專利名稱：靜脈內(nèi)免疫血清球蛋白及其產(chǎn)物的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的背景本發(fā)明涉及一種用于生產(chǎn)靜脈內(nèi)給藥的含IgG(γ-球蛋白)作為主要成分的免疫血清球蛋白的集合的、多步驟的商品化方法。
已知有多種從人血漿Cohn分級(jí)產(chǎn)生的起始材料獲得靜脈內(nèi)給藥的γ-球蛋白溶液的方法。特定的Cohn級(jí)分含有比其它級(jí)分更高滴度的γ-球蛋白。γ-球蛋白的通常起始材料是Cohn級(jí)分II或Cohn級(jí)分II+III。
雖然現(xiàn)有技術(shù)使用了多種分離和滅菌技術(shù)，但一直有人在尋求方法的改進(jìn)，以增加終產(chǎn)品的純度和安全性，以及總產(chǎn)出。
許多商品化方法利用溶劑/去污劑步驟進(jìn)行病毒滅活，或使用熱處理步驟進(jìn)行病毒滅活。迄今為止，現(xiàn)有技術(shù)中并未提供一種以Cohn級(jí)分II或II+III糊(paste)狀物開始包括兩種不同病毒滅活步驟作為有效，高產(chǎn)γ-球蛋白制造工藝一部分的多步驟方法。
Kameyama等在美國專利5,151,499中指出一種制造滅活病毒的蛋白質(zhì)組合物的方法，其中用溶劑/去污劑處理蛋白質(zhì)組合物滅活有包膜病毒，用熱處理蛋白質(zhì)組合物滅活無包膜病毒。′499專利教導(dǎo)優(yōu)選地首先在蛋白酶抑制劑存在下進(jìn)行溶劑/去污劑步驟，隨后是熱處理。由于熱處理是在溶液狀態(tài)進(jìn)行，在任何熱處理之前，首先需要通過吸附到離子交換柱從溶劑/去污劑中回收蛋白質(zhì)。溶液熱處理可在糖、糖醇或氨基酸穩(wěn)定劑存在下進(jìn)行。雖然′644專利列出了包括免疫球蛋白的起始蛋白質(zhì)組合物，其生產(chǎn)實(shí)施例使用因子IX，凝血酶，血纖蛋白原和纖連蛋白。未考慮通過分級(jí)除去在熱處理步驟中產(chǎn)生的變性蛋白質(zhì)。
現(xiàn)有技術(shù)的某些產(chǎn)生可靜脈內(nèi)注射的γ-球蛋白溶液的方法中描述了在以Cohn級(jí)分II+III糊狀物起始的多步驟純化流程中包括在山梨糖醇熱穩(wěn)定劑存在下進(jìn)行溶液熱處理。在Hirao等的美國專利4,845,199中，將Cohn級(jí)分II+III用于聚乙二醇(此后簡稱“PEG”)分級(jí)(8％W/V PEG，然后12％W/V PEG)分級(jí)，然后在山梨糖醇作為穩(wěn)定劑存在下進(jìn)行溶液熱處理之前進(jìn)行離子交換層析(DEAE-Sephadex)并除去人血型抗體。另一方面，在Hirao等的美國專利4,876,088的實(shí)施例1中描述了從Cohn級(jí)分II+III沉積物制備可靜脈內(nèi)注射的γ-球蛋白溶液，其中將糊狀物懸浮于水中，將pH值調(diào)節(jié)至5.5并離心，然后在33％W/V山梨糖醇存在下將上清熱處理滅活病毒，接著是通過PEG分級(jí)(6％/12％)除去熱變性蛋白質(zhì)，然后是其它純化步驟，包括DEAE-Sephadex離子交換層析。
本發(fā)明總結(jié)本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種整合的、可用于商品化生產(chǎn)的方法以從Cohn分級(jí)過程產(chǎn)生高度純化的γ-球蛋白溶液。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供非常純的，不含有包括所有熱敏感病毒的包膜和無包膜病毒的可靜脈內(nèi)用藥的γ-球蛋白溶液。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種商品化γ-球蛋白工藝，使得在第二階段病毒滅活之前除去熱滅菌中產(chǎn)生的任何變性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明提供了上述和其它對熟練技術(shù)人員是顯而易見的目的，其中在含水介質(zhì)中熱穩(wěn)定劑存在下將可能為部分純化的但富含γ-球蛋白的醇Cohn級(jí)分熱處理以滅活病毒，隨后先用PEG分級(jí)，然后在破碎包膜病毒的溶劑，優(yōu)選地是溶劑-去污劑存在下第二次滅活病毒，最后從溶液或溶液-去污劑混合物中分離。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，山梨糖醇是熱穩(wěn)定劑，磷酸三烷基酯是溶劑。
在本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在第二次滅活病毒前利用PEG分級(jí)除去熱處理滅活病毒時(shí)的變性產(chǎn)物，以提供極純的熱處理的γ-球蛋白。
在本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，在溶劑-去污劑處理前除去任何存在的顆粒。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，提供了一種適于靜脈內(nèi)用藥的熱滅菌的和溶劑-去污劑滅菌的γ-球蛋白。
本發(fā)明的詳細(xì)描述含有免疫球蛋白的級(jí)分用作起始材料。這一級(jí)分并不特定限定，只要來自人血清并含有免疫球蛋白級(jí)分。這種含免疫球蛋白級(jí)分的特定例子包括通過Cohn的乙醇分級(jí)獲得的級(jí)分II+III和級(jí)分II，以及與此等價(jià)的含免疫球蛋白級(jí)分的糊狀物。其它起始材料是級(jí)分I+II+III，和級(jí)分II+IIIw。起始材料可能含有雜質(zhì)，諸如人血型抗體，血纖蛋白溶酶原，血纖蛋白溶酶，激肽釋放酶，前激肽釋放酶激活劑，IgM，IgA，IgG多聚物(后面稱為“聚集體”)，等。
優(yōu)選的起始材料是Cohn級(jí)分II或Cohn級(jí)分II+III。當(dāng)使用Cohn級(jí)分II+III糊狀物時(shí)，推薦先進(jìn)行洗滌步驟來形成級(jí)分II+IIIw，然后將其用于本發(fā)明的流程。“級(jí)分II+IIIw”是用磷酸二鈉溶液洗滌的Cohn級(jí)分II+III沉淀物。
可通過將級(jí)分II+III糊狀物懸浮于注射用冷水獲得級(jí)分II+IIIw，比例大約是每20體積水1公斤II+III糊狀物。加入磷酸鈉至終濃度約0.003M，用于溶解脂，脂蛋白和清蛋白。將冷乙醇加至終醇濃度大約20％。在加入乙醇時(shí)，將溫度逐步降至-5±1℃并例如通過使用乙酸鹽緩沖液或稀釋氫氧化鈉將pH保持在7.2±0.1。保持溫度在-5±1℃，通過離心和/或過濾回收級(jí)分II+IIIw糊狀物。
在本發(fā)明第一次滅活病毒步驟前，可進(jìn)行各種預(yù)先純化和/或減少聚集物步驟。例如，在使用級(jí)分II+IIIw糊狀物時(shí)，典型地含有大約20％乙醇和超過70％IgG，可在大約0到5℃溫度將其懸浮于3到10體積，優(yōu)選地3到5體積冷水中并使用pH和乙酸鹽緩沖液或鹽酸將pH調(diào)節(jié)在4.5到6.0之間，優(yōu)選地在5.0至5.5之間。將混合液振動(dòng)大約2至15小時(shí)，以使所有的γ-球蛋白進(jìn)入溶液。此后，可通過離心和/或過濾除去未溶解的蛋白質(zhì)，諸如清蛋白和α-球蛋白。
當(dāng)使用不同的起始Cohn級(jí)分時(shí)，可適當(dāng)選擇進(jìn)行預(yù)先純化所需的初始步驟或處理流程步驟，以獲得用于進(jìn)一步處理的高IgG含量級(jí)分。例如，在已將級(jí)分II(含超過95％的IgG)從Cohn級(jí)分III分離時(shí)，將級(jí)分II用于進(jìn)一步處理，初始的過程可以如Uemura等在美國專利4,371,520中所述在3.2至5.0的酸性pH，優(yōu)選地在3.8至4.2，從而將免疫球蛋白聚集物降解成免疫球蛋白單體和二體，因?yàn)橐阎奂锞哂锌寡a(bǔ)體活性(ACA)。另一方面，以Cohn級(jí)分II+III為起始材料，Uemura等申請專利在如上所述的初始化步驟后并在使病毒失活的熱處理步驟前加上進(jìn)行低pH處理的步驟。
對于熱除菌步驟，將免疫球蛋白溶于水或者如果是諸如從上述部分純化的片段II+III收集的過濾物的液體混合液，可以就這樣使用，并向其中加入糖，糖醇和/或氨基酸熱穩(wěn)定劑。熱穩(wěn)定劑優(yōu)選地是蔗糖，麥芽糖，山梨糖醇或甘露糖醇，最優(yōu)選地為山梨糖醇。將糖或糖醇以粉末狀加到免疫球蛋白溶液或先將其與少量水混合再加入，以提供大約10至5W/V％的終濃度，直至飽和。此時(shí)，免疫球蛋白水溶液含足夠的水，從而此溶液含大約1至6％的總蛋白，每公斤糊狀物含大約300克蛋白質(zhì)的典型的級(jí)分II+III起始材料。
在加入熱穩(wěn)定劑后，將混合液加熱至大約50-70℃10-100小時(shí)，優(yōu)選地在大約60℃10至20小時(shí)，以滅活熱敏感病毒。熱處理不僅滅活病毒，而且能產(chǎn)生蛋白質(zhì)變性效應(yīng)，能優(yōu)選地降低某些通常與Cohn級(jí)分II+III相聯(lián)的不需要的蛋白質(zhì)的含量，諸如前激肽釋放酶，血纖蛋白溶酶，血纖蛋白溶酶原和IgA。
在熱處理后，加入所需量的冷水使蛋白質(zhì)濃度保持在大約0.3至2.0％。將溶液冷至0-2℃。
此后，對熱處理的溶液進(jìn)行PEG分級(jí)分離。PEG分級(jí)分離是本技術(shù)領(lǐng)域純化免疫球蛋白熟知的方法，是為了將所需的IgG單體和二體與IgG聚合物以及起始血漿蛋白級(jí)分中天然存在的其它雜質(zhì)分離。然而，在本方法中，PEG分級(jí)亦能將所需的IgG單體和二體與熱處理中產(chǎn)生的不需要的變性蛋白產(chǎn)物分離。這些變性的蛋白產(chǎn)物是變性的前激肽釋放酶，血纖蛋白溶酶原，血纖蛋白溶酶，IgA，IgM及其聚合物。
可使用任何現(xiàn)有技術(shù)中所述的PEG分級(jí)分離方法。通常進(jìn)行兩階段的PEG分級(jí)分離。在PEG分級(jí)的第一階段，選擇PEG濃度和pH，使所需的IgG單體和二聚體保持在溶液中而將諸如聚集物的不需要的蛋白沉淀出溶液。在離心和/或過濾后，增加了PEG濃度并調(diào)節(jié)pH，使所需的IgG單體和二聚體沉淀。
例如，當(dāng)使用級(jí)分II+IIIw糊狀物作為起始材料，第一階段的PEG分級(jí)可在pH大約5.0至7.5，優(yōu)選地pH值大約6.5至7.5進(jìn)行，當(dāng)使用級(jí)分II+III糊狀物作為起始材料時(shí)優(yōu)選地在pH值大約5.5至6.0，PEG濃度范圍大約4至8％，在使用級(jí)分II+IIIw糊狀物作為起始材料時(shí)優(yōu)選地在4至6％，或使用級(jí)分II+III糊狀物作為起始材料時(shí)6至8％。保持低溫大約0-2℃，可進(jìn)行第一階段的PEG分級(jí)大約1至8小時(shí)，此后如上所述除去糊狀物。然后將過濾液pH調(diào)節(jié)至大約8.0至9.0，優(yōu)選地大約8.5至8.9，并將PEG加至終濃度大約10至15％，優(yōu)選地大約12％。通過過濾和/或離心移去形成的糊狀物，即純化的免疫球蛋白。
在上述Hirao等的美國專利4,876,088和Hirao等的美國專利4,845,199中可以找到在本發(fā)明中實(shí)際可用的PEG分級(jí)分離方法的其它細(xì)節(jié)。
本發(fā)明的最后關(guān)鍵步驟是使用溶劑或溶劑-去污劑混合液進(jìn)行第二次病毒滅活步驟。如下所述，進(jìn)一步的純化步驟，特別是那些包括使用離子交換樹脂步驟，可在溶劑-去污劑處理之前和/或之后進(jìn)行。一種特別有效的方法是在溶劑去污劑病毒滅活之前進(jìn)行陰離子交換處理然后在溶劑去污劑病毒滅活后進(jìn)行陽離子交換處理。通過這種程序，使用陰離子交換從IgG中除去人血漿中存在的某些不需要的蛋白質(zhì)物質(zhì)(諸如前激肽釋放酶激活劑，IgA，IgM和清蛋白)然后通過陽離子交換進(jìn)一步除去這類物質(zhì)(前激肽釋放酶激活劑，IgA，IgM，清蛋白和PEG)以及溶劑-去污劑處理中使用的殘留試劑。
如果在整個(gè)流程中沒有另外完成，需處理用于溶劑-去污劑的溶液以除去所有顆粒物質(zhì)，其可包括變性蛋白質(zhì)。因而，優(yōu)選地在加入溶劑-去污劑之前用1微米或更細(xì)濾器過濾溶液。這樣也可降低在大顆粒中存在病毒的可能性從而可能避免暴露于溶劑-去污劑。
現(xiàn)今，滅活有包膜病毒的優(yōu)選溶劑是磷酸三烷基酯。本發(fā)明中使用的磷酸三烷基酯沒有特定限制，但優(yōu)選地使用三(正-丁基)磷酸酯(此后稱為“TNBP”)。其它可用的磷酸三烷基酯是三(三丁基)磷酸酯，三(正己基)磷酸酯，三(乙基己基)磷酸酯等等。可以使用2種或更多不同的磷酸三烷基酯混合物。
使用的磷酸三烷基酯的量在0.01至10(W/V)％，優(yōu)選地大約0.1至3(W/V)％。
可在有或無去污劑或表面活性劑存在下使用磷酸三烷基酯。優(yōu)選地將磷酸三烷基酯與去污劑組合使用。去污劑的作用是增強(qiáng)免疫球蛋白組合物中的病毒與磷酸三烷基酯的接觸。
去污劑舉例包括脂肪酸的聚氧乙烯衍生物，無水山梨糖醇的部分酯諸如Polysorbate 80(商品名吐溫80，等)和Polysorbate 20(商品名吐溫20，等)；以及非離子性油浴清洗劑諸如氧乙基化烷基酚(商品名Triton X100，等)。實(shí)施例還包括其它表面活性劑和去污劑諸如兩性離子去污劑等等。
使用去污劑時(shí)，并沒有嚴(yán)格加入量；例如，可使用大約0.001％至大約10％的比率，優(yōu)選地在0.01％至3％。
本發(fā)明中，含免疫球蛋白組合物的磷酸三烷基酯處理是在大約20至35℃進(jìn)行的，優(yōu)選地25至30℃，時(shí)間超過1小時(shí)，優(yōu)選地大約5至8小時(shí)，更優(yōu)選地大約6至7小時(shí)。
在磷酸三烷基酯處理中，免疫球蛋白在水溶劑中是大約3至8％的蛋白溶液。
如果未在溶劑-去污劑處理前進(jìn)行，則可用陰離子交換處理用溶劑去污劑處理過的免疫球蛋白。優(yōu)選地，至少對溶劑-去污劑處理產(chǎn)物進(jìn)行陽離子交換處理。在離子交換處理中，免疫球蛋白溶解于水溶液，通常pH值大約5-8，并具有所需的低離子強(qiáng)度使IgG最大吸附。蛋白質(zhì)濃度通常在1-15W/V％的范圍，更優(yōu)選地在大約3至10W/V％。用所使用的相同水溶液平衡離子交換，可使用分批或連續(xù)系統(tǒng)。例如，可通過將免疫球蛋白溶液與陰離子交換介質(zhì)以大約10至100毫升每毫升預(yù)處理的陰離子交換介質(zhì)(例如，1克DEAE Sephadex A-50樹脂在0.4％氯化鈉溶液中膨脹到大約20克濕重)的量混合，將混合物在大約0.5℃振蕩大約0.5至5個(gè)小時(shí)，然后過濾或在6,000至8,000rpm離心10至30分鐘回收上清液來進(jìn)行陰離子交換分批處理。連續(xù)處理可通過將免疫球蛋白溶液以大約10至100毫升每毫升離子交換劑的比率穿過陰離子交換柱進(jìn)行，并回收不吸附的級(jí)分。
使用的陰離子交換劑舉例包括與不可溶載體相連的陰離子交換基團(tuán)。陰離子交換基團(tuán)包括二乙基胺基乙基(DEAE)，一種四價(jià)氨基乙基(QAE)基團(tuán)等，不可溶載體包括瓊脂糖，纖維素，葡聚糖，聚丙烯酰胺等。
可使用的陽離子交換劑是羧甲基葡聚糖凝膠(CM-Sephadex)，CM-纖維素，SP-Sephadex，CM-瓊脂糖凝膠(CM-Sepharose)和S-Sepharose。將1毫升預(yù)處理的陽離子交換劑(例如1克CM-Sephadex C-50樹脂在0.4％氯化鈉溶液中膨脹至大約30-35克濕重)與0.5毫升至5毫升免疫球蛋白溶液混合并在0-5℃振蕩1-6小時(shí)。將懸浮液離心或過濾回收吸收了IgG的樹脂。亦可使用連續(xù)處理方法。
將上述條件用于陽離子交換劑時(shí)，IgG將被吸附，此后通過例如大約1.4N氯化鈉溶液洗吸附了蛋白的陽離子交換樹脂，可洗脫出IgG。
遵循上述步驟，澄清，滲濾了IgG并濃縮至所需程度。如果需要，可加入諸如D-山梨糖醇并最終將溶液組分調(diào)節(jié)至含有大約100毫克/毫升IgG和50毫克/毫升D-山梨糖醇，pH值在5.4。然后將溶液通過無菌細(xì)菌保留濾器進(jìn)行無菌過濾并充入小管中。
陳述下列實(shí)施例來說明本發(fā)明但不是限制。
如果需要，可將其它免疫球蛋白純化方法適當(dāng)?shù)嘏c此處所述的流程結(jié)合。例如，可使用能降低激肽釋放酶和前激肽釋放酶激活劑的膨潤土澄清步驟。下面的實(shí)施例1中對此進(jìn)行了說明。實(shí)施例1熱處理和溶劑-去污劑處理的γ-球蛋白將685克級(jí)分II+IIIw糊狀物懸浮于大約11.9公斤冷水中。將三水合醋酸鈉加到懸浮液中至終濃度約0.04M，選擇性溶解IgG?；旌洗蠹s15分鐘后，將懸浮液的pH值用pH4.0的醋酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)至4.8。將冷乙醇(95％)加到懸浮液中至終濃度17％。在加入乙醇時(shí)，將懸浮液的溫度逐漸降至大約-6℃。向懸浮液中加入303克酸洗的Celite公司的Celite 535，終濃度大約2.0％?；旌弦恍r(shí)后，通過過濾器壓力過濾除去Celite和含有不需要的蛋白質(zhì)諸如血纖蛋白溶酶，血纖蛋白溶酶原，IgA和IgM的級(jí)分III。通過0.45微米和0.2微米濾器進(jìn)一步澄清濾液。
用1.0N鹽酸將級(jí)分II+IIIw澄清溶液的pH值調(diào)節(jié)至4.0然后通過超濾濃縮至大約3.4升(原體積的1/5)。將與第一次超濾去除量等量的冷水加到濃縮溶液并重新通過超濾濃縮到原體積的大約1/5。在此步驟中，溶液中蛋白濃度大約2％。將溶液進(jìn)一步濃縮至大約4％并對冷水滲濾直至溶液的導(dǎo)電率低于300μs/cm，以防止熱處理中的蛋白聚集和變性。將溶液進(jìn)一步濃縮到大約8.8％蛋白質(zhì)。將D-山梨糖醇加到溶液中至終濃度大約33％?；旌?0分鐘后，將含山梨糖醇的溶液的pH用0.5N氫氧化鈉調(diào)節(jié)到5.5。然后將溶液在60℃加熱10個(gè)小時(shí)。熱處理后，加入相當(dāng)于熱處理后溶液3倍體積的冷水并將稀釋溶液降溫至0-2℃。
用0.25N氫氧化鈉將溶液pH調(diào)節(jié)至6.9并向溶液中加入50％的聚乙二醇(PEG)3350使PEG終濃度為4％。將溶液中氯化鈉濃度調(diào)節(jié)至大約8mM，以幫助在pH6.9下雜質(zhì)和聚集物的沉淀。通過過濾除去形成的糊狀物。用1.0N鹽酸將濾液的pH調(diào)節(jié)至4.8并加入膨潤土至終濃度大約0.25％。將膨潤土懸浮液的pH重新調(diào)節(jié)至大約5.2然后過濾懸浮液除去膨潤土。用0.25N氫氧化鈉將濾液pH調(diào)節(jié)至8.5并加入50％的PEG 3350溶液至PEG終濃度為12％。通過離心移去形成的沉淀(純化的免疫球蛋白)。
將大約175克如上獲得的純化免疫球蛋白糊狀物懸浮于大約790克0.3％氯化鈉溶液。將懸浮液pH調(diào)節(jié)到5.5并隨后將其混合2.5小時(shí)。將62克預(yù)先平衡的DEAE-Sephadex A-50樹脂(含0.3％氯化鈉，pH5.5)加入溶液并將懸浮液混合2小時(shí)。然后過濾懸浮液除去樹脂。將氯化鈉濃度調(diào)節(jié)到0.4％后，將三-正-丁基磷酸酯(TNBP)和Polysorbate 80混合物加到濾液中，使溶液中TNBP終濃度0.3％，Polysorbate 80終濃度1.0％。溫育過夜后，將溶液pH調(diào)節(jié)到5.8并加入大約860克預(yù)先平衡的CM-Sephadex C-50(含0.4％氯化鈉，pH5.8)?；旌?小時(shí)后，將懸浮液過濾。用0.3％氯化鈉洗CM-Sephadex樹脂3次后，用1.4N氯化鈉洗脫吸附的IgG。將洗脫液澄清，滲濾并濃縮。加入D-山梨糖醇并最后調(diào)節(jié)使溶液組成中有大約100毫克/毫升IgG，50毫克/毫升D-山梨糖醇，pH5.4。然后用無菌細(xì)菌保留過濾器將溶液無菌過濾并充入小管中。
此實(shí)施例中中間的膨潤土步驟是有用的，可進(jìn)一步減少低血壓酶諸如激肽釋放酶和前激肽釋放酶激活劑的存在。
實(shí)施例1中產(chǎn)品的檢測結(jié)果<
>ND＝未測到實(shí)施例2熱處理的和溶劑-去污劑處理的γ-球蛋白將1公斤級(jí)分II+III糊狀物懸浮于4.5公斤0-2℃的冷水中?；旌?小時(shí)后，將懸浮液pH用1N鹽酸調(diào)節(jié)至5.0。在pH5.0混合3小時(shí)后，離心除去沉淀。將D-山梨糖醇加到離心物中至終濃度33％并混合1小時(shí)。將懸浮液pH調(diào)節(jié)至5.5并隨后在60℃加熱10個(gè)小時(shí)。熱處理后，加入相當(dāng)于熱處理后溶液3倍體積的冷水并將稀釋溶液降溫至0-2℃。加入50％聚乙二醇(PEG)3350溶液至終濃度6％PEG。用0.5N氫氧化鈉將6％PEG懸浮液pH調(diào)節(jié)到5.7并將懸浮液混合2小時(shí)。加入酸洗Celite 535至終濃度1.5％并將懸浮液混合1小時(shí)。過濾除去沉淀和Celite。用0.5N氫氧化鈉將濾液pH調(diào)節(jié)至8.8，并加入50％PEG溶液使PEG濃度調(diào)節(jié)至12％。將12％PEG懸浮液的pH調(diào)節(jié)至8.8，將懸浮液混合1小時(shí)并過濾收集純化的免疫球蛋白糊狀物。回收到251克純化的免疫球蛋白糊狀物。
將如上獲得的251克純化的免疫球蛋白糊狀物懸浮于大約1.4公斤0.3％氯化鈉溶液?；旌?小時(shí)后，用5％乙酸將懸浮液的pH調(diào)節(jié)至6.0。糊狀物完全溶解后，將使用0.3％氯化鈉在pH6.0預(yù)先平衡的104克DEAE-Sephadex A-50樹脂加到溶液中并混合2小時(shí)。過濾除去樹脂。通過0.2微米過濾器進(jìn)一步澄清濾液。通過加入氯化鈉將澄清溶液中氯化鈉的濃度增至0.4％。將三-正-丁基磷酸鹽(TNBP)和Polysorbate 80混合物加到溶液中使其終濃度為0.3％TNBP和1.0％Polysorbate 80。然后將溶液在27℃溫育1小時(shí)并置于冷盒中4℃過夜。第二天，將溶液pH調(diào)節(jié)至5.8并在pH5.8下加入1.8公斤預(yù)先用0.4％氯化鈉平衡的CM-Sephadex C-50樹脂。混合2小時(shí)后，通過過濾分離樹脂。在用0.3％氯化鈉洗CM-Sephadex樹脂3次后，用1.4N氯化鈉洗脫吸附的IgG。將洗脫液澄清，滲濾并濃縮。加入D-山梨糖醇并最后調(diào)節(jié)產(chǎn)生具有大約100毫克/毫升IgG和大約50毫克/毫升D-山梨糖醇組分的溶液。將溶液分成2份，A份和B份。將A份pH值調(diào)節(jié)至5.4并將B份調(diào)節(jié)至pH4.3。然后分別將A份和B份溶液用無菌細(xì)菌保留濾器進(jìn)行無菌過濾并充填到小管。
實(shí)施例2產(chǎn)品的測定結(jié)果
>ND＝未測到對熟練技術(shù)人員而言本發(fā)明的變化將是顯而易見的。
權(quán)利要求
1.一種制備靜脈內(nèi)注射γ-球蛋白溶液的方法，包括(a)在足夠滅活熱敏感病毒的時(shí)間和溫度條件下熱處理不純的γ-球蛋白溶液；(b)將熱處理的γ-球蛋白溶液用聚乙二醇分級(jí)分離以獲得純化的γ-球蛋白溶液；以及(c)用有機(jī)溶劑處理純化的γ-球蛋白溶液以滅活有包膜病毒。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中不純的γ球蛋白溶液是Cohn級(jí)分I+II+III，Cohn級(jí)分II+III，Cohn級(jí)分II+IIIw，或Cohn級(jí)分II。
3.權(quán)利要求1中的方法，其中在熱處理步驟(a)前對不純的γ球蛋白溶液進(jìn)行至少一次純化步驟。
4.權(quán)利要求1中的方法，其中的熱處理步驟(a)在大約50至70℃進(jìn)行大約10到100小時(shí)。
5.權(quán)利要求4中的方法，其中熱處理步驟(a)在大約60℃進(jìn)行大約10個(gè)小時(shí)。
6.權(quán)利要求1中的方法，其中的聚乙二醇分級(jí)分離經(jīng)至少兩個(gè)階段進(jìn)行，在聚乙二醇分級(jí)分離的第一階段中將雜質(zhì)以沉淀方式除去，在聚乙二醇分級(jí)分離的第二階段中將γ-球蛋白以糊狀物移出。
7.權(quán)利要求1中的方法，其中步驟(c)中使用的有機(jī)溶劑是一種磷酸烷基酯。
8.權(quán)利要求6中的方法，其中步驟(c)中使用的有機(jī)溶劑是一種磷酸烷基酯。
9.權(quán)利要求8中的方法，其中的磷酸烷基酯是三-正-丁基磷酸酯。
10.權(quán)利要求1中的方法，其中的有機(jī)溶劑含有去污劑。
11.權(quán)利要求9中的方法，其中的有機(jī)溶劑含有去污劑。
12.權(quán)利要求1中的方法，其中的步驟(a)后將γ球蛋白溶液用陰離子交換樹脂和陽離子交換樹脂處理。
13.權(quán)利要求12中的方法，其中的陰離子交換樹脂處理在步驟(c)之前并且陽離子交換樹脂處理在步驟(c)之后。
14.權(quán)利要求6中的方法，其中在分離的聚乙二醇分級(jí)分離的第一階段的后進(jìn)行膨潤土澄清步驟。
15.通過權(quán)利要求1中的方法制成的靜脈內(nèi)注射γ球蛋白溶液。
16.通過權(quán)利要求3中的方法制成的靜脈內(nèi)注射γ球蛋白溶液。
全文摘要
一種用于產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上無病毒污染的靜脈內(nèi)給藥的γ球蛋白溶液的方法;其通過滅活病毒的熱處理,不純的γ球蛋白溶液分級(jí)分離,然后用溶劑－去污劑將純化的γ球蛋白進(jìn)一步處理滅活病毒。
文檔編號(hào)C07K16/06GK1252729SQ9880437
公開日2000年5月10日 申請日期1998年12月7日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月24日
發(fā)明者雷加·R·馬米迪, 安德雷尼克·巴格達(dá)薩瑞恩, 竹知一夫, 戈古尼歐·卡納維雷爾 申請人:阿爾法醫(yī)療公司