以上的組合。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述優(yōu)化取代聚合物中的活性側(cè)基至少有一個(gè)是通式為-(CH2)nR的長臂活性基因，其中2＜n＜20，R是所述活性側(cè)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述優(yōu)化取代聚合物包括活性側(cè)基取代率為3％-50％、優(yōu)選方案為3％-23％、更優(yōu)選方案為3％-13％的聚多糖衍生物、聚丙烯酰胺衍生物和聚賴氨酸衍生物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成，其特征在于所述聚多糖包括葡聚糖、瓊脂糖和纖維素。
8.一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于其為含所述平面基質(zhì)包被聚合物組成的片基，其基質(zhì)的全部表面、部分表面或點(diǎn)區(qū)域上包被有包被組成中的包被聚合物，而且所述包被區(qū)域被所述包被聚合物功能化。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的聚合物包被片基的包被聚合物具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的聚合物包被片基的交聯(lián)結(jié)構(gòu)通過下述一種或兩種及兩種以上的交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)環(huán)氧氯丙烷、2，3二溴丙醇、次甲基雙丙烯酰胺、丁二醇雙縮水甘油醚。
11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的聚合物包被片基的基質(zhì)選自于未修飾或已修飾的以下之一或任意兩種及兩種以上組合玻璃、金屬氧化物、金屬和聚合物材料，所述修飾包括表面修飾和聚合物包被。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其征在于所述的聚合物包被片基的制備方法包括以下步驟(a)準(zhǔn)備含有包被聚合物的包被組成；(b)準(zhǔn)備未化學(xué)修飾或已進(jìn)行化學(xué)修飾的基質(zhì)；(c)將所述包被組成與所述基質(zhì)接觸并形成面包被或點(diǎn)包被；(d)將所述包被進(jìn)行聚合物之間的交聯(lián)以穩(wěn)定包被；以及(e)如有必要，將所述包被進(jìn)行活化。
13.一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于其為含所述平面基質(zhì)包被聚合物組成的一種反應(yīng)器，其基質(zhì)上包被有聚合物和配基，所述聚合物至少有一種選自于用于包被平面基質(zhì)的包被組成中的包被聚合物，而且所述包被聚合物與配基之間有結(jié)合。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器的聚合物和配基在片基上的包被，其形成方式為先包被聚合物再包被配基，或同時(shí)包被聚合物和配基，或先包被部分聚合物再同時(shí)包被其它聚合物和配基。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器的聚合物具有交聯(lián)結(jié)構(gòu)。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器的聚合物交聯(lián)結(jié)構(gòu)通過下述一種或兩種及兩種以上的交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)環(huán)氧氯丙烷、2，3二溴丙醇、次甲基雙丙烯酰胺、丁二醇雙縮水甘油醚。
17.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器中的配基為選自于以下組中的一種或兩種及兩種以上任意組合的物質(zhì)抗原、抗體、配體、配基、多肽和單鏈或多鏈DNA、RNA、核苷酸、聚核苷酸(polynucleotide)、糖、共酶、輔因子(cofactor)、抗生素(antibiotic)、類固醇(steroid)。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器的基質(zhì)選自于未修飾或已修飾的以下之一或任意兩種或兩種以上的組合玻璃、金屬氧化物、金屬和聚合物材料，所述修飾包括表面修飾和聚合物包被。
19.根據(jù)權(quán)利要求13所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的反應(yīng)器的方法，包括下列步驟(1)準(zhǔn)備含有包被聚合物的包被組成；(2)準(zhǔn)備未化學(xué)修飾或已進(jìn)行化學(xué)修飾的基質(zhì)；(3)將所述包被組成與配基混合，所述聚合物必須同所述配基結(jié)合但不必須同所述基質(zhì)結(jié)合；(4)將步驟(3)中得到的混合物與所述基質(zhì)接觸并進(jìn)行固定化反應(yīng)；以及(5)如有必要，將所述聚合物交聯(lián)以穩(wěn)定包被。
20.一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于其為含所述平面基質(zhì)包被聚合物組成的分析檢測裝置。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的分析檢測裝置是芯片、芯片試劑盒或含有芯片的檢測分析裝置。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的分析檢測裝置是酶標(biāo)孔、酶標(biāo)板、酶標(biāo)試劑盒或含有酶標(biāo)孔的檢測分析裝置。
23.根據(jù)權(quán)利要求20或22所述的一種平面基質(zhì)包被聚合物組成的應(yīng)用，其特征在于所述的分析檢測裝置的方法中，包被、交聯(lián)和/或活化可以同步進(jìn)行或以不同次序分步進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種平面基質(zhì)包被聚合物組成及其應(yīng)用，具體涉及一種用于包被平面基質(zhì)的包被組成、一種聚合物包被片基、一種含聚合物包被的反應(yīng)器和一種含有此一反應(yīng)器的裝置，特別是芯片裝置，本發(fā)明的包被聚合物包括高分子表面活性劑和優(yōu)化取代聚合物，其具有足夠高的結(jié)合配基的活性和最小化的非特異結(jié)合活性。
文檔編號C08L39/00GK1514246SQ03135618
公開日2004年7月21日 申請日期2003年8月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月18日
發(fā)明者鄒方霖, 陳春生, 陳寧, 王建霞 申請人:成都夸常科技有限公司