專利名稱：人氯離子通道zsig44的制作方法
背景技術(shù)：
氯離子是介導(dǎo)氯離子和其它陰離子跨脂雙分子層被動運輸?shù)哪さ鞍住Ｋ鼈兇嬖谟谫|(zhì)膜和各種細(xì)胞器中，經(jīng)常與主動陰離子轉(zhuǎn)運系統(tǒng)有關(guān)。綜述見Pusch，M.，Jentsch，T.J.，生物學(xué)綜述74813-827，1994和Jentsch，T.J.，Gunther，W.，生物分析19117-126，1997。
幾種類型的氯離子通道已得到分離并受到不同調(diào)節(jié)。配體控制的氯離子通道通過外來配體的結(jié)合活化，例如在神經(jīng)元和骨骼肌中的g-氨基丁酸(GABA)和氨基乙酸活化的通道。3’，5’-環(huán)腺苷單磷酸(cAMP)依賴型氯離子通道因為cAMP增加而活化，例如囊性纖維化跨膜轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)蛋白(CTFR)氯離子通道。這種活化相信是由依賴于cAMP的蛋白激酶A(PKA)的磷酸化作用介導(dǎo)。其它氯離子通道包括通過細(xì)胞內(nèi)鈣增加活化的氯離子通道和可以通過酪氨酸磷酸化調(diào)節(jié)的數(shù)量依賴型氯離子通道。
在適當(dāng)表達系統(tǒng)(例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞)中表現(xiàn)增加的電壓依賴型氯離子轉(zhuǎn)運的質(zhì)膜氯離子通道分為不同基因家族。電壓控制的氯離子通道CLC家族直接作用為氯離子通道；其成員在結(jié)構(gòu)上是相似的大蛋白，含有幾個證明功能明顯不同的跨膜結(jié)構(gòu)域。其它離子通道如K+通道具有相似結(jié)構(gòu)(Hille，B.，可興奮膜的離子通道，Sinauer Assoc.，Sunderland，MA，1992)。
已發(fā)現(xiàn)氯離子通道蛋白的另一家族增加電壓依賴型氯離子轉(zhuǎn)運，但不直接作用為氯離子通道；這些蛋白可能作用為離子通道調(diào)節(jié)劑。這些蛋白結(jié)構(gòu)上與CLC家族不同并且是只具有單一跨膜結(jié)構(gòu)域的小蛋白。此蛋白家族包括大鼠和人phospholemman(PLM)和MAT-8氯離子通道(Chem，L.K.，Genomics，41435-443，1997；Morrison，B.W.等，生物化學(xué)雜志，2702176-2182，1995)。其它與此家族相關(guān)的蛋白是K離子(K+)通道蛋白IsK(minK)和大鼠通道誘導(dǎo)因子(CHIF)(Barhanan，J.等，自然，78-80，1996；Sanguinetti，M.C.等，自然，80-83，1996；Attali，B等，美國國家科學(xué)院院報，926092-6096，1995)。最近證據(jù)表明IsK作用為K離子通道調(diào)節(jié)劑，其本身不能形成離子通道，但在功能性K+通道存在的情況下增強電壓依賴型轉(zhuǎn)運(Attali，B.，自然，38424-25，1996；Barhanan，J.等，同上；Sanguinetti，M.C.等，同上)。這些小氯離子通道蛋白是通道調(diào)節(jié)劑還是真正的通道還不了解。
幾種離子通道與人體中的遺傳疾病有關(guān)(見Ackerman，M.J.，Clapham，D.E.，新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志3361575-1586，1997)。CLC-1通道是骨骼肌的主要氯離子通道，其突變與導(dǎo)致肌強直(肌肉僵硬)的超興奮骨骼肌有關(guān)。而且，腎特異的CLC-K1通道在享勒彎曲中有高表達，在脫水大鼠整個腎中表達上調(diào)，證明其在尿濃縮中的作用。另一大鼠腎通道CLC-K2在腎內(nèi)有不同細(xì)胞定位并可能有不同的生理作用。大鼠CLC-K形式的人同系物已知。參與心肌細(xì)胞膜復(fù)極化的IsK K+通道調(diào)節(jié)劑可能在心律不齊中起作用(Attali，B.，同上；Barhanan，J.等，同上；Sanguinetti，M.C.等，同上)。CTFR氯離子通道參與囊性纖維化。這些發(fā)現(xiàn)加強了離子通道的差異性、它們的組織特異性和它們與人類病理狀態(tài)的相關(guān)性。
新離子通道分子的發(fā)現(xiàn)提供了對潛在人類疾病狀態(tài)的理解，提供了發(fā)現(xiàn)新治療方法要調(diào)整的目標(biāo)并作用為遺傳疾病的標(biāo)記。因此尋求新離子通道的發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供這些多肽用于這些用途和其它對于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說可從本文說明顯而易見的用途。
發(fā)明概述本發(fā)明滿足了提供離子通道蛋白新家族的新人類離子通道的需求。
一方面，本發(fā)明提供編碼zsig44多肽的分離的多核苷酸，包含與選自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸殘基序列(a)SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；并且(b)SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)89(Cys)。在一實施方案中，上面公開的分離的多核苷酸分子選自(a)SEQ ID NO1中所示多核苷酸序列的核苷酸52-核苷酸270；以及(b)SEQ ID NO1中所示多核苷酸序列的核苷酸4-核苷酸270。在另一實施方案中，上面公開的分離的多核苷酸分子包含SEQ ID NO8的核苷酸1-核苷酸267。在另一實施方案中，上面公開的分離的多核苷酸基本上由與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸殘基序列組成。在另一實施方案中，上面公開的分離的多核苷酸基本上由SEQID NO2中所示氨基酸殘基序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)組成。
另一方面，本發(fā)明提供含有下列可操作連接元件的表達載體轉(zhuǎn)錄啟動子；編碼與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的zsig44多肽的DNA片段；以及轉(zhuǎn)錄終止子。在一實施方案中，上面公開的表達載體進一步包含與DNA片段可操作連接的分泌信號序列。
另一方面，本發(fā)明提供已導(dǎo)入上面公開的表達載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中細(xì)胞表達DNA片段編碼的多肽。
另一方面，本發(fā)明提供編碼融合蛋白的DNA構(gòu)建體，此DNA構(gòu)建體包含編碼與選自以下氨基酸序列的氨基酸殘基序列至少90％同源的的多肽的第一個DNA片段(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)16(Ala)；(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)28(Asp)；(c)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)64(Lys)；(d)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)65(Ser)-殘基數(shù)89(Cys)；(e)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)64(Lys)；(f)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)89(Cys)；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；以及編碼其它多肽的至少一個其它DNA片段，其中第一個和其它DNA片段是框架內(nèi)連接的；并且編碼融合蛋白。在一實施方案中，按以下方法制備融合蛋白，方法包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入含有以下可操作連接的單元的載體的宿主細(xì)胞(a)轉(zhuǎn)錄啟動子；(b)編碼根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白的DNA構(gòu)建體；以及(c)轉(zhuǎn)錄終止子；并且回收DNA片段編碼的蛋白。
另一方面，本發(fā)明提供一種分離的多肽，包含與選自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸殘基序列(a)包含SEQID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；并且(b)包含SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)89(Cys)。在一實施方案中，上面公開的分離的多肽進一步包含在構(gòu)型M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA中從N端到C端間隔開的基序1-4和PLITPGSA基序。在另一實施方案中，上面公開的分離的多肽基本上由與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸殘基序列組成。在另一實施方案中，上面公開的分離的多肽是SEQ ID NO2中所示的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)。
另一方面，本發(fā)明提供合成zsig44多肽多肽的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，；并且分離細(xì)胞合成的zsig44多肽。
另一方面，本發(fā)明提供制備抗zsig44多肽抗體的方法，包括用選自以下多肽的多肽免疫接種動物(a)由9-89個氨基酸組成的多肽，其中多肽是與SEQ ID NO2中連續(xù)氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的多肽；(b)根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽；(c)具有與SEQ ID NO2的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)28(Asp)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(d)具有與SEQ IDNO2的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)64(Lys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(e)具有與SEQ ID NO2的殘基數(shù)65(Ser)-殘基數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；其中多肽在動物中引發(fā)免疫反應(yīng)；并且從動物中分離抗體。在一實施方案中，上面公開的抗體與zsig44多肽結(jié)合。在另一個實施方案中，上面公開的抗體是單抗體克隆。
另一方面，本發(fā)明提供與上面公開的多肽特異結(jié)合的抗體。
另一方面，本發(fā)明提供在測試樣品中檢測zsig44蛋白活性調(diào)節(jié)劑存在的方法，包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體的細(xì)胞，其中細(xì)胞在含有或不含有測試樣品的情況下表達DNA片段編碼的zsig44蛋白；并且通過生物學(xué)或生物化學(xué)分析比較含有或不含有測試樣品時zsig44的活性水平；并且從比較中確定測試樣品中zsig44活性調(diào)節(jié)劑的存在。
參照下面本發(fā)明的詳細(xì)描述和附圖，本發(fā)明的這些和其它方面將變得更清楚。
附圖簡述

圖1表示zsig44(SEQ ID NO2)，rat CHIF(RATCHI)(SEQ IDNO3)，人MAT-8(HSMAT8)(SEQ ID NO4)，人PLM(HSU722)(SEQID NO5)的多重比較。
發(fā)明詳述在詳細(xì)描述本發(fā)明之前，定義下列術(shù)語有助于其理解。
術(shù)語“親和標(biāo)記物”用于此處是指能與第二個多肽結(jié)合以提供第二個多肽的純化或檢測或者提供第二個多肽與底物結(jié)合的位點的多肽片段。原則上，任何抗體或其它特異結(jié)合試劑的肽或蛋白都適于用作親和標(biāo)記物。親和標(biāo)記物包括多組氨酸臂、蛋白質(zhì)A(Nilsson等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法1983，1991)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Jahnson，基因，6731，1988)、Glu-Glu親和標(biāo)記物(Grussenmeyer，等，蛋白表達和純化295-107，1991)。編碼親和標(biāo)記物的DNA可以從商業(yè)供應(yīng)商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)獲得。
術(shù)語“等位變體”用于此處是指占據(jù)相同染色體位點的基因的兩種或多種可換形式中的任一種。等位變體通過突變自然產(chǎn)生，并在種群內(nèi)導(dǎo)致表型多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?編碼的多肽中沒有變化)或編碼含有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語等位變體此處也用于表示由基因的等位變體編碼的蛋白。
術(shù)語“氨基端”和“羧基端”用于此處是指多肽內(nèi)的位置。如果上下文允許，參照多肽的特定序列或部分使用這些術(shù)語以表示接近或相對的位置。例如，多肽內(nèi)位于參考序列的羧基端的特定序列是位于接近參考序列的羧基末端，但不一定位于完整多肽的羧基末端。
術(shù)語“互補/反互補對”是指在適當(dāng)條件下形成非共價連接的穩(wěn)定配對的非相同部分。例如，生物素和抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白鏈霉素)是互補/反互補對的典型成員。其它典型互補/反互補對包括受體/配體對、抗體/抗原(或半抗原或抗原決定基)對、正義/反義多核苷酸對等。在需要互補/反互補對隨后解離的地方，互補/反互補對優(yōu)選地具有小于109M-1的結(jié)合親和性。
術(shù)語“多核苷酸分子的互補”是與參考序列相比，具有互補堿基序列和反方向的多核苷酸分子，例如序列5’ATGCACGGG 3’與5’CCCGTGCAT 3’互補。
術(shù)語“重疊群”是指具有與另一多核苷酸相同或互補序列的毗鄰片段的多核苷酸。毗鄰序列是指與具有在它們的整體上或沿著多核苷酸的部分片段的多核苷酸序列的給定片段重疊。例如多核苷酸序列5’-ATGGCTTAGCTT-3’的相應(yīng)重疊群是5’-TAGCTTgagtct-3’和3’-gtcgacTACCGA-5’。
術(shù)語“簡并核苷酸序列”是指包含一個或多個簡并密碼子的核苷酸序列(與編碼多肽的參考多核苷酸分子相比)。簡并密碼子含有不同的核苷酸三聯(lián)體，但編碼相同的氨基酸殘基(即GAU和GAC三聯(lián)體都編碼Asp)。
“DNA片段”是具有指定特征的大DNA分子的部分。例如，編碼指定多肽的DNA片段是更大DNA分子如質(zhì)?；蛸|(zhì)粒片段的部分，即在從5’讀到3’方向時編碼指定多肽的氨基酸序列。
術(shù)語“表達載體”用于表示包含與提供用于轉(zhuǎn)錄的其它片段可操作連接的編碼目的多肽的片段的線性或環(huán)狀DNA分子。這樣的其它片段包括啟動子和終止子序列，并且也可以包括一個或多個復(fù)制起點、一個或多個選擇性標(biāo)記、增強子、多聚腺苷酸信號等。表達載體一般起源于質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。
術(shù)語“離子通道”廣泛用于表示與陰離子、陽離子或其它通道蛋白或它們的公認(rèn)調(diào)節(jié)劑同源或?qū)嶋H上就是陰離子、陽離子或其它通道蛋白或它們的公認(rèn)調(diào)節(jié)劑的多肽或蛋白。術(shù)語離子通道此處也用于表示編碼這樣的多肽的核苷酸。
術(shù)語“分離的”用于多核苷酸時，是指多核苷酸已從其天然的遺傳環(huán)境中提取出來，因而不含有其它外源或不需要的編碼序列，并且是適于遺傳工程蛋白合成系統(tǒng)中使用的形式。如此分離的分子是那些與其天然環(huán)境分開的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含有正常與它們結(jié)合的其它基因，但可以包含天然存在的5’和3’非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。相關(guān)區(qū)域的鑒定對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的(見例如Dynan和Tijan，自然316774-778，1985)?！胺蛛x的”多肽或蛋白是存在于非其天然環(huán)境的狀態(tài)如從血液和動物組織分離的多肽或蛋白。在優(yōu)選的形式中，分離的多肽基本上不含其它多肽，尤其是其它動物來源的多肽。優(yōu)選的是提供高度純化形式即大于95％純度、更優(yōu)選地大于99％純度的多肽。當(dāng)用于本文的上下文時，術(shù)語“分離的”并不排除以可互換的物理形式如二聚體或選擇性地糖基化或派生形式存在的相同多肽的存在。
術(shù)語“可操作連接”用于DNA片段時，是指對片段進行安排使它們的功能與預(yù)期目的相協(xié)調(diào)，如轉(zhuǎn)錄在啟動子起始并延伸通過編碼片段至終止子。
術(shù)語“種同系物(ortholog)”表示從一個種獲得的蛋白或多肽是來自不同種的多肽或蛋白的功能對應(yīng)物。種同系物之間的序列差異是物種形成的結(jié)果。
術(shù)語“paralog”是生物合成的、不同但結(jié)構(gòu)上相關(guān)的蛋白。據(jù)認(rèn)為Paralog是由于基因重復(fù)而引起的。例如α-珠蛋白、β-珠蛋白和肌紅蛋白互相是Paralog。
術(shù)語“多核苷酸”是從5’末端讀至3’末端的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸堿基的單鏈和雙鏈多聚體。多核苷酸包括RNA和DNA，可以從天然來源分離、體外合成或由天然和合成分子的組合制備。
多核苷酸的大小表示為堿基對(縮寫“bp”)、核苷酸(“nt”)或千堿基(“kb”)。只要上下文允許，后兩個術(shù)語可以描述單鏈或雙鏈多核苷酸。當(dāng)術(shù)語用于雙鏈分子時，它用于表示全長并且應(yīng)理解為與術(shù)語“堿基對”相同。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到雙鏈多核苷酸的兩條鏈可能長度不同并且其末端可能因為酶消化而錯開；因此，雙鏈多核苷酸分子內(nèi)可能不是所有的核苷酸都配對。這樣的未配對末端長度一般不超過20nt。
“多肽”是天然合成或人工合成的通過肽鍵連接的氨基酸殘基的聚合物。少于10個氨基酸殘基的多肽一般稱為“肽”。
此處使用術(shù)語“啟動子”的本領(lǐng)域公認(rèn)的意義，表示含有提供RNA聚合酶結(jié)合和轉(zhuǎn)錄起始的DNA序列的基因部分。啟動子序列一般但并不總是位于基因的5’非編碼區(qū)。
“蛋白”是包含一條或多條多肽鏈的大分子。蛋白也可以包含非肽成分如碳水化合物基團。合成蛋白的細(xì)胞可能將碳水化合物和其它非肽取代基加到蛋白上，取代基將隨細(xì)胞類型變化。此處依據(jù)蛋白的氨基酸主鏈結(jié)構(gòu)來定義蛋白；一般不說明取代基如碳水化合物基團，但這些基團可能存在。
術(shù)語“受體”表示與生物活性分子(即配體)結(jié)合并在細(xì)胞上調(diào)節(jié)配體效應(yīng)的細(xì)胞相關(guān)蛋白。膜結(jié)合受體的特征一般在于多結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)，包括細(xì)胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一般參與信號傳導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域。配體和受體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，引起效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域與細(xì)胞內(nèi)其它分子之間的相互作用。此相互作用繼而引起細(xì)胞代謝的變化。與受體-配體相互作用相關(guān)的代謝事件包括基因轉(zhuǎn)錄、磷酸化作用、去磷酸化作用、環(huán)AMP合成的增加、細(xì)胞鈣的動員、膜脂的動員、細(xì)胞粘附、肌醇脂的水解和磷脂的水解。一般情況下，受體可以是膜結(jié)合的、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核的；單體的(如促甲狀腺激素受體、β-腎上腺素能受體)或多聚體的(如PDGF受體、生長激素受體、IL-3受體、GM-CSF受體、G-CSF受體、促紅細(xì)胞生成素受體和IL-6受體。
術(shù)語“分泌信號序列”是指編碼作為更大多肽的組成部分指導(dǎo)更大的多肽通過合成此多肽的細(xì)胞分泌通路的多肽(“分泌肽”)的DNA序列。在通過分泌通路傳遞的過程中通常對更大的多肽進行切割以除去分泌肽。
術(shù)語“剪切變體”用于此處是指從基因轉(zhuǎn)錄的RNA的可變換形式。剪切變化在轉(zhuǎn)錄的RNA分子內(nèi)或更少見的分開的轉(zhuǎn)錄RNA分子之間通過使用可變換的剪切位點天然產(chǎn)生，并且可能導(dǎo)致從相同基因轉(zhuǎn)錄的幾種mRNA。剪切變體可以編碼具有改變的氨基酸序列的多肽。術(shù)語剪切變體用于此處也表示由從基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的剪切變體編碼的多肽或蛋白。
術(shù)語“可溶性蛋白”用于此處是指不與細(xì)胞膜結(jié)合的蛋白多肽?？扇苄缘鞍装ㄌ烊粸榧?xì)胞內(nèi)的如胞質(zhì)的蛋白或從細(xì)胞天然分泌的蛋白。很多細(xì)胞表面有天然存在的可溶性對應(yīng)物，它們通過蛋白水解合成或從選擇性剪切的mRNA翻譯合成。當(dāng)受體和配體多肽缺乏足夠的分別提供膜錨定或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的跨膜和細(xì)胞內(nèi)多肽片段的部分時，它們被認(rèn)為基本上不含這些片段。可溶性蛋白也包括經(jīng)遺傳加工變成可溶性的膜結(jié)合蛋白，例如以常規(guī)方法通過去除跨膜區(qū)域或僅表達蛋白的可溶性部分。
由不精確分析方法(例如電泳)測定的聚合物分子量和長度應(yīng)理解為大約的數(shù)值。當(dāng)這樣的數(shù)值表示為“約”X或“大約”X時，所述數(shù)值X應(yīng)理解為精確到±10％。
本文引用的所有參考文獻的說明在此全面引入作為參考。
本發(fā)明部分以編碼離子通道或通道調(diào)節(jié)劑的新DNA序列的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)。對應(yīng)于此DNA的mRNA的組織分布的Northern印跡分析表明表達在腎和骨髓中最高，并且在任何測試的其它組織或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中沒有可檢測的表達水平。推測的剪切變體在脊髓中表達。幾個組織的點印跡分析表明心臟中的信號。此肽稱為zsig44。
本發(fā)明的新zsig44多肽最初通過查詢信號序列的同源序列的EST數(shù)據(jù)庫而得到鑒定。發(fā)現(xiàn)了一個N-端EST序列并推測與離子通道CHIF/MAT-8家族有關(guān)(Attoli，B.等，同上；Morrison，B.W.等，同上)。
全長zsig44的核苷酸序列在SEQ ID NO1中描述，并且其推測的氨基酸序列在SEQ ID NO2中描述。多重比較揭示zsig44是離子通道家族的成員，其特征在于它們小而單一的跨膜結(jié)構(gòu)域，可能作用為離子通道調(diào)節(jié)劑。
編碼zsig44多肽的DNA(SEQ ID NO1)的分析揭示了編碼89個氨基酸的開放閱讀框架(SEQ ID NO2)，此開放閱讀框架包含19個氨基酸殘基[SEQ ID NO2的殘基1(Met)-殘基16(Ala)]的信號肽、22個氨基酸的跨膜結(jié)構(gòu)域[SEQ ID NO2的殘基36(Asn)-殘基58(Leu)]和73個氨基酸的成熟多肽[SEQ ID NO2的殘基17(Leu)-殘基89(Cys)]。zsig44與其它已知離子通道的多重比較揭示對應(yīng)于SEQ ID NO2的氨基酸殘基29(Pro)至氨基酸殘基64(Lys)的相似區(qū)域。此區(qū)域此后稱為“中心區(qū)域”或“中心結(jié)構(gòu)域”。在此區(qū)域中，有4保守的基序，此后稱為“基序1”(SEQ ID NO6；SEQ IDNO2的氨基酸29-34)、“基序2”(SEQ ID NO7；SEQ IDNO2的氨基酸41-46)、“基序3”(SEQ ID NO8；SEQ IDNO2的氨基酸52-57)、“基序4”(SEQ ID NO9；SEQ IDNO2的氨基酸59-64)?；?和4被存在于所示所有離子通道成員中的單一保守絲氨酸殘基隔開；此絲氨酸可能作用為PKC磷酸化作用位點。C端“PLITPGSA基序”也存在(SEQ ID NO10；SEQ IDNO2的氨基酸79-86)。而且，zsig44多肽不具有作為CHIF/MAT-8類型離子通道特征的PKA磷酸化保守位點(見附圖)。
在如下所示的構(gòu)型中，基序1-4和“PLITPGSA基序”從N端-C端被間隔開M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA，其中M#代表上面公開的特定基序(例如M1是基序1等)，PLITPGSA表示上面公開的PLITPGSA基序；并且{#}表示基序之間的氨基酸數(shù)。
保守基序的存在一般與蛋白中的重要結(jié)構(gòu)區(qū)域相關(guān)或限定蛋白中的重要結(jié)構(gòu)區(qū)域。這些基序之間或側(cè)翼的區(qū)域可能是更多變的，但常常是功能上重要的，因為它們與重要結(jié)構(gòu)和活性有關(guān)或限定重要結(jié)構(gòu)和活性如結(jié)合結(jié)構(gòu)域、生物和酶活性、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、組織定位結(jié)構(gòu)域等?？赡芄δ苤匾闹行慕Y(jié)構(gòu)域側(cè)翼的區(qū)域是SEQ ID NO2的殘基17(Leu)-殘基28(Asp)以及殘基65(Ser)-殘基89(Cys)。
本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，分離的多核苷酸將在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO1或其互補序列的相似大小區(qū)域雜交。一般情況下，選擇在指定離子強度和pH下低于特定序列熱解鏈點(Tm)約5℃的嚴(yán)格條件。Tm是50％靶序列與完全匹配探針雜交時的溫度(在指定離子強度和pH下)。典型的嚴(yán)格條件是那些pH7時NaCl濃度高達約0.03M并且溫度至少約60℃的條件。
如前面所指出的，本發(fā)明的分離的多肽包括DNA和RNA。分離DNA和RNA的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。一般優(yōu)選的是從腎或骨髓分離RNA，盡管DNA也可以使用來自其它組織、細(xì)胞系的RNA制備或分離為基因組DNA。使用異硫氰酸胍抽提，接著在CsCl梯度中離心分離，可以制備總RNA(Chirgwin等，生物化學(xué)1852-94，1979)。Poly(A)+RNA使用Aviv和Leder(美國國家科學(xué)院院報691408-1412，1972)的方法從總RNA制備。使用已知方法從poly(A)+RNA制備互補DNA(cDNA)。然后通過例如雜交或PCR鑒定和分離編碼zsig44多肽的多核苷酸。
本發(fā)明也提供編碼此處公開的zsig44多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員容易認(rèn)識到，考慮到遺傳密碼的簡并性，在這些多核苷酸分子中可能有相當(dāng)多的序列變化。SEQID NO11是包括所有編碼SEQ ID NO2的zsig44多肽的DNA的簡并DNA序列。本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員將認(rèn)識到，通過將U替換成T，SEQID NO2的簡并序列也提供所有編碼SEQ ID NO2的RNA序列。因此，編碼zsig44多肽的多核苷酸包括SEQ ID NO11的核苷酸1-核苷酸267，并且本發(fā)明包括它們的RNA等價物。表1說明SEQ ID NO11中表示簡并核苷酸位置所用的單字母符號?！胺直妗北硎痉栕帜复淼暮塑账??！盎パa”表示互補核苷酸的符號。例如，符號Y代表C或T，其互補R代表A或G，A與T互補，G與C互補。
表1核苷酸 分辨 互補 分辨AA T TCC G GGG C CTT A ARA|G Y C|TYC|T R A|GMA|C K G|TKG|T M A|CSC|G S C|GC|G A|T W A|THA|C|T D A|G|TBC|G|T V A|C|GVA|C|G B C|G|TDA|G|T H A|C|TNA|C|G|T N A|C|G|T在下面表2中列出了SEQ ID NO11中所使用的簡并密碼子，包括對于給定氨基酸的所有可能密碼子。
表2氨基酸字母 密碼子 簡并密碼子CysCTGC TGT TGYSerSAGC AGT TCA TCC TCG TCT WSNThrTACA ACC ACG ACT ACNProPCCA CCC CCG CCT CCNAlaAGCA GCC GCG GCT GCNGlyGGGA GGC GGG GGT GGNAsnNAAC AAT AAYAspDGAC GAT GAYGluEGAA GAG GARGlnQCAA CAG CARHisHCAC CAT CAYArgRAGA AGG CGA CGC CGG CGT MGNLysKAAA AAG AARMetMATG ATGIleIATA ATC ATT ATHLeuLCTA CTC CTG CTT TTA TTG YTNValVGTA GTC GTG GTT GTNPheFTTC TTT TTYTyrYTAC TAT TAYTrpWTGG TGGTer.TAA TAG TGA TRRAsn|AspBRAYGlu|GlnZSARAnyXNNN本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將會理解在確定簡并密碼子(代表編碼每個氨基酸的所有可能密碼子)時引入的某些錯讀。例如，絲氨酸(WSN)的簡并密碼子在某些情況下編碼精氨酸(AGR)，精氨酸(MGN)的簡并密碼子在某些情況下編碼絲氨酸(AGY)。相似的關(guān)系在編碼苯丙氨酸和亮氨酸的密碼之間也存在。因此，簡并序列所包含的某些多核苷酸可能編碼不同的氨基酸序列，但本領(lǐng)域普通技術(shù)人員參考SEQ IDNO2的氨基酸序列可以容易地鑒定這樣的不同序列。可以容易地對不同序列測定如此處公開的功能性。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人也將理解不同序列可能表現(xiàn)“偏愛的密碼子使用”。一般參見Grantham等，核酸研究81893-1912，1980；Haas等，Curr.Biol.6315-324，1996；Wain-Hobson等，基因13355-64，1981；Grosjean和Fiers，基因18199-209，1982；Holm，核酸研究143075-3087，1986；Ikemura，分子生物學(xué)雜志158573-597，1982。如此處所用的，術(shù)語“偏愛的密碼子使用”或“偏愛的密碼子”是關(guān)于最常用于某些物種細(xì)胞的蛋白翻譯密碼子，因此偏愛編碼每個殘基的一個或幾個代表性的可能密碼子的術(shù)語(見表2)。例如，殘基蘇氨酸(Thr)可以由ACA、ACC、ACG或ACT編碼，但在哺乳動物中，ACC是最常用的密碼子；在其它物種如昆蟲細(xì)胞、酵母、病毒或細(xì)菌中，不同Thr密碼子可能是優(yōu)選的。特定物種的偏愛密碼子可以通過本領(lǐng)域已知的各種方法導(dǎo)入本發(fā)明的多肽中。將偏愛的密碼子序列導(dǎo)入重組DNA可以例如通過使特定細(xì)胞類型或物種內(nèi)的蛋白翻譯更有效來增加蛋白合成。因此，SEQ ID NO11中公開的簡并密碼子序列作用為優(yōu)化在本領(lǐng)域常用的和此處公開的各種細(xì)胞類型和物種中多核苷酸表達的模板?？梢栽诟鞣N物種中測試含有偏愛密碼子的序列并優(yōu)化表達，并且測試此處公開的功能性。
本發(fā)明進一步提供來自其它物種的相似多肽和多核苷酸(種同系物)。這些物種包括但不限于哺乳動物、鳥類、兩棲動物、爬行動物、魚類、昆蟲以及其它脊椎動物和無脊椎動物物種。尤其感興趣的是來自其它哺乳物種包括鼠、大鼠、豬、羊、牛、狗、貓、馬和其它靈長類多肽的zsig44多肽。使用本發(fā)明提供的信息和組合物結(jié)合傳統(tǒng)克隆技術(shù)可以克隆人zsig44的種同系物。例如使用從表達此處公開的zsig44的組織或細(xì)胞類型獲得的mRNA可以克隆cDNA。通過使用根據(jù)此處公開的序列設(shè)計的探針探測Northern印跡可以鑒定mRNA的適當(dāng)來源。然后從陽性組織或細(xì)胞系的mRNA制備文庫。然后可以通過一系列方法如通過用完整或部分人cDNA或用基于公開序列的一套或多套簡并探針探查來分離編碼zsig44的cDNA。zsig44中心結(jié)構(gòu)域中的高度保守殘基序列可以用作鑒定新離子通道成員的工具。例如，反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)可使用從各種組織來源得到的RNA擴增編碼保守基序1-4和PLITPGSA基序的序列。具體地，從5’信號序列設(shè)計的高度簡并引物可用于此目的。用根據(jù)此處公開的代表性人zsig44序列設(shè)計的引物，使用聚合酶鏈反應(yīng)或PCR(Mullis，美國專利No.4,683,202)也可以克隆cDNA。在其它方法中，可以使用cDNA文庫轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，用抗zsig44的抗體檢測目的cDNA的表達。相似的技術(shù)也可以應(yīng)用于基因組克隆的分離。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將意識到SEQ ID NO1中公開的序列代表人zsig44的單一等位基因，并且預(yù)期會發(fā)生的等位變異和可變換的剪接。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法通過探查來自不同個體的cDNA或基因組文庫可以克隆此序列的等位變體?？梢允贡绢I(lǐng)域已知的各種分子生物學(xué)技術(shù)克隆相同或不同細(xì)胞類型內(nèi)的剪切變體。例如cDNA末端的5’和3’快速擴增(RACE)、使用簡并寡核苷酸引物的RCR和傳統(tǒng)的雜交克隆技術(shù)等都可用于鑒定和克隆等位變體和剪切變體cDNA(Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY，1989和Ausubel等(編輯)，分子生物學(xué)常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，NY，1987)。SEQ ID NO1中所示的DNA序列的等位變體，包括那些含有沉默突變的變體和那些突變導(dǎo)致氨基酸序列變化的變體，在本發(fā)明范圍之內(nèi)，SEQ ID NO2的等位變體蛋白也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。從選擇性剪切的mRNA產(chǎn)生的、保留了zsig44多肽特性的cDNA也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)，由這樣的cDNA和mRNA編碼的多肽也包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。按照本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法，通過探測來自不同個體或組織的cDNA或基因組文庫可以克隆這些序列的等位變體和剪切變體。
本發(fā)明也提供了與SEQ ID NO2的多肽及其種同系物基本上同源的分離的zsig44多肽。術(shù)語“基本上同源”用于此處是指與SEQID NO2中所示的序列或其種同系物有50％、優(yōu)選60％、更優(yōu)選至少80％序列相同性的多肽。這樣的多肽與SEQ ID NO2或其種同系物或Paralog將更優(yōu)選地至少90％相同，并且最優(yōu)選地95％或更多的相同。通過傳統(tǒng)的方法確定序列相同百分率。參見例如Altschul等，Bull.Math.Bio.48603-616，1986和Henikoff和Henikoff，美國國家科學(xué)院院報，8910915-10919，1992。簡單地說，使用缺口開放補償(gap opening penalty)10、缺口延伸補償(gapextension penalty)1比較兩個氨基酸序列以最優(yōu)化序列匹配，并且Henikoff和Henikoff(同上)的“blosum 62”評分矩陣在表3中表示(用標(biāo)準(zhǔn)單字母符號表示氨基酸)。然后按以下公式計算相同百分率
表3A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y VA 4R -1 5N -2 0 6D -2 -2 1 6C 0 -3 -3 -3 9Q -1 1 0 0 -3 5E -1 0 0 2 -4 2 5G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8I -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5W -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4使用上述比率用相似方法測定多核苷酸分子的序列相同性。
不同的zsig44多肽或基本上同源的zsig44多肽以帶有一個或多個氨基酸置換、缺失或增加為特征。這些改變優(yōu)選的是具次要性質(zhì)的變化，即保守氨基酸的置換(見表4)和其它不顯著影響蛋白或多肽折疊或活性的置換；小的刪除，一般1至30個氨基酸；以及小的氨基或羧基末端延伸如氨基末端甲硫氨酸殘基、長達20-25個殘基的小接頭肽或有助于純化的小延伸如親和標(biāo)記物。因此本發(fā)明也包括含有標(biāo)記物如多組氨酸臂、蛋白質(zhì)A(Nilsson等，歐洲分子生物學(xué)組織雜志，41075，1985；Nilsson等，酶學(xué)方法1983，1991)、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(Smith和Johnson，基因，6731，1988)、麥芽糖結(jié)合蛋白(Kellerman和Ferenci，酶學(xué)方法，90459-463，1982；Guan等，基因6721-30，1987)、硫氧還蛋白、遍在蛋白、纖維素結(jié)合蛋白、T7聚合酶或其它抗原表位或結(jié)合結(jié)構(gòu)域的zsig44多肽。一般參見Ford等，蛋白表達和純化，295-107，1991。編碼親和標(biāo)記物的DNA可以從商業(yè)供應(yīng)商(例如PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ；New England Biolabs，Beverly，MA)獲得。含有親和標(biāo)記物的多肽可以進一步包含zsig44多肽和親和標(biāo)記物之間的蛋白水解切割位點。優(yōu)選的位點是凝血酶切割位點和因子Xa切割位點。另外可以對zsig44的氨基酸殘基進行光親和標(biāo)記(Brunner等，生物化學(xué)年鑒62483-514，1993和Fedan等，Biochem.Pharmacol.331167-1180，1984)。
表4保守的氨基酸替換堿性的 精氨酸賴氨酸組氨酸酸性的 谷氨酸天冬氨酸極性的 谷氨酰胺天冬酰胺疏水的 亮氨酸異亮氨酸纈氨酸芳香族的 苯丙氨酸色氨酸酪氨酸小的 甘氨酸丙氨酸絲氨酸蘇氨酸甲硫氨酸本發(fā)明的蛋白也可以含有非天然存在的氨基酸殘基。非天然存在的氨基酸包括但不限于反-3-甲基脯氨酸、2，4-甲烷脯氨酸、順-4-羥脯氨酸、反-4-羥脯氨酸、N-甲基甘氨酸、別-蘇氨酸、甲基蘇氨酸、羥乙基半胱氨酸、羥乙基高半胱氨酸、硝基谷氨酰胺、高谷氨酰胺、六氫吡啶羧酸、四氫噻唑羧酸、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、3，3-二甲基脯氨酸、叔亮氨酸、正纈氨酸、2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨酸、4-重氮苯丙氨酸和4-氟苯丙氨酸、4-羥脯氨酸、6-N-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸和α-甲基絲氨酸。將非天然存在的氨基酸殘基摻入蛋白的幾種方法在本領(lǐng)域中已知。例如，可以使用其中使用化學(xué)氨?；种苿﹖RNA抑制無義突變的體外系統(tǒng)。合成氨基酸和氨酰tRNA的方法在本領(lǐng)域中已知。在含有大腸桿菌S30提取物和商業(yè)可獲得的酶及其它試劑的無細(xì)胞體系中進行含有無義突變的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄和翻譯。蛋白通過層析得到純化。參見例如Robertson等，美國化學(xué)協(xié)會雜志1132722，1991；Ellman等，酶學(xué)方法202301，1991；Chung等，科學(xué)259806-809，1993和Chung等，美國國家科學(xué)院院報9010145-10149，1993)。在第二種方法中，通過微注射突變的mRNA和化學(xué)氨?；种苿﹖RNA在非洲爪蟾卵母細(xì)胞中進行翻譯(Turcatti等，生物化學(xué)雜志27119991-19998，1996)。在第三種方法中，在不含要置換的天然氨基酸和含有所需的非天然存在的氨基酸(如2-重氮苯丙氨酸、3-重氮苯丙氨酸、4-重氮苯丙氨酸或4-氟苯丙氨酸)的條件下培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞。將非天然存在的氨基酸在其天然對應(yīng)物位置摻入蛋白中。見Koide等，生物化學(xué)，337470-7476，1994。通過體外化學(xué)修飾可以將天然存在的氨基酸殘基轉(zhuǎn)變成非天然存在的種類。化學(xué)修飾可以與定點誘變結(jié)合以進一步擴展替換的范圍(Wynn和Richards，蛋白質(zhì)科學(xué)，2395-403，1993)。
有限數(shù)量的非保守氨基酸、不由遺傳密碼子編碼的氨基酸、非天然存在的氨基酸以及非天然的氨基酸可替換zsig44氨基酸殘基。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法如定點誘變或丙氨酸掃描誘變，可以鑒定本發(fā)明zsig44多肽中的必需氨基酸(Cunningham和Wells，科學(xué)，2441081-1085，1989；Bass等，美國國家科學(xué)院院報884498-4502，1991)。在后一種技術(shù)中，在分子的每個殘基處引入單個丙氨酸突變，并檢測生成的突變分子的如下公開的生物學(xué)活性(例如電壓依賴型轉(zhuǎn)運)以鑒定對分子活性關(guān)鍵的氨基酸殘基。也參見Hilton等，生物化學(xué)雜志，2714699-4708，1996。通過結(jié)構(gòu)的物理分析也可確定蛋白-蛋白和分子內(nèi)氨基酸相互作用位點，如通過諸如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射或光親和標(biāo)記的技術(shù)并結(jié)合推測的接觸位點氨基酸的突變測定的。參見例如de vos等，科學(xué)，255306-312，1992；Smith等，分子生物學(xué)雜志224899-904，1992；Wlodaver等，F(xiàn)EBS Lett.30959-64，1992。也可以從與相關(guān)蛋白如已知離子通道的同源性分析推測zsig44多肽必需氨基酸的性質(zhì)。
另外，識別公認(rèn)的高度抗原性位點的zsig44的疏水性圖可用于預(yù)測此處公開的允許的氨基酸替換和抗體表位。疏水性圖的制備和抗原位點的測定、允許的氨基酸替換和表位為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知。
使用已知的誘變和篩選方法可以制備和檢測多個氨基酸替換。例如參見Reidhaar-Olson和Sauer，科學(xué)，24153-57，1988或Bowie和Sauer，美國國家科學(xué)院院報，862152-2156，1989。簡要地說，這些作者公開了在多肽中同時隨機選取兩個或多個位置、選擇有功能的多肽以及隨后對誘變的多肽測序以確定每個位置允許置換的范圍的方法?？梢允褂玫钠渌椒òㄊ删w展示(如Lowman等，生物化學(xué)3010832-10837，1991；Ladner等，美國專利No.5,223,409；Huse，WIPO公開文本W(wǎng)O 92/06204)和定區(qū)域誘變(Derbyshire等，基因46145，1986；Ner等，DNA，7127，1988)。
公開的Zsig44 DNA和多肽序列的變體可以通過Stemmer，自然370389-91，1994；Stemmer，美國國家科學(xué)院院報9110747-10751，1994和WIPO公開文本W(wǎng)O 97/20078公開DNA移動法制備。簡而言之，通過親本DNA的隨機片段的體外同源重組，接著用RCR重新裝配，得到隨機引入的點突變來制備變體DNA。此技術(shù)可以通過使用親本DNA家族如等位變體或來自不同種的DNA來修飾以在此方法中導(dǎo)入額外的可變性。所需活性的選擇或篩選、隨后誘變的額外重復(fù)以及分析通過選擇有利突變同時排除有害變化來提供序列的快速“進化”。
此處公開的誘變方法可以與高效率的自動篩選方法結(jié)合以在宿主細(xì)胞中檢測克隆的、誘變的多肽的活性。編碼活性多肽(例如在非洲爪蟾卵母細(xì)胞或哺乳動物細(xì)胞中增加電壓依賴型轉(zhuǎn)運或用針對zsig44產(chǎn)生的抗體檢測細(xì)胞表面上的表達)的誘變的DNA分子可以從宿主細(xì)胞得到回收并用現(xiàn)代儀器快速測序。這些方法允許目的多肽中單個氨基酸重要性的快速測定，并可以應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
使用此處討論的方法，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以鑒定和/或制備保留野生型蛋白的離子通道或調(diào)節(jié)特性的SEQ ID NO2的各種多肽片段或變體?；钚钥赏ㄟ^使用此處公開的技術(shù)評估。這樣的多肽可以包括來自例如跨膜、中心及細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的部分或全部的其它氨基酸；其它結(jié)構(gòu)域；親和標(biāo)記物等。這些多肽也可以包括如上充分公開的其它多肽片段。
對于任何zsig44多肽，包括變體和融合蛋白，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以容易地使用上表1和2中所示的信息制備編碼變體的完全簡并多核苷酸序列。
本發(fā)明的多肽，包括全長蛋白、其片段、生物活性片段和融合蛋白，可以根據(jù)傳統(tǒng)技術(shù)在遺傳工程宿主細(xì)胞中合成。適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞是那些可以用外源DNA轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染并在培養(yǎng)中生長的細(xì)胞類型，包括細(xì)菌、真菌細(xì)胞和培養(yǎng)的高等真核細(xì)胞。優(yōu)選的是真核細(xì)胞，尤其是多細(xì)胞生物的培養(yǎng)細(xì)胞。操作克隆的DNA分子和將外源DNA導(dǎo)入許多宿主細(xì)胞的技術(shù)由Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，紐約，1989和Ausubel等(編輯)，分子生物學(xué)常用方法，John Wiley和Sons，Inc.，紐約，1987公開。
總的來說，將編碼zsig44多肽的DNA序列可操作地與其表達所需的其它基因元件，一般包括表達載體內(nèi)轉(zhuǎn)錄啟動子和終止子連接。載體一般也將含有一個或多個選擇性標(biāo)記以及一個或多個復(fù)制起點，盡管本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到在某些系統(tǒng)內(nèi)也可以在分開的載體上提供選擇性標(biāo)記并且通過整合入宿主細(xì)胞基因組提供外源DNA的復(fù)制。啟動子、終止子、選擇性標(biāo)記、載體和其它元件的選擇是本領(lǐng)域普通技術(shù)水平內(nèi)的常規(guī)設(shè)計。許多這樣的元件在文獻中得到描述并可通過商業(yè)供應(yīng)商得到。
為了將zsig44多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞分泌通路，在表達載體中提供分泌信號序列(也已知為前導(dǎo)序列、早前肽或前肽)。分泌信號序列與Zsig44 DNA序列可操作連接，即兩個序列在正確閱讀框架中連接并定位以將新合成的多肽導(dǎo)入宿主細(xì)胞的分泌通路。分泌信號序列一般定位于編碼目的多肽的DNA序列的5’端，盡管某些信號序列可以定位于目的DNA序列的別處(參見例如Welch等，美國專利No.5,037,743；Holland等，美國專利No.5,143,830)。
選擇性地，本發(fā)明多肽中所含的和此處公開的分泌信號序列可用于將其它多肽導(dǎo)入分泌通路。本發(fā)明提供這樣的融合多肽。信號融合多肽可以得到制備，其中使用本領(lǐng)域已知的和此處公開的方法，將來自SEQ ID NO2的殘基1(Met)-殘基16(Ala)的分泌信號序列與另一多肽可操作連接。優(yōu)選地，將本發(fā)明融合多肽中所含的分泌信號序列與另一多肽的氨基末端融合以將其它肽導(dǎo)入分泌通路。這樣的構(gòu)建體具有在本領(lǐng)域中已知的大量用途。例如，這些新的分泌信號序列融合構(gòu)建體可介導(dǎo)正常不分泌蛋白的活性成分的分泌。這樣的融合可在體內(nèi)或體外用于介導(dǎo)肽通過分泌通路。
在本發(fā)明內(nèi)，培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞是適當(dāng)?shù)乃拗?。將外源DNA導(dǎo)入哺乳動物宿主細(xì)胞的方法包括磷酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wigler等，細(xì)胞，14725，1978；Corsaro和Pearson，體細(xì)胞遺傳學(xué)，7603，1981；Graham和Van der Eb，病毒學(xué)，52456，1973)、電穿孔(Neumann等，歐洲分子生物學(xué)雜志，1841-845，1982)，DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Ausubel等，同上)和脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Hawley-Nelson等，焦點，1573，1993；Ciccarone等，焦點，1580，1993)以及病毒載體(Miller，A.，Rosman，G.，生物技術(shù)7980-990，1989；Wang，Q.，F(xiàn)iner，M.，Nature Med.2714-716，1996)。在培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞中重組多肽的合成公開于例如Levinson等，美國專利No.4,713,339；Hagen等，美國專利No.4,784,950；Palmiter等，美國專利No.4,579,821和Ringold，美國專利No.4,656,134。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No.CRL 1573；Graham等，遺傳病毒學(xué)雜志，3659-72，1977)和中國倉鼠卵巢細(xì)胞系(如CHO-K1，ATCC No.CRL 61)。其它適當(dāng)?shù)募?xì)胞系在本領(lǐng)域內(nèi)已知，并可以從公共保藏單位如美國典型培養(yǎng)物保藏中心，Rockyille，Maryland獲得。一般優(yōu)選的是強轉(zhuǎn)錄啟動子，例如來自SV-40或巨細(xì)胞病毒的啟動子。參見例如，美國專利No.4,956,288。其它適當(dāng)?shù)膯幼影切﹣碜越饘倭虻鞍谆?美國專利No.4,579,821和4,601,978)的啟動子以及腺病毒主要晚期啟動子。
一般藥物選擇用于選擇已插入外源DNA的培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞。這些細(xì)胞通常稱作“轉(zhuǎn)染子”。在選擇性藥物存在時培養(yǎng)的并能夠?qū)⒛康幕騻鬟f給子代的細(xì)胞稱為“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染子”。優(yōu)選的選擇性標(biāo)記是編碼對抗生素新霉素抗性的基因。選擇在新霉素型藥物如G-418等存在時進行。選擇系統(tǒng)也可以用于增加目的基因的表達水平，稱之為“擴增”的過程。通過在低水平選擇藥物存在時培養(yǎng)轉(zhuǎn)染子，然后增加選擇性藥物的量以選擇合成高水平導(dǎo)入基因產(chǎn)物的細(xì)胞來進行擴增。優(yōu)選的可擴增的選擇性標(biāo)記是賦予氨甲蝶呤抗性的二氫葉酸還原酶。也可以使用其它藥物抗性基因(如潮霉素抗性、多藥抗性、嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶)。導(dǎo)入變化的表型的可選標(biāo)記，例如綠色熒光蛋白或細(xì)胞表面蛋白如CD4、CD8、I類MHC、胎盤堿性磷酸酶可用于通過諸如FACS分選或磁珠分離技術(shù)的方法從非轉(zhuǎn)染細(xì)胞中選出轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
也可以使用其它更高等的真核細(xì)胞作為宿主，包括昆蟲細(xì)胞、兩棲動物細(xì)胞(例如非洲爪蟾卵母細(xì)胞)、植物細(xì)胞和鳥類細(xì)胞。昆蟲細(xì)胞的轉(zhuǎn)化和其中外源多肽的合成公開于Guarino等，美國專利No.5,162,222；Bang等，美國專利No.4,775,624和WIPO公開文本W(wǎng)O 94/06463。發(fā)根農(nóng)桿菌作為在植物細(xì)胞中表達基因的載體的用途已在Sinkar等，生物科學(xué)雜志(Bangalore)，1147-58，1987中綜述。
昆蟲細(xì)胞可以用一般源于苜蓿丫紋夜蛾核型多角體病毒(AcNPV)的重組桿狀病毒侵染。用兩種方法之一將編碼zsig44多肽的DNA插入桿狀病毒基因組以取代AcNPV多角體蛋白基因編碼序列。第一種方法是在野生型AcNPV和在AcNPV側(cè)翼含有zsig44的轉(zhuǎn)化載體之間同源DNA重組的傳統(tǒng)方法。適當(dāng)?shù)睦ハx細(xì)胞如SF9細(xì)胞用野生型AcNPV侵染和用含有與AcNPV多角體蛋白基因啟動子、終止子和側(cè)翼序列可操作連接的zsig44多肽的轉(zhuǎn)化載體侵染。參見King，L.A.和Possee，R.D.，桿狀病毒表達系統(tǒng)實驗室指南，London，Chapman & Hall；O’Reilly，D.R.等，桿狀病毒載體實驗室手冊，New York，Oxford University Press，1994以及Richardson，C.D.編輯，桿狀病毒表達方法分子生物學(xué)方法，Totowa，NJ，Humana Press，1995。昆蟲細(xì)胞中的天然重組將形成含有由多角體蛋白啟動子啟動的zsig44的重組桿狀病毒。重組病毒菌種用本領(lǐng)域常用的方法制備。
制備重組桿狀病毒的第二種方法是利用Luckow所述的以轉(zhuǎn)座子為基礎(chǔ)的系統(tǒng)(Luckow，V.A等，病毒學(xué)雜志674566-4579，1993)。此系統(tǒng)在Bac-to-BacTM試劑盒(Life Technologies，Rockville，MD)中出售。此系統(tǒng)利用含有轉(zhuǎn)座子Tn7的轉(zhuǎn)染載體pFastBaclTM(Life Technologies)以將編碼zsig44多肽的DNA移入在大腸桿菌中保持的桿狀病毒基因組成為稱作“桿?！钡拇筚|(zhì)粒。pFastBaclTM轉(zhuǎn)化載體使用AcNPV多角體蛋白啟動子以啟動目的基因的表達，在此例中啟動zsig44的表達。然而，可以對pFastBaclTM進行相當(dāng)程度的修飾。參見Hill-Perkins，M.S.和Possee，R.D.，普通病毒學(xué)雜志71971-976，1990；Bonning，B.C.等，普通病毒學(xué)雜志751551-1556，1994以及Chazenbalk，G.D.和Rapoport，B.，生物化學(xué)雜志2701543-1549，1995。另外，轉(zhuǎn)化載體可以包含框架內(nèi)在表達zsig44多肽的DNA的C-或N-末端與編碼附加表位如Glu-Glu附加表位的DNA的融合(Grussenmeyer，T.等，美國國家科學(xué)院院報827952-7954，1985)。使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)，將含有zsig44的轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌并篩選含有重組桿狀病毒特征即打斷的LacZ基因的桿粒。使用常用技術(shù)分離含有重組桿狀病毒基因組的桿粒DNA并將其用于轉(zhuǎn)染草地夜蛾細(xì)胞如SF9細(xì)胞。表達zsig44的重組病毒隨后得到制備。重組病毒菌種用本領(lǐng)域常用的方法制備。
重組病毒用于侵染宿主細(xì)胞，典型地是源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)的細(xì)胞系。一般參見Glick和Pasternak，分子生物學(xué)重組DNA的原理和應(yīng)用，ASM Press，Washington，D.C.，1994。另一適當(dāng)?shù)募?xì)胞系是源于Trichoplusia ni的High FiveoTM細(xì)胞系(Invitrogen)(美國專利No.5,300,435)。使用商購的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)和保持這些細(xì)胞。適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基是用于Sf9細(xì)胞的Sf900IITM(Life Technologies)或ESF 921TM(Expression Systems)以及用于T.ni細(xì)胞的Ex-cell0405TM(JRH BioSciences，Lenexa，KS)或ExpressFiveOTM(Life Technologies)。當(dāng)細(xì)胞長到約2-5×105細(xì)胞至1-2×106細(xì)胞的接種密度時，加入感染復(fù)數(shù)(MOI)為0.1-10、更典型的接近3的重組病毒菌種。所用的方法廣泛描述于可得到的實驗室手冊(King，L.A.和Possee，R.D.，同上；O’Reilly，D.R.等，同上；Richardson，C.D.，同上)。可以使用此處描述的方法實現(xiàn)zsig44多肽隨后從上清液的純化。
真菌細(xì)胞，包括酵母細(xì)胞也可在本發(fā)明內(nèi)使用。在此方面特別有利的酵母種包括釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母和PichiaMethanolica。用外源DNA轉(zhuǎn)化釀酒酵母細(xì)胞以及從其生產(chǎn)重組多肽的方法公開于例如Kawasaki，美國專利No.4,599,311；Kawasaki等，美國專利No.4,931,373；Brake，美國專利No.4,870,008；Welch等，美國專利No.5,037,743和Murray等，美國專利No.4,845,075。通過由選擇性標(biāo)記，通常是抗藥性或在缺少特定營養(yǎng)(如亮氨酸)時生長的能力確定的表型來選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在釀酒酵母中使用的優(yōu)選載體系統(tǒng)是由Kawasaki等(美國專利No.4,931,373)公開的POT1載體系統(tǒng)，它允許通過在含葡萄糖的培養(yǎng)基上的生長選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。在酵母中使用的適當(dāng)啟動子和終止子包括那些來自糖酵解基因(參見例如Kawasaki，美國專利No.4,599,311；Kingsman等，美國專利No.4,615,974和Bitter，美國專利No.4,977,092)和醇脫氫酶基因的啟動子和終止子。也參見美國專利No.4,990,446；5,063,154；5,139,936和4,661,454。用于其它酵母包括多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母、乳酸克魯維酵母、脆壁克魯維酵母、玉蜀黍黑粉菌、巴斯德畢赤酵母、季也蒙畢赤酵母、Pichia methaolica和Candida maltosa的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)在本領(lǐng)域內(nèi)已知。參見例如Gleeson等，遺傳微生物學(xué)雜志，1323459-3465，1986和Cregg，美國專利No.4,882,279。根據(jù)Mcknight等，美國專利No.4,935,349的方法可以使用曲霉細(xì)胞。轉(zhuǎn)化Acremoniumchrysogenum的方法由Sumino等，美國專利No.5,162,228公開。轉(zhuǎn)化脈孢菌的方法由Lambowitz，美國專利No.4,486,533公開。
根據(jù)傳統(tǒng)方法，在含有營養(yǎng)物和所選宿主細(xì)胞生長所需的其它成份的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。許多適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基包括確定成分的培養(yǎng)基和復(fù)合培養(yǎng)基在本領(lǐng)域內(nèi)已知并且一般包含碳源、氮源、必需氨基酸、維生素和礦物質(zhì)。如果需要，培養(yǎng)基也可以含有諸如生長因子或血清的成份。生長培養(yǎng)基一般將例如通過藥物選擇或缺失必需營養(yǎng)物對含有外源DNA的細(xì)胞進行選擇，其中缺失的必需營養(yǎng)物可以由表達載體所攜帶的或共轉(zhuǎn)染進宿主細(xì)胞的選擇性標(biāo)記來補償。
Pichia methanolica用作重組蛋白合成的宿主公開于WIPO公開文本W(wǎng)O 97/17450，WO 97/17451，WO 98/02536和WO 98/02565中。用于轉(zhuǎn)化P.methanolica的DNA分子常制備為雙鏈、環(huán)狀質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)化之前優(yōu)選地將質(zhì)粒線形化。對于P.methanolica中的多肽合成，優(yōu)選的是質(zhì)粒中的啟動子和終止子是P.methanolica基因如P.methanolica醇利用基因(AUG1或AUG2)的啟動子和終止子。其它有用的啟動子包括二羥丙酮合酶(DHAS)、甲酸脫氫酶(FMD)、過氧化氫酶(CAT)基因。為有助于DNA整合入宿主染色體，優(yōu)選的是在質(zhì)粒完整表達片段兩端側(cè)翼含有宿主DNA序列。用于Pichiamethanolica的優(yōu)選選擇性標(biāo)記是P.methanolica ADE2基因，它編碼磷酸核糖基-5-氨基咪唑羧化酶(AIRC；EC 4.1.1.21)，此酶使ade2宿主能在缺少腺嘌呤時生長。對于大量工業(yè)生產(chǎn)，優(yōu)選的是使用已刪除兩個甲醇利用基因(AUG1和AUG2)的宿主細(xì)胞。為生產(chǎn)分泌的蛋白，優(yōu)選的是使用液泡蛋白酶基因(PEP4和PRB1)缺陷的宿主細(xì)胞。使用電穿孔以有助于將含有編碼目的多肽的DNA的質(zhì)粒導(dǎo)入P.methanolica細(xì)胞。優(yōu)選的是通過使用具有2.5-4.5kV/cm、優(yōu)選地約3.75kV/cm電場和1-40毫秒、最優(yōu)選地約20毫秒時間常數(shù)(t)的指數(shù)衰減的脈沖電場電穿孔來轉(zhuǎn)化P.methanolica細(xì)胞。
原核宿主細(xì)胞包括細(xì)菌大腸桿菌、芽孢桿菌和其它屬的菌株也可用作本發(fā)明的宿主細(xì)胞。轉(zhuǎn)化這些宿主和表達外源DNA序列的技術(shù)在本領(lǐng)域內(nèi)已知(參見例如Sambrook等，同上)。當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達zsig44多肽時，多肽通?？梢宰鳛椴蝗苄灶w粒存留在胞質(zhì)中或可以通過細(xì)菌分泌序列導(dǎo)入周質(zhì)間隙。在前一種情況下，裂解細(xì)胞并回收顆粒，并且使用例如異硫氰酸胍或尿素等變性。然后變性的多肽可以通過稀釋變性劑，例如通過逆著尿素等溶液以及還原的和氧化的谷胱甘肽的混合物透析，接著逆著緩沖鹽溶液透析而重新折疊并形成二聚體。在后一種情況下，通過破碎細(xì)胞(通過例如超聲波處理或滲透休克)釋放周質(zhì)間隙的內(nèi)容物并回收蛋白可以從周質(zhì)間隙回收可溶和有功能形式的多肽，從而避免變性和重新折疊的需要。
將P.methanolica細(xì)胞于約25℃-35℃溫度培養(yǎng)在包含充足碳、氮和微量元素的培養(yǎng)基中。通過傳統(tǒng)方法如振蕩小培養(yǎng)瓶或發(fā)酵罐噴射向液體培養(yǎng)物提供充足的通風(fēng)。優(yōu)選的P.methanolica培養(yǎng)基是YEPD[2％D-葡萄糖、2％BactoTM蛋白胨(Peptone)(DifcoLaboratories，Detroit，MI)、1％BactoTM酵母提取物(DifcoLaboratories)、0.004％腺嘌呤和0.006％L-亮氨酸]。
優(yōu)選的是將蛋白純化至＞80％純度，更優(yōu)選至＞90％純度，甚至更優(yōu)選＞95％，并且特別優(yōu)選的是藥物純化狀態(tài)，即就污染的大分子、尤其是其它蛋白和核酸來說，純度＞99.9％，并且不含感染和致熱因子。優(yōu)選地，純化的蛋白基本上不含其它蛋白，尤其是動物來源的其它蛋白。
表達的重組zsig44多肽(或嵌合的zsig44多肽)可以使用分級分離和/或傳統(tǒng)純化方法及介質(zhì)純化。硫酸銨沉淀和酸或離液劑抽提物可以用作分級分離的樣品。典型的純化步驟可以包括羥基磷灰石層析、大小排阻層析、FPLC和反相高效液相層析。適當(dāng)?shù)膶游鼋橘|(zhì)包括衍生的葡聚糖、瓊脂糖、纖維素、聚丙烯酰胺、特殊性能硅石等。優(yōu)選的是PEI、DEAE、QAE和Q衍生物。典型的層析介質(zhì)包括那些用苯基、丁基或辛基衍生的那些介質(zhì)，例如苯基-SepharoseFF(Pharmacia)、東洋珍珠丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或聚丙烯樹脂如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。適當(dāng)?shù)墓腆w支持物包括玻璃珠、硅基樹脂、纖維素樹脂、瓊脂糖珠、交聯(lián)瓊脂糖珠、聚苯乙烯珠、交聯(lián)聚丙烯酰胺樹脂等，它們在所用條件下是不可溶的。這些支持物可以用反應(yīng)性基團進行修飾，反應(yīng)性基團允許通過氨基、羧基、硫氫基、羥基和/或碳水化合物部分結(jié)合蛋白。偶聯(lián)化學(xué)法的例子包括溴化氰活化、N-羥琥珀酰胺活化、環(huán)氧化物活化、巰基活化、酰肼活化及對碳二亞胺偶聯(lián)化學(xué)法的羧基和氨基衍生物。這些和其它固體介質(zhì)在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知并廣泛應(yīng)用，并可以從商業(yè)供應(yīng)商獲得。將受體多肽與支持物介質(zhì)結(jié)合的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。特定方法的選擇是一種常規(guī)設(shè)計，部分決定于所選支持物的特性。參見例如親和層析原理和方法，Pharmacia LKBBiotechnology，Uppsala，Sweden，1988。
本發(fā)明的多肽也可以利用其結(jié)構(gòu)和物理特性分離。例如，固定金屬離子吸附(IMAC)層析可用于純化富集組氨酸的蛋白，包括那些含有多聚組氨酸標(biāo)記物的蛋白。簡單地說，首先用二價金屬離子使凝膠帶電以形成螯合物(E.Sulkowski，生物化學(xué)趨勢，3∶1-7，1985)。取決于所使用的金屬離子，富集組氨酸的蛋白以不同的親和力吸附于此基質(zhì)上，并通過競爭性洗脫、降低pH值或使用強螯合劑來洗脫。其它純化方法包括通過凝集素親和層析和離子交換層析純化糖基化蛋白(酶學(xué)方法，第182卷，“蛋白純化指南”，M.Deutscher(編輯)，學(xué)術(shù)出版社，San Diego，1990，第529-539頁)。在本發(fā)明的另一實施方案中，可以構(gòu)建目的多肽與親和標(biāo)記物(如多聚組氨酸、麥芽糖結(jié)合蛋白、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域)的融合體以利于純化。
而且，利用本領(lǐng)域描述的方法，可以使用本發(fā)明的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域結(jié)合其它已知離子通道(如MAT、PLM和IsK)或異源蛋白的區(qū)域或結(jié)構(gòu)域構(gòu)建多肽融合或雜合zsig44離子通道蛋白(Sambrook等，同上；Altschul等，同上；Picard D.，Cur.Opin.，Biology，5.511-515，1994以及其中的參考文獻)。這些方法使得可以測定目的多肽中更大結(jié)構(gòu)域或區(qū)域的生物學(xué)重要性。這樣的雜合可改變反應(yīng)動力學(xué)、結(jié)合、收縮或擴大底物特異性，或者改變多肽的組織和細(xì)胞定位，并可應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。
融合蛋白可用本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員已知的方法通過制備融合蛋白的每個成分并將它們化學(xué)連接來制備。選擇性地，編碼正確閱讀框中的融合蛋白的每個成分的多核苷酸可以用已知技術(shù)制備并用此處所述的方法表達。例如，可以在本發(fā)明的zsig44和來自另一離子通道如MAT-8或IsK的有功能等價結(jié)構(gòu)域之間交換賦予生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)域的部分或全部。這樣的結(jié)構(gòu)域包括但不限于此處所述的分泌信號序列、跨膜結(jié)構(gòu)域、中心結(jié)構(gòu)域和中心結(jié)構(gòu)域側(cè)翼的區(qū)域。取決于要構(gòu)建的融合，預(yù)計這樣的離子通道具有與本發(fā)明的多肽或其它已知離子通道蛋白(如MAT-8、CHIF或IsK)相同或相似的生物功能模式。而且，這樣的融合蛋白可能表現(xiàn)此處公開的其它特性。
zsig44多肽或其片段也可以通過化學(xué)合成制備。zsig44多肽可以是單體或多聚體；糖基化或非糖基化；pegylated或non-pegylated；可以包含或不包含起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明的多肽也可通過固相合成、部分固相方法、片段縮合或傳統(tǒng)的溶液合成來合成。合成多肽的方法在本領(lǐng)域眾所周知。參見例如，Merrifield，美國化學(xué)學(xué)會雜志852149，1963；Kaiser等，生物化學(xué)分析34595，1970。在固相載體上完全合成目的肽之后，用可從樹脂上將多肽切割下來的試劑處理肽-樹脂并去除大部分側(cè)鏈保護基團。這樣的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已非常成熟。
本發(fā)明分子的活性可以使用許多測定離子通道活性的分析法測定。特別感興趣的是跨細(xì)胞膜的離子轉(zhuǎn)移。這樣的分析法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。評定新氯離子通道或它們的調(diào)節(jié)劑的活性的分析法包括但不限于測定非洲爪蟾卵母細(xì)胞中電壓依賴性轉(zhuǎn)運的生物分析(參見Rudy，B.和Iverson，L.E.編輯，酶學(xué)方法，第207卷，AcademicPress，San Diego，CA，1992；Hamill，O.P.等，PfluegersArch.39185-100，1981；Moorman，J.R.等，生物化學(xué)雜志26714551-14554，1992；Durieux，M.E.等，美國生理學(xué)雜志263C896-C900，1992)。此方法包括將體外表達的mRNA注射入分離的卵母細(xì)胞并使用膜片鉗技術(shù)評估電壓依賴型轉(zhuǎn)運。離子通道或其調(diào)節(jié)劑可以在此分析系統(tǒng)中增加電壓依賴型轉(zhuǎn)運。此系統(tǒng)可以應(yīng)用于其它細(xì)胞類型如昆蟲細(xì)胞和哺乳動物細(xì)胞(參見Rudy，B.，Iverson，L.E.編輯，同上)。其它分析包括借助使用螯合劑染料如Fura2間接測定哺乳動物或其它細(xì)胞類型中的離子通道活性(參見例如James-Kracke M.R.，普通生理學(xué)雜志9941-62，1992；Raghu，P.等，基因190151-156，1997)。離子通道活性也可以通過使用放射標(biāo)記的離子如125I流出分析法來監(jiān)測(Xia，Y.等，膜生物學(xué)雜志151269-279，1996)。其它分析法測定哺乳動物細(xì)胞中由離子通量或離子通道磷酸化作用發(fā)出信號的基因表達的變化；例如通過在適當(dāng)啟動子如下述啟動子下啟動可測定報告基因熒光素酶基因的表達。
分析本發(fā)明蛋白活性的可選體內(nèi)方法包括病毒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。用于此目的的病毒例子包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘病毒和腺伴隨病毒(AAY)。雙鏈DNA病毒腺病毒是目前得到最佳研究的轉(zhuǎn)移外源核酸的基因轉(zhuǎn)移載體(綜述參見T.C.Becker等，細(xì)胞生物學(xué)方法學(xué)43161-89，1994以及J.T.Douglas和D.T.Curiel，科學(xué)&醫(yī)學(xué)444-53，1997)。腺病毒系統(tǒng)提供幾個優(yōu)點腺病毒可以(i)容納相對大的DNA插入；(ii)培養(yǎng)到高滴度；(iii)感染廣譜的哺乳動物細(xì)胞類型；(iv)與含有不同啟動子的大量可用載體一起使用。同時，因為腺病毒在血流中穩(wěn)定，它們可以通過靜脈注射施用。
通過刪除腺病毒基因組的部分，可以容納大的外源DNA插入片段(高達7kb)。這些插入片段可以通過連接或通過用共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒同源重組摻入病毒DNA。在典型的系統(tǒng)中，從病毒載體刪除必需E1基因，并且病毒將不會復(fù)制，除非宿主提供E1基因(例如人293細(xì)胞系)。當(dāng)靜脈注射給完整動物時，腺病毒主要靶向肝。如果腺病毒轉(zhuǎn)移系統(tǒng)缺乏E1基因，病毒就不能在宿主細(xì)胞中復(fù)制。然而，宿主組織(如肝)將表達和加工(并且如果存在分泌信序列，分泌)外源蛋白。分泌的蛋白將進入高度囊泡化肝中的循環(huán)，并且可以測定對侵染的動物的影響。
腺病毒系統(tǒng)也可用于體外蛋白合成。通過在細(xì)胞不迅速分化的條件下培養(yǎng)腺病毒侵染的非293細(xì)胞，細(xì)胞可在延長的時期內(nèi)合成蛋白。例如，將BHK細(xì)胞培養(yǎng)至鋪滿細(xì)胞瓶，然后與編碼目的分泌蛋白的腺病毒載體接觸。然后在無血清條件下培養(yǎng)細(xì)胞，這種條件，使侵染的細(xì)胞能在不明顯分化的情況下存活幾周。選擇性地，腺病毒載體侵染的293S細(xì)胞可以相當(dāng)高的細(xì)胞密度在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)以合成大量蛋白(見Garnier等，細(xì)胞技術(shù)15145-55，1994)。用任一方法，都可以從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液重復(fù)分離表達的、分泌的外源蛋白。在感染的293S細(xì)胞合成方法中，非分泌的蛋白也可以有效地獲得。
zsig44的組織分布表明其在腎或骨髓功能中的作用。zsig44可作用為骨髓、腎或其它組織如心和脊髓中的新氯離子通道或調(diào)節(jié)已存在或未知的離子通道。例如，已知上面公開的幾種CLC氯離子通道或CLC-1和CLC-L人同系物是腎特異的，并且可能受zsig44調(diào)節(jié)。而且，zsig44可能在與遺傳和其它人體疾病狀態(tài)如糖尿病、腎結(jié)石、骨病、造血失調(diào)、免疫失調(diào)、白血病、高血壓、心臟病和神經(jīng)疾病有關(guān)的腎、骨髓、心和/或神經(jīng)病理學(xué)中起作用。zsig44活性的拮抗劑或興奮劑的發(fā)現(xiàn)將提供zsig44多肽的治療用途。根據(jù)所觀察到的此zsig44的組織分布，興奮劑(包括天然配體、底物、輔因子等)和拮抗劑具有體外和體內(nèi)應(yīng)用潛力。
本發(fā)明的蛋白也用于以細(xì)胞為基礎(chǔ)篩選zsig44的調(diào)節(jié)劑(例如拮抗劑和興奮劑)。拮抗劑和興奮劑可以幾種方式如調(diào)節(jié)活性、基因表達、與其它離子通道或離子通道亞單位結(jié)合影響zsig44(Kim，J.W.等，生物化學(xué)和生物物理學(xué)報350133-135，1997)。這樣的拮抗劑和興奮劑可以分別通過降低或增加經(jīng)離子通道的離子轉(zhuǎn)運；或者通過影響zsig44對其它離子通道的推測調(diào)節(jié)功能或影響zsig44或其亞基作為直接離子通道的活性來影響zsig44多肽。這種增加或降低通過評估電壓依賴型轉(zhuǎn)運或用本領(lǐng)域內(nèi)已知的另一適當(dāng)分析系統(tǒng)來測定。在這樣的應(yīng)用中，zsig44單獨表達或與由本發(fā)明多肽調(diào)節(jié)的指示劑離子通道共表達。構(gòu)建這樣的細(xì)胞的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知并在此處公開。優(yōu)選的指示劑離子通道具有可穩(wěn)定測量的生物學(xué)活性如可測量的電壓轉(zhuǎn)運或用熒光螯合劑染料如Fura指示的鈣通量。這樣的活性分析在本領(lǐng)域內(nèi)已知。通過在與下述各種試劑接觸后篩選細(xì)胞的電壓轉(zhuǎn)運成鈣通量來鑒定拮抗劑和興奮劑。電壓轉(zhuǎn)運或指示劑變化反映出相對不用試劑處理對照細(xì)胞，試劑通過增強或抑制zsig44活性對zsig44發(fā)揮的活性。例如，相對于對照，增加zsig44活性的興奮劑將導(dǎo)致增加的轉(zhuǎn)運。相反，相對于對照，降低zsig44活性的拮抗劑將引起降低的轉(zhuǎn)運。試劑來源包括任何天然或化學(xué)來源，包括但不限于植物、微生物和真菌提取物、化學(xué)品庫以及組合化學(xué)品庫等。建立和使用這種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的篩選分析的方法在本領(lǐng)域內(nèi)已知。
zsig44也可用于鑒定其活性的調(diào)節(jié)劑(如拮抗劑)。將測試化合物加入此處公開的分析中以鑒定抑制zsig44活性的化合物。除了此處公開的這些分析法，在一系列設(shè)計用于測定zsig44結(jié)合、寡聚化或zsig44依賴型細(xì)胞反應(yīng)的刺激作用/抑制作用的分析法中，可以對樣品進行抑制zsig44活性的測試。例如，可以用對zsig44刺激的細(xì)胞通路有反應(yīng)的報告基因構(gòu)建體轉(zhuǎn)染zsig44反應(yīng)性細(xì)胞系。此類報告基因構(gòu)建體在本領(lǐng)域內(nèi)已知，并且一般將包含與編碼分析可檢測的蛋白如熒光素酶的基因可操作連接的zsig44-DNA反應(yīng)元件。DNA反應(yīng)元件可以包括但不限于環(huán)AMP反應(yīng)元件(CRE)、激素反應(yīng)元件(HRE)、胰島素反應(yīng)元件(IRE)(Nasrin等，美國國家科學(xué)院院報875273-5277，1990)和血清反應(yīng)元件(SRE)(Shaw等，Cell56563-572，1989)。環(huán)AMP反應(yīng)元件綜述于Roestler等，生物化學(xué)雜志263(190)9063-9066；1988和Habener，分子內(nèi)分泌學(xué)4(8)1087-1094；1990。激素反應(yīng)元件綜述于Beato，細(xì)胞56335-344；1989。測試候選化合物、溶液、混合物或提取物由報告基因表達的zsig44刺激作用降低所證明的對靶細(xì)胞抑制zsig44活性的能力。此類分析將檢測例如通過二聚體形成直接阻斷zsig44與細(xì)胞表面結(jié)合的化合物以及阻斷這樣的結(jié)合之后的細(xì)胞通路中進程的化合物。選擇性地，使用可檢測標(biāo)記物(如125I、生物素、辣根過氧化酶、FITC等)標(biāo)記的zsig44，可以測試化合物或其它樣品對zsig44的直接阻斷或?qū)sig44與其它細(xì)胞表面分子結(jié)合的阻斷。在此類分析中，測試樣品抑制標(biāo)記的zsig44與另一蛋白結(jié)合的能力可以作為抑制活性的指示標(biāo)志，這一點可以通過第二種分析來證實。
zsig44多肽也可用于制備與zsig44表位、肽或多肽特異結(jié)合的抗體。將zsig44或其片段作用為抗原(免疫原)接種動物并引發(fā)免疫反應(yīng)。適當(dāng)?shù)目乖怯蒘EQ ID NO2的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)編碼的成熱zsig44多肽或其9-89氨基酸的連續(xù)片段。另外，適當(dāng)?shù)目乖ㄖ行慕Y(jié)構(gòu)域即SEQ ID NO2的氨基酸殘基30(Pro)-氨基酸殘基64(Lys)以及其側(cè)翼序列即SEQ ID NO2的殘基17(Leu)-殘基28(Asp)和殘基65(Ser)-殘基89(Cys)。而且，以zsig44多肽的疏水性圖為基礎(chǔ)推測的抗原片段也可以作用為制備抗體的適當(dāng)抗原。從此免疫反應(yīng)制備的抗體可以如此處公開的得到分離和純化。制備和分離多克隆和單克隆抗體的方法在本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知。參見例如免疫學(xué)常用方法，Cooligan等(編輯)，NationalInstitutes of Health，John Willey和Sons，Inc.，1995；Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，紐約，1989以及Hurrell，J.G.R.編輯，單克隆雜交瘤抗體技術(shù)和應(yīng)用，CRC出版社，Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L，1982)。
多克隆抗體可以通過用zsig44多肽或其片段免疫接種溫血動物如馬、牛、山羊、綿羊、狗、雞、兔、小鼠和大鼠中來制備，這一點對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是顯而易見的。
通過使用佐劑如明礬(氫氧化鋁)或弗氏完全或不完全佐劑可以增加zsig44多肽的免疫原性。對免疫有用的多肽也包括融合多肽如與免疫球蛋白多肽或與麥芽糖結(jié)合蛋白觸合的zsig44或其部分的融合體。多肽免疫原可以是全長分子或其部分，例如肽或可溶性zsig44蛋白。如果多肽部分是“半抗原樣的”，為了免疫接種，此部分可以有利地與大分子載體[如鑰孔血藍素(KLH)、牛血清白蛋白(BSA)或破傷風(fēng)類毒素]結(jié)合或連接。
如本文所用的，術(shù)語“抗體”包括多克隆抗體、親和純化的多克隆抗體、單克隆抗體和抗原結(jié)合片段如F(ab’)2和Fab蛋白水解片段。也包括遺傳工程的完整抗體或片段如嵌合抗體、Fv片段、單鏈抗體等以及合成的抗原結(jié)合肽和多肽。通過將非人類CDR移植到人構(gòu)架和穩(wěn)定區(qū)上或通過摻入整個非人類可變結(jié)構(gòu)域(選擇性地通過置換暴露的殘基用人樣表面“覆蓋”它們，其中結(jié)果是“覆蓋的”抗體)使非人類抗體人類化。在一些例子中，人類化抗體可以在人可變區(qū)構(gòu)架區(qū)內(nèi)容留非人殘基以增強正確的結(jié)合特性。借助人類化抗體，可以提高生物半衰期，并且在施用于人體時減少不利免疫反應(yīng)的可能。
此處對產(chǎn)生或選擇抗體有用的其它技術(shù)包括在體外使淋巴細(xì)胞與zsig44蛋白或肽接觸以及在噬菌體或類似載體中選擇抗體展示文庫(例如通過固定的或標(biāo)記的zsig44蛋白或肽的使用)。編碼具有潛在zsig44多肽結(jié)合結(jié)構(gòu)域的多肽的基因可以通過篩選噬菌體(噬菌體展示)或細(xì)菌如大腸桿菌上展示的隨機肽文庫得到。編碼這些多肽的核苷酸序列可以以多種方式，例如通過隨機誘變和隨機多核苷酸合成得到。一般情況下，這些隨機肽展示文庫可用于篩選與已知靶相互作用的肽，已知靶可以是蛋白或多肽如配體或受體、生物大分子或合成的大分子、或者有機或無機物質(zhì)。制備和篩選這樣的隨機肽展示文庫的技術(shù)在本領(lǐng)域中已知(Ladner等，美國專利NO.5,223,409；Ladner等，美國專利NO.4,946,778；Ladner等，美國專利NO.5,403,484和Ladner等，美國專利NO.5,571,698)，并且隨機肽展示文庫和篩選這樣的文庫的試劑盒可例如從Clontech(Palo Alto，CA)，Invitrogen Inc.(San Diego，CA)，New England Biolabs，Inc.(Beverly，MA)和pharmaciaLKB Biotechnology Inc.(Piscataway，NJ)商業(yè)購買?？梢允褂么颂幑_的zsig44序列篩選隨機肽展示文庫以鑒定與zsig44結(jié)合的蛋白。這些與zsig44多肽相互作用的“結(jié)合蛋白”可用于標(biāo)記細(xì)胞、用于通過親和純化分離同系物多肽；它們可直接或間接與藥物、毒素、放射性核素等偶聯(lián)。這些結(jié)合蛋白也可用于分析方法如篩選表達文庫和中和活性。這些結(jié)合蛋白也可用于診斷分析以測定多肽的循環(huán)水平；用于檢測或定量測定作為潛在病理學(xué)或疾病標(biāo)記的可溶性多肽。這些結(jié)合蛋白也可作用為zsig44“拮抗劑”在體內(nèi)和體外阻斷zsig44結(jié)合、多聚體形成或zsig44介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。
如果抗體1)表現(xiàn)結(jié)合活性的閾值水平，和/或2)它們不與相關(guān)多肽分子顯著交叉反應(yīng)，那么這些抗體可確定為特異地結(jié)合。首先，如果抗體與zsig44多肽、肽或表位以至少比與對照(非zsig44)多肽大10倍的親和性結(jié)合，那么此時抗體是特異地結(jié)合。優(yōu)選的是抗體表現(xiàn)106M-1或更高的、優(yōu)選地107M-1或更高的、更優(yōu)選地108M-1或更高的、最優(yōu)選109M-1或更高的結(jié)合親和性(Ka)?？贵w結(jié)合親和性很容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)測定，例如通過Scatchard分析(Scatchard，G.，Ann.NY Acad.Sci.51660-672，1949)。
其次，如果抗體不與相關(guān)多肽顯著交叉反應(yīng)，那么抗體可確定為特異地結(jié)合。例如，如果它們使用Western印跡分析(Ausubel等，同上)檢測到zsig44而不是已知的相關(guān)蛋白，那么抗體不與相關(guān)多肽分子顯著交叉反應(yīng)。已知的相關(guān)多肽的例子是種同系物，例如CHIF(SEQ ID NO3)；Paralog，例如其它已知人離子通道如MAT-8(SEQ ID NO4)；突變的zsig44多肽以及其它相關(guān)離子通道或它們的調(diào)節(jié)劑。而且可以針對已知相關(guān)多肽篩選抗體以分離與本發(fā)明多肽特異結(jié)合的群體。例如，使針對zsig44產(chǎn)生的抗體吸附在固著在不溶性基質(zhì)上的相關(guān)多肽上。在適當(dāng)緩沖液條件下，對zsig44特異的抗體將通過基質(zhì)流出。這樣的篩選使得可以分離不與緊密相關(guān)多肽交叉反應(yīng)的多克隆抗體和單克隆抗體(抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實驗出版社，1988；免疫學(xué)常用方法，Cooligan，等(編輯)，National Institutes of Health，John Wiley和Sons，Inc.，1995)。特異抗體的篩選和分離在本領(lǐng)域眾所周知。參見基礎(chǔ)免疫學(xué)，Paul(編輯)，Raven Press，1993；Getzoff等，免疫學(xué)進展431-98，1988；單抗體克隆原理和實踐，Goding，J.W.(編輯)，Academic press Ltd.，1996；Benjamin等，免疫學(xué)年鑒267-101，1984。
本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種分析法可用于檢測與zsig44蛋白或肽特異結(jié)合的抗體。典型的分析法詳細(xì)描述于抗體實驗室手冊，Harlow和Lane(編輯)，冷泉港實驗室出版社，1988。這些分析的代表性例子包括合并的免疫電泳、放射免疫分析、放射免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)、點印跡或Western印跡分析、抑制或競爭分析和三明治實驗。此外也可以篩選抗體與野生型/突變型zsig44蛋白或多肽的結(jié)合。
針對zsig44的抗體可用于標(biāo)記表達zsig44的細(xì)胞；用于通過親和純化分離zsig44；用于測定zsig44多肽循環(huán)水平的診斷分析；用于檢測或定量測定zsig44多核苷酸或多肽作為潛在病理學(xué)或疾病的標(biāo)記；用于采用FACS的分析方法，用于篩選表達文庫；用于制備抗基因型抗體；以及用作中和抗體或拮抗劑以在體外和體內(nèi)阻斷zsig44活性。適當(dāng)?shù)闹苯訕?biāo)記物或標(biāo)記包括放射性核素、酶、底物、輔因子、抑制劑、熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記、磁粒子等；間接標(biāo)記物或標(biāo)記涉及使用生物素-抗生物素蛋白或其它互補/反互補對作為中間體。此處抗體也可以直接或間接與藥物、毒素、放射性核素等偶聯(lián)，并且將這些偶聯(lián)物用于體內(nèi)診斷或治療應(yīng)用。而且，抗zsig44的抗體或其片段可在體外使用以在分析法如Western印跡或其它本領(lǐng)域已知分析法中檢測變性的zsig44或其片段。
本發(fā)明的多核苷酸也可用于檢測與疾病或其它人體特性有關(guān)的人染色體10上的異常。本發(fā)明的多核苷酸定位在人染色體10上的10q11.1區(qū)。zsig44基因在WICGR放射雜交圖上定位在從人染色體10連鎖群頂端的308.19cR_3000。近端和遠(yuǎn)端構(gòu)架標(biāo)記(frameworkmarker)分別是NIB353和AFMB032YH1。使用周圍標(biāo)記將zsig44定位于完整LDB染色體10圖譜上的10q11.1區(qū)中。
本發(fā)明也提供發(fā)現(xiàn)可用診斷應(yīng)用的試劑。例如，zsig44基因、含有zsig44 DNA或RNA或其亞序列的探針可用測定zsig44基因是存在于染色體10上還是缺失或是否出現(xiàn)了突變。在zsig44基因基因座上可檢測的染色體異常包括但不限于非整倍性、基因拷貝數(shù)變化、插入、缺失、限制性位點改變以及重排。這樣的異?？梢允褂帽景l(fā)明的多核苷酸、通過利用分子遺傳技術(shù)如限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析、使用PCR技術(shù)的短串聯(lián)重復(fù)(STR)分析以及本領(lǐng)域已知的其它遺傳連鎖分析技術(shù)(Sambrook等，同上；Ausubel等，同上；Marian，A.J.，Chest，108255-265，1995)來檢測。
本發(fā)明的分子將可用于診斷遺傳染色體異常。本發(fā)明的多肽、核酸和/或抗體可用于治療與糖尿病、骨病或白血病有關(guān)的疾病。本發(fā)明的分子可用于調(diào)節(jié)其它離子通道或用于治療在這樣的分布組織如腎、骨髓和心臟中的病理學(xué)癥狀或預(yù)防其發(fā)展。特別是可以對某些遺傳綜合癥和其它人體疾病進行這樣的診斷、治療或預(yù)防。
經(jīng)遺傳操作表達zsig44基因的轉(zhuǎn)基因小鼠以及表現(xiàn)完全缺乏zsig44基因功能的、稱為敲除小鼠(Snouwaert等，科學(xué)2571083，1992)的小鼠也以得到制備(Lowell等，自然366740-42，1993)。這些小鼠可以用于在體內(nèi)系統(tǒng)中研究zsig44基因并由此研究編碼的蛋白。
編碼zsig44多肽的多核苷酸可用于需要增加或抑制zsig44活性的基因治療應(yīng)用。如果哺乳動物已突變或缺失了zsig44基因，那么可以將zsig44基因?qū)氩溉閯游锛?xì)胞。在一個實施方案中，將病毒載體中編碼zsig44多肽的基因?qū)塍w內(nèi)。這樣的載體包括減毒的或缺陷型的DNA病毒，例如但不限于單純皰疹病毒(HSV)、乳頭瘤病毒、Epstein Barr病毒(EBV)、腺伴隨病毒(AAV)等。優(yōu)選的是完全或幾乎完全缺失本發(fā)明病毒基因的缺陷型病毒。缺陷型病毒不形成有活力的侵染性病毒并且不能在導(dǎo)入細(xì)胞后再侵染。缺陷型病毒載體允許施用給特定局部區(qū)域中的細(xì)胞，而不必?fù)?dān)心該載體可能侵染其它細(xì)胞。特定載體的例子包括但不限于缺陷型簡單皰疹病毒1(HSV1)載體(Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，2320-330，1991)，減毒的腺病毒載體如Stratford-Perricaudet等，臨床研究雜志90626-630(1992)所述的載體以及缺陷性腺伴隨病毒載體(Samulski等，病毒學(xué)雜志613096-3101，1987；Samulski等，病毒學(xué)雜志633822-3828，1989)。
在另一實施方案中，zsig44基因可導(dǎo)入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，例如Anderson等，美國專利No.5,399,346；Mann等，細(xì)胞33153，1983；Temin等，美國專利No.4,650,764；Temin等，美國專利No.4,980,289；Markowitz等，病毒學(xué)雜志621120，1988；Temin等，美國專利No.5,124,263；由Dougherty等于1995年3月16日公開的國際專利公開文本No.WO 95/07358以及Kuo等，血液，82845，1993中描述。
選擇性地，可以使用脂質(zhì)體通過體內(nèi)脂轉(zhuǎn)染導(dǎo)入載體。合成的陽離子脂類可用于制備用于編碼標(biāo)記的基因的體內(nèi)轉(zhuǎn)染的脂質(zhì)體(參見，F(xiàn)elgner等，美國國家科學(xué)院院報847413-7417，1987；Mackey等，美國國家科學(xué)院院報858027-8031，1988)。使用脂轉(zhuǎn)染在體內(nèi)將外源基因?qū)胩囟ㄆ鞴儆心承嵱玫膬?yōu)點。脂質(zhì)體分子靶向特定細(xì)胞代表一個受益的區(qū)域。更具體地，將轉(zhuǎn)染導(dǎo)向特定細(xì)胞代表一個受益的區(qū)域。例如，將轉(zhuǎn)染導(dǎo)向特定細(xì)胞類型將在具細(xì)胞異質(zhì)性的組織如胰腺、肝、腎和腦中特別有利。為了靶向的目的，脂類可以與其它分子偶聯(lián)?？梢詫⒍ㄏ螂娜缂に鼗蛏窠?jīng)遞質(zhì)和蛋白如抗體或非肽分子與脂質(zhì)體化學(xué)偶聯(lián)。
從身體中取出靶細(xì)胞、將載體作為裸DNA質(zhì)粒導(dǎo)入、然后再將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞移入體內(nèi)是可以的。用于基因治療的裸DNA載體可以通過本領(lǐng)域已知的方法如轉(zhuǎn)染、電穿孔、微量注射、轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸鈣沉淀、使用基因槍或使用DNA載體運載蛋白導(dǎo)入目的宿主細(xì)胞。參見例如Wu等，生物化學(xué)雜志，267963-967，1992；Wu等，生物化學(xué)雜志，26314621-14624，1988以及Johnston和Tang，細(xì)胞生物學(xué)方法43353-65(1994)。
本發(fā)明的另一方面包括與SEQ ID NO1中所示多核苷酸的片段互補的反義多核苷酸成分。這樣的合成反義多核苷酸設(shè)計以結(jié)合編碼zsig44多肽的mRNA并抑制zsig44轉(zhuǎn)錄和這樣的mRNA的翻譯。這樣的反義多核苷酸可用于在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒瀸ο笾幸种凭幋azsig44多肽的基因的表達。
本發(fā)明的分子可用于鑒定和分離與zsig44相關(guān)或結(jié)合的離子通道蛋白。例如，本發(fā)明的蛋白和肽可固定在柱上并使膜制品通過柱(固定層析配體技術(shù)，Hermanson等編輯，Academic Press，SanDiego，CA，1992，第195-202頁)。也可以對蛋白和肽進行放射性標(biāo)記(酶學(xué)方法，第182卷，“蛋白純化指南”，M.Deutscher編輯，Acad.Press，San Diego，1990，721-737)或光親和標(biāo)記(Brunner等，生物化學(xué)年鑒62483-514，1993和Fedan等，Biochem.Pharmacol.331167-1180，1984)，并且特異的細(xì)胞表面蛋白可以得到鑒定。
實施例實施例1 zsig44的鑒定使用EST序列以得到全長zsig44使用信號俘獲作為查詢程序掃描翻譯的DNA數(shù)據(jù)庫導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)與人分泌信號序列同源的已表達序列標(biāo)志(EST)序列的鑒定。從鑒定的EST序列設(shè)計寡核苷酸引物ZC 13，652(SEQ ID NO12)和ZC 13，653(SEQ ID NO13)。使用引物在EST中內(nèi)部結(jié)合。組織來源的鑒定為鑒定含有EST的全長mRNA在其中表達的組織來源，使用對于EST多核苷酸序列特異的寡核苷酸(oligo)從幾個人體組織(胎兒腦、骨髓、HUVEC、胎兒肺、淋巴結(jié)、胰腺、小腸、胃)擴增cDNA。約1ng來自不同組織來源的MarathonTM備好即用cDNA(Clontech Laboratories，Inc.，Palo Alto，CA)用作聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RCR)中的模板，PCR反應(yīng)使用根據(jù)EST序列設(shè)計的寡核苷酸。
PCR所用的條件是于94℃、5分鐘的1個循環(huán)；于94℃、30秒，然68℃、4分鐘的30個循環(huán)；4℃浸泡。在1.5％瓊脂糖凝上分析PCR產(chǎn)物并僅在胎兒腦中觀察到預(yù)期的200bp PCR產(chǎn)物。此組織來源胎兒腦鑒定為具有含有EST序列cDNA的高度可能性。其它測試的cDNA不能用寡核苷酸引物擴增。序列分析證實胎兒腦PCR產(chǎn)物序列是EST的序列。全長zsig44 cDNA的分離為得到全長cDNA，采用3’RACE。使用“marathon備好即用”人胎兒腦cDNA作為模板和AP-1(Clontech)和寡核苷酸ZC13，653(SEQ ID NO13)作為引物制備3’RACE產(chǎn)物。此第一輪3’RACE PCR反應(yīng)如下進行于94℃、5分鐘的1個循環(huán)；于94℃、30秒；然后68℃、4分鐘的30個循環(huán)；4℃浸泡。取出1份3’RACE PCR產(chǎn)物并在1.5％瓊脂糖凝上分析。在膠上看到多條條帶。
將剩余的DNA稀釋1∶100。進行第二輪嵌套式3’RACE PCR反應(yīng)以擴增模板cDNA序列。此PCR反應(yīng)使用設(shè)計與ZC 13，653(SEQ IDNO13)退火的AP-2(Clontech)和寡核苷酸ZC 13，611(SEQ IDNO14)。
此嵌套式PCR反應(yīng)作為每個上面公開的第一輪3’RACE反應(yīng)進行。將產(chǎn)生的DNA產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上電泳并觀察到約453bp的明顯條帶。凝膠純化DNA條帶并對其進行測序。序列分析揭示DNA產(chǎn)物包含EST DNA序列。而且，從3’RACE產(chǎn)物制備的此453bp序列是編碼zsig44蛋白的全長cDNA。實施例2 組織分布使用來自人Clontech(Palo Alto，CA)的多個組織印跡(MTNI，MTNII和MINIII)進行Northern印跡分析。將實施例1所述的453bp產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠上電泳，并將片段電洗脫，然后根據(jù)制造商說明用32P-dCTP、使用隨機引物Prime-It II標(biāo)記系統(tǒng)(Stvatagene克隆系統(tǒng)，LaJolla，CA)對其進行放射性標(biāo)記。然后根據(jù)制造商的說明書，使用Chroma Spin+TE-30 LC柱(Clontech)純化探針。使用ExpressHybTM(Clontech)進行預(yù)雜交并作為Northern印跡分析的雜交溶液。雜交使用5×106cpm/ml標(biāo)記探針于65℃進行過夜。然后在2×SSC/1％SDS中于65℃洗滌印跡，接著在0.1×SSC/0.1％SDS中于55℃洗。在約1.0Kb處檢測到一個轉(zhuǎn)錄物。腎和骨髓的信號密度最高。在印跡代表的其它任何組織中不存在1.0Kb處的信號。只在脊髓中觀察到2.4Kb轉(zhuǎn)錄物，可能是zsig44的剪切變體。使用相同探針和Northern印跡分析條件，對來自各種組織的mRNA的點印跡進行分析。在心臟組織觀察到最強的信號。
也使用人腫瘤一系列印跡I-VI(Invitrogen，San Diego，CA)進行Northern印跡分析。使用上面公開的453bp探針探測這些印跡。沒有在任何腫瘤樣品中檢測到轉(zhuǎn)錄物。實施例3 以PCR為基礎(chǔ)的zsig44基因的染色體作圖使用商購的GeneBridge 4放射雜交系列(Research Genetics，Inc.，Huntsville，AL)將zsig44定位到染色體10上。TheGeneBridge 4放射雜交系列含有分別來自93個放射雜交克隆的DNA和兩個對照DNA(HFL供體和A23受體)。公眾可得到的www服務(wù)器(http//www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmapper.pl)相對于用GeneBridge 4放射雜交系列構(gòu)建的WhiteheadInstitute/MIT基因組研究中心的人基因組放射雜交圖(“WICGR”放射雜交圖)來作圖。
對于使用GeneBridge 4 RH系列的zsig44的作圖，在96孔微量滴定板(Stratagene，La Jolla，CA)中設(shè)定20μl PCR反應(yīng)并在RoboCycler Gradient 96熱循環(huán)儀(Stratagene)中使用。95個PCR反應(yīng)中的每一個含有2μl 10X KlenTaq PCR反應(yīng)緩沖液(Clontech)1.6μl dNTP混合物(各2.5mM，PERKIN-ELMER，F(xiàn)oster City，CA)，1μl有義引物ZC 14，842(SEQ ID NO15)，1μl反義引物ZC14，838(SEQ ID NO16)，2μl RediLoad(Research Genetics，Inc.)，0.4μl 50X Advantage KlenTaq聚合酶混合物(Clontech)，25ng來自各個雜交克隆的DNA或?qū)φ蘸退?，總體積02μl。用相同量的礦物油覆蓋在反應(yīng)物上并密封。PCR反應(yīng)如下進行于95℃變性5分鐘的1個起始循環(huán)；于95℃變性1分鐘，于62℃退火1分鐘并于72℃延伸1.5分鐘的35個循環(huán)；接著于72℃延伸7分鐘的最后1個循環(huán)。通過在2％瓊脂糖凝膠(Life Technologies，Gaithersburg，MD)上電泳分離反應(yīng)物。
結(jié)果表明zsig44在WICGR放射雜交圖上定位在從人染色體10連鎖群的頂端308.49cR_3000。近端和遠(yuǎn)端構(gòu)架標(biāo)記分別是NIB353和AFMB032YH1。使用周圍的標(biāo)記將zsig44定位在完整LDB染色體10圖譜的10q1.1區(qū)中(The Genetic Location Database，University of Southhampton，www服務(wù)器http//cedar.genetics.soton.ac.uk/public_html/)。
從前述應(yīng)該理解，盡管為了舉例說明的目的，本發(fā)明的具體實施方案已在此處得到描述，但是可以對其進行各種修飾，而不偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此除了隨后的權(quán)利要求書所限定的之外，本發(fā)明不受其它限制。序列表<110>ZymoGenetics，Inc.
<120>新的人離子通道ZSIG44<130>97-45PC<150>60/053,715<151>1997-07-25<160>16<170>FastSEQ for Windows Version 3.0<210>1<211>451<212>DNA<213>Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(4)…(270)<400>1gac atg gag aga gtg acc ctg gcc ctt ctc cta ctg gca ggc ctg act 48Met Glu Arg Val Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr1 5 10 15gcc ttg gaa gcc aat gac cca ttt gcc aat aaa gac gat ccc ttc tac 96Ala Leu Glu Ala Asn Asp Pro Phe Ala Asn Lys Asp Asp Pro Phe Tyr20 25 30tat gac tgg aaa aac ctg cag ctg agc gga ctg atc tgc gga ggg ctc 144Tyr Asp Trp Lys Asn Leu Gln Leu Ser Gly Leu Ile Cys Gly Gly Leu35 40 45ctg gcc att gct ggg atc gcg gca gtt ctg agt ggc aaa tgc aaa tgc 192Leu Ala Ile Ala Gly Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys50 55 60aag agc agc cag aag cag cac agt cct gta cct gag aag gcc atc cca 240Lys Ser Ser Gln Lys Gln His Ser Pro Val Pro Glu Lys Ala Ile Pro65 70 75ctc atc act cca ggc tct gcc act act tgc tgagcacagg actggcctcc290Leu Ile Thr Pro Gly Ser Ala Thr Thr Cys80 85agggatggcc tgaagcctaa cactggcccc cagcacctcc tcccctggga ggccttatcc350tcaaggaagg acttctctcc aagggcaggc tgttaggccc ctttctgatc aggaggcttc410tttatgaatt aaactcgccc caccaccccc tcaaaaaaaa a451<210>2<211>89<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Met Glu Arg Val Thr Leu Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly Leu Thr Ala1 5 10 15Leu Glu Ala Asn Asp Pro Phe Ala Asn Lys Asp Asp Pro Phe Tyr Tyr20 25 30Asp Trp Lys Asn Leu Gln Leu Ser Gly Leu Ile Cys Gly Gly Leu Leu35 40 45Ala Ile Ala Gly Ile Ala Ala Val Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys Lys50 55 60Ser Ser Gln Lys Gln His Ser Pro Val Pro Glu Lys Ala Ile Pro Leu65 70 75 80Ile Thr Pro Gly Ser Ala Thr Thr Cys85<210>3<211>87<212>PRT<213>Rattus norvegicus<400>3Met Glu Gly Ile Thr Cys Ala Phe Leu Leu Val Leu Ala Gly Leu Pro1 5 10 15Val Leu Glu Ala Asn Gly Pro Val Asp Lys Gly Ser Pro Phe Tyr Tyr20 25 30Asp Trp Glu Ser Leu Gln Leu Gly Gly Met Ile Phe Gly Gly Leu Leu35 40 45Cys Ile Ala Gly Ile Ala Met Ala Leu Ser Gly Lys Cys Lys Cys Arg50 55 60Arg Asn His Thr Pro Ser Ser Leu Pro Glu Lys Val Thr Pro Leu Ile65 70 75 80Thr Pro Gly Ser Ala Ser Thr85<210>4<211>87<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Met Gln Lys Val Thr Leu Gly Leu Leu Val Phe Leu Ala Gly Phe Pro1 5 10 15Val Leu Asp Ala Asn Asp Leu Glu Asp Lys Asn Ser Pro Phe Tyr Tyr20 25 30Asp Trp His Ser Leu Gln Val Gly Gly Leu Ile Cys Ala Gly Val Leu35 40 45Cys Ala Met Gly Ile Ile Ile Val Met Ser Ala Lys Cys Lys Cys Lys50 55 60Phe Gly Gln Lys Ser Gly His His Pro Gly Glu Thr Pro Pro Leu Ile65 70 75 80Thr Pro Gly Ser Ala Gln Ser85<210>5<211>92<212>PRT<213>Homo Sapiens<400>5Met Ala Pro Leu His His Ile Leu Val Phe Cys Val Gly Leu Leu Thr1 5 10 15Met Ala Lys Ala Glu Ser Pro Lys Glu His Asp Pro Phe Thr Tyr Asp20 25 30Tyr Gln Ser Leu Gln Ile Gly Gly Leu Val Ile Ala Gly Ile Leu Phe35 40 45Ile Leu Gly Ile Leu Ile Val Leu Ser Arg Arg Cys Arg Cys Lys Phe50 55 60Asn Gln Gln Gln Arg Thr Gly Glu Pro Asp Glu Glu Glu Gly Thr Phe65 70 75 80Arg Ser Ser Ile Arg Arg Leu Ser Thr Arg Arg Arg85 90<210>6<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens
<400>6Pro Phe Tyr Tyr Asp Trp1 5<210>7<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Gly Leu Ile Cys Gly Gly1 5<210>8<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Gly Ile Ala Ala Val Leu1 5<210>9<211>6<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Gly Lys Cys Lys Cys Lys1 5<210>10<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Pro Leu Ile Thr Pro Gly Ser Ala1 5<210>11<211>267<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>從zsig44氨基酸序列推出的簡并序列<400>11atggarmgng tnacnytngc nytnytnytn ytngcnggny tnacngcnyt ngargcnaay60gayccnttyg cnaayaarga ygayccntty taytaygayt ggaaraayyt ncarytnwsn120ggnytnatht gyggnggnyt nytngcnath gcnggnathg cngcngtnyt nwsnggnaar180tgyaartgya arwsnwsnca raarcarcay wsnccngtnc cngaraargc nathccnytn240athacnccng gnwsngcnac nacntgy267<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC13652<400>12cagtcaggcc tgccagtagg agaa24<210>13<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC13653<400>13cgcaggacac tggtgaggga gc 22<210>14<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物ZC13611<400>14gtgacatgga gagagtgacc ctgg24
<210>15<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物AC14842<400>15ctgccactac ttgctgag 18<210>16<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>寡核苷酸引物AC14838<400>16gcctgccctt ggagagaa 18
權(quán)利要求
1.編碼zsig44多肽的分離的多核苷酸，包含與選自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸殘基序列(a)SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；并且(b)SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)89(Cys)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中多核苷酸選自(a)SEQ ID NO1中所示多核苷酸序列的核苷酸52-核苷酸270；以及(b)SEQ ID NO1中所示多核苷酸序列的核苷酸4-核苷酸270。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中多核苷酸包含SEQ ID NO8的核苷酸1-核苷酸267。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的多核苷酸，其中zsig44多肽基本上由與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸殘基序列組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的分離的多核苷酸，其中zsig44多肽基本上由SEQ ID NO2中所示氨基酸殘基序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)組成。
6.含有下列可操作連接元件的表達載體轉(zhuǎn)錄啟動子；編碼與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的zsig44多肽的DNA片段；以及轉(zhuǎn)錄終止子。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體，進一步包含與DNA片段可操作連接的分泌信號序列。
8.其中已導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體的培養(yǎng)細(xì)胞，其中細(xì)胞表達DNA片段編碼的多肽。
9.編碼融合蛋白的DNA構(gòu)建體，此DNA構(gòu)建體包含編碼與選自以下氨基酸序列的氨基酸殘基序列至少90％同源的多肽的第一個DNA片段(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)16(Ala)；(b)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)28(Asp)；(c)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)64(Lys)；(d)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)65(Ser)-殘基數(shù)89(Cys)；(e)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)64(Lys)；(f)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)89(Cys)；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；以及編碼其它多肽的至少一個其它DNA片段，其中第一個和其它DNA片段是框架內(nèi)連接的；并且編碼融合蛋白。
10.按以下方法制備的融合蛋白，方法包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入含有以下可操作連接的單元的載體的宿主細(xì)胞(a)轉(zhuǎn)錄啟動子；(b)編碼根據(jù)權(quán)利要求9所述的融合蛋白的DNA構(gòu)建體；以及(c)轉(zhuǎn)錄終止子；并且回收DNA片段編碼的蛋白。
11.一種分離的多肽，包含與選自以下氨基酸序列的氨基酸序列至少90％同源的氨基酸殘基序列(a)包含SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)89(Cys)；并且(b)包含SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的殘基數(shù)1(Met)-殘基數(shù)89(Cys)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的多肽，其中多肽進一步包含在構(gòu)型M1-{6}-M2-{5}-M3-{1}-M4-{14}-PLITPGSA中從N端到C端間隔開的基序1-4和PLITPGSA基序。
13.根據(jù)權(quán)利要求11所述的分離的多肽，其中多肽基本上由與SEQ ID NO2中所示氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸殘基序列組成。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的分離的多肽，其中氨基酸殘基序列是SEQ ID NO2中所示氨基酸殘基序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)。
15.合成zsig44多肽多肽的方法，包括培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞，；并且分離細(xì)胞合成的zsig44多肽。
16.制備抗zsig44多肽抗體的方法，包括用選自以下多肽的多肽免疫接種動物(a)由9-89個氨基酸組成的多肽，其中多肽是與SEQ ID NO2中連續(xù)氨基酸序列的氨基酸數(shù)17(Leu)-氨基酸數(shù)89(Cys)至少90％同源的多肽；(b)根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽；(c)具有與SEQ ID NO2的殘基數(shù)17(Leu)-殘基數(shù)28(Asp)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(d)具有與SEQ ID NO2的殘基數(shù)29(Pro)-殘基數(shù)64(Lys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；(e)具有與SEQ ID NO2的殘基數(shù)65(Ser)-殘基數(shù)89(Cys)至少90％同源的氨基酸序列的多肽；其中多肽在動物中引發(fā)免疫反應(yīng)；并且從動物中分離抗體。
17.用權(quán)利要求16的方法制備的抗體，此抗體與zsig44多肽結(jié)合。
18.權(quán)利要求16的抗體，其中抗體是單抗體克隆。
19.與權(quán)利要求11的多肽特異結(jié)合的抗體。
20.在測試樣品中檢測zsig44蛋白活性調(diào)節(jié)劑存在的方法，包括培養(yǎng)其中已導(dǎo)入根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達載體的細(xì)胞，其中細(xì)胞在含有或不含有測試樣品的情況下表達DNA片段編碼的zsig44蛋白；并且通過生物學(xué)或生物化學(xué)分析比較含有或不含有測試樣品時zsig44的活性水平；并且從比較中確定測試樣品中zsig44活性調(diào)節(jié)劑的存在。
全文摘要
本發(fā)明涉及離子通道家族的新成員zsig44的多核苷酸和多肽分子。多肽和編碼它們的多核苷酸可用于診斷與染色體10有關(guān)的遺傳疾病。本發(fā)明也包括抗zsig44多肽的抗體。
文檔編號C07K14/705GK1270633SQ9880909
公開日2000年10月18日 申請日期1998年7月24日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月25日
發(fā)明者P·O·施帕德, E·E·穆爾 申請人:津莫吉尼蒂克斯公司