專利名稱：天然抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到在醫(yī)藥領(lǐng)域有用的、抑制腫瘤細(xì)胞和病毒增殖的、發(fā)揮抗腫瘤效果以及抗病毒效果的來(lái)自天然的新的化合物，以及該化合物的制造方法、用途和產(chǎn)生它的細(xì)胞。
更詳細(xì)地說(shuō)本發(fā)明涉及到從取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞株，代表性的是從TTK-1細(xì)胞進(jìn)一步克隆的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制(NS)細(xì)胞(CD57+HLA-DRbrightNS細(xì)胞株(TTK-1))(以下略記為[NS細(xì)胞])的培養(yǎng)產(chǎn)物、其制造方法、其用途以及該NS細(xì)胞。
在癌化療領(lǐng)域中，人們嘗試著將博萊霉素(Bleomycin)以及阿霉素(Adriamycin)等許多微生物的代謝產(chǎn)物應(yīng)用于臨床，而實(shí)際上臨床上正在使用這些代謝物。
然而，這些代謝物對(duì)各種腫瘤的療效未必充分，隨著腫瘤細(xì)胞對(duì)臨床上這些藥劑的耐藥性現(xiàn)象被弄清楚，它們臨床上的應(yīng)用性正變得復(fù)雜化[參照第47次日本癌學(xué)會(huì)總會(huì)記事，12頁(yè)～15頁(yè)(1988年)]。
另外，人們已經(jīng)弄清楚母系對(duì)胎兒的免疫反應(yīng)最初是在蛻膜組織被調(diào)節(jié)的，屬于帶有NK標(biāo)記的大顆粒淋巴細(xì)胞(LGL)的大群細(xì)胞集積于包括初期妊娠的人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的蛻膜層中(森等，哺乳綱植入法中的免疫分子機(jī)制.內(nèi)分泌，J.41(增刊)S17[Mori，T et.al，Immunlmolecular mechanisms in mammalian implantation.Endocrine.J.41(Suppl)S17.])。
由于小鼠中的NS細(xì)胞含有WGA凝集素的受體，人體中的NS細(xì)胞含有CD57的糖鏈標(biāo)記，所以屬于LGL的NS細(xì)胞是與免疫T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞不同的細(xì)胞群。
有報(bào)道說(shuō)由于NS具有能強(qiáng)烈抑制因MHC-非限制性分裂素引起的淋巴細(xì)胞的分裂反應(yīng)和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)等淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)的功能，所以NS細(xì)胞還有抑制癌細(xì)胞分裂的功能(Tilden等，免疫學(xué)雜志130卷，1171頁(yè))。
然而有關(guān)擔(dān)任NS細(xì)胞的免疫抑制作用、癌細(xì)胞的增殖抑制作用的物質(zhì)，雖然有人指出是TGF-β族的蛋白質(zhì)和分子量1萬(wàn)以下的核糖醇那樣的物質(zhì)(Clark等人，免疫學(xué)雜志，144卷，3008頁(yè)(Clarket.al.，J.Immunol)以及(Mortari等人，免疫學(xué)雜志，144卷，3037頁(yè)(Mortari et.al.，J.Immunol))，但現(xiàn)在正確的結(jié)構(gòu)和功能完全不清楚，人們一直期待著給予闡明。
作為與本發(fā)明化合物化學(xué)構(gòu)造近似的已知的具有抗腫瘤和抗病毒效果的化合物有氟尿嘧啶(Fluorouracil)(美國(guó)專利第2802005號(hào)和2885396號(hào))、脫氧氟尿苷(Doxifluridine)(美國(guó)專利第4071680號(hào))、喃氟啶(Tegafur)(英國(guó)專利第1168391號(hào))、疊氮胸苷(zidovudine；AZT)(德國(guó)專利第3608606號(hào))、雙脫氧腺苷(Didanosine；ddI)(歐州專利公開(kāi)第206497號(hào)公報(bào))等。
雖然這些核酸系抗癌制劑、抗病毒制劑不只限于用于預(yù)料有效果的腫瘤細(xì)胞和病毒類，對(duì)人的正常細(xì)胞也有作用，但存在的細(xì)胞毒性高的副作用正成為社會(huì)化問(wèn)題。
本發(fā)明是借鑒含有上述以前技術(shù)的課題后完成的發(fā)明，其目的在于從人細(xì)胞代謝產(chǎn)物中探索對(duì)已有抗腫瘤制劑和抗病毒制劑不能充分發(fā)揮效果的癌類以及病毒具有效果的物質(zhì)，提供對(duì)各種耐藥性癌具有治癌作用和抗病毒作用，對(duì)人正常細(xì)胞沒(méi)有傷害，副作用低的物質(zhì)。
本發(fā)明人為達(dá)到上述目的，進(jìn)行了銳意研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了NS細(xì)胞株誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、BeWo、GCIY人癌細(xì)胞程序死亡，抑制癌細(xì)胞的分裂反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞株分泌的誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序化死亡的核酸系物質(zhì)(命名為AIF)，并進(jìn)行了分離、純化和確定其結(jié)構(gòu)。我們認(rèn)為這些物質(zhì)作為按照全新的設(shè)想作成副作用小的天然型抗癌制劑、抗病毒制劑以及其它藥品開(kāi)發(fā)應(yīng)用是有可能。
本發(fā)明人通過(guò)培養(yǎng)取自具有產(chǎn)生式(1)化合物能力的人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞，從其培養(yǎng)液(上清和細(xì)胞，特別是上清)提取式(1)化合物，根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽，得到式(1)
(式中R1是用
表示的基團(tuán)，R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的化合物或其醫(yī)藥上允許的鹽，發(fā)現(xiàn)式(1)表示的化合物或其醫(yī)藥上允許的鹽具有誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡，抑制癌細(xì)胞增殖反應(yīng)，具有抗腫瘤效果以及抗病毒效果，直至本發(fā)明完成。
即本發(fā)明涉及到上述式(1)(式中的R1和R2與上述定義相同)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽、其制造方法、以上述式(1)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽作為有效成分的醫(yī)藥，上述化合物的醫(yī)藥制造和治療上的使用，以及取自CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的來(lái)自人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是化合物P1的NMR圖。圖2是化合物P2的NMR圖。圖2是化合物P3的NMR圖。圖4是化合物P4的NMR圖。圖5是化合物P5的NMR圖。圖6是化合物P6的NMR圖。圖7給出了AIF(P1)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖8給出了AIF(P2)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖9給出了AIF(P3)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖10給出了AIF(P4)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖11給出了AIF(P5)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖12給出了AIF(P6)的UV光譜、質(zhì)譜和結(jié)構(gòu)式。圖13是本發(fā)明的NS細(xì)胞株的相差顯微鏡照片。圖14(A～G)是表示DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。圖15是表示NS細(xì)胞與靶細(xì)胞的間接共培養(yǎng)結(jié)果的曲線。圖16(A，B)是表示AIF引起的靶細(xì)胞3H-胸腺嘧啶攝入抑制結(jié)果的曲線。圖17(A，B)是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。圖18(A～C)是AIF的HPLC圖。圖19是表示3H-胸腺嘧啶攝入抑制結(jié)果的曲線。圖20是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。圖21(A～D)是表示由AIF引起的靶細(xì)胞DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果的照片。圖22是表示由AIF對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制效果的曲線。圖23是表示由AIF引起的人胃組織萎縮的效果(A～B)以及DNA片段化試驗(yàn)結(jié)果(C)的照片。圖24是表示AIF對(duì)人T細(xì)胞白血病細(xì)胞的抑制效果的曲線。
以下就本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
首先就本說(shuō)明書中涉及到的各種用語(yǔ)以及定義進(jìn)行說(shuō)明。
式(1)化合物是通過(guò)物理和化學(xué)的方法從NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中分離、純化得到的程序化死亡誘導(dǎo)因子(AIF)，是用下式(1)
(式中R1是用
表示的基團(tuán)，R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的化合物，這些化合物由于是通過(guò)反相高速液相色譜進(jìn)行活性分級(jí)，所以被分別命名為P1、P2、P3、P4、P5和P6。
這里，所謂[P1、P2、P3、P4、P5和P6]，具體來(lái)說(shuō)是分別指2′-O-脫氧尿苷、核糖胸腺嘧啶核苷、2′-O-甲基尿苷、脫氧胸腺嘧啶核苷、2′-O-次黃苷和2′-O-甲基鳥(niǎo)苷。
即在式(1)中，R1和R2分別為
和氫原子的化合物P1，分別為
和羥基的化合物P2，分別為
和甲氧基的化合物P3，分別為
和氫原子的化合物P4，分別為
和甲氧基的化合物P5，
分別為
和甲氧基的化合物P6。以下給出了本發(fā)明代表性化合物的理化性狀。a)P1的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C9H12N2O5mp165℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 229[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7.2)，max，258.5nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖1中給出了P1的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.64[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間20分鐘b)P2的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C10H14N2O6mp183～185℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 259[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，267nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖2中給出了P2的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.66[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間29分鐘c)P3的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C10H14N2O6mp159℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 259[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，263nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖3中給出了P3的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.72[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間40分鐘d)P4的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C10H14N2O5mp185℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 243[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，267nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖4中給出了P4的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制，Kieselgel60F254)Rf值0.69[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間50分鐘e)P5的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C11H14N4O5mp210～212℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 283[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，283nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖5中給出了P5的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.67[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間64分鐘f)P6的理化性狀性狀無(wú)色結(jié)晶分子式C11H15N5O5mp218～220℃質(zhì)譜高分辨能FAB-MS；m/z 298[M+1]UV光譜λ[H2O(pH7)，max，pH11時(shí)258nm，pH1時(shí)256nm]1H-NMR譜(300MHz，d-三氯甲烷，δppm)圖6中給出了P6的NMR譜。溶解性可溶于甲醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，溶于水。酸性、中性、堿性物質(zhì)的區(qū)別堿性物質(zhì)薄層層析(Merck公司制造、Kieselgel60F254)Rf值0.59[展開(kāi)溶劑三氯甲烷/甲醇/水(60∶40∶8)]高速液相色譜柱子TSKgel ODS-80TM4.6×150mm(東洋曹達(dá)公司制造)流動(dòng)相于含有0.1％三氟乙酸的水中以濃度梯度5％/360分鐘速度增加含有0.1％三氟乙酸的乙腈的體系。流速0.5ml/分檢測(cè)UV214nm保留時(shí)間83分鐘以下給出了本發(fā)明細(xì)胞株的細(xì)胞學(xué)的性質(zhì)。
(1)細(xì)胞的形態(tài)大顆粒性淋巴細(xì)胞(LGL)(2)細(xì)胞的來(lái)源從妊娠7周令的人胎盤分離的蛻膜組織細(xì)胞(3)繼代培養(yǎng)能永久增殖(4)生長(zhǎng)因子需求性在不含有人正常子宮內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和肝素的培養(yǎng)基中是能夠增殖的。
(5)細(xì)胞維持、增殖條件、增殖依賴性本細(xì)胞株一般是在36～38℃、最好是在37℃的溫度條件下以及pH6.5～7.5，最好是7.0的條件下能良好地維持增殖。
(6)細(xì)胞增殖能力如果將本細(xì)胞的2×105個(gè)細(xì)胞/ml在上述培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，3日后至少達(dá)到5×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度。
(7)功能從沒(méi)有雌激素和孕酮受體以及不分泌催乳激素可知不是蛻膜間質(zhì)細(xì)胞。產(chǎn)生核酸系功能物質(zhì)，抑制由MLR和分裂素刺激引起的淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)。
(8)菌落形式在平皿上形成菌落，但在瓊脂中不能形成菌落。
(9)冷凍保存于-70℃～-196℃下可以保存非常長(zhǎng)的時(shí)間。
(10)染色體的性狀著絲點(diǎn)位于染色體中央部位(11)通過(guò)染色體分析確認(rèn)來(lái)自人組織的細(xì)胞(12)染色體數(shù)99～100、107～108(13)細(xì)胞表面標(biāo)記由CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性看是免疫系統(tǒng)細(xì)胞。
(14)維持和增殖用培養(yǎng)基于10％FCS+RPMI-1640培養(yǎng)液或除去脫氧胸腺嘧啶核苷的無(wú)血清培養(yǎng)基能良好地維持增殖。
為了得到本發(fā)明的細(xì)胞株，例如可以采用如下方法，即為了取得人胎盤蛻膜細(xì)胞，可以按照臨床研究雜志(J.Clin.Invest.)第52卷、2745頁(yè)-2756頁(yè)(1973年)記載的方法進(jìn)行。方法的概要如下首先盡可能地?zé)o菌條件下采取人子宮內(nèi)膜或胎盤蛻膜(只要是人子宮內(nèi)組織哪種組織都可以，例如能很容易得到胎盤蛻膜部位是最好。)，洗凈后，用胰蛋白酶處理將細(xì)胞從結(jié)合組織上分離下來(lái)，收集獲得人胎盤蛻膜細(xì)胞。
本發(fā)明使用的細(xì)胞是來(lái)自CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性的人胎盤蛻膜細(xì)胞，只要是有產(chǎn)生式(1)化合物能力的細(xì)胞無(wú)論哪種細(xì)胞都可以，但最好是NS細(xì)胞或其克隆株、亞克隆株。本細(xì)胞株(NS)可以通過(guò)常規(guī)方法經(jīng)有選擇性地克隆得到。
例如在利用常規(guī)方法對(duì)NS細(xì)胞進(jìn)行克隆時(shí)，通過(guò)檢測(cè)式(1)化合物的產(chǎn)生量，就可以獲得式(1)化合物產(chǎn)生能力高的克隆株。具體來(lái)說(shuō)，首先按照有限稀釋方法將1×105個(gè)TTK-1細(xì)胞稀釋到0-1個(gè)細(xì)胞/孔，于37℃、5％二氧化碳?xì)獯嬖谙逻M(jìn)行培養(yǎng)，選擇式(1)化合物產(chǎn)生能力高的克隆株。
另外本發(fā)明的細(xì)胞株保藏于通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工程工業(yè)技術(shù)研究所(日本茨城縣筑波市東1丁目1番3號(hào))，其生命研保藏號(hào)是FERM BP6350(原保藏日平成9年5月19日)(由國(guó)內(nèi)保藏FERMP-16233號(hào)移管(移管日平成10年5月13日))。
圖13給出了本發(fā)明的NS細(xì)胞株(TTK-1)的相差顯微鏡照片(400倍)。NS細(xì)胞株自身分泌昆布氨酸，附著于培養(yǎng)基，表現(xiàn)出LGL細(xì)胞株形態(tài)。
以下說(shuō)明本發(fā)明化合物的制造方法。
將取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞，有代表性的NS細(xì)胞接種于含有營(yíng)養(yǎng)源的培養(yǎng)基上，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行有氧培養(yǎng)，從其培養(yǎng)液(上清和細(xì)胞，最好是上清)提取本發(fā)明的式(1)化合物，如果需要，可以作成醫(yī)藥上允許的鹽。
象上述那樣得到的取自人胎盤蛻膜的NS細(xì)胞可以在一般動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基中按需要添加血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，具體來(lái)說(shuō)是可以在含有20％的胎牛血清的通常的細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
作為該細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基有BME培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基(Earle.Dulbecco，High-GEM)、Ham培養(yǎng)基(F-10、F-12)、ISKOF培養(yǎng)基、119培養(yǎng)基、L-15培養(yǎng)基、Mccoy5A培養(yǎng)基、NCTC135培養(yǎng)基、WilliamsE培養(yǎng)基、Waymouth培養(yǎng)基等，只要是可培養(yǎng)該細(xì)胞的培養(yǎng)基無(wú)論哪一種都可以，最好是RPMI-1640。
培養(yǎng)方法可以與一般的細(xì)胞株代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)方法一樣進(jìn)行，無(wú)論是固體還是液體培養(yǎng)都可以。在液體培養(yǎng)時(shí)，使用靜置培養(yǎng)、攪拌培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、通氣培養(yǎng)等哪一種培養(yǎng)方法都可以，但振蕩培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)等更好。在培養(yǎng)該細(xì)胞時(shí)，最好是使上述的培養(yǎng)基中的CO2的百分含量為5％左右。
有關(guān)培養(yǎng)基的pH是6～8，尤其是在中性附近更合適。培養(yǎng)可在30～40℃下進(jìn)行，最好是在37℃附近。培養(yǎng)時(shí)間因使用的培養(yǎng)基、pH、溫度條件等不同不能一概而論，通常是培養(yǎng)4～5日就可進(jìn)行該細(xì)胞的繼代。
為了從培養(yǎng)液中提取目的物質(zhì)式(1)化合物，可以適當(dāng)?shù)乩脧呐囵B(yǎng)物中提取微生物生產(chǎn)的代謝物中常用的分離手段。
通過(guò)單獨(dú)或聯(lián)合使用眾所周知的分離純化方法，例如溶劑萃取法、離子交換樹(shù)脂法、吸附或分配層析法、凝膠過(guò)濾法等可以純化生成的式(1)化合物。
從培養(yǎng)濾液進(jìn)行萃取純化時(shí)也可以適當(dāng)利用反相高速液相色譜和薄層色譜等。例如通過(guò)將硅膠柱層析、離子交換層析、親和層析、反相高速液相層析適當(dāng)?shù)亟M合能進(jìn)行高度地純化。
就象后面敘述的那樣(“本發(fā)明的可用性的確認(rèn)”一項(xiàng))，人們期待著本發(fā)明化合物能作為包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物的腫瘤以及病毒性疾病的治療劑等醫(yī)藥。
另外本發(fā)明化合物雖然在生物體內(nèi)有被磷酸化后表現(xiàn)出藥理作用的可能性，不用說(shuō)有關(guān)的磷酸化合物也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
適合本發(fā)明化合物，預(yù)期有治療效果的腫瘤不只是人的血癌、還有一般的胃癌、大腸癌等消化系統(tǒng)癌、肺癌等呼吸系統(tǒng)癌、卵巢癌、絨毛癌等生殖系癌等上皮性癌。
適合本發(fā)明化合物，預(yù)期有治療效果的病毒有人逆轉(zhuǎn)病毒系的HTLV、HIV等。
本發(fā)明的式(1)化合物在作為抗腫瘤制劑或抗病毒制劑可以使用時(shí)，其醫(yī)藥上允許的鹽也可以使用。
作為用式(1)表示的本發(fā)明化合物的無(wú)毒性鹽，有與鹽酸、硝酸、硫酸或磷酸等無(wú)機(jī)酸形成的鹽，與醋酸、檸檬酸或酒石酸等有機(jī)酸形成的鹽，與甲磺酸或p-甲苯磺酸等有機(jī)磺酸形成的鹽或與天冬氨酸、谷氨酸或賴氨酸等形成的鹽。
本發(fā)明化合物的醫(yī)藥上允許的鹽的制造方法可以使用將在有機(jī)合成化學(xué)領(lǐng)域中通常使用的方法進(jìn)行適當(dāng)組合后形成的方法。具體講，如可以用酸性溶液對(duì)含有游離的本發(fā)明化合物的溶液進(jìn)行中和滴定等。
將本發(fā)明化合物作為抗腫瘤制劑或抗病毒制劑使用時(shí)的藥劑形態(tài)可以選擇各種形態(tài)，例如片劑、膠囊、散劑、顆粒制劑、液體制劑等口服制劑，以及將溶液、懸濁液等滅菌的液體狀非口服制劑等。本發(fā)明的制劑其有效成分含有本發(fā)明化合物(一種或數(shù)種)，根據(jù)需要可以含有載體、稀釋劑或成型劑等通常的各種添加物(醫(yī)藥組合物)。
固體制劑雖然可以直接作成片劑、膠囊、顆粒劑或粉末形態(tài)，但也可以使用適當(dāng)?shù)奶砑游镏圃臁?br> 作為添加物有乳糖、葡萄糖等糖類，例如玉米、小麥、大米等淀粉類，例如硬脂酸等脂肪酸，例如硅酸鈉、鋁酸鎂、無(wú)水磷酸鈣等無(wú)機(jī)鹽，例如聚乙烯吡咯烷酮、聚(亞烷基)二醇等合成的高分子，例如硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等脂肪酸鹽、例如十八烷醇、苯甲醇等醇類，例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、乙基纖維素、羥丙甲基纖維素等合成的纖維素衍生物，此外水、明膠、滑石、植物油、阿拉伯樹(shù)膠等通常用的添加物等。
這些片劑、膠囊、顆粒制劑、粉末等固體形制劑一般含有0.1～100重量％、最好含有5～100重量％的有效成分。
液體制劑在水、醇類或來(lái)自大豆油、花生油、芝麻油等植物油的油等液體狀制劑中使用通常用的適當(dāng)?shù)奶砑游?，可以制造成懸濁液、糖漿制劑、注射制劑等形態(tài)。
以非口服方式經(jīng)肌肉內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、皮下注射、腫瘤內(nèi)注射給藥時(shí)所用的溶劑有注射用的蒸餾水、鹽酸利多卡因水溶液(肌肉內(nèi)注射用)、生理鹽水、葡萄糖水溶液、乙醇、靜脈內(nèi)注射用液體(例如檸檬酸、檸檬酸鈉等水溶液)、電解質(zhì)溶液(例如點(diǎn)滴靜脈輸入、靜脈內(nèi)注射用)等或它們的混合溶液。
這些注射制劑除了預(yù)先溶解的制劑以外，也可以采用用時(shí)溶解粉末或添加了適當(dāng)添加物的制劑形態(tài)。這些注射液通常含有0.1～10重量％、最好含有1～5重量％的有效成分。
口服的懸濁液制劑或糖漿制劑可以含有0.5～10重量％的有效成分。
本發(fā)明的制劑可以含有作為有效成分的本發(fā)明化合物的1種或數(shù)種，理想的有效成分的例子可以是本發(fā)明代表性的化合物P1～P6中的1種，最好是2～6種的組合。
本發(fā)明化合物的實(shí)際理想的給藥量可以根據(jù)使用的化合物的種類、配合的組合物的種類、適用的頻度以及可以治療的疾病的部位和患者的病狀適當(dāng)?shù)卦鰷p。
例如，每天每一個(gè)成年人的給藥量口服是10至500mg，非口服給藥最好是靜脈注射，每天是10至100mg。而給藥次數(shù)可因給藥方法和病狀不同而不同，可以一次或分成2至5次給藥。
確認(rèn)本發(fā)明的有用性取自人胎盤蛻膜組織的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性自然抑制(NS)細(xì)胞株誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、GCIY、BeWo等人癌細(xì)胞程序死亡，抑制這些細(xì)胞的增殖。使用物理、化學(xué)方法對(duì)NS細(xì)胞產(chǎn)生的AIF進(jìn)行了分離和純化。AIF的活性測(cè)定是通過(guò)細(xì)胞攝入3H脫氧胸腺嘧啶核苷的能力和DNA片段化方法進(jìn)行的。首先NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清中的AIF的分離是通過(guò)使上清吸附于C18柱，然后再進(jìn)行洗脫。該粗提取物在薄層層析(TLC)展開(kāi)，活性級(jí)分用反相高速液相色譜(HPLC)純化。
從HPLC得到的六個(gè)峰的成分(P1-P6)可以誘導(dǎo)K562、Molt4、U937、GCIY、BeWo癌細(xì)胞的死亡和抑制增殖，但來(lái)自人胎兒肺的正常WI-38細(xì)胞對(duì)這些癌細(xì)胞完全沒(méi)有傷害。這六個(gè)AIF的物理、化學(xué)的性質(zhì)表明是核酸或其衍生物，實(shí)際上通過(guò)FAB-MS、NMR進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析確認(rèn)P1是2′-O-脫氧尿苷、P2是核糖胸腺嘧啶核苷、P3是2′-O-甲基尿苷、P4是脫氧胸腺嘧啶核苷、P5是2′-O-次黃苷，P6是2′-O-甲基鳥(niǎo)苷。在將這六種AIF給移植了人癌組織的鼠服用的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中也可確認(rèn)顯著的腫瘤萎縮效果。
將經(jīng)HPLC最后分離純化的AIF添加到靶癌細(xì)胞中，在研究試管內(nèi)的程序化死亡誘導(dǎo)能力的同時(shí)，研究AIF在接種了癌細(xì)胞的SCID小鼠的治療效果(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))。試管內(nèi)的實(shí)驗(yàn)下面為了顯示本發(fā)明的有用性，首先將與本發(fā)明有關(guān)的代表例NS細(xì)胞株和來(lái)自有代表性的各種人的癌細(xì)胞作為靶細(xì)胞使用，測(cè)定由于直接或間接的共培養(yǎng)引起的相互作用。使用的細(xì)胞如下所示。
NS細(xì)胞株(TTK-1)(取自人胎盤蛻膜的細(xì)胞株)是從妊娠7周令的人胎盤蛻膜組織細(xì)胞的培養(yǎng)的細(xì)胞，是CD57陽(yáng)性、HLA-DR強(qiáng)陽(yáng)性的來(lái)自骨髓淋巴系組織的自然免疫抑制細(xì)胞。
Molt4(人T細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)K562(人成紅細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)U937(人組織性白血病細(xì)胞株)GcIY(人胃癌細(xì)胞株)BeWo(人絨毛癌細(xì)胞株)WI-38(來(lái)自人胎兒肺組織的正常細(xì)胞株)以上細(xì)胞是在10％FCS+RPMI-1640培養(yǎng)液或除去脫氧胸腺嘧啶核苷的無(wú)血清培養(yǎng)基上于5％CO2、37℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行繼代培養(yǎng)的細(xì)胞。
試驗(yàn)例1NS細(xì)胞株與Molt4/K562/U937/GcIY/BeWo/WI-38靶細(xì)胞直接共培養(yǎng)試驗(yàn)(直接反應(yīng))直接共培養(yǎng)試驗(yàn)使用NS、Molt4(人T細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、K562(人成紅細(xì)胞性白血病細(xì)胞株)、U937(人組織性白血病細(xì)胞株)、GcIY(人胃癌細(xì)胞株)、BeWo(人絨毛癌細(xì)胞株)和WI-38，于24孔板中各加入2ml培養(yǎng)液對(duì)NS(104、105、106)與Molt4/K562/U937/GcIY/BeWo/WI-38細(xì)胞(106)直接共培養(yǎng)24小時(shí)到48小時(shí)。
NS細(xì)胞株與靶細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，提取細(xì)胞的DNA，在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。
其結(jié)果就象圖14A所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與Molt4 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有NS 106/孔，帶5中只有Molt4 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M帶是表示DNA大小的標(biāo)記物。
象圖14B所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與K562 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有K562 106/孔，帶5中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。
象圖14C所示的那樣，帶1、2、3分別是K562細(xì)胞和細(xì)胞數(shù)為106、105、104/孔的Molt4共培養(yǎng)，帶4中只有Molt4 106/孔、帶5中只有K562 106/孔時(shí)，無(wú)論那種情況都沒(méi)引起DNA片段化。
象圖14D所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與BeWo 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有NS 106/孔，帶5只有BeWo 106/孔，帶6是BeWo 106/孔與GcIY106/孔間共培養(yǎng)，帶7只有GcIY106/孔時(shí)，無(wú)論那種情況都看不到DNA片段化。
象圖14E所示的那樣，帶1、2、3、4分別是NS細(xì)胞數(shù)為103、104、105、106/孔與U937 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶7是Molt4 106/孔與U937106/孔間的共培養(yǎng)，帶8是只有Molt4 106/孔，帶6是只有U937106/孔，帶5是只有NS 106/孔時(shí)，都不會(huì)引起DNA片段化。
象圖14F所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與GcIY106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而在帶4只有GcIY106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。
象圖14G所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與WI-38 106/孔間的共培養(yǎng)，盡管接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，在靶細(xì)胞中也看不到DNA片段化。帶4只有WI-38106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)都不會(huì)引起DNA片段化。
即NS細(xì)胞株與Molt4、K562、BeWo、U937、GcIY細(xì)胞間的相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果是在培養(yǎng)24小時(shí)后能看到靶細(xì)胞的DNA片段化。另外靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
另外DNA片段化在K562與Molt4細(xì)胞間共培養(yǎng)，或是在Molt4與U937細(xì)胞間，以及BeWo與GcIY細(xì)胞間共培養(yǎng)，無(wú)論那種情況都不會(huì)發(fā)生。而即使NS細(xì)胞與WI-38正常細(xì)胞間的共培養(yǎng)也看不到DNA片段化。這表明NS細(xì)胞不會(huì)傷害人正常細(xì)胞。就是說(shuō)NS細(xì)胞株能引起由于人癌細(xì)胞的特異的細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)。
試驗(yàn)例2將NS細(xì)胞與靶細(xì)胞K562/Molt細(xì)胞加入到容器內(nèi)進(jìn)行的間接相互作用(間接共培養(yǎng))間接共培養(yǎng)安裝一個(gè)孔中底部成濾膜狀(直徑0.45μm)的細(xì)胞反應(yīng)用培養(yǎng)室，然后分別注入Molt4/K562(104)細(xì)胞。
于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)三天后，收集靶細(xì)胞，進(jìn)行3H脫氧胸腺嘧啶核苷攝入放射能法、臺(tái)盼藍(lán)攝入染色法、DNA片段化法，測(cè)定細(xì)胞間相互作用的結(jié)果。
在這個(gè)系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少(圖15)。
該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表示能通過(guò)容器室的微孔膜，低分子量的可溶性的引起靶癌細(xì)胞死亡的物質(zhì)是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的。
試驗(yàn)例3通過(guò)薄層層析(TLC)確認(rèn)由粗提取的AIF引起的3H脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入抑制以及DNA片段化試驗(yàn)將由NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上(BONDELUTE)，用乙腈和甲醇分離、洗脫保留在柱子上的物質(zhì)，利用氮?dú)馐谷軇]發(fā)，進(jìn)行濃縮干燥。柱子中保留的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)DNA片段化。
利用TLC將該級(jí)分展開(kāi)，即將用C18柱分離的物質(zhì)溶解在三氯甲烷∶甲醇(1∶1)溶液中之后，點(diǎn)到薄層板上，通過(guò)三氯甲烷∶甲醇∶蒸餾水(60∶40∶8)展開(kāi)。展開(kāi)后，在培養(yǎng)基中含有的級(jí)分被酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)分為下級(jí)分部(Rf＜0.5，TLC-A)和上級(jí)分部(Rf＞0.5，TLC-B)，挑取相應(yīng)凝膠，利用三氯甲烷/甲醇分別萃取回收，用氮?dú)飧稍?。確認(rèn)在TLC上酚紅(Rf＝0.5)位置上部存在的級(jí)分中存在抑制K562/Molt4細(xì)胞增殖(圖16A～B)，誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)(圖17A～B)。
作為對(duì)照，在所用的新鮮培養(yǎng)基、或靶細(xì)胞K562/Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清中看不到抑制靶細(xì)胞的增殖，或誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)的產(chǎn)生。然而在NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中能產(chǎn)生可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序化死亡(細(xì)胞死亡)的物質(zhì)(AIF)，通過(guò)TLC可以確認(rèn)在比酚紅移動(dòng)更快的級(jí)分中(酚紅Rf＝0.5)中存在AIF。
試驗(yàn)4用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷的抑制試驗(yàn)利用ODS-80TM柱(TOSOH)，通過(guò)在360分鐘內(nèi)使含有0.1％三氟乙酸的乙腈從0達(dá)到5％的濃度，以流速0.5ml/分進(jìn)行分離純化，同時(shí)通過(guò)OD214nm吸光度進(jìn)行測(cè)定。
來(lái)自得到的主要六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)的樣品(7μg/ml)無(wú)論哪一種都抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性(圖19)。
就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
試驗(yàn)例5能夠誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化的AIF的界限量就象圖20A、20B表示的那樣，使取自通過(guò)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(A7μg/ml、B7×3-2μg/ml)作用于5×105個(gè)Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，然后提取靶細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。雖然在7μg/ml和7×3-2μg/ml的濃度下能看到Molt4細(xì)胞的DNA片段化，但就象圖20C表示的那樣，在7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了。
試驗(yàn)例6用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞BeWo細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21A表示的那樣，使取自通過(guò)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于BeWo細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，然后提取BeWo細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無(wú)論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)BeWo細(xì)胞的DNA片段化(圖21A)。
試驗(yàn)例7用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞U937細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21B表示的那樣，使取自通過(guò)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于U937細(xì)胞48個(gè)小時(shí)后，然后提取U937細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無(wú)論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)U937細(xì)胞的DNA片段化(圖21B)。
試驗(yàn)例8用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞GCIY細(xì)胞的DNA片段化試驗(yàn)就象圖21C表示的那樣，使取自通過(guò)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(21μg/ml)作用于GCIY細(xì)胞48個(gè)小時(shí)后，然后提取GCIY細(xì)胞的DNA，在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。無(wú)論那一個(gè)峰都能誘導(dǎo)GCIY細(xì)胞的DNA片段化(圖21C)。
試驗(yàn)例9用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)人正常細(xì)胞WI-38的DNA片段化試驗(yàn)以人正常細(xì)胞WI-38作為靶細(xì)胞時(shí)，即使用3倍來(lái)自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品量(63μg/ml)作用于該細(xì)胞，也看不到細(xì)胞增殖的抑制和DNA片段化(圖21D)。就象圖14G表示的那樣，這種現(xiàn)象與即使使NS細(xì)胞與WI-38細(xì)胞直接作用也不會(huì)傷害正常細(xì)胞的結(jié)果對(duì)應(yīng)。
這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重大的意義。即本發(fā)明人分離純化的AIF會(huì)引起癌細(xì)胞特異地程序化死亡(DNA片段化)，但對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有傷害，就是說(shuō)患者服用后沒(méi)表現(xiàn)出副作用，表明可以作為理想的抗癌制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。
而以前的免疫抑制制劑是用阻礙淋巴細(xì)胞分裂的藥理作用表現(xiàn)其效果的，本發(fā)明化合物也是有可能作為免疫抑制制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)的。
作為用HPLC的最終分離對(duì)照，對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清或新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行與NS細(xì)胞株培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從TTK-1培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在對(duì)照的HPLC圖上不存在(圖18B、C)。
另外破壞NS細(xì)胞株本身提取的樣品的HPLC圖與NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的圖相同。這表明NS細(xì)胞本身也含有與上清相同的活性峰(1-6)。
以上試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果歸納如下。
(1)[NS細(xì)胞株誘導(dǎo)靶癌細(xì)胞的細(xì)胞程序死亡]NS細(xì)胞株與Molt4、K562、BeWo、U937、GCIY細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果，在培養(yǎng)24小時(shí)后能看到靶細(xì)胞的DNA片段化(圖14A.B.C.D.E.F)。
靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。另外DNA片段化在K562與Molt4細(xì)胞間共培養(yǎng)(圖14C)，或是在Molt4與U937細(xì)胞間，以及BeWo與GcIY細(xì)胞間共培養(yǎng)，無(wú)論那種情況都不會(huì)發(fā)生。而即使NS細(xì)胞與WI-38正常細(xì)胞間的共培養(yǎng)也看不到DNA片段化(圖14G)。這表明NS細(xì)胞不會(huì)傷害人正常細(xì)胞。就是說(shuō)只有NS細(xì)胞株具有誘導(dǎo)人癌細(xì)胞特異程序死亡的能力。
(2)[NS細(xì)胞株將AIF釋放到培養(yǎng)上清中]在將NS細(xì)胞與K562/Molt細(xì)胞加入到培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行間接相互作用(間接共培養(yǎng))的系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少(圖15)。另外也可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞的DNA片段化。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明能通過(guò)容器室的微孔膜的，低分子量的可溶性的能引起靶癌細(xì)胞死亡的物質(zhì)是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的。
(3)[通過(guò)薄層層析(TLC)確認(rèn)由粗提取的AIF引起的3H脫氧胸腺嘧啶核苷攝入抑制、誘導(dǎo)DNA片段化]將由NS(TTK-1)細(xì)胞株培養(yǎng)上清約50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈和甲醇對(duì)保留在柱子上的物質(zhì)進(jìn)行洗脫、濃縮干燥，得到的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的分裂、誘導(dǎo)DNA片段化。
再將該級(jí)分加到TLC上，在培養(yǎng)基中含有的處于酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)以上的級(jí)分(Rf＞0.5，TLC-B)中存在抑制K562/Molt4細(xì)胞增殖(圖16A，B)，誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)(圖17A，B)。
作為對(duì)照，在所用的新鮮培養(yǎng)基(SFM)、既看不到靶細(xì)胞K562/Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清中抑制靶細(xì)胞的增殖，也沒(méi)有誘導(dǎo)DNA片段化的物質(zhì)的產(chǎn)生。
進(jìn)而在NS細(xì)胞株的培養(yǎng)上清中能產(chǎn)生可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡(細(xì)胞死亡)的物質(zhì)(AIF)，通過(guò)TLC可以確認(rèn)在比酚紅移動(dòng)更快的級(jí)分中(酚紅Rf＞0.5)中存在AIF。
(4)[用HPLC最終分離純化的AIF對(duì)靶細(xì)胞DNA片段化的誘導(dǎo)]由NS細(xì)胞培養(yǎng)上清500ml經(jīng)TLC粗純化的總的活性級(jí)分(TLC-B)再經(jīng)TSKgelODS-80TM柱(東曹)、反相HPLC分離提取。
得到主要的六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)。當(dāng)測(cè)定3H-脫氧胸腺嘧啶核苷的攝入能力時(shí)，來(lái)自(1-6)六個(gè)峰的樣品(7μg/ml)無(wú)論那一種都抑制Molt4細(xì)胞攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷(圖19)。就是說(shuō)抑制Molt4細(xì)胞的分裂。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性。就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
(5)[能夠誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA片段化能的AIF界限量]與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制Molt4細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品(7μg/ml)無(wú)論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(圖20A)。
用經(jīng)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品7×3-2μg/ml作用于Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，確認(rèn)靶細(xì)胞的DNA片段化(圖20B)，但在7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了(圖20C)。
(6)如果使用BeWo、U937、和GCIY作為靶細(xì)胞，無(wú)論來(lái)自那個(gè)峰(1-6)的樣品(21μg/ml)以及稀釋到1/10的混合樣品(各2.1μg/ml)都可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA的片段化(圖21A、B、C)以人正常細(xì)胞WI-38作為靶細(xì)胞時(shí)，即使用3倍來(lái)自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品量(63μg/ml)作用于該細(xì)胞，也看不到細(xì)胞增殖的抑制和DNA片段化(圖21D)。就象圖14G表示的那樣，這種現(xiàn)象與即使使NS細(xì)胞與WI-38細(xì)胞直接作用也不會(huì)傷害正常細(xì)胞的結(jié)果對(duì)應(yīng)。
這一系列的實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有重大的意義。即本發(fā)明人分離純化的AIF會(huì)引起癌細(xì)胞特異地程序化死亡(DNA片段化)，但對(duì)正常細(xì)胞幾乎沒(méi)有傷害，就是說(shuō)患者服用后沒(méi)表現(xiàn)出副作用，表明可以作為理想的抗癌制劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)。對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清或新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行與TTK-1培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從TTK-1培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在其HPLC圖上不存在(圖18B、C)。
另外破壞NS細(xì)胞株本身提取的樣品的HPLC圖與NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的圖相同。這表明NS細(xì)胞本身也含有與上清相同的活性峰(1-6)。
如果歸納以上結(jié)果，可以得出AIF是由NS細(xì)胞株產(chǎn)生的、釋放到培養(yǎng)基中的物質(zhì)的結(jié)論。
(7)AIF的物理化學(xué)特性的研究和構(gòu)造確定用HPLC最終分離純化的AIF中的氨基酸或六碳糖的有無(wú)可以通過(guò)地衣酚硫酸反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)定性地研究。由于進(jìn)一步從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)。分子量通過(guò)質(zhì)譜(FAB-MASS)推定。利用質(zhì)子核磁共振(NMR)法可以確定最終的構(gòu)造。
通過(guò)HPLC分離的AIF的各個(gè)活性峰(1-6)耐熱，茚三酮、地衣酚反應(yīng)呈陰性，表明是非蛋白質(zhì)類、非六碳糖類的物質(zhì)。
由于進(jìn)一步從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)(圖7～12左上圖)。
因?yàn)榇_定了構(gòu)造解析的方向，所以進(jìn)行NS細(xì)胞的大量培養(yǎng)(約300L)，從最終的HPLC分離純化的各個(gè)峰(1-6)制備樣品。通過(guò)質(zhì)量分析(FAB-MASS)和核磁共振(NMR)法確定最終的構(gòu)造。AIF的活性峰1-6中，P1是2′-O-脫氧尿苷、P2是核糖胸腺嘧啶核苷、P3是2′-O-甲基尿苷、P4是脫氧胸腺嘧啶核苷、P5是2′-O-次黃苷，P6是2′-O-甲基鳥(niǎo)苷(圖右上畫面)。
AIF的各個(gè)活性峰(1-6)的分子量(+H)表示在質(zhì)量分析圖(圖7～12下的畫面)的箭頭的下方。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)作為試管內(nèi)實(shí)驗(yàn)已確認(rèn)AIF效果的血液癌細(xì)胞的代表，使用Molt4，而作為上皮性癌細(xì)胞的代表使用GCIY。
(1)向SCID鼠各20只接種大約108個(gè)人胃癌細(xì)胞(GCIY)，在腫瘤的直徑達(dá)到0.5cm(0.25cm2)時(shí)(約2周后)，分成4組，使用AIF在荷瘤鼠中進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)，每組各有荷瘤鼠5只。試驗(yàn)例1.
將含有上述經(jīng)TLC分級(jí)的6種核苷(AIF)樣品(TLC-B級(jí)分)溶解于磷酸緩沖液(PBS)后，每次將總量1mg(相當(dāng)于2′-O-脫氧尿苷90μg、胸腺嘧啶核苷110μg、2′-O-甲基尿苷135μg、脫氧胸腺嘧啶核苷322μg、2′-O-次黃苷226μg，2′-O-甲基鳥(niǎo)苷116μg)溶解于0.5ml的PBS后，對(duì)荷瘤鼠各5只由靜脈(尾部靜脈)共18次(總量18mg)給藥。
作為對(duì)照，使用用TLC分級(jí)時(shí)得到的TLC上酚紅以下的級(jí)分，即不含6種核苷的樣品(TLC-A級(jí)分)，仍然是經(jīng)靜脈(尾部靜脈)共18次給藥。腫瘤的大小用長(zhǎng)徑×短徑的面積(面積)計(jì)量。圖22給出了第1周、第2周、第3周各5只鼠的腫瘤的平均大小。就象曲線表明的那樣，可以看出注入AIF組與對(duì)照組兩組的差異，注入AIF組與對(duì)照組相比，表現(xiàn)出有意義的很強(qiáng)的抑制腫瘤效果(在t檢測(cè)中P＜0.01)。試驗(yàn)例2.
與試驗(yàn)例1一樣，將TLC-A、B各1mg溶解在0.3ml的PBS后，分3次(0.1ml/次)3天內(nèi)直接注入各5只荷瘤鼠的腫瘤內(nèi)，若是用含有TLC-B級(jí)分的6種核苷的樣品(組成量與實(shí)驗(yàn)1一樣)，結(jié)果使得腫瘤完全萎縮。若是用作為對(duì)照不含有AIF的TLC-A級(jí)分，完全不能誘導(dǎo)腫瘤的萎縮。(作為代表性的例子，圖23A、B給出了對(duì)照荷瘤鼠與治療鼠各一只以及切除腫瘤的AIF給藥組3例和對(duì)照組3例)。AIF引起腫瘤萎縮的機(jī)制就象圖23C表示的那樣AIF誘導(dǎo)DNA片段化，即經(jīng)細(xì)胞程序死亡使腫瘤死亡。
(2)向SCID鼠各30只接種大約108個(gè)人T細(xì)胞白血病(Molt4)，在腫瘤的直徑達(dá)到0.3cm(0.09cm2)時(shí)(約2周后)，分成2組，使用AIF在荷瘤鼠中進(jìn)行治療實(shí)驗(yàn)。
將3種AIF核苷(2′-O-脫氧尿苷、胸腺嘧啶核苷、脫氧胸腺嘧啶核苷各400mg，三者合計(jì)1.2mg)溶解于0.5ml的PBS后，反復(fù)交替經(jīng)靜脈和直接向5只荷瘤鼠腫瘤內(nèi)給藥，共18次(總量21.6mg)。腫瘤的大小用長(zhǎng)徑×短徑的面積(面積)計(jì)量，追蹤3周。5只鼠中有3只鼠的腫瘤完全萎縮，其余的2只的腫瘤也被抑制到非常小。圖24的曲線給出了第1周、第2周、第3周各5只鼠的腫瘤的平均大小。而就象對(duì)照組曲線表示的那樣在注入PBS的對(duì)照組中會(huì)引起腫瘤的增大，可以看出兩者之間完全有意義的差別(在t檢測(cè)中P＜0.001)。[III]考察母系對(duì)胎兒的免疫反應(yīng)最初是在蛻膜組織被調(diào)節(jié)的。
認(rèn)為含有NK細(xì)胞標(biāo)記的LGL細(xì)胞的大群細(xì)胞團(tuán)集積在包括初期妊娠的人在內(nèi)的哺乳類的蛻膜層的現(xiàn)象通過(guò)本發(fā)明人的研究已經(jīng)被搞清楚了。大概這些NK細(xì)胞團(tuán)在胚盤胞的著床的局面起著重要的作用。就是說(shuō)NK細(xì)胞在妊娠時(shí)不斷增殖，控制處于發(fā)育過(guò)程中的胎兒胎盤的形成。換句話說(shuō)天然的癌免疫反應(yīng)在妊娠時(shí)就進(jìn)行著。
本發(fā)明人擁有的NS細(xì)胞株是本發(fā)明人從人妊娠3個(gè)月的蛻膜層克隆、建立的CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞。該細(xì)胞株不具有作為蛻膜間質(zhì)細(xì)胞特征的雌性激素和黃體酮受體，由于也不分泌催乳激素，可以認(rèn)為是從骨髓或淋巴系組織游離出來(lái)的細(xì)胞系譜。
作為NS細(xì)胞的具體的功能不只是抑制由MLR或分裂素刺激引起的淋巴細(xì)胞分裂反應(yīng)，最近抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用也有報(bào)道(Sugiura，K.，M.Inaba.，H.Ogata.，R.Yasumuzu.，E.E.Sardin.，K.Inaba.，S.Kuma，.R.A.Good.，and S.Ikehara.1990.Inhibition oftumor cell proliferation by natural suppressor cells present inmurine bone marrow.Canser.Res..502582)。該NS細(xì)胞基本上作為參與細(xì)胞分裂調(diào)控的效應(yīng)物質(zhì)雖然一直被認(rèn)為是TGF-β家族的蛋白質(zhì)(Clark，D.A.，K.C.Flanders.，D.Banwatt.，W.Millar-Book.，J.Manuel.，J.Stedronska-Clark.，and B.Rowley，1990.Murinepregnancy decidua produces a unique immunosuppressive moleculerelated to transforming grwth factor beta-2.J.Immunol.1443008)或分子量1萬(wàn)以下的核糖醇那樣的物質(zhì)(Mortari，F(xiàn).，andS.K.Singhal.1988.Production of human bone marrow-derivedsuppressor factor Effect on antibody synthesis and lectin-activated cell prliferation.J.Immunol.1413037)，但其實(shí)體還不清楚。作為由NS細(xì)胞引起的免疫抑制作用機(jī)制，就象本發(fā)明人的以前的研究(Tatsumi，K，T.Mori.，E.Mori.，H.Kanzaki.，andT.Mori.1987.Immunoregulatory factor released form a cell linederived from human decidual tissue.Am.J.Reprod.Immunol.Microbiol.1387)就以指出的那樣，NS細(xì)胞株的上清中的蛋白類物質(zhì)抑制通過(guò)IL-2進(jìn)行的T細(xì)胞分裂反應(yīng)。
在本發(fā)明中可能使人驚奇的是我們已經(jīng)搞清楚該NS細(xì)胞株通過(guò)細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)作用不只是誘導(dǎo)人血液癌細(xì)胞K562/Molt4/U937，也誘導(dǎo)惡性度極高的人胃癌細(xì)胞GCIY和人絨毛癌細(xì)胞BeWo死亡和抑制其增殖。
另外從該細(xì)胞株的培養(yǎng)上清進(jìn)行了誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序死亡的物質(zhì)(AIF)的分離、純化、構(gòu)造確定。其過(guò)程首先是將NS細(xì)胞株培養(yǎng)上清的冷凍干燥樣品上C18-柱，然后用乙腈將與柱子疏水性結(jié)合的物質(zhì)洗脫出來(lái)。洗脫出來(lái)的活性因子再經(jīng)TLC粗純化?；钚约?jí)分表現(xiàn)出來(lái)的Rf值比酚紅大，年抑制K562/Molt4細(xì)胞分裂、引起DNA片段化。最終通過(guò)C18反相柱經(jīng)HPLC將活性分子作為6個(gè)主要的峰分離純化。由這6個(gè)峰獲得的樣品無(wú)論那一個(gè)都抑制靶癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)DNA片段化，可以確認(rèn)就是當(dāng)初的目的物即AIF。而這6種AIF混合后作為混合物使用時(shí)(現(xiàn)在癌化療法進(jìn)行的多制劑并用，這里是天然的多制劑并用)發(fā)現(xiàn)最有效。由于這6種AIF的物理化學(xué)的性質(zhì)是地衣酚反應(yīng)和茚三酮反應(yīng)陰性，所以它們是非蛋白性的不含六碳糖的物質(zhì)。其分子量推定為100～500。
象圖7～12左上表示的那樣經(jīng)HPLC分級(jí)的各活性峰在UV光譜中顯示出的最大吸收值處于245nm到265nm范圍。就是說(shuō)強(qiáng)烈地暗示出AIF是核酸或與其衍生物有關(guān)的物質(zhì)。
從大量的NS細(xì)胞培養(yǎng)上清最終分離純化AIF，制備可以進(jìn)行構(gòu)造解析的樣品，通過(guò)FAB-MS確定分子量，用NMR最終確定它們的構(gòu)造(圖1～12)。6種AIF屬于含有堿基或核糖的一部分被脫氧，或是被甲基化的唯一構(gòu)造的核苷系列。
象本發(fā)明人那樣發(fā)現(xiàn)NS細(xì)胞分泌一系列的核酸系物質(zhì)，誘導(dǎo)人的所有癌細(xì)胞的程序死亡一事僅限于本發(fā)明人了解，即使在世界也是首次。
現(xiàn)在臨床上使用的核酸系抗癌制劑、抗病毒制劑(例如5-FU)、Futraful(FT)、Furtulon、AZT、DDI、Ara-c)細(xì)胞毒性高，其效果也就差些，用于人時(shí)副作用大，正成為社會(huì)化問(wèn)題。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的AIF雖說(shuō)是是試管和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所見(jiàn)(這些實(shí)驗(yàn)體系是以人用的抗癌制劑、抗病毒制劑的評(píng)價(jià)作為目的，在該領(lǐng)域中確立的一直用的試管內(nèi)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系(例如參照?qǐng)D22、23、24))，但對(duì)人正常細(xì)胞完全沒(méi)有傷害，就是說(shuō)將來(lái)用于人時(shí)副作用減輕，由于誘導(dǎo)癌細(xì)胞特異的細(xì)胞程序死亡(DNA片段化)這一自然的藥理作用機(jī)制開(kāi)拓了可能開(kāi)發(fā)引起癌細(xì)胞死亡的天然型理想的制癌劑。[IV]圖的補(bǔ)充說(shuō)明圖14表示NS細(xì)胞株誘導(dǎo)靶癌細(xì)胞的程序死亡，但不誘導(dǎo)正常細(xì)胞的程序死亡。
NS細(xì)胞株與靶細(xì)胞間的直接相互作用(共培養(yǎng))的結(jié)果，經(jīng)24小時(shí)培養(yǎng)后，提取細(xì)胞的DNA，在2％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳。
其結(jié)果就象圖14A所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與Molt4 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶5中只有Molt4 106/孔，帶4中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14B所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與K562 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。
而帶4中只有K562的106/孔，帶5中只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14C所示的那樣，帶1、2、3分別是K562細(xì)胞和Molt細(xì)胞數(shù)分別為106、105、104/孔間共培養(yǎng)，帶4中只有Molt4 106/孔、帶5中只有K562 106/孔時(shí)，無(wú)論那種情況都沒(méi)引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14D所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與BeWo 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有NS 106/孔，帶5只有BeWo 106/孔，帶6是BeWo 106/孔與GcIY106/孔間共培養(yǎng)，帶7只有GcIY106/孔時(shí)，無(wú)論那種情況都看不到DNA片段化。
象圖14E所示的那樣，帶1、2、3、4分別是NS細(xì)胞數(shù)為103、104、105、106/孔與U937 106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶7是Molt4 106/孔與U937106/孔間的共培養(yǎng)，帶8是只有Molt4 106/孔，帶6是只有U937106/孔，帶5是只有NS 106/孔時(shí)，都不會(huì)引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14F所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與GcIY106/孔間的共培養(yǎng)，靶細(xì)胞中DNA片段化程度隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加而上升。而在帶4只有GcIY106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)看不到DNA片段化。M是標(biāo)記物。
象圖14G所示的那樣，帶1、2、3分別是NS細(xì)胞數(shù)為104、105、106/孔與WI-38 106/孔間的共培養(yǎng)，即使接種的NS細(xì)胞數(shù)增加，在靶細(xì)胞中也看不到DNA片段化。帶4只有WI-38106/孔，帶5只有NS 106/孔時(shí)都不會(huì)引起DNA片段化。M是標(biāo)記物。圖15表示NS細(xì)胞與K562/Molt4細(xì)胞間接共培養(yǎng)中抑制靶細(xì)胞增殖。
象圖15表示的那樣在將NS(TTK-1)細(xì)胞與K562/Molt細(xì)胞加入到培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行間接相互作用(間接共培養(yǎng))的系統(tǒng)中，隨著接種的NS細(xì)胞數(shù)的增加，72小時(shí)后可以看到容器內(nèi)的靶癌細(xì)胞數(shù)的減少。
圖16～17表示通過(guò)薄層層析(TLC)的粗提取的AIF抑制靶細(xì)胞攝入3H脫氧胸腺嘧啶核苷、誘導(dǎo)DNA片段化。
將由NS(TTK-1)細(xì)胞株培養(yǎng)上清(TTK-1 Sup)50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈和甲醇對(duì)保留在柱子上的物質(zhì)進(jìn)行洗脫、濃縮干燥，得到的級(jí)分抑制K562/Molt4細(xì)胞的分裂。
象圖16A表示的那樣，將該級(jí)分加到TLC上，在培養(yǎng)基中含有的處于酚紅試劑的帶(Rf＝0.5)上部的級(jí)分(U)與無(wú)血清的培養(yǎng)基(SFM)、對(duì)照組(C)以及存在于TLC上的下部的級(jí)分(L)相比，可以看出抑制K562的分裂。
另外象圖16B表示的那樣，進(jìn)一步將該級(jí)分加到TLC上展開(kāi)，培養(yǎng)基中存在的處于酚紅(Rf＝0.5)位置的上部(U)的級(jí)分與存在于酚紅位置下部的級(jí)分相比，能看出有意義的抑制Molt4細(xì)胞分裂。
對(duì)照組(C)和使用新鮮無(wú)血清培養(yǎng)基(SFM)都看不到抑制靶細(xì)胞增殖的現(xiàn)象。
象圖17A，B所表示的那樣，將由NS(TTK-1)細(xì)胞培養(yǎng)上清約50ml冷凍干燥的樣品加到C18柱上，用乙腈洗脫保留在柱子上的物質(zhì)，然后濃縮，濃縮的級(jí)分利加到TLC上展開(kāi)，然后將處于酚紅位置(Rf值0.5)上部(U，帶1，3)和下部(L，帶2，4)的級(jí)分分別提取出來(lái)，研究是否存在誘導(dǎo)K562細(xì)胞(A)/Molt4細(xì)胞(B)的DNA片段化。
用這些提取物與K562/Molt4細(xì)胞反應(yīng)24小時(shí)(帶1，2)、48小時(shí)(帶3，4)后提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。就象該圖所表示的那樣，NS細(xì)胞培養(yǎng)上清中產(chǎn)生了誘導(dǎo)人癌細(xì)胞程序死亡的物質(zhì)(AIF)，確認(rèn)在TLC上比酚紅移動(dòng)快的級(jí)分(Rf＞0.5)中存在AIF。圖18用HPLC最終分離的AIF的HPLC曲線象圖18A所表示的那樣，由NS(TTK-1)培養(yǎng)上清500ml經(jīng)TLC粗純化的總的活性級(jí)分經(jīng)TSKgelODS-80TM柱(東曹)、反相HPLC分離提取。得到了主要的六個(gè)峰(1-6)。
象圖18B，C所表示的那樣，對(duì)Molt4細(xì)胞的培養(yǎng)上清(B)或新鮮的培養(yǎng)基(C)進(jìn)行與NS(TTK-1)細(xì)胞培養(yǎng)基完全相同的處理，最終加到HPLC上比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)從NS細(xì)胞株培養(yǎng)基得到的那樣的活性峰(1-6)在其HPLC圖上不存在。圖19，20表示了用HPLC最終分離純化的AIF能夠抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷，誘導(dǎo)DNA片段化，以及能夠誘導(dǎo)DNA片段化的AIF的有效量。
象圖19所表示的那樣，來(lái)自用HPLC分離的主要的(1-6)六個(gè)峰的樣品(7μg/ml)無(wú)論那一種都抑制Molt4攝入3H-脫氧胸腺嘧啶核苷，就是說(shuō)抑制Molt4細(xì)胞的分裂。特別是取自峰1和峰4的樣品表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性，各個(gè)峰稀釋到1/10濃度的混合樣品(各0.7μg/ml)也表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性。就象圖19的柱M表示的那樣，它表現(xiàn)出了各個(gè)峰(AIF)的協(xié)同效果。
象圖20A所表示的那樣，用從各個(gè)活性峰(1-6)制備的樣品作用于Molt4細(xì)胞48小時(shí)后，提取Molt4細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制Molt4細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品(7μg/ml)和取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10濃度的樣品(0.7μg/ml)的混合物無(wú)論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(圖20A，帶1-7)。
象圖20B，C所表示的那樣，用經(jīng)HPLC分離的各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(B；7×3-2μg/ml，C；7×3-5μg/ml)作用于Molt4細(xì)胞48個(gè)小時(shí)，提取細(xì)胞DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。就象圖20B表示的那樣，取自各個(gè)活性峰(1-6)的樣品(7×3-2μg/ml)和取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10濃度的樣品(0.7×3-2μg/ml)的混合物無(wú)論那一個(gè)都可誘導(dǎo)Molt4細(xì)胞的DNA片段化(帶1-7)。象圖20C表示的那樣，單獨(dú)7×3-5μg/ml，還是1/10稀釋的混合物，在0.7×3-5μg/ml的低濃度下其作用已經(jīng)消失了(帶1-7)。圖21經(jīng)HPLC最終分離的AIF雖然可以誘導(dǎo)人癌細(xì)胞BeWo/U937/GCIY的DNA片段化，但不能誘導(dǎo)人正常細(xì)胞WI-38的DNA片段化。
象圖21A、B、C所表示的那樣，用來(lái)自各個(gè)峰(1-6)的樣品(21μg/ml)以及取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10的混合樣品(各2.1μg/ml)與BeWo(A)/U937(B)/GCIY(C)細(xì)胞反應(yīng)48小時(shí)后，然后提取各個(gè)靶細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。與各個(gè)活性峰(1-6)的抑制靶細(xì)胞分裂效果相對(duì)應(yīng)，取自各個(gè)峰(1-6)的樣品以及取自各個(gè)峰(1-6)的稀釋到1/10的混合樣品無(wú)論那個(gè)樣品都可誘導(dǎo)靶細(xì)胞的DNA片段化(帶1-7)。
象圖21D所表示的那樣，用取自各個(gè)峰(1-6)樣品(用量是與靶癌細(xì)胞反應(yīng)的3倍(63μg/ml))與人正常細(xì)胞WI-38反應(yīng)48小時(shí)后，提取WI-38細(xì)胞的DNA，進(jìn)行2％瓊脂糖凝膠電泳。無(wú)論那一種AIF都不能抑制正常細(xì)胞的分裂和誘導(dǎo)DNA片段化。圖7～12經(jīng)HPLC分離的各活性峰1-6(AIF)的物理化學(xué)特性和構(gòu)造確定進(jìn)行NS細(xì)胞的大量培養(yǎng)(約300L)，從最終的HPLC分離純化的各個(gè)峰(1-6)制備樣品。
象圖7～12各P1-P6的左上圖表示的那樣，由于從UV光譜解析可以看到最大吸收值出現(xiàn)在260nm前后，所以判斷是核酸系物質(zhì)。
因?yàn)橥ㄟ^(guò)UV光譜解析確定了構(gòu)造解析的方向，所以通過(guò)質(zhì)量分析(FAB-MASS)確定分子量(下圖箭頭)。又象圖7～12(右上)表示的那樣，利用核磁共振(NMR)法確定了AIF的最終構(gòu)造。
以下通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。(實(shí)施例1)(說(shuō)明培養(yǎng)基、培養(yǎng)液)于5％CO2、37℃條件下培養(yǎng)3天，將NS細(xì)胞培養(yǎng)上清(500ml)冷凍干燥，通過(guò)C18柱進(jìn)行分離。由于活性物質(zhì)結(jié)合在柱子上，所以利用乙腈、甲醇從柱子上分離、洗脫，再利用氮?dú)馐谷軇]發(fā)，最后使溶質(zhì)濃縮干燥。
將用C18柱分離的物質(zhì)溶解在三氯甲烷∶甲醇(1∶1)溶液中之后，點(diǎn)到薄層(kieselgel)板上，通過(guò)三氯甲烷∶甲醇∶蒸餾水(60∶40∶8)展開(kāi)。展開(kāi)后，被酚紅試劑的帶分為下級(jí)分部(L)和上級(jí)分部(U)，挑取相應(yīng)凝膠，利用三氯甲烷/甲醇(1∶1)分別萃取回收，用氮?dú)飧稍铩?br> 利用ODS-80TM柱(TOSOH)，通過(guò)乙腈、0.1％三氟乙酸從0到5％的直線濃度梯度洗脫，時(shí)間為360分鐘，流速0.5ml/分，用OD214nm吸光度檢測(cè)，對(duì)具有活性的TLC中的u級(jí)分進(jìn)行分離純化，得到的主要的六個(gè)峰(1-6)(圖18A、HPLC圖)。
得到的目的物P1、P2、P3、P4、P5和P6分別有0.014mg、0.017mg、0.021mg、0.050mg、0.035mg、0.018mg。
以下雖然給出了本發(fā)明的化合物的制劑化例子，但本發(fā)明的化合物制劑化并不限于本制劑化例子。
制劑化例1本物質(zhì)(P1)10(份)(以下相同，表示重量比例)碳酸氫鎂15乳糖75將上述化合物均勻混合，作成350μm以下的粉末狀的或細(xì)粒狀的散劑。將該散劑放入膠囊容器內(nèi)作成膠囊制劑。
制劑化例2本物質(zhì)(P2)45(份)淀粉15乳糖16結(jié)晶纖維素21聚乙烯醇3蒸餾水30將上述成分均一混合，破碎造粒，干燥，然后篩選，作成177～1410μm大小的顆粒制劑。
制劑化例3使用與制劑化例2同樣的方法作成顆粒制劑后，相對(duì)于該顆粒制劑96份加硬脂酸鈣4份，壓縮成形，作成直徑10mm的片劑。
制劑化例4相對(duì)于用制劑化例2的方法作成的顆粒制劑90份，加入結(jié)晶纖維素10份和硬脂酸鈣3份，壓縮成形，作成直徑8mm的片劑后，然后再加入糖水明膠、沉淀性的碳酸鈣混合懸濁液，作成糖衣?tīng)睢?br> 制劑化例5本物質(zhì)(P3)0.6(份)
非離子系表面活性劑2.4生理鹽水97將上述成分加溫混合后，加入到安瓶中，滅菌后作成注射劑。
本發(fā)明的式(1)化合物或醫(yī)藥上允許的鹽對(duì)人正常細(xì)胞完全沒(méi)有傷害，用于人體時(shí)預(yù)計(jì)副作用會(huì)很輕，所以因其通過(guò)特異的細(xì)胞程序死亡引起癌細(xì)胞的死亡這一自然的作用機(jī)制，人們期待著用它治療人癌癥以及病毒疾病，在醫(yī)藥領(lǐng)域中作為抗腫瘤制劑和抗病毒制劑是有用的。
權(quán)利要求
1.由下式(1)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽，
式中的R1是用
代表的基團(tuán)，R2代表氫原子、羥基或甲氧基。
2.權(quán)利要求1記載的化合物或其醫(yī)藥上允許的鹽，其特征是R1和R2分別是
和氫原子，或是
和羥基，或是
和甲氧基，或是
和氫原子，或是
和甲氧基，或是
和甲氧基。
3.權(quán)利要求1或2記載的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽的制備方法，其特征是培養(yǎng)具有產(chǎn)生權(quán)利要求1記載的式(1)的化合物能力的取自人胎盤的蛻膜細(xì)胞，從其培養(yǎng)液中提取式(1)的化合物，根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽。
4.CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞。
5.以權(quán)利要求1或2記載的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽為有效成分的醫(yī)藥。
6.以權(quán)利要求1或2記載的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽為有效成分的抗腫瘤制劑或抗病毒制劑。
7.腫瘤或病毒的抑制方法，其特征是將權(quán)利要求1或2記載的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽的有效量用于需要進(jìn)行腫瘤或病毒抑制的患者。
8.權(quán)利要求1或2記載的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽用于制備抗腫瘤制劑或抗病毒制劑。
全文摘要
本發(fā)明提供對(duì)現(xiàn)有的抗腫瘤制劑和抗病毒制劑不能充分發(fā)揮效果的癌和病毒具有效果,對(duì)各種耐性癌具有制癌和抗病毒作用的,對(duì)人正常細(xì)胞沒(méi)有傷害的副作用小的物質(zhì)。本發(fā)明涉及到用式(1)(式中的R1是用特定的式表示的核酸堿基,R2代表氫原子、羥基或甲氧基)表示的抗腫瘤性或抗病毒性物質(zhì)或其醫(yī)藥上允許的鹽。本發(fā)明也涉及到式(1)的物質(zhì)或醫(yī)藥上允許的鹽的制備方法,該方法是培養(yǎng)具有產(chǎn)生式(1)的化合物能力的NS細(xì)胞,從其培養(yǎng)液中提取式(1)的化合物,根據(jù)需要作成醫(yī)藥上允許的鹽。另外本發(fā)明也公開(kāi)了以上述化合物為有效成分的醫(yī)藥,以及CD57陽(yáng)性、HLA.DR強(qiáng)陽(yáng)性的人型自然抑制細(xì)胞。
文檔編號(hào)C07H19/04GK1261372SQ98806532
公開(kāi)日2000年7月26日 申請(qǐng)日期1998年6月2日 優(yōu)先權(quán)日1997年6月3日
發(fā)明者森庸厚, 郭卯戊, 森悅子 申請(qǐng)人:森庸厚, 森崇英, 七枝株式會(huì)社