專利名稱：一種聚丙烯腈磁珠及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種磁性生物材料及其制備方法以及作為固定化酶載體的應(yīng)用，尤其涉及一種聚丙烯腈磁珠及其制備方法和應(yīng)用。
固定化酶是將水溶性的酶用物理或化學(xué)方法處理，使之變成不溶于水的仍具有酶活性的酶衍生物。固定化酶不但應(yīng)具有酶的高度專一性及溫和條件下高效率催化的特點(diǎn)，還應(yīng)具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，使生產(chǎn)連續(xù)化、自動(dòng)化，不帶進(jìn)雜質(zhì)，產(chǎn)物容易精制，收率較高。同時(shí)，固定化酶還應(yīng)能夠反復(fù)使用，并具有較高的穩(wěn)定性。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，固定化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用日益廣泛，在食品、制藥生產(chǎn)中起著十分重要的作用。特別使用化學(xué)工藝很難進(jìn)行的操著，用固定化酶就較容易解決。
能夠作為固定化酶載體的材料很多，如大孔樹脂、殼聚糖、幾丁質(zhì)多糖等。但在生產(chǎn)實(shí)際中發(fā)現(xiàn)它們單位質(zhì)量載體固定的酶量十分有限。聚丙烯腈由于丙烯腈單體都含有一個(gè)腈基(-CN)，可以被氫化為氨基(-NH3)，容易實(shí)現(xiàn)酶的固定化。然而，文獻(xiàn)(Japanese published unexamined patent applications No.121592/1976和No.7485/1979，Auslegeschrift No.122633)報(bào)導(dǎo)，聚丙烯腈即使在其氫化后，其吸附酶的能力仍較低，而且吸附很不穩(wěn)定，酶易于從載體表面釋放出去。
為了克服上述困難，美國(guó)專利U.S.P.4486549采用氫化的孔狀纖維結(jié)構(gòu)的聚丙烯腈作為酶載體，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，帶有氨基(-NH3)的孔狀聚丙烯腈纖維對(duì)酶的吸附量和結(jié)合能力都大大提高，可以達(dá)到2至30倍。然而，這種方法，面臨的一個(gè)突出問題是固定化材料的回收和重復(fù)利用比較困難。
高分子包埋納米磁性粒子形成的磁珠，對(duì)其表面改性可以接枝各種功能分子，如酶、抗體、DNA等。利用外加磁場(chǎng)可以進(jìn)行回收和重復(fù)利用。但是，目前所用的高分子磁珠大都為乙烯基芳香族聚合物微珠，典型的制備方法可見USP4358388的報(bào)導(dǎo)。然而采用這類方法，很難制成聚丙烯腈磁珠。因?yàn)榧{米磁性粒子很難均勻分散于丙烯腈中，且不能聚合成球。
本發(fā)明的目的之一在于解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，公開一種酶吸附量高，分離周期短、載體回收效率高的聚丙烯腈磁珠；本發(fā)明的目的之二在于提供上述聚丙烯腈磁珠制備方法；本發(fā)明的目的之三在于上述聚丙烯腈磁珠作為固定化酶載體的應(yīng)用。
本發(fā)明的構(gòu)思是這樣的(1)采用聚丙烯腈和水溶性磁流體為主要原料，先將水溶性磁流體分散在聚丙烯腈的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，然后噴霧造粒，獲得聚丙烯腈磁珠。
(2)將酶交聯(lián)到氫化后的聚丙烯腈磁珠表面，在催化反應(yīng)結(jié)束后，利用磁場(chǎng)進(jìn)行回收，從而發(fā)揮固定化優(yōu)勢(shì)。
本發(fā)明所說的磁珠由聚丙烯腈和納米磁性粒子所構(gòu)成，其組分和重量百分比含量為聚丙烯腈 40～90％納米磁性粒子 10～60％所說的納米磁性粒子為Fe3O4；優(yōu)選的重量百分比含量為聚丙烯腈60～90％納米磁性粒子10～40％最優(yōu)選的為聚丙烯腈70～80％納米磁性粒子20～30％磁珠的直徑在0.2～7μm之間，最佳為1～5μm。
上述的聚丙烯腈磁珠的制備包括如下步驟①超順磁性的納米Fe3O4粒子懸浮液的制備所說的超順磁性是指該磁性粒子具有在磁場(chǎng)作用下顯示磁性，撤去磁場(chǎng)后即無(wú)剩磁的性質(zhì)。
將堿加入二價(jià)鐵和三價(jià)鐵的硫酸鹽或氯化物混合水溶液，三價(jià)鐵鹽與二價(jià)鐵的摩爾比為1.0～3.0，最好是1.8～2.2，這樣能得到符合要求的超順磁性材料的尺寸和磁性能。
二價(jià)過渡金屬鹽如鉻、鈷、銅、鎂、錳、鎳、鋅鹽和它們的混合物可以部分或全部取代二價(jià)鐵鹽；所說的堿為氨水、氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉、碳酸氫鈉或碳酸鉀等無(wú)機(jī)堿中的一種或一種以上，優(yōu)選的是氫氧化鈉或氨水；堿的加入量以使溶液的pH值達(dá)到8～12為好，最好為10～11；制備條件為在55～90℃，進(jìn)行反應(yīng)，得到黑色超順磁性的納米Fe3O4粒子懸浮液。
②超順磁性的納米Fe3O4粒子的制備在上述的納米Fe3O4粒子懸浮液中再加入5～15％重量比的陰離子表面活性劑，如十二烷基苯磺酸鈉、油酸鈉、十二烷基硫酸鈉等，熟化30～60min后，冷卻至室溫，用酸如HCl調(diào)pH至4～6，然后過濾，水洗，冷凍干燥，即得到超順磁性的納米Fe3O4粒子；③聚丙烯腈磁珠的制備在上述的納米Fe3O4粒子中加入5～15％重量比的陰離子表面活性劑，如十二烷基苯磺酸鈉、油酸鈉、十二烷基硫酸鈉等，制成重量百分比濃度為10～70％的水溶性的磁流體，備用；按照常規(guī)的方法制備聚丙烯腈，該方法為現(xiàn)有技術(shù)，簡(jiǎn)述如下稱取0.1～0.5g偶氮二異丁腈倒入500mL的小燒杯中，加入20～40mL丙烯腈，1.0～2.0mL甲基丙烯酸甲脂，攪拌至偶氮二異丁腈完全溶解。加入0.5～2.5％的聚乙烯醇水溶液20～80mL，去離子水60～100mL，均勻分散后，將其倒入三口燒瓶反應(yīng)器中，再在60～80℃攪拌條件下反應(yīng)3～5小時(shí)出料，用去離子水250mL水透析3～5次，真空干燥，得到聚丙烯腈；將聚丙烯腈的N，N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，配制成濃度為0.5～3g/1000mL的溶液，再將上述水溶性磁流體均勻分散在上述聚丙烯腈的溶液中，配制成磁流體含量為10～50％的混合溶液，然后用噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧造粒，噴霧干燥機(jī)的干燥溫度為160～200℃，進(jìn)料速率為1.0～4.0mL/s，旋轉(zhuǎn)盤旋轉(zhuǎn)速率為20000～40000r/min，得到本發(fā)明所說的聚丙烯腈磁珠。
上述聚丙烯腈磁珠可以作為一種固定化酶載體，用于固定等電點(diǎn)偏酸性的生物酶，如青霉素?；?、膽堿氧化酶、葡萄糖氧化酶等。
該聚丙烯腈磁珠具有十分優(yōu)異的性能，其固定量可比聚丙烯腈纖維或其他固定化載體高30％以上，且固定化過程簡(jiǎn)單，分離回收便利。
具體的應(yīng)用方法如下將所說的聚丙烯腈磁珠置于濃度為0.01～0.05g/mL的LiAlH4的無(wú)水乙醚溶液中，在40～80℃的水浴中回流反應(yīng)10分鐘～30小時(shí)，然后依次用無(wú)水乙醚、稀鹽酸、去離子水、堿溶液和去離子水洗滌聚丙烯腈磁珠，獲得一種氫化的聚丙烯腈磁珠；聚丙烯腈磁珠與LiAlH4的加入比例為1∶1～1∶4；將上述化氫化的聚丙烯腈磁珠置于濃度為10～20％、pH為8～9的戊二醛和硼酸鹽緩沖溶液中，在0℃下充分?jǐn)嚢瑁缓笤诖艌?chǎng)中用pH為8～9的硼酸鹽緩沖溶液和pH為7.5的0.1M的磷酸酸鹽水溶液洗滌，將洗滌后的氫化聚丙烯腈磁珠迅速放入置有酶的磷酸鹽緩沖溶液(pH為7.5)的試管中，在0～40℃的條件下反應(yīng)0.5～5小時(shí)，然后將磁珠分離出溶液，即獲得含有酶的聚丙烯腈磁珠。
聚丙烯腈磁珠與戊二醛和硼酸鹽緩沖溶液的比例為1∶40～1∶100；所說的聚丙烯腈磁珠的酶吸附量高，且反應(yīng)后可回收重復(fù)使用?；厥辗椒ㄈ缦略诤忻傅木郾╇娲胖榻?jīng)過催化反應(yīng)后，用磁場(chǎng)對(duì)反應(yīng)溶液進(jìn)行分離，具體過程如下將含有聚丙烯腈磁珠的母液置于1特斯拉的磁場(chǎng)中，由于磁珠中包含的磁粉在磁場(chǎng)的作用下迅速富集，即可進(jìn)行分離，然后經(jīng)過洗滌，便可重復(fù)使用。
下面將結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1將濃度為1.0mol/L的NaOH水溶液緩慢加入濃度為1.0mol/L的FeCl2和濃度為2.0mol/L的FeCl3混合水溶液(1∶2，摩爾比)，在85℃、pH為10的條件下反應(yīng)，獲得納米Fe3O4粒子懸浮液；加入10％(重量)的油酸鈉，熟化30秒，冷卻至室溫，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH至5，然后過濾，洗滌，冷凍干燥，獲得超順磁性的納米Fe3O4粒子；
然后在上述的納米Fe3O4粒子再中加入10％(重量)的油酸鈉和水，制成水溶性的磁流體，用電子顯微鏡觀察，其粒徑為8～12nm。
實(shí)施例2稱取0.2克偶氮二異丁腈倒入500mL的小燒杯中，加入30mL丙烯腈，1.5mL甲基丙烯酸甲脂，攪拌至偶氮二異丁腈完全溶解，加入2％的聚乙烯醇水溶液50mL，去離子水80mL，均勻分散后將其倒入反應(yīng)瓶中，再在70℃下攪拌反應(yīng)4小時(shí)，用去離子水透析5次，真空干燥，獲得聚丙烯腈。
實(shí)施例3將實(shí)施例2所獲得的聚丙烯腈溶解于N’N-二甲基酰胺中，配制成濃度為1.5g/mL毫升的溶液，再將實(shí)施例1的水溶性的磁流體均勻分散在上述的聚丙烯腈溶液中，配制成磁流體含量為30％的混合溶液，然后用噴霧干燥機(jī)進(jìn)行噴霧造粒，噴霧干燥機(jī)的干燥溫度為180℃，進(jìn)料速率為2.0mL/s，旋轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速為40000r/min，獲得聚丙烯腈磁珠。用激光散射粒度儀測(cè)得平均粒徑為1.6μm。
實(shí)施例4在250毫升燒瓶中加入120毫升的無(wú)水乙醚和1克LiAlH4，然后加入2.5克實(shí)施例3的聚丙烯腈磁珠，在40℃的水浴下回流反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，依次用無(wú)水乙醚、稀鹽酸、去離子水、堿溶液和去離子水洗滌聚丙烯腈磁珠，獲得一種氫化的聚丙烯腈磁珠。用熱重儀測(cè)得Fe3O4含量為23.2％。
實(shí)施例5將180mg實(shí)施例4的氫化聚丙烯腈磁珠加入15mL濃度為12.5％，pH為8.5的戊二醛和硼酸鹽緩沖溶液中，在0℃下充分?jǐn)嚢?，活?0min，然后在磁場(chǎng)中用pH為8.5的硼酸鹽緩沖溶液洗滌，將洗滌后的氫化聚丙烯腈磁珠迅速放入置有10毫升的酶活為23u/mL的膽堿氧化酶溶液中，在30℃的條件下震蕩反應(yīng)2小時(shí)，依次用pH=7.5、7.0的磷酸鹽緩沖溶液在磁場(chǎng)作用下對(duì)磁珠進(jìn)行洗滌，即獲得含有膽堿氧化酶的聚丙烯腈磁珠。通過檢測(cè)酶活，測(cè)得聚丙烯腈磁珠固定化的膽堿氧化酶的含量為45u/mL。將磁珠固定化的酶進(jìn)行催化反應(yīng)后，再用磁場(chǎng)分離回收，磁珠可重復(fù)使用。
權(quán)利要求
1.一種聚丙烯腈磁珠，其特征在于，組分和重量百分比含量為聚丙烯腈40～90％納米磁性粒子10～60％。所說的納米磁性粒子為Fe3O4；
2．如權(quán)利要求1所述的磁珠，其特征在于，重量百分比含量為聚丙烯腈60～90％納米磁性粒子10～40％。
3．如權(quán)利要求2所述的磁珠，其特征在于，重量百分比含量為聚丙烯腈70～80％納米磁性粒子20～30％。
4．如權(quán)利要求1～3任一所述的磁珠，其特征在于，磁珠的直徑為0.2～7μm。
5．如權(quán)利要求4所述的磁珠，其特征在于，磁珠的直徑為1～5μm。
6．如權(quán)利要求1～3任一所述的磁珠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟①超順磁性的納米Fe3O4粒子懸浮液的制備將堿加入二價(jià)鐵和三價(jià)鐵的硫酸鹽或氯化物混合水溶液，三價(jià)鐵鹽與二價(jià)鐵的摩爾比為1.0～3.0；所說的堿為無(wú)機(jī)堿，堿的加入量使溶液的pH值達(dá)到8～12；②超順磁性的納米Fe3O4粒子的制備在上述的納米Fe3O4粒子懸浮液中加入陰離子表面活性劑，用酸調(diào)pH至4～6，然后采用常規(guī)的方法收集超順磁性的納米Fe3O4粒子；③聚丙烯腈磁珠的制備在上述的納米Fe3O4粒子中再加入陰離子表面活性劑，制成水溶性的磁流體，備用；將聚丙烯腈溶解在溶劑中，再將上述水溶性磁流體分散在上述聚丙烯腈的溶液中，然后進(jìn)行噴霧造粒，即得到聚丙烯腈磁珠。
7．如權(quán)利要求6所述的磁珠的制備方法，其特征在于，所說的無(wú)機(jī)堿是氫氧化鈉或氨水，堿的加入量使溶液的pH值達(dá)到10～11，三價(jià)鐵鹽與二價(jià)鐵的摩爾比為1.8～2.2。
8．如權(quán)利要求6所述的磁珠的制備方法，其特征在于，以鉻、鈷、銅、鎂、錳、鎳或鋅鹽和它們的混合物部分或全部取代二價(jià)鐵鹽。
9．如權(quán)利要求7所述的磁珠的制備方法，其特征在于，以鉻、鈷、銅、鎂、錳、鎳或鋅鹽和它們的混合物部分或全部取代二價(jià)鐵鹽。
10．如權(quán)利要求1～3任一所述的磁珠的應(yīng)用，其特征在于，可以作為一種固定化酶載體，用于固定等電點(diǎn)偏酸性的生物酶。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種聚丙烯腈磁珠及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明采用聚丙烯腈和水溶性磁流體為主要原料,先將水溶性磁流體分散在聚丙烯腈的N,N－二甲基甲酰胺(DMF)溶液中,然后噴霧造粒;獲得聚丙烯腈磁珠,然后將酶交聯(lián)到氫化后的聚丙烯腈磁珠表面,在催化反應(yīng)結(jié)束后,利用磁場(chǎng)進(jìn)行回收,從而發(fā)揮固定化優(yōu)勢(shì)。該聚丙烯腈磁珠具有十分優(yōu)異的性能,其固定量高,且固定化過程簡(jiǎn)單,分離回收便利。
文檔編號(hào)C08K7/18GK1296032SQ00127460
公開日2001年5月23日 申請(qǐng)日期2000年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2000年11月21日
發(fā)明者王強(qiáng)斌, 朱以華, 古宏晨, 張淑蘭, 王勝林 申請(qǐng)人:上海博納科技發(fā)展有限公司, 華東理工大學(xué)